Изучение вопросов биотехнологии в курсе химии средней школы

104

Изучение вопросов биотехнологии в курсе химии средней школы

Введение

Актуальность исследования: в настоящее время российское химическое образование претерпевает глубокие изменения. Возросла необходимость в новых методических разработках, отражающих современное состояние науки. Особого внимания заслуживает информация, касающаяся интеграционных тенденций между различными отраслями знания. Конкретизировать изложенные положения позволяет целый спектр тем, затрагивающих различные направления биологических наук. Одно из первых мест занимают новые направления биотехнологии, прежде всего генетическая инженерия, которая привела к «биотехнологическому буму», свидетелями которого мы являемся.

Таким образом, для ориентации человека в новой информационной и материально-технической среде обитания, формирования реалистического взгляда на окружающий мир необходима постановка новых задач обучения. Преодоление абстрактности и оторванности учебного материала от жизни, которые влекут к потере познавательного интереса, - приоритетная задача обучения. Наличие познавательного интереса является важным условием формирования высокого качества знаний.

Другой стороной абстрактности при изучении биологии является недооценка её роли в возникновении и решении глобальных продовольственных, сырьевых, экологических проблем настоящего и будущего. Кому как не биотехнологии, вышедшей из недр химии и биологии, заниматься этими проблемами. Сегодня нам ясно, что открытия биохимии глубоко скажутся на судьбе человечества.

Учитывая разобщенность и поверхностность вопросов биотехнологии почти во всех предложенных программах (см. главу 2) целью работы является разработка элективного курса по теме «основы биотехнологии» а также комплекса фрагментов включения данного материала в общепринятые биологические программы.

Объект исследования: место и процесс применения изучаемой темы в структуре биологического образования.

Предметом исследования является разработка методических рекомендаций к изучению темы «основы биотехнологии».

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. Проанализировать методическую литературу, обосновать актуальность темы.

2. Проанализировать литературу, дающую обзор основных вопросов биотехнологии.

3. Подобрать материал к проведению уроков по данной теме и разработать методические рекомендации по его использованию.

4. Подобрать лабораторные работы, которые следует включить в изучение данной темы.

5. Провести педагогический эксперимент.

Поставленные задачи решались с использованием методов, соответствующих объекту и предмету исследования

Теоретические

· Анализ литературы по теме, систематизация теоретического материала

· Теоретико-методический анализ проблемы

Эмпирические

· Общепедагогические: наблюдение и самонаблюдение, беседа

· Химические: лабораторный эксперимент

Также была выдвинута гипотеза: при включении материала биотехнологического уклона в учебный процесс предполагаем повышение познавательного интереса и мотивации к обучению у учащихся.

1. Основы биотехнологии (литературный обзор)

1.1 Основы генетической инженерии

История развития генетической инженерии

Генетическая инженерия - раздел молекулярной генетики, исследующий возможности и способы создания лабораторным путем (in vitro) генетических структур и наследственно измененных организмов, т.е. создания искусственных генетических программ, с помощью которых направленно конструируются молекулярные генетические системы вне организма с последующим их введением в живой организм (А.А. Баев). Обычно употребляются два названия данного научного направления - генетическая инженерия и генная инженерия, являющиеся как бы синонимами[7]. Однако их смысловое содержание неодинаково: генетическую инженерию связывают с генетикой, а генная имеет отношение только к генам. Кроме того, генетическая инженерия точнее раскрывает содержание дисциплины - создание генетических программ, основная задача которых - создание in vitro молекул ДНК посредством соединения фрагментов ДНК, которые в естественных условиях чаще не сочетаются благодаря межвидовым барьерам (рекомбинантные ДНК). Молекула рекомбинантной ДНК представляет собой соединенные в бесклеточной системе два компонента: вектор (смотри ниже), обеспечивающий механизм репликации и экспрессии, и фрагмент клонируемой («чужеродной») ДНК, содержащий интересующие исследователя генетические элементы. Согласно определению национальных институтов здоровья США, «рекомбинантными ДНК называют молекулы ДНК, полученные вне живой клетки путем соединения природных или синтетических фрагментов ДНК с молекулами, способными реплицироваться в клетке». Первая рекомбинантная ДНК получена в 1972 г. (П. Бергом с сотр.) и была составлена из фрагмента ДНК обезьяньего вируса ОВ40 и бактериофага ? dvgal с галактозным опероном E. coli. Формально 1972 г. следует считать датой рождения генетической инженерии.

Генетическая инженерия имеет яркую историю благодаря тому общественному резонансу, который она вызвала с самых первых своих шагов. Начало этим событиям положило послание участников Гордоновской конференции (1973) президиуму АН США, в котором говорилось о возможной опасности технологий рекомбинантных ДНК для здоровья человека. Возможные блага генетической инженерии признавались с самого начала, но разногласия по данной проблеме не затихли и сейчас. В таблице 1 перечислены основные этапы становления и развития генетической инженерии.

Таблица 1. Основные этапы развития генетической инженерии

Год	Автор	Содержание открытия
1869	Ф. Мишер	Выделена ДНК из ядер клеток гноя
1880	А. Коссель[5]	Выделение азотистых оснований
1928	Гриффитс[3]	Явление бактериальной трансформации
1929	П. Левин, Е. Лондон	Выделение 2-D-дезоксирибозы
1930	Эвери, Мак-Карти и Мак-Леод	Выделение вещества гена
1938	Беренс	Локализация н.к.
1940	Браун и Тодд	Принципы химического строения полинуклеотидной цепи.
1950	Э. Чаргафф	Закономерности нуклеотидных отношений
1953	Д. Уотсон, Ф. Крик	Сконструирована модель двойной спирали ДНК на основании результатов рентгеноструктурного анализа ДНК
1956	Волкин, Астрахан и Херши	Открытие и-РНК
1957	А. Корнберг	Синтез ДНК in vitro
1961	А. Мармур и П. Доти	Открыто явление ренатурации ДНК и установлены точность и специфичность реакции гибридизации нуклеиновых кислот
1962	В. Арбер	Впервые получены сведения о ферментах рестрикции ДНК
1968	М. Мезельсон и Е. Юань	Выделена первая рестриктаза
1966	М. Ниренберг, С. Очоа, Г. Корана	Расшифрован генетический код
1967	М. Геллерт	Открыта ДНК-лигаза
1970	Г. Тёмин, С. Мизутани	Открыта ревертаза
1972-1973	Г. Бойер, С. Коэн, П. Берг	Разработана технология клонирования ДНК
1975-1977	Ф. Сэнгер, Р. Баррел, А. Максам, В. Гилберт	Разработаны методы быстрого определения нуклеотидной последовательности
1979	Г. Корана	Синтезирован ген тирзиновой супрессорной РНК
1981-1982	Р. Пальмитер, Р. Бринстер, А. Спрэдлинг, Г. Рубин	Получена трансгенная мышь. Получены трансгенные экземпляры дрозофилы
1993	Л.К. Эрнст, Г. Брем, И.В. Прокофьев	Получены трансгенные овцы с геном химозина

