Исследование влияния антибиотиков на стафилококковые инфекции

3 этап. Проводили исследование колоний бактерий, происходящих от одной бактериальной клетки и выросших на плотной питательной среде (колония и является чистой культурой возбудителя). Производили макроскопическое и микроскопическое исследование колоний. В проходящем свете изучали размер, края, прозрачность колоний, а в отраженном свете изучали цвет, поверхность, положение колоний, невооруженным глазом, с помощью лупы, под малым увеличением микроскопа. Изучали культуральные свойства.

4 этап. Идентифицировали в выделенной чистой культуре возбудителя Staphylococcus aureus.

5 этап. Определили чувствительность Staphylococcus aureus к антибиотикам с помощью диско-диффузионного метода (ДДМ).

Методические указания по определению чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам разработаны:

- Центральным научно-исследовательским институтом эпидемиологи (Н.А.Семина, С.В.Сидоренко);

- Государственным научным центром по антибиотикам (С.П.Резван, С.Л.Грудинина);

- Научно-исследовательским институтом антимикробной химиотерапии Смоленской государственной медицинской академии (Л.С.Страчунский, О.У.Стецюк, Р.С.Козлов, М.В.Эйдельштейн);

- Кафедрой микробиологии и химиотерапии Российской медицинской академии последипломного образования (Е.А.Ведьмина, Л.Г.Столярова, И.В.Власова).

Принцип метода

ДДМ определения чувствительности основан на способности АБП диффундировать из пропитанных ими бумажных дисков в питательную среду, угнетая рост микроорганизмов, посеянных на поверхности агара.

6 этап. Подготовили питательную среду

Для определения чувствительности ДДМ использовали сухую агаризованную питательную среду, растворяли и автоклавировали в соответствии с инструкцией изготовителя. После автоклавирования колбы с питательной средой помещали на водяную баню при t 48-50C, где выдерживали до достижения указанной температуры, после чего в них асептически вносили рабочие растворы антибиотиков (1 часть рабочего раствора АБП на 9 частей расплавленного агара) и, при необходимости, термолабильные питательные добавки. Затем среду тщательно перемешали и разлили по чашкам Петри, толщина слоя питательной среды была 3-4 мм.

Приготовляли чашки Петри с плотной питательной средой связано с некоторыми особенностями. Плотную питательную среду готовили в соответствии с инструкцией изготовителя. Важным моментом при определении чувствительности ДДМ являлась толщина слоя агара в чашке. Она составляла (4,0 +/- 0,5) мм, что достигалось внесением в чашку Петри диаметром 90 мм строго 20 мл агара, диаметром 100 мм - 25 мл агара, а диаметром 150 мм - 60 мл агара. Перед заполнением расплавленной средой чашки Петри устанавливали на строго горизонтальную поверхность (выверенную по уровню, без впадин и выпуклостей). Соблюдение указанных предосторожностей было связано с тем, что размер и форма зоны ингибиции роста зависят от глубины и равномерности агарового слоя.

После заполнения чашки оставляли при комнатной температуре для застывания. Хранили чашки запаянными в полиэтиленовые пакеты при t 4-8 C в течение 7-10 суток. При использовании свежеприготовленных чашек или чашек после хранения в холодильнике их подсушивали перед инокуляцией, что достигалось инкубацией при t 35 C с приоткрытой крышкой в течение 10-

20 мин. Перед инокуляцией проконтролировали отсутствие конденсата жидкости на внутренней поверхности крышек.

7 этап. Диски с антибиотиками (BD Sensi-Disc)

Рис.3 Диски антибиотиками.

Для определения чувствительности ДДМ использовали только стандартизированные качественные диски. Изготовление дисков с АБП, необходимых для определения чувствительности диско-диффузионным методом, в лабораторных условиях нецелесообразно. Это связано с жесткими требованиями к исходным материалам (субстанциям АБП, картону) и со значительной трудоемкостью методов контроля качества дисков.

