Технология получения пробиотиков

Технология производства бифидумбактерина включает следующие стадии: приготовление питательных сред, выращивание посевного материала, культивирование, сублимационное высушивание, приготовление лекарственных форм, контроль готового препарата.

Приготовление питательных сред. Для культивирования бифидобактерий используют среду Блоурокка или среду на основе гидролизата казеина.

В состав среды Блоурокка входят агар микробиологический, натрий хлористый, пептон сухой, лактоза, печёночный бульон, цистин. Срок хранения питательной среды не более 7 сут при температуре 20±5єС.

Срок хранения сред на основе гидролизата казеина не более 72 ч при температуре 20±5єС.

Стадия выращивания посевного материала. Посевы бифидобактерий инкубируют при температуре 38±1єС в течение 60±12 ч. Контрольные посевы инкубируют при температуре 22±2єС в течение 8 сут. При этом получают бифидобактерии 1-ой генерации.

Следующий этап - получение бифидобактерий 2-ой генерации. Засев культуры проводят из расчёта 10% от объёма среды. Культура бифидобактерий и контрольные посевы инкубируют при той же температуре в матрасах, что и для посева 1-ой генерации. Общее время также аналогично времени для посевов 1-ой генерации. Контроль посевной культуры проводится при высевании бифидобактерий 2-ой генерации в пробирки с глюкозой, средой Сабура и приготовлении мазка, окрашенного по Грамму.

При отсутствии роста в контрольных пробирках и наличии типичного роста бифидобактерий в виде рыхлого зернистого осадка, полученную культуру используют для посева в биореактор.

Культивирование. Культивирование бифидобактерий проводят в биореакторах марки БИОР. После проверки на герметичность и обработки фильтров биореактор стерилизуют при 130єС в течение 90 мин. Затем в него вводят гидролизатно-молочную или казеиноводрожжевую среду. Засев питательной среды проводят бифидобактериями 2 - 3-ей генерации.

После культивирования проводят контроль биомассы. Биологическая концентрация бифидобактерий должна быть не менее 10⁸ клеток/мл, посторонняя микрофлора должна отсутствовать, рН = 7,1 ± 0,1. Затем готовят среду высушивания и вводят в биореактор. Биомассу со средой высушивания перемешивают 3±0,5 мин механической мешалкой, разливают в стерильные ёмкости аппарата «Магнолия» и передают на участок розлива в ампулы.

Сублимационное высушивание биомассы. Розлив биомассы в ампулы производится при постоянном перемешивании. В начале, середине и конце розлива отбирают пробы для определения посторонней микрофлоры и жизнеспособности бифидобактерий, равномерности и точности розлива. Заполненную ампулами кассету прикрывают несколькими слоями стерильной марли, металлической крышкой и передают для замораживания в низкотемпературную установку Масс-5, где выдерживают препарат при температуре минус 40±2єС в течение 48 ± 2 ч.

Высушивание проводят при давлении 13,3 ± 0,13 Па и температуре минус 30 ± 4єС в течение 24 ± 2 ч, далее температуру повышают до + 28 ± 2єС в течение 16 ± 2 ч и выдерживают 20 ± 2 ч.

После окончания процесса высушивания производится запайка ампул. Герметизацию ампул осуществляют не позднее 72 ч после окончания лиофилизации на автомате для запайки ампул в атмосфере азота.

Получение готовой лекарственной формы. Пятой стадией производства бифидумбактерина является маркировка и упаковка препарата. В помещении контроль производят проверку герметичности ампул и визуальный контроль.

Ампулы, прошедшие контроль и осмотр, отправляют на маркировочную машину, затем укладывают по 10 штук в пачки из картона. В каждую пачку вкладывается инструкция по применению препарата.

Контроль готового препарата осуществляется по следующим показателям: физические свойства, внешний вид, отсутствие посторонней микрофлоры, количество живых бифидобактерий в одной дозе препарата, активность кислотообразования, остаточная влажность, рН, герметичность.

3.5. Технология производства пробиотиков на основе бактерий рода Bacillus.

Во всём мире продолжается работа по созданию новых пробиотиков. Важным арсеналом разработки и совершенствования биопрепаратов являются бактерии рода Bacillus. Свойства некоторых штаммов этой группы бактерий настолько разносторонни, что только за последние годы на их основе разработано более десятка эффективных препаратов (табл. 2).

Важнейшими свойствами некоторых штаммов бацилл являются: антагонистическая активность ко многим патогенным и условно патогенным микроорганизмам; высокая ферментативная активность, позволяющая существенно регулировать и стимулировать пищеварения: противоаллергенное и антитоксическое действие и ряд других.