Биотехнология рекомбинантных ДНК

Технология рекомбинантных ДНК включает набор, как новых методов, так и заимствованных из других дисциплин, в частности из генетики микроорганизмов. Эти методы существенно расширяют возможности генетических исследований. К наиболее важным методам биотехнологии рекомбинантных ДНК следует отнести следующие:

1. Специфическое расщепление ДНК рестрикцирующими нуклеазами, что в значительной степени ускоряет выделение различных генов и манипуляции с ними.

2. Быстрое секвенирование всех нуклеотидов в очищенном фрагменте ДНК, позволяющее определить точные границы гена и кодируемую им аминокислотную последовательность полипептида.

3. Гибридизация нуклеиновых кислот, позволяющая с большой точностью выявить специфические нуклеотидные последовательности на основе их способности связывать комплементарные основания.

4. Клонирование ДНК, суть которого сводится к введению ДНК-фрагмента в самореплицирующийся генетический аппарат (плазмиду или вирус), который используют для трансформации бактерий. Бактериальная клетка после трансформации способна воспроизводить этот фрагмент во многих миллионах идентичных копий.

5. Генетическая инженерия, позволяющая получать модифицированные версии генов (сайт-спецефический мутагенез и т.д.) и затем внедрять их в клетки или организмы.

Расщепление ДНК в специфических участках нуклеотидных последовательностей осуществляется особыми ферментами - рестрикцирующими нуклеазами, способными разрушить чужеродную ДНК. Каждый фермент, способный разрушить чужеродную ДНК, опознает в ней специфическую последовательность из 4-6 нуклеотидов (сайт узнавания). Соответствующие последовательности в геноме бактерий замаскированы метилированием остатков с помощью метилаз.

Для успешного решения задач генетической инженерии очень важно быстро секвенировать (определять последовательность нуклеотидов) любых очищенных фрагментов ДНК[8]. В середине 70-х г. в этой области произошел решительный перелом, связанный с открытием рестриктаз и усовершенствованием метода гель-электрофореза, когда стало возможным разделять достаточно протяженные фрагменты ДНК, отличающиеся размером всего на один нуклеотид. С помощью рестриктаз ДНК стали разрезать на определенные блоки и определять в них позиции нуклеотидов химическими (А. Максам и У. Гилберт 1976) или энзиматическими (Сангер и Коулсон 1975) методами.

Важнейший метод получения рекомбинантных ДНК основан на способности нуклеиновых кислот быстро восстанавливать свою структуру после нагревания до 100?С в сильно щелочной среде (рН 13) [9]. При нагревании до 100?С комплементарные пары оснований разрушаются, и ДНК диссоциирует на две раздельные цепи. Этот процесс назван денатурацией ДНК («плавлением»). Выдерживание комплементарных цепей при температуре 65?С приводит к их спариванию и восстановлению структуры двойной спирали (гибридизация, ренатурация, или «отжиг»).

Обмен генами, а также введение в клетку гена другого вида организма осуществляют посредством генетической рекомбинации in vitro.

Для эффективного введения (трансформации) необходимо иметь достаточное число копий нуклеотидных последовательностей.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) - это метод амплификации фрагментов нуклеиновых кислот in vitro, с помощью которого можно достаточно быстро (в течение нескольких часов) получить миллионы копий определенных нуклеотидных последовательностей (генов) [9]. Метод был предложен в 1985 г. К. Мюллисом (биотехнологическая корпорация «Cetus», США) и получил широкое распространение в 1988 г., когда Р. Сайки с соавт. была опубликована основополагающая работа по теории ПЦР и её оптимизации. Метод ПЦР, названный «изобретением века» и очень скоро, в 1993 г., отмеченный Нобелевской премией, ускорил реализацию программы «Геном человека», а также способствовал внедрению в практику клинической диагностики многих заболеваний высокоэффективных диагностических наборов нового поколения.

В методе ПЦР для амплификации фрагментов ДНК используют термоустойчивую ДНК-полимеразу из термофильной бактерии Thermus aquaticus (Taq-полимеразу), которая в присутствии всех 4 видов дезоксирибонуклеозидтрифосфатов и коротких 20-30-членных затравок (праймеров) осуществляет синтез комплементарных последовательностей ДНК. ПЦР имеет циклический, включающих нагревание и охлаждение проб, и цепной характер, так как синтезированные фрагменты ДНК в дальнейшем сами служат матрицей, на которой идет синтез. Повторяя циклы амплификации 30-40 раз, за 1,5 - 3 ч получают миллионы копий фрагментов ДНК.

Лигазная цепная реакция проводится по принципу, аналогичному ПЦР, но вместо Taq-полимеразы и dNTP используется термостабильная ДНК-лигаза и 4 специфических олигонуклеотида, добавляемых в реакционную смесь в избытке. Каждые 2 олигонуклеотида комплементарны к амплифицируемому фрагменту ДНК-матрицы и непосредственно примыкают друг к другу; одновременно они комплементарны и другой паре олигонуклеотидов.