Для получения правильных результатов определения чувствительности ДДМ строго соблюдали правила хранения и использования коммерческих дисков, в противном случае содержание в них антибиотиков могло снизиться ниже допустимого уровня (прежде всего в результате увлажнения) еще до истечения срока годности.

Долговременное хранение дисков с АБП осуществляли в герметичной упаковке в морозильной камере при температуре t -18 C и ниже. Небольшие партии дисков, используемые при повседневной работе, хранили в холодильнике при температуре t 4-8 C, плотно закупоренными так, чтобы гарантировать невозможность попадания во флакон влаги, кроме того для дополнительной защиты от влаги во флаконах (картриджах) с дисками содержится специальный влагопоглотитель (силикагель).

Флаконы (картриджи) с дисками извлекали из холодильника за 1 ч до начала работы и выдерживали герметично закрытыми до достижения ими комнатной температуры, что предотвращает образование конденсата на дисках после открывания флаконов.

8 этап. Приготовление бактериальной суспензии и инокуляция При определении чувствительности ДДМ использовали стандартный инокулюм, соответствующий по плотности 0,5 по стандарту Мак-Фарланда и содержащий примерно 1,5 x 10 КОЕ/мл. Инокулюм использовали в течение

15 мин. после приготовления. Для инокуляции приготовленных чашек с агаром использовали наиболее удобный способ с использованием стерильных ватных тампонов. Тампон погружали в стандартную суспензию микроорганизма, затем избыток инокулюма удаляли, отжав тампон о стенки пробирки. Инокуляцию проводили штриховыми движениями в трех направлениях, поворачивая чашку Петри на 60 град.

9 этап. Аппликация дисков и инкубация

Не позднее чем через 15 мин. после инокуляции на поверхность питательной среды наносили диски с АБП. Аппликацию дисков проводили с помощью стерильного пинцета. Расстояние от диска до края чашки и между дисками было 15-20 мм. Таким образом, на одну чашку диаметром 100 мм сл помещали не более 6 дисков с АБП. Диски равномерно контактировали с поверхностью агара, для чего их аккуратно прижали пинцетом.

Непосредственно после аппликации дисков чашки Петри помещали в термостат кверху дном и инкубировали при температуре t 35 C в течение 18-24 ч.

10 этап. Учет результатов

После окончания инкубации чашки помещали кверху дном на темную матовую поверхность так, чтобы свет падал на них под углом в 45градусов (учет в отраженном свете). Диаметр зон задержки роста измеряли с точностью до 1 мм, предпочтительнее пользоваться штангенциркулем или кронциркулем.

При измерении зон задержки роста ориентировались на зону полного подавления видимого роста. Не обращали внимания на очень мелкие колонии, выявляемые в пределах зоны задержки роста только при особых условиях освещения или увеличении, и едва заметный налет у края зоны. Так же использовали Полуавтоматическую систему для учета и интерпретации результатов определения чувствительности бактерий к АМП диско-диффузионным методом: Osiris.

Рис 4. Полуавтоматическая система для учета и интерпретации результатов определения чувствительности бактерий к АМП диско- диффузионным методом: Osiris.

Рис.5 Чашка в системе для интерпретации результатов.

Достоинства: Автоматизация, высокая точность, стандартизация и производительность анализа. Встроенная система контроля качества.

Экспертная система интерпретации результатов согласно критериям CLSI (USA).Выявление различных фенотипов резистентности. Единая база данных. Возможность анализа результатов.

Рис.6 Определение чувствительности микроорганизмов диско- диффузионным методом.

Критерии интерпретации чувствительности бактерий

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследование проводилось на базе отделения реанимации и интенсивной терапии Научно-исследовательского института трансплантологии и искусственных органов Минздрава РФ на пациентах после операций по трансплантации жизненно важных органов, а также оперативных вмешательств кардиохирургического профиля для выявления факторов риска развития воспалительных и инфекционных осложнений.

Фармако-эпидемиологические исследования проводили с целью разработки рационального использования антибиотиков и подбора индивидуальных схем антибиотикопрофилактики и антибиотикотерапии.

