Основное назначение современных абсорбциометрических приборов - определение концентрации образца с исследуемым веществом посредством сравнения величин поглощения или пропускания световой энергии исследуемого образца и образца известной концентрации.

В настоящее время на рынке фотометрических приборов и в практических лабораториях можно встретить большое разнообразие различных по конструкции и характеристикам колориметров, фотометров и спектрофотометров.

Приборы могут отличаться:

· по форме представления информации (в единицах светопропускания, в единицах оптической плотности, в единицах концентрации или любых других значениях, по которым произведена калибровка);

· по способу построения и хранения калибровочных значений (автоматическое, ручное, длительное или краткосрочное);

· по способу подачи в прибор исследуемого раствора (проточная кювета, коммутируемая кювета, кюветы специальной конструкции, например, 96-луночный планшет и т.д.);

· по конструкции оптической системы (одноканальные и многоканальные);

· по виду источника излучения световой энергии (разнообразные лампы накаливания с телом накала из вольфрама, импульсные, газоразрядные лампы, светодиоды, лазеры).

Существуют и другие отличительные признаки, так или иначе влияющие на параметры и эксплуатационные характеристики приборов.

2.1 Типы абсорбционных спектрометров

При измерении поглощения вещества определяется его поглощающая способность на определенной длине волны л₁. Настроив монохроматор на эту длину волны, мы определяем разницу между значениями, полученными в присутствии и отсутствие исследуемого образца (на таком принципе основаны колориметры, фотоколориметры и большинство фотометров):

Аналогично можно отсканировать весь спектральный диапазон Дл между л₁ и л₂, в присутствии и отсутствие образца (двулучевые спектрофотометры имеют два параллельных луча, один из которых проходит через сравнительную кювету, а второй - через кювету с образцом) и получить с помощью встроенного компьютера скорректированный спектр поглощения (с помощью вычислений на компьютере в режиме реального времени) (см. рис.2, а)

До недавних пор логарифмирование данных измерений спектрометров осуществляли с помощью логарифмирующего усилителя, т.е. аппаратно. Теперь, с целью снижения стоимости оборудования, процесс логарифмирования выполняется с помощью программного обеспечения спектрофотометра, исходный сигнал в котором сохраняется в линеаризированном виде. Однако это порождает некоторые трудности.

1) Прежде чем рассчитать логарифм, необходимо с высокой точностью определить нулевую линию (т.е. "истинный нулевой сигнал"), что особенно важно при измерении небольших значений поглощения, незначительные отклонения могут вызвать существенные изменения величины поглощения и формы спектра.

2) Последующее логарифмирование линеаризированных данных, хранящихся в памяти, приводит к логарифмическому фотометрическому разрешению.

3) Измерение спектров поглощения быстросканирующими спектрофотометрами с одновременным логарифмированием линейного сигнала требует высоких скоростей преобразования, которые достижимы только с использованием быстродействующих микропроцессоров.

Рис.2. Типы сканирующих абсорбционных спектрофотометров. (согласно Науману и Шредеру, 1987)

С точки зрения схемной реализации - усиление сигнала переменного тока производить проще, чем усиление сигнала постоянного тока. Поэтому сигнал постоянного тока, получаемый на фотодетекторе спектрометра, перед усилением преобразуют в сигнал переменного тока механическим прерывателем (см. рис.2, б).

В отличие от последовательных измерений, измерение образца и сравнения можно проводить одновременно, предварительно расщепив луч света (расщепителем луча Y) и используя два отдельных фотодетектора D₁ и D₂, после чего два независимых сигнала преобразуются в спектр поглощения (рис.2, в). Такой метод позволяет исключить ошибки измерения, вызванные флуктуациями источника света, но не компенсирует различия в чувствительности детекторов.

В сканирующем абсорбционном спектрометре, приведенном на рис.2, г, применяется только один детектор. Измеряющий свет расщепляется на два луча (расщепителем луча Y), затем после прохождения образца, сравнения и прерывателя они соединяются обратным расщепителем луча Y. Затем с помощью фазочувствительного усилителя, который воспринимает сигнал сравнения с прерывателя, получают исправленный спектр поглощения. Такая конструкция сканирующего абсорбционного спектрометра применяется наиболее часто. Однако у него есть несколько недостатков. Вследствие ограниченной частоты прерывателя (60 Гц) и в соответствии с теоремой отбора, скорость сканирования длины волны не может быть выше 30 с на спектр в диапазоне от 400 до 800 нм. Иначе фотометрические ошибки и ошибки определения длины волны достигнут неприемлемо высоких значений. Обычно механическое расстояние между образцом/сравнением и фотодетектором D более 20 см. Таким образом, допустимый телесный угол света, излучаемого образцом, составляет 0,001. Это исключает, однако, возможность измерения мутных рассеивающих образцов наподобие присутствующих in vivo биологических и застеклованных при низких температурах.