Таблица 2. Пробиотики на основе бактерий рода Bacillus

Именно такими свойствами обладает медицинский препарат Биоспорин [Приложение А].

Биоспорин применяется для коррекции нарушений микрофлоры кишечника человека. Вызванной нерациональным применением антибиотиков, нарушением питания, перенесёнными инфекционными заболеваниями, для профилактики и лечения острых кишечных инфекций. Однако установлено, что спектр показаний для применения пробиотиков в клинической практике может быть существенно расширен. Так, выявлены их позитивные эффекты при лечении ревматоидного артрита, некоторых инфекций мочеполовых путей, гнойно-воспалительных осложнений в хирургической практике, гине-кологических заболеваниях инфекционной природы и многих других.

Биод-5 - новый пробиотик ветеринарного назначения, разработанный сотрудниками кафедры биотехнологии МГАВМиБ имени Скрябина, включает два штамма бацилл - B. Subtillus ТПИ 13 и B. Licheniformis ТПИ 11.

Препарат предназначен для лечения животных, больных острыми кишечными инфекциями, вызванных сальмонеллами, шигеллами, стафилококками и другими патогенными микроорганизмами, для восстановления нормальной микрофлоры кишечника.

Технология предусматривает раздельное культивирование B. Subtillus ТПИ 13 и B. Licheniformis ТПИ 11 и смешивание их после стадии концентрирования в соотношении 3:1 (рис. 2).

Одним из перспективных направлений разработки новых биопрепаратов является создание пробиотиков на основе микроорганизмов с заданными свойствами, полученными методами генной инженерии. Первый такой пробиотик медицинского назначения Субалин, наряду с высокой антибактериальной активностью в отношении широкого спектра патогенных микроорганизмов, характеризуется антивирусными свойствами. Этот препарат разработан в Институте микробиологии и вирусологии им. Д. К. Заболотного НАН Украины совместно с НПО «Вектор» (Россия) и в настоящее время проходит с успехом клинические испытания.

Рис. 2. Схема технологического процесса производства Биод-5

Создание пробиотиков и их широкое применение являются сегодня стратегическим направлением в борьбе со многими инфекционными заболеваниями человека и животных [8].

4. Унификация технологии пробиотиков: достижения и перспективы

Востребованность медицинских пробиотических препаратов на фармацевтическом рынке обусловлена широким распространением дисбиотических состояний среди взрослого и детского населения [1]. Повышение эффективности отечественного производства пробиотиков является актуальной задачей, решению которой способствует развитие элементов технологической унификации. Основные стадии получения препаратов, связанные с накоплением бактериальной биомассы и её стабилизацией, в последние годы являются объектами интенсивных исследований. Разработка и практическое применение единообразных питательных сред для культивирования бактерий производственных штаммов и защитных сред для лиофилизации препаратов отражают современный уровень унификации технологии пробиотиков.

Микробиологическая практика свидетельствует, что эффективные среды для культивирования бактерий производственных штаммов могут быть изготовлены с применением питательных основ из достаточно широкого круга взаимозаменяемых субстратов животного, растительного или иного происхождения [3]. Питательную основу, содержащую необходимые нутриенты для метабиоза разных микроорганизмов, можно использовать в качестве универсального базового компонента при конструировании бактериологических сред различного назначения. При этом появляется возможность разработки унифицированных комплексов питательных сред для производственного применения. Питательная среда в данном случае, как структурная единица унифицированного комплекса, должна состоять из 2 частей: постоянной (универсальной), включающей базовый субстрат, а также переменной (специфичной), зависящей от потребностей конкретного производственного штамма бактерий. Приготовление такой среды может включать раздельную подготовку обеих частей, а их сведение можно осуществлять непосредственно перед или в ходе культивирования микроорганизмов [4].

Алгоритм конструирования унифицированных комплексов питательных сред для массового производства пробиотиков включает несколько необходимых этапов:

? предварительный выбор питательных субстратов с учётом критериев биологической ценности, доступности и экономичности;

? получение питательных основ и оценка их эффективности на модели регламентированных питательных сред;

? разработка и оценка способов получения питательных основ с учётом критериев технологичности и трудоёмкости;

? балансировка состава питательных сред.

Примером такого подхода в практике получения пробиотиков являются казеиново-дрожжевые среды. Это связано с тем, что они в значительной степени отвечают требованиям массового производства по совокупности биологических, технологических и экономических параметров.