NASBA-метод (Nucleic Acid Sequence - Base Amplification), разработанный в последние годы, является наиболее универсальным методом амплификации как ДНК, так и РНК. Этот метод, в отличие от ПЦР, является изотермальным и осуществляется при 41?С. Основными компонентами NASBA-системы являются РНК-полимераза фага Т7, РНКаза Н (гидролизует РНК в составе гибрида РНК:ДНК, но не атакует свободную ДНК) и обратная транскриптаза вируса птичьего миелобластоза. В систему входят также нуклеозидтрифосфаты и два специфических праймера, один из которых содержит участок, представляющий собой последовательность (промотор), распознаваемую РНК-полимеразой.

Один из важных этапов конструирования молекулы ДНК - лигирование (или сшивание) генов с помощью фермента ДНК - лигазы. Сшивание фрагментов ДНК, содержащих нужные гены, осуществляют двумя основными методами: а) по «липким» концам; б) с помощью искусственно достроенных «липких» концов.

Сшивание генов (фрагментов) (рис. 1) ДНК по «липким» концам, т.е. взаимнокомплементарным участкам, длиной из 4-6 пар нуклеотидов, достаточно легко осуществляется ферментом ДНК-лигазой с образованием ковалентной фосфодиэфирной связи между соседними нуклеотидами:

- - А Т Г Ц А А Т Т Ц А Г Т Ц - - - - - -

Т А Ц Г Т Т А А Г Т Ц А Г - - - - - -

Сшивание ДНК-лигаза

А Т Г Ц А А Т Т - Ц А Г Т Ц

Т А Ц Г - Т Т А А - Г Т Ц А Г

Рис. 1. Сшивание генов

При отсутствии комплементарных «липких» концов у сшиваемых фрагментов их достраивают, т.е. синтезируют искусственно ферментативным путем (коннекторный метод получения гибридных молекул ДНК), используя концевую (терминальную) дезоксинуклеотидилтрансферазу из тимуса теленка или поли(А) - полимеразу E.coli.

Также, для стыковки фрагментов применяют так называемые линкеры (рис. 2) (или «переходники») - короткие участки ДНК, имеющие разные «липкие» концы:

- А Т Г Ц А А Т Т Ц Т Г А Г А Т Ц Ц А Т А Ц Г

Т А Ц Г Т Т А А Г А Ц Т Ц Т А Г Г Т А Т Г Ц

Фрагмент 1 Линкер Фрагмент 2

Рис. 2. Объединение фрагментов линкерами

Линкерные фрагменты не только обеспечивают объединение генов, но и обусловливают их экспрессию, в связи с чем, часто в середину линкера помещают какой-либо регуляторный генетический элемент, например промотор, или участок связывания с рибосомой.

После того как рекомбинантная ДНК сшита, ее вводят в живые клетки. При этом рекомбинантные ДНК становятся составной частью генетического аппарата реципиентного организма и, кроме того, они привносят в него новые генетические и физиолого-биохимические свойства, полезные для человека. Но поскольку она не способна к самовоспроизведению, её разрушают внутриклеточные нуклеазы. Для того чтобы рекомбинантная ДНК стала составной частью генетического аппарата клетки, она должна либо встроиться (интегрироваться) в её геном и реплицирваться за его счет, либо быть способной к автономной репликации. Принято молекулы ДНК, способные акцептировать чужеродную ДНК и автономно реплицироваться, называть векторными молекулами. К числу векторов относят плазмиды, бактериофаги, вирусы животных. Векторы должны обладать следующими особенностями:

1. Иметь субстратные участки для определенных эндонуклеаз рестрикции.

2. Иметь свойства репликона.

3. Содержать один или несколько маркерных генов, которые после проникновения вектора в клетку придают ей фенотип, свидетельствующий о присутствии вектора.

Таким образом, все векторы обеспечивают репликацию встроенных генов, их экспрессию, интеграцию в хромосому клетки и т.д. Чаще других в генетической инженерии в качестве векторов используют плазмиды. Плазмидами называют стабильно наследуемые бактериальные репликоны (внехромосомные элементы наследственности). Они представляют собой двуцепочечные кольцевые молекулы ДНК с вариабельными молекулярными массами. Они детерминируют разные свойства: резистентность к антибиотикам (R-плазмиды); биодеградацию (D-плазмиды) и др. Например, плазмиды стафилококков несут гены устойчивости к пенициллину, соединениям ртути и др. Количество плазмид в клетке может колебаться от одной до более ста.

Первый плазмидный вектор был получен С. Коэном (1973). Его источником была плазмида E. coli R_6-5 c Mr 65 кДа. Плазмида стала родоначальником серии векторов и других структур.

Плазмида pBR313 содержит уникальные участки расщеплений нескольких рестриктаз (рис. 3).



Рис. 3. Схема использования плазмиды pBR322 для отбора клеток, содержащих рекомбинантные плазмиды[14].

Возможности плазмид для генетической инженерии не беспредельны, что связано с их небольшими размерами. Когда нужно клонировать крупные фрагменты ДНК, удобнее использовать векторы на основе бактериофага ?. Геном фага ? досконально изучен[9]. В центральной части линейного генома фага содержится область, необязательная для литической инфекции, которую и используют для вставки клонируемой ДНК. ДНК фага ? разрезают с помощью рестриктазы Eco RI, удаляют необязательную центральную область и на её место встраивают нужный фрагмент ДНК, получая, таким образом, конкамер - предшественник для упаковки фаговой ДНК в зрелые фаговые частицы. Фаг ? очень пластичен: без нарушения развития фага из него можно убрать до 25% ДНК или пристроить до 6% лишней ДНК. В этот фаговый вектор можно встраивать до 23 000 н.п.

В тех случаях, когда не хватает возможностей фага, используют ещё более крупные векторы - космиды. В состав космид входят: ген (маркер) резистентности к антибиотикам, репликон плазмиды и фрагмент ДНК фага ? (так называемый cos-участок). Этот фрагмент представляет собой однонитевые комплементарные участки на концах фаговой ДНК, т.е. «липкие концы».

Ещё один вид векторов - фазмиды, искусственные гибриды между фагом и плазмидой. После встройки чужеродной ДНК они в одних условиях могут размножаться как фаги, а в других - как плазмиды.

Векторы на основе нитевидных фагов применяют тогда, когда удобнее работать с одной цепью ДНК. Так, фага М13 и fd содержат кольцевую одноцепопочечную ДНК с полностью изученными последовательностями нуклеотидов.