В исследовании участвовали 10 пациентов отделения реанимации и интенсивной терапии, из них 6 женщин и 4 мужчин в возрасте 48-69 лет после операций.

В норме патогенные микроорганизмы в крови отсутствуют. Стойкая бактериемия - достоверный признак серьёзного инфекционного заболевания. К наиболее часто высеваемым патогенным микроорганизмам относится золотистый стафилококк.

Существуют два подхода к интерпретации результатов определения чувствительности: микробиологический и клинический. Микробиологическая интерпретация основана на анализе распределения значений концентраций антибиотика, подавляющих жизнеспособность бактерий. Клиническая интерпретация основана на оценке эффективности антибактериальной терапии.

Чувствительные микроорганизмы (susceptible)

Клинически к чувствительным относят бактерии (с учетом параметров, полученных in vitro), если при лечении стандартными дозами антибиотика инфекций, вызываемых этими микроорганизмами, наблюдают хороший терапевтический эффект.

При отсутствии достоверной клинической информации подразделение на категории чувствительности базируется на совместном учете данных, полученных in vitro, и фармакокинетики, т.е. на концентрациях антибиотика, достижимых в месте инфекции (или в сыворотке крови).

Резистентные микроорганизмы (resistant)

К резистентным (устойчивым) относят бактерии, когда при лечении инфекции, вызванной этими микроорганизмами, нет эффекта от терапии даже при использовании максимальных доз антибиотика. Такие микроорганизмы имеют механизмы резистентности.

Микроорганизмы c промежуточной резистентностью (intermediate) Клинически промежуточную резистентность у бактерий подразумевают в случае, если инфекция, вызванные такими штаммами, может иметь различный терапевтический исход. Однако лечение может быть успешным, если антибиотик используется в дозировке, превышающей стандартную, или инфекция локализуется в месте, где антибактериальный препарат накапливается в высоких концентрациях.

С микробиологической точки зрения к бактериям с промежуточной резистентностью относят субпопуляцию, находящуюся в зоне между чувствительными и резистентными микроорганизмами. Иногда штаммы с промежуточной резистентностью и резистентные бактерии объединяют в одну категорию резистентных микроорганизмов.

Анализ результатов изучения наличие чувствительности стафилококка к антибиотикам в крови

Результаты исследования крови пациентов на наличие роста микроорганизмов представлены в таблице 1.

Таблица 1 Результаты исследования на наличие роста микроорганизмов в исследуемом материале (крови)

По результатам исследования выявили рост микроорганизмов у 4-х пациентов из 10-ти. Т.к. в норме микроорганизмы в крови отсутствуют, то мы можем говорить ,о наличие инфекции у 4-х пациентов.

Таблица 2

Таблица результатов выделения чистой культуры.

У 3-х пациентов из 4-х обнаружен золотистый стафилококк. Что говорит о распространенности данной инфекции.

Высок риск инфицирования стафилококком при использовании внутривенных катетеров и других медицинских устройств, контактирующих с внутренней средой организма. Фактором риска также является искусственная вентиляция легких. А исследуемые пациенты и относятся к этой группе, т.к. выше перечисленные манипуляции происходили с ними до, во время и после операций.

Таблица 3

Изучение наличия чувствительности стафилококка к антибиотикам в крови

ВЫВОДЫ

1) Поистине огромен перечень антибиотиков и он постоянно увеличивается за счет новых препаратов. Антибиотики обладают мощным действием на многие микробы, но, конечно, не на все. Антибиотиков универсального действия пока нет. Ученые стремятся к получению антибиотиков так называемого широкого спектра действия. Это значит, что такие антибиотики должны действовать на большое количество различных микробов, и такие антибиотики созданы. К их числу относятся стрептомицин, тетрациклин, хлорамфеникол и др. Но именно потому, что они вызывают гибель массы разнообразных микробов (но не всех), оставшиеся становятся агрессивными и могут причинить вред. В то же время за ними большое будущее.