Повышение эффективности использования сублимационной техники при традиционном выпуске пробиотиков в виде сухой биомассы во флаконах и ампулах предполагает применение защитных сред, позволяющих при сохранении жизнеспособности клеток обеспечить необходимую структуру (внешний вид) сухого препарата в условиях непродолжительного и интенсивного режима высушивания. Практика разработки защитных сред свидетельствует, что для минимизации гибели клеток и отходов продукции по физическим свойствам состав ксеропротектора для каждого вида бактерий должен включать сбалансированный качественно и количественно набор компонентов. При этом существенное значение имеет количество клеток в бактериальной суспензии, её эвтектические параметры, а также характер температурного воздействия при замораживании и обезвоживании [2].

Унификация защитных сред, применяемых в производстве пробиотиков, предполагает ограничение количества используемых компонентов, необходимых в составе ксеропротекторов для «жёстких» режимов сублимации. При таких режимах высушивания негативный биологический и структуродеформирующий эффект нивелируется, как правило, увеличением концентрации ксеропротектора в бактериальной суспензии. При этом добиться улучшения структуры сухой биомассы значительно сложнее, чем получить необходимое количество живых клеток в сухом препарате.

Решить указанные проблемы удалось при использовании сахарозо-желатино-молочных защитных сред, применяемых в настоящее время в производстве большинства пробиотических препаратов.

Перспективы дальнейшей унификации технологии пробиотиков связана с разработкой универсальных режимов лиофилизации препаратов, с использванием единых методических приёмов контроля препаратов. Всё это будет способствовать повышению конкурентоспособности отечественных пробиотических препаратов [2].

Заключение

Множество исследований в последнее десятилетие посвящено улучшению микроэкологии кишечника новорожденных, так в Японии, пребиотики добавляются к формулам раннего вскармливания вот уже более 20 лет и только недавно стали официально вводиться в Европе [5].Однако существует потенциальный риск отдаленных последствий использования ранних формул по вскармливанию. Пролонгированное введение про- и пребиотиков недоношенным, может порождать повышение специфических IgA и антител IgM против них [6].

Таким образом, положительным следует считать тот факт, что в последнее время проблема дисбиоза начала рассматриваться клиницистами с позиций, принятых в международной медицинской практике.

Важным фактом становится и то, что пересматриваются и научно обосновываются пути нормализации микрофлоры кишечника, где на первое место выходят про- и пребиотики, а не биотерапевтические агенты, бактериофаги или антибиотики [7].

Прогнозируется, что в ХХI веке пробиотики заменят значительную часть традиционных фармакологических препаратов и займут достойное место в арсенале эффективных и безопасных средств укрепления здоровья населения планеты [11].

Список литературы

1. Бондаренко В.М. // Журн. микробиол. 2004. № 1. с. 84-92.

2. Долинов К.Е. Основы технологии сухих биопрепаратов. М.: Медицина, 1969. 230 с.

3. Нечисляев В.А. Дисс. …канд. мед. наук. Пермь, 1989. 147 с.

4. Нечисляев В.А. Дисс. …канд. мед. наук. Пермь, 2005. 277 с.

5. Ghisolfi J. Dietary fibre and prebiotics in infant formulas. Proc Nutr Soc. 2003; 62(1):183-5.

6. Международный классификатор заболеваний человека (МКБ-10). М., 1997.

7. Беюп Е.А, Куваева И.Б. Дисбактериозы кишечника и их клиническое значение. // Клин. мед. -1986. - Г П. - С.37-44.

8. Биотехнология: Учебник / И.В. Тихонов, Е.А. Рубан, Т.Н. Грязнева и др.; Под ред. Акад. РАСХН Е.С. Воронина. - Спб.: ГИОРД, 2005. с. 322-336.

9. Биотехнология: Учеб. пособие для студ. высш. учеб. заведений / Ю.О. Сазыкин, С.Н., Орехов, Чакалева; под ред. А.В. Катминского. - М.: Издательский центр «Академия», 2006. - с. 183-192.

10. Новейшие биопрепараты и их классификация. / Дебора Ткач, Издательство «Ридерз Дайджест», 2008 - с. 100-120.

11. Здоровье Украины. Журн. № 7, 2006.

Приложение А

Размещено на http://www.allbest.ru/

42

Размещено на http://www.allbest.ru/

Механизм лечебно-профилактического действия препарата Биоспорин

Приложение Б

Таблица 3. Пробиотеческие препараты, выпускаемые в странах-членах ЕС и используемые в них виды микроорганизмов

Размещено на Allbest.ru