Дрожжи Saccharomyces cerevisiae представляют собой перспективные модели для экспериментов с рекомбинантными ДНК. Их гаплоидный геном содержит 1,4 х 10⁷ н.п. (в 3 раза больше, чем у E.coli), распределенных по 17 хромосомам. Дрожжи не инфицируются вирусами, но в их клетках выявлена плазмида, используемая в качестве вектора - 2 мкм-плазмидная ДНК. Важной особенностью дрожжевых систем является то обстоятельство, что клонируемые фрагменты ДНК способны к рекомбинации с гомологичными участками дрожжевого генома, что ведет к стабильной сайт-специфической трансформации последнего (независимо от сохранения или утраты вектора).

Векторные плазмиды и векторные вирусы со встроенными чужеродными генами часто называют гибридными (или химерными) плазмидами (или фагами). После конструирования рекомбинантных ДНК их с помощью трансформации вводят в реципиентный организм: бактериальную, грибную, растительную или животную клетку. Трансформация предусматривает предварительную обработку клеток соединениями(CaCl₂), обусловливающими проникновение ДНК внутрь клеток с последующим их помещением в среду, в которой способны существовать только клетки, получившие векторную молекулу, например в среду с определенным антибиотиком.

Процесс инфицирования клеток с помощью чужеродных ДНК, приводящий к образованию зрелого фагового потомства, назван трансфекцией.

Однако эффективность проникновения экзогенной ДНК в клетку довольно низка. Поэтому среди бактерий, подвергшихся трансформации, только небольшая часть оказывается трансформированной. Отделение её от общей массы возможно также в процессе клонирования. Для клонирования бактериальную суспензию определенной концентрации выливают на твердую питательную среду, например на агар с питательными добавками в чашке Петри из расчета 5-10 бактерий на 1 см² поверхности. Бактериальная клетка на поверхности агара начинает делиться с образованием в итоге маленькой колонии, похожей на шляпку гриба. Эта колония называется клоном, причем из каждой клетки образуется свой клон, все клетки которого имеют свойства бактерии-родоначальника.

Рекомбинантные клоны могут быть идентифицированы по синтезируемому ими продукту (иммунологический метод Брума-Джилберта) [4]. Но чаще приходится идентифицировать непосредственно нуклеотидную вставку с использованием методов гибридизации (Грюнштейн - Хогнесс) [18]. (рис. 4).



Рис. 4. Метод радиоавтографии в применении к поиску рекомбинантных клонов[14].

Из фрагментов вирусных и бактериальных хромосом уже выделен целый ряд генов. Что же касается выделения специфических генов из фрагментированных эукариотических хромосом, то реализация этой процедуры все еще остается сложной и трудоемкой задачей. Существует два основных подхода для получения специфических генов, подлежащих затем рекомбинации и клонированию. В одном из них, который получил название «шотган» (от англ. shotgun - дробовик), всю клеточную ДНК обрабатывают рестриктирующей эндонуклеазой, образующей в местах разрыва выступающие концы. Полученные фрагменты ДНК встраивают затем в плазмиды E.coli, «раскрытые» (т.е. переведенные в линейную форму) с помощью той же самой рестриктирующей эндонуклеазы. В результате образуется чрезвычайно сложная смесь, состоящая, вероятно, из тысяч разных рекомбинантных плазмид, среди которых лишь одна может содержать нужный ген. Для поиска плазмиды, несущей этот ген, разработаны специальные процедуры, которые называют скринингом.

Другой подход, используемый для получения нужных генов, состоит в конструировании на мРНК-матрице комплементарной по отношению к ней ДНК (кДНК) [11].Теперь специфическую мРНК, кодирующую белок, ген которого надо получить, можно использовать в качестве матрицы для ферментативного синтеза кДНК с помощью обратной транскриптазы (ревертазы). (рис. 5).

После расщепления гибрида ДНК-РНК, используя видоизменённую протеазами ДНК-полимеразу E.coli - фрагмент Клёнова, синтезируют двухцепочечную ДНК.

После расщепления «шпильки» остается синтетическая двуцепочечная кДНК, соответствующая белку, кодируемому интересующим нас геном. Заметим, однако, что если эту синтетическую кДНК получали с эукариотической мРНК, то она не идентична природному гену этого белка, поскольку не содержит ни интронов, т.е. вставочных последовательностей, ни стартовых и терминирующих сигналов, присущих генам большинства эукариотических белков. И для экспрессии такого гена в клетках прокариот необходимо, чтобы он находился под контролем прокариотических регуляторных элементов. В связи с этим для осуществления экспрессии соответствующая кДНК присоединяется к регуляторным элементам бактерии-промотору, оператору и рибосом-связывающему участку.

На современном этапе также возможен химико-ферментативный синтез полинуклеотидных последовательностей. Синтез гена впервые был осуществлён в 1970 году в лаборатории Х.Г. Кораны.



Рис. 5. Схема подготовки кДНК для клонирования[14].

Клонирование и экспрессия генов в различных организмах

В настоящее время разработаны системы клонирования в бактериях, дрожжах, грибах, растениях и млекопитающих. Особый интерес с экономической точки зрения представляют системы клонирования генов в грамположительных бактериях, многие из которых являются сверхпродуцентами важнейших химических соединений[7]. Значительных успехов в биоиндустрии удалось достичь с клетками Bacillus subtilis, стрептомиценами и Sacchromyces cerevisiae.

Векторы для клонирования в таких системах представляют собой двойные репликоны, способные существовать и в E.coli, и в той клетке хозяина, для которой они предназначены. С этой целью создают гибридные векторы, содержащие репликон какой-либо из плазмид E.coli и требуемый репликон (из бактерий, дрожжей и др.), и первоначально клонируют с последующим отбором требуемых генов в хорошо изученной системе. Затем выделенные рекомбинантные плазмиды вводят в новый организм.

Инсулин - гормон поджелудочной железы, регулирующий углеводный обмен и поддерживающий нормальный уровень сахара в крови. Недостаток этого гормона в организме приводит к одному из тяжелейших заболеваний - сахарному диабету.