2) Изучить сущность и основные характеристики стафилококковых инфекций и пути их блокады; Всегда надо разграничивать такие понятия, как стафилококк и стафилококковая инфекция. Обнаружение стафилококка при отсутствии реальных симптомов болезни - вовсе не повод к незамедлительному спасению и глотанию лекарств. Прошло чуть более полувека, и сейчас о таких стафилококках можно только мечтать. Фармакологи синтезируют все новые и новые антимикробные средства, а микробиологи, с не меньшей частотой, обнаруживают стафилококки, к этим средствам не чувствительные. Главная причина этого явления не только сам стафилококк, но и неоправданно широкое применение антибиотиков в ситуациях, когда без этого вполне можно обойтись. Ведь некоторые стафилококковые болезни в лечении антибиотиками не нуждаются - например, пищевые отравления, когда надо лечить не сам микроб, а то что он вырабатывает - токсины.

3) До открытия антибиотиков смертность от стафилококковых инфекций достигала 90%. Антибиотики позволили значительно снизить смертность, но не стали радикальным решением проблемы.

На сегодняшний день не существует методов, которые позволили бы с абсолютной достоверностью прогнозировать клинический эффект антибиотиков при лечении инфекционных болезней. Однако, данные результатов определения чувствительности могут служить хорошим ориентиром клиницистам для выбора и коррекции антибактериальной терапии.

4) Лечение стафилококковых болезней - задача сложная, путь к ее решению долог и дорог, но вполне реален. Золотистый стафилококк, устойчивый ко всем антибактериальным средствам, - явление очень редкое. Бактериологические методы позволяют обнаружить его и определить его чувствительность к лекарствам, после чего провести курс эффективной терапии. Гнойные очаги в соответствующих органах устраняются оперативными вмешательствами, антибактериальными препаратами, используются также антистафилококковые плазма и иммуноглобулины, посредством которых в организм вводятся уже готовые антитела.

СНОСКИ

1 Руководство по инфекционным болезням/ Под ред. Ю. В. Лобзина. СПб.: Фолиант, 2003. с. 32.

2 Гавришева Н. А., Антонова Т. В. Инфекционный процесс: Клинические и патофизиологические аспекты: учеб. пособие. - СПб.: Эл-би, 2006. с. 41.

3 Основы микробиологии, вирусологии, иммунологии. Под редакцией А.А. Воробьева и др. М.: Академия, 2009. с. 26.

4 Руководство по инфекционным болезням/ Под ред. Ю. В. Лобзина. СПб.: Фолиант, 2003. с. 35.

5 Основы микробиологии, вирусологии, иммунологии. Под редакцией А.А. Воробьева и др. М.: Академия, 2009. с. 28.

6, 7, 8 Основы микробиологии, вирусологии, иммунологии. Под редакцией А.А. Воробьева и др. М.: Академия, 2009. с. 31.

9 Шувалова Е. П. Инфекционные болезни: учебник. - 6 изд. - М.: Медицина, 2005. с. 108.

10 Шувалова Е. П. Инфекционные болезни: учебник. - 6 изд. - М.: Медицина, 2005. с. 109.

11 Там же, с. 110.

12, 13 Гавришева Н. А., Антонова Т. В. Инфекционный процесс: Клинические и патофизиологические аспекты: учеб. пособие. - СПб.: Эл-би, 2006. с. 49-51.

14 Прозоркина Н.В. Основы микробиологии, вирусологии, иммунологии. Ростов н/Д.: Феникс, 2010. с. 49.

15 qwe.in.ua

16 Степаненко П.П. Микробиология молока и молочных продуктов. М.: Лира, 2002. с. 81.

17 Руководство для средних медицинских работников /Под ред. Ю. П. Никитина, В. М. Чернышева. - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2007. с. 232.

18 Руководство для средних медицинских работников /Под ред. Ю. П. Никитина, В. М. Чернышева. - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2007. с. 233.

19 Руководство для средних медицинских работников /Под ред. Ю. П. Никитина, В. М. Чернышева. - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2007. с. 235.

20 Энциклопедия клинических лабораторных тестов под ред. Н.У. Тица. М.: Лабинформ. - 1997. с. 131.

21 Учайкин В. Ф., Нисевич Н. К, Шамшева О. В. Инфекционные болезни и вакцинопрофилактика у детей: учебник. - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2007. с. 81.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Билетова Н.В., Корнелаева Р.П., Кострикина Л.Г. и др. Санитарная микробиология. М.: Пищевая пром-сть, 1980. - 352 с.

2. Воробьев А.А. Медицинская и санитарная микробиология. М.: Академия, 2010. - 464 с.

3. Гигиенические требования к качеству и безопасности продовольственного сырья и пищевых продуктов. Санитарные правила и нормы (САНПиН 2.3.2.560-96). - М., 1997.

4. Гавришева Н. А., Антонова Т. В. Инфекционный процесс: Клинические и патофизиологические аспекты: учеб. пособие. - СПб.: Эл-би, 2006. - 282 с.

5. Загаевский И.С. Жмурко Т.В. «Ветеринарно-санитарная экспертиза с основами технологии переработки продуктов животноводства». М.: Колос. 1983.

6. Инфекционные болезни и эпидемиология: учебник /В. И. Покровский, С. Г. Пак, Н. И., Брико, Б. К. Данилкин. - 2-е изд. - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2007.

- 816 с.

7. Кишкун А. А. Клиническая лабораторная диагностика: учеб. пособие для медицинских сестер. - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2008. - 720 с.

8. Корнелаева Р.П., Степаненко П.П., Павлова Е.В. Санитарная микробиология сырья и продуктов животного происхождения. М.: 2006.- 407 с.

9. Королева Н.С., Семенихина В.Ф. Санитарная микробиология молока и молочных продуктов. - М.: Пищевая промышленность, 1980. - 256 с.

10 .Макаров В.А. и др. «Ветеринарно-санитарная экспертиза с основами технологии и стандартизации продуктов животноводства». М.: Агропромиздат. 1991.

11 .Мухина С. А., Тарновская И. И. Теоретические основы сестринского дела: учебник для медицинских училищ и колледжей. - 2-е изд. - М.: ГЭОТАР- Медиа, 2008. - 368 с.

12 .Осипова В. Л. Внутрибольничная инфекция: учебное пособие для медицинских училищ и колледжей. - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2009. - 256 с.

13 .Осипова В. Л. Дезинфекция: учеб. пособие для медицинских училищ и колледжей. - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2009. - 136 с.

14 .Основы микробиологии, вирусологии, иммунологии. Под редакцией А.А. Воробьева и др. М.: Академия, 2009. - 288 с.

15 .Паразитарные болезни человека / Под ред. С. С. Сергиева, Ю. В. Лобзина.

- СПб.: Фолиант, 2006. -- 592 с.

16 .Прозоркина Н.В. Основы микробиологии, вирусологии, иммунологии.

Ростов н/Д.: Феникс, 2010. - 378 с.

17 .Руководство для средних медицинских работников /Под ред. Ю. П. Никитина, В. М. Чернышева. - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2007. - 992 с.

18 .Руководство по инфекционным болезням/ Под ред. Ю. В. Лобзина. -- СПб.: Фолиант, 2003. - 1040 с.

19 .Учайкин В. Ф., Нисевич Н. К, Шамшева О. В. Инфекционные болезни и вакцинопрофилактика у детей: учебник. - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2007. - 688 с.

20 .Сестринское дело при инфекционных болезнях с курсом ВИЧ-инфекции и эпидемиологии. М.: ГЭОТАР-Медиа, 2011. - 416 с.

21 .Степаненко П.П. Микробиология молока и молочных продуктов. М.: Лира, 2002. - 413 с.

22 .Сидоров М.А., Р.П. Корнелаева «Микробиология мяса и мясопродуктов» 3-е издание. Москва «Колос» 1998-134 с.

23 .Шувалова Е.П. Инфекционные болезни: учебник. - 6 изд. - М.: Медицина, 2005. - 696 с.

24 .Энциклопедия клинических лабораторных тестов под ред. Н.У. Тица. М.: Лабинформ. - 1997 - 942 с.

Размещено на Allbest.ru