Обычно поджелудочная железа крупного рогатого скота и свиней не используется в мясной и консервной промышленности и поставляется на фармацевтические предприятия, где проводят экстракцию гормона. Для получения 100 г. кристаллического инсулина необходимо 800-1000 кг исходного сырья. В 1978 г. появилось сообщение о получении штамма кишечной палочки, продуцирующего крысиный проинсулин (США). В этом же году были синтезированы отдельные цепи человеческого инсулина посредством экспрессии их синтетических генов в клетках E.coli (рис. 6).

Рис. 6. Экспрессия гена проинсулина человека в составе гибридного белка с ?-галактозидазой[14]

Был синтезирован и ген соматостатина - гормона гипоталамуса. Соматостатин подавляет выделение инсулина и гормона роста человека. В Национальном медицинском центре «Хоуп» (Калифорния) был осуществлен химико-ферментативный синтез гена длиной в 42 нуклеотида, способного кодировать соматостатин. Синтетический ген соматостатина был встроен в плазмиду pBR322 E.coli вблизи конца гена, кодирующего фермент ?-галактозидазу. Между двумя генами был помещен кодон метионина. После введения рекомбинантной плазмиды в бактериальную клетку кишечная палочка стала синтезировать гибридный белок. Часть его (соматостатин) затем отщепляли от ?-галактозидазы BrCN. Первый синтез соматостатина генно-инженерным способом был осуществлен в 1977 г. Бойером. Выход гормона составил 10 000 молекул на одну клетку. Из 100 г. биомассы E.coli, выращенной в ферментере объемом 8 л, удалось выделить 5 мг соматостатина, т.е. столько, сколько можно его выделить из 100 кг овечьих мозгов.

Соматотропин (или гормон роста человека ГРЧ) секретируется передней долей гипофиза. Его недостаток приводит к заболеванию - гипофизарной карликовости (1 случай на 5000 человек). Обычно его получают из гипофиза трупов, но в недостаточном количестве. Гормона хватает лишь для лечения 1/3 случаев гипофизарной карликовости в развитых странах. Препарат из трупного материала представляет собой смесь из нескольких форм. Это приводило к тому, что у 30% больных, получавших препарат, против гормона вырабатывались антитела, сводившие на нет его биологическую активность. Принимая во внимание это обстоятельство, в настоящее время ГРЧ синтезируют методами генетической инженерии в специально сконструированных клетках бактерий. Биосинтез ГРЧ был осуществлен в 1979 г. Д. Гедделем с сотрудниками. Конечный выход гормона составил 2,4 мкг на 1 мл культуры, что составляет 100 000 молекул гормона на клетку.

Проблема введения генов в клетки млекопитающих очень важна для исследования функционирования генов высших эукариот[7].

Предварительно клонированные гены вводят в клетку животных различными путями. Суть одного из них состоит в трансформации клеток требуемым геном, соединенным с одним из генов, для которых осуществляется селекция. Для идентификации и последующего размножения клеток, содержащих интегрированную ДНК, был разработан метод, получивший название метода маркера. Примером может служить метод получения клеток, дефектных по синтезу фермента тимидинкиназы (ТК^--клетки). Такие клетки трансформировались фрагментами ДНК вируса герпеса (HSV), содержащего ген фермента ТК, и после трансформации они приобретали способность к синтезу фермента на селективной среде, т.е. становились ТК⁺-клетками. Клетки ТК⁺ легко отличаются от клеток ТК^-, поскольку способны расти на средах с аминоптерином (ингибитор, блокирующий определенные стадии биосинтеза нуклеотидов). Следовательно, в данном случае для трансформации клеток животных были использованы гибриды бактериальных плазмид с геном ТК из вируса герпеса. Для этого предварительно проводили клонирование и идентификацию генов в клетках E.coli и затем полученная рекомбинантная плазмида вводилась в ТК-клетки.

Представляют немаловажный интерес микроинъекции ДНК непосредственно в ядро клетки. Её осуществляют с помощью специальной пипетки (внутренний диаметр её около 1 мкм), а количество инъецированного раствора ДНК составляет 1-2 пкл. Так, плазмиды, содержащие фрагмент вируса герпеса с геном тимидинкиназы, и плазмиды pBR322 были инъецированы в ТК-клетки, при этом ТК-ген проник в ядра и нормально в них реплицировался. Микроинъекцию клонированных генов проводят в один или оба пронуклеуса только что оплодотворенной яйцеклетки мыши. После инъекции яйцеклетку немедленно имплантируют в яйцевод приемной матери или дают возможность развиваться в культуре до стадии бластоцисты, после чего имплантируют в матку. Таким образом, были инъецированы гены интерферона и инсулина человека, ген глобина кролика, ген тимидинкиназного вируса герпеса и кДНК вируса лейкемии мышей. Несмотря на определенные успехи в области интеграции чужеродных генов в эмбриональные клетки животных, до сих пор не удалось встроить чужеродную ДНК в заданный участок хромосомы, вытеснить ген и заменить его новой нуклеотидной последовательность, подчинить новый ген системе регуляции организма.

Применение методов генетической инженерии в животноводстве открывает перспективу изменения ряда свойств организма: повышение продуктивности, резистентности к заболеваниям, увеличение скорости роста, улучшение качества продукции и др. Животных, несущих в своем геноме рекомбинантный (чужеродный) ген, принято называть трансгенными, а ген, интегрированный в геном реципиента, - трансгеном. Продукт этого гена (белок) является трансгенным. Благодаря переносу генов у трансгенных животных возникают новые качества, а дальнейшая селекция позволяет закрепить их в потомстве и создавать трансгенные линии.

Генетический анализ родившихся трансгенных животных и полученного от них потомства показал, что, несмотря на инъекцию ДНК на ранних стадиях, в трансгенных линиях могут появляться так называемые мозаики. К мозаикам относят животных, происходящих из одной зиготы, но имеющих разные генотипы. Подсчитано, что около 30% первичных трансгенных животных, полученных методом микроинъекции ДНК, - мозаики, что затрудняет создание чистых трансгенных линий животных.

Первые трансгенные мыши с ГР были получены в 1982 г. У них отмечалось повышение скорости роста и увеличение конечной живой массы. Однако у трансгенных свиней с геном ГР (1989) увеличение роста не наблюдалось.

По данным Л.К. Эрнста (1996), у трансгенных свиней с геном рилизинг-фактора гормона роста (РФ ГР) конечная живая масса была на 15,7% выше по сравнению с контрольными животными. Однако у трансгенных овец с генами Гр и РФ ГР, несмотря на повышенный уровень ГР, скорость роста не увеличивалась.

Одна из важнейших задач использования трансгенных животных в медицине - получение биологически активных соединений за счет включения в клетки организма генов, вызывающих у них синтез новых белков.

В Эдинбурге в 1992 г. были выведены трансгенные овцы с геном ?-1-антитрипсина человека и ?-глобулиновым промотором. Содержание этого белка у разных трансгенных овец составляло от 1 до 35 г./л, что соответствует половине всех белков в молоке. При таком уровне продукции белка может быть получено около 10 кг трансгенного белка от одного животного в год, что достаточно для 50 пациентов при лечении эмфиземы легких. В России группой ученых под руководством Л.К. Эрнста получены трансгенные овцы с геном химозина, в 1 л молока которых содержится 200-300 мг химозина - основного компонента для производства сыра. Крупное достижение сделано учёными научного центра, в котором была создана первая клонированная овечка - Долли. Исследователи из института Рослина произвели пять поколений птиц, в яичном белке которых содержатся человеческий интерферон и miR24 антитела для борьбы с меланомой[20].

Генно-инженерные методы, в частности технология рекомбинантных ДНК, позволяют создавать новые генотипы и, следовательно, новые формы растений гораздо быстрее, чем классические методы селекции. Кроме того, появляется возможность целенаправленного изменения генотипа - трансформации - благодаря введению определенных генов.

Формальным явлением генетической инженерии растений считается получение первого в мире химерного растения - санбина (sunbeen) как результат переноса гена запасного белка бобовых (фазеолина) в геном подсолнечника (sunflower+been) [12].

Получение растений с новыми свойствами из трансформированных клеток (регенерация) возможно благодаря их свойству тотипотентности, т.е. способности развиваться в целое растение.

Перенос генов в растительные клетки, так же как и в клетки животных, и их встраивание в геном растений (трансформация) осуществляются главным образом благодаря специфическим структурам - векторам.

Некоторые виды агробактерий (Agrobacteria) могут заражать двудольные растения, вызывая образование опухолей - корончатых галлов (рис. 7).

Одним из самых сильных индукторов опухолей служит почвенная бактерия A.tumefaciens[12]. Способность этой бактерии к образованию опухоли связана с большой внехромосомной плазмидой, получившей название Ti-плазмида (от англ. tumor inducing - индуцирующие опухоль). Ti-плазмиды - это естественные векторы для генов, обладающие всеми функциями, необходимыми для переноса, стабильного включения и экспрессии генетической информации в растениях. Они имеют широкий круг хозяев.

После заражения часть Ti-плазмиды встречается в хромосомах клеток растения-хозяина (М. Монтесю и Д. Шелл [6])

Недостаток этих плазмид состоит в том, что некоторые гены, находящиеся в Т-ДНК, заставляют расти клетки растений независимо от гормонов, вносимых в питательную среду, на которой культивируются данные клетки. В связи с этим очень трудно регенерировать нормальное растение из клеток, содержащих полную последовательность Т-ДНК. Другой недостаток - большие размеры Ti-плазмиды, из-за которых затруднены какие-либо манипуляции с ней, поэтому вставить ген в плазмиду традиционными способами невозможно.

В настоящее время конструируются производные Ti-плазмиды, в которых оставляют регуляторный участок Т-области, а вместо её структурных генов вшивают структурную часть гена, который надо ввести в растение. Такие гены с позиции их регенерации безвредны для растений (рис 8).

Существуют и другие бактерии (A.rhizogenes), вызывающие усиленное образование корешков при заражении растений. За этот процесс ответственны содержащиеся в них так называемые Ri-плазмиды (от англ. root inducing - индуцирующий корни). Ri-плазмиды выгодно отличаются от Тi-плазмид тем, что они служат естественными безвредными векторами, так как трансформированные с их помощью растительные клетки сохраняют способность к морфогенезу и к регенерации здоровых растений. В связи с этим Ri-плазмиды в данный момент рассматриваются как более перспективные векторы.



Поэтому фитовирусы представляют собой очень эффективные средства для получения хорошей экспрессии чужеродного гена. Однако вирусы в качестве векторов обладают и существенными недостатками: имеют небольшую емкость, патогенны и неспособны встраиваться в хромосомы хозяина.

Методы прямого переноса генов в растение возникли благодаря появлению специфического объекта - изолированных протопластов, т.е. клеток, лишенных целлюлозной стенки.

1) Трансформация растительных протопластов осуществляется благодаря комбинации методик кальциевой преципитации ДНК и слияния протопластов. Для трансформации может быть использован практически любой ДНК-вектор.

2) Культуру протопластов на начальной стадии её роста заражают агробактериями, которые используют в качестве векторов.

3) Микроинъекции ДНК. Аналогичен методу микроинъекций животных клеток. Этот метод можно рассматривать как наиболее универсальный. Эффективность трансформации растительных клеток - 10-20% независимо от типа вектора. Трансформация не видоспецифична, возможен перенос генов в любое растение.

4) Электропорация. Метод основан на повышении проницаемости биомембран за счет действия импульсов высокого напряжения. В результате молекулы ДНК проникают в клетки через поры в клеточной мембране.

5) Упаковка в липосомы. Это один из методов, позволяющих защитить экзогенный генетический материал от разрушения нуклеазами растительной клетки. Липосомы - сферические тельца, оболочки которых образованы фосфолипидами.

6) Метод биологической баллистики[6]. Это один из самых эффективных методов трансформации однодольных растений. Исходный материал для трансформации - суспензионная культура, каллусная ткань или 4-5-дневные культивируемые незрелые зародыши однодольных. Метод основан на напылении ДНК-вектора на мельчайшие частички вольфрама, которыми затем бомбардируют клетки. Бомбардировка осуществляется с помощью биолистической пушки за счет перепада давления. Часть клеток гибнет, а выжившие клетки трансформируются, затем их культивируют и используют для регенерации растений.

Решение проблемы создания новых форм растений подразумевает в первую очередь повышение качества синтезируемых растением продуктов, которые определяют его питательную и техническую ценность. В основном это касается запасных белков.

Начиная с 1970 г. стали появляться серьезные работы по изучению генов азотфиксации и их переносу в клетки Klebsiella pneumoniae и E.coli. Конструирование плазмид, несущих nif-гены, позволяет передавать способность к фиксации азота организмам, не обладающим этим свойством. Среди бактерий, кроме E.coli, такой перенос осуществлен для бактерий Salmonella typhimurium, Erwinia herbicola и других. Однако подобные манипуляции могут приводить к нежелательным эффектам. Так перенос генов в штамм Erwinia (бактерии, вызывающие гниение растений) может усилить его патогенное действие.

В настоящее время внимание ученых привлекают проблемы введения генов азотфиксации в клетки растений; создания ризоценозов между небобовыми растениями (особенно злаками) и азотфиксирующими организмами. Наиболее интересна первая проблема - введение nif-генов в клетки растений. Однако её решение сопряжено с рядом трудностей. Основная - разрушение нитрогеназы под воздействием кислорода. У азотфиксирующих микроорганизмов существует ряд приспособлений, защищающих бактерии от свободного кислорода. Таким образом, введение только nif-генов в какую-то растительную клетку не решает проблемы. Кроме того, сама клетка, в которую переносят гены азотфиксации, может быть не приспособлена к синтезу и расходованию большого количества энергии, которое требуется для фиксации азота. Следовательно, более перспективно повышение эффективности фиксации азота в уже существующих природных системах за счет воздействия на гены, контролирующие этот процесс, а также увеличение мощности корневой системы бобовых растений и создание новых азотфиксирующих систем с помощью методов клеточной инженерии.

Наибольший урон растениям приносят грибные, бактериальные и вирусные патогенны. В растении существуют защитные механизмы, которые в большей или меньшей степени (в зависимости от устойчивости растений) начинают действовать в ответ на проникновение фитопатогенов в клетку. Во-первых, начинается синтез соединений, вызывающих гибель патогенов. Примером могут служить специфические белки PRP (pathogen related proteins). Из них наиболее изучены ферменты хитиназы и ?-1,3 - глюконазы, которые угнетают рост грибов и некоторых видов бактерий, разрушая их клеточные стенки. Во-вторых, могут создаваться структурные барьеры, препятствующие распространению инфекции. Это достигается благодаря лигнификации клеточных стенок.

Так, гены хитиназы и глюконазы кодируются одиночными генами. Благодаря этому были получены трансгенные растения табака и турнепса, в состав генома которых ввели ген хитиназы. Лабораторные и полевые испытания выявили большую устойчивость трансгенных растений. В растения томатов был введен ген защитных пептидов редьки (дефензинов) rs, отвечающих за устойчивость к фитопатогенным грибам.

Другой подход к получению трансгенных растений, устойчивых к вирусной инфекции, состоит во введении в геном исходных растений гена оболочки вируса. Это приводит к ингибированию размножения вируса и снижению инфицированности. Благодаря такому подходу был получен стойкий антивирусный эффект у растений табака, трансформированных геном оболочки вируса табачной мозаики (ВТМ).

Создание трансгенных растений, устойчивых к насекомым, с помощью методов генной инженерии стало возможным после того, как было обнаружено, что бактерии Bacillus thurengiensis синтезируют специфический белок - прототоксин, высокотоксичный для насекомых. Попадая в кишечник насекомого, этот белок расщепляется, образуя активную форму токсина. В результате насекомое погибает. Ген, ответственный за экспрессию прототоксина, удалось обнаружить, выделить из генома B. thurengiensis и с помощью бинарного вектора ввести в геном растений табака.

Аналогичным образом растения томата были трансформированы генами другого инсектицидного белка - эндотоксина. В итоге были получены первые трансгенные растения, которые не повреждали насекомые (рис. 9).

Божьи коровки, которые питались тлями, жившими на ГМ - картофеле, становились бесплодными и т.д. Некоторые авторы связывают данные явления с «горизонтальными» потоками генетической информации[19].

Генную терапию на современном этапе можно определить как лечение наследственных, мультифакторных и ненаследственных (инфекционных) заболеваний путем введения генов в клетки пациентов с целью направленного изменения генных дефектов или придания клеткам новых функций[2]. Первые клинические испытания методов генной терапии были предприняты 22 мая 1989 года с целью генетического маркирования опухоль-инфильтрующих лимфоцитов в случае прогрессирующей меланомы. Первым моногенным наследственным заболеванием, в отношении которого были применены методы генной терапии, оказался наследственный иммунодефицит, обусловленный мутацией в гене аденозиндезаминазы (ADA). 14 сентября 1990 года в Бетесде (США) четырехлетней девочке, страдающей этим достаточно редким заболеванием (1: 100 000), были пересажены её собственные лимфоциты, предварительно трансформированные вне организма (ex vivo) геном ADA (ген ADA + ген neo + ретровирусный вектор). Лечебный эффект наблюдался в течение нескольких месяцев, после чего процедура была повторена с интервалом 3-5 месяцев. В результате лечения состояние пациентки настолько улучшилось, что она смогла вести нормальный образ жизни и не бояться случайных инфекций.

В 1997 году число допущенных к клиническим испытаниям протоколов составляло уже 175, более 2000 пациентов приняли участие в их реализации.

До настоящего времени интеграция в геном достигалась только при использовании ретровирусных либо аденоассоциированных векторов. В последнее время особое внимание уделяется созданию векторов на базе искусственных хромосом млекопитающих (Mammalian Artificial Chromosomes). Благодаря наличию основных структурных элементов обычных хромосом такие мини-хромосомы длительно удерживаются в клетках и способны нести полноразмерные (геномные) гены и их естественные регуляторные элементы.

Современный уровень знаний не позволяет проводить коррекцию генных дефектов на уровне половых клеток и клеток ранних доимплантационных зародышей человека в связи с реальной опасностью засорения генофонда нежелательными искусственными генными конструкциями или внесением мутаций с непредсказуемыми последствиями для будущего человечества.

1.2 Биотехнологические процессы в пищевой промышленности

Молочные продукты

В пищевой промышленности для получения молочных продуктов применяют, главным образом, ферментацию[4]. В сквашивании молока обычно принимают участие стрептококки и молочнокислые бактерии; лактоза при этом превращается в молочную кислоту. Путем использования иных реакций, которые сопутствуют главному процессу или идут при последующей обработке, получают и другие продукты переработки молока. Среди них пахта, сметана, йогурт и сыр.

В молоке при ферментации могут протекать шесть основных реакций, и в результате образуются молочная (СН₃СН(ОН) СООН), пропионовая (СН₃СН₂СООН) или лимонная кислота ((НООССН₂)₂С(ОН) СООН), спирт (С₂Н₅ОН), масляная кислота (С₃Н₇СООН) или же происходит колиформное газообразование. Главная из этих реакций - образование молочной кислоты. На ней основаны все способы ферментации (сквашивания) молока. Лактоза молока гидролизуется при этом с образованием галактозы и глюкозы. Обычно галактоза превращается в глюкозу ещё до сквашивания. Имеющиеся в молоке бактерии преобразуют глюкозу в молочную кислоту (путь Эмбдена-Мейергофа-Парнаса). Образование сгустка казеина происходит в изоэлектрической точке этого белка (рН 4,6) под действием молочной кислоты. Этот процесс лежит в основе сыроварения.

При производстве швейцарского сыра ключевую роль играет маслянокислое брожение с образованием углекислого газа.

С₆Н₁₂О₆=СН₃СН₂СН₂СООН+2СО₂+2Н₂

Именно это обуславливает своеобразный вкус (букет) этих сыров и образование глазков. Характерный вкус пахты, сметаны и сливочного масла формируется в результате лимоннокислого брожения. Он складывается из составляющих вкусов диацетила (СН₃С(О) С(О) СН₃), пропионовой и уксусной кислот и близких к ним соединений. Различные процессы ферментации молока проводят сегодня в контролируемых условиях. В течение многих прошедших тысячелетий они осуществлялись при участии бактерий, исходно присутствующих в молоке. В наше время для этого используют разнообразные закваски, позволяющие получать молочные продукты нужного качества и типа. Применяющиеся при этом культуры живых бактерий могут представлять либо один какой-то штамм определенного вида, либо несколько штаммов и / или видов.

Хотя свойства сыров чрезвычайно разнообразны, в процессе выработки всех их есть много общего. Первый этап - это подготовка культуры молочнокислых бактерий и засев ею молока. Затем молоко створаживают, для чего обычно применяют фермент реннин. После отделения водянистой жидкости (сыворотки) полученную творожистую массу подвергают термообработке и прессуют в формах. Далее сгусток солят и ставят на созревание. На следующем этапе сыры отправляют на созревание или выдержку. Созревание происходит в специальных помещениях с контролируемой температурой и длится до четырех лет. Микроорганизмы и ферменты в ходе этого процесса гидролизуют жиры, белки и некоторые другие вещества молодого сыра. В результате их распада образуются вещества, придающие сырам характерный вкус.

Из молочных продуктов проще всего получать масло. В зависимости от сорта производимого масла используют сливки с концентрацией от 30-32 до 30-40%. При их сбивании эмульсия масла в воде превращается в эмульсию воды в масле. При производстве масла для улучшения вкуса и лучшей сохранности используют особые культуры бактерий.

При изготовлении сметаны к сливкам добавляют 0,5-1% закваски, используемой при производстве масла. Далее продукт выдерживают, пока концентрация кислоты не достигнет 0,6%.

Известно, что некоторые люди не переносят лактозу. Для них можно выпускать молоко, обработанное ?-галактозидазой - ферментом, который уменьшает содержание лактозы. Для этой цели нужно разработать недорогой промышленный способ производства такого молока. ?-Галактозидазу получают из дрожжей, плесневых грибов и бактерий.

Хлебопродукты

Для производства хлеба до сих пор применяют в основном дрожжи Saccharomyces cerevisiae. Обычно их растят в ферментерах периодического действия на мелассе (свекловичной или сахарного тростника). В простейшем случае готовят тесто, смешивая муку, воду, дрожжи и соль. При замесе слои теста перемещаются, создаются условия для образования пузырьков газа и подъема теста. Замешанному тесту дают возможность «подойти», а затем режут на куски нужного веса, формуют и выдерживают во влажной атмосфере. При выдержке и на первой, следующей за ней стадии выпечки образовавшиеся при замесе и формовке «зародыши» газовых пузырьков наполняются углекислым газом. Он выделяется в ходе анаэробного сбраживания глюкозы и мальтозы муки. Поднявшееся тесто выпекают. В ходе этого термического процесса крахмал желатинизируется, дрожжи погибают, и тесто частично обезвоживается. Помимо углекислого газа при анаэробном брожении образуются органические кислоты, спирты и эфиры. Все они заметно влияют на формирование вкуса хлеба.

Кроме хлебопечения, крахмал используют для получения низкомолекулярных углеводов. Гидролиз крахмала в промышленном масштабе осуществляется разными способами: только кислотой, кислотой и ферментами и только ферментами. В середине 60-х годов на смену кислотному и кислотно-ферментативному процессам пришел ферментативный способ переработки крахмала, основанный на последовательном применении ?-амилазы B.subtilis и амилоглюкозидазы A.oryzae или A.niger. Кроме производства глюкозы, наиболее заметным успехом в этой отрасли промышленности был выпуск смесей глюкозы и фруктозы. Этот продукт известен под названием изоглюкозы или кукурузного сиропа с высоким содержанием фруктозы. Изоглюкоза может заменять сахарозу в большинстве видов пищи. Изомеризация осуществляется ферментами из различных организмов. Выбор их определяется тем, насколько просто с ними работать, нуждаются ли они в кофакторах и стабильны ли (смотри «Основы инженерной энзимологии»).