Для того чтобы собрать как можно больше квантов света, конструкция спектрометра должна предусмотреть как можно больший телесный угол сбора света от образца (до 2р). Площадь катода отдельного фотоумножителя, как правило, бывает неоднородной с точки зрения эффективности. Поэтому, если два луча двулучевого спектрофотометра падают на слегка различающиеся площадки одного и того же фотокатода, то, даже в случае оптимальной юстировки, коррекция нулевой линии оказывается недостаточной, и это выражается в существенном отклонении от идеальной горизонтальной линии. В практически всех спектрометрах такого типа применяется оптическая последовательная корректировка, которая занимает много времени. В соответствии с правилом Гаусса, касающимся ошибки распространения луча, ошибки лучей образца и сравнения аддитивно влияют на конечный результат. На рис.3 представлена конструкция типичного двулучевого спектрофотометра ("Kontron Instruments GmbH"). Если вновь ввести второй детектор согласно рис.2, д и компенсировать различие усиления обоими детекторами вторым световым источником переменного тока частотой f_H, мы снимем ограничения в скорости сканирования. Образец, сравнение и детекторы размещаются очень близко друг к другу, что позволяет проводить измерения рассеивающих мутных образцов. Если требования к оптическим свойствам и разрешению по длине волны (порядка Дл = ±0,5 нм) не очень высоки, что обычно бывает в химической и биологической молекулярной спектроскопии, то идеальным представляется использование конструкции Сейя - Намиока на основе голографической вогнутой решетки рис.4. Доступно быстрое спектральное сканирование мутных и сильно рассеивающих (in vivo) образцов, компактный дизайн, низкий уровень рассеянного света, большой динамический диапазон измерения и, что наиболее важно, встроенный компьютер, производящий все типы спектральных измерений. Такие спектрометры отличаются небольшими размерами, низкой стоимостью и высокой надежностью. Для каждого исследуемого образца не требуется последующее сканирование сравнительного образца. Сравнительный спектр, снятый раз и навсегда, сохраняется в виде коррекционной кривой в памяти компьютера, и спектр исследуемого образца автоматически корректируется в процессе сканирования без вмешательства человека.

Рис.3. компоненты типичного двулучевого спектрофотометра ("Kontron Instruments GmbH")

Рис.4. Схема небольшого, но мощного монохроматора Сейя - Намиока на основе голографической вогнутой решетки.

2.2 Типы абсорбционных спектрометров видимого и ближнего ультрафиолетового диапазона

2.2.1 Колориметры и фотоколориметры

Фотоколориметры - приборы, предназначенные для определения количества окрашенного вещества путем измерения величин поглощения и пропускания в видимой части электромагнитного спектра.

Рис.5 Упрощенная схема фотоколориметра: 1 - источник световой энергии (лампа накаливания, импульсная лампа); 2 - полосовой светофильтр, пропускающий световой поток в полосе длин волн Дл.; 3 - контейнер для исследуемых образцов (кювета); 4 - детектор (фотоприемник); Ф₀ - падающий поток световой энергии; Ф - поток световой энергии, прошедший раствор, который поглотил часть энергии; Дл. - полоса пропускания светофильтра использования.

Рис 6. Обобщенная структурная схема одноканального колориметра: 1 - источник световой энергии; 2 - диафрагма; 3 - оптическая система; 4 - полосовой фильтр; 5 - оптическая система; 6 - кювета; 7 - фотоприемник; 8 - аналого-цифровой преобразователь; 9 - микро-ЭВМ; 10 - индикатор; 11 - пульт оператора; 12 - интерфейс связи с внешней ЭВМ и регистрирующим устройством.

2.2.2 Спектрофотометры

Основное отличие спектрофотометра от фотоколориметра состоит в возможности пропустить через исследуемый образец световой поток любой требуемой длины волны, проводить фотометрические измерения, сканируя (просматривая) весь диапазон длин волн не только видимого (VIS) света - от 380 до 750 нм, но и ближнего ультрафиолета (UV) - от 200 до 380 нм.

Последнее обстоятельство не исключает целесообразности выпуска недорогих спектрофотометров, не имеющих источника ультрафиолетового излучения и работающих только в видимой части оптического диапазона волн.

Целью упомянутого и очень важного режима работы спектрофотометров - режима сканирования - является построение спектральной кривой поглощения (абсорбции) и нахождение на ней пиков, а также исследование процессов интерференции и поиск ложных пиков, приводящих к ошибочным результатам при спектрофотометрических исследованиях.

Рис 7 - монохроматор (источник монохроматического излучения световой энергии на длине волны л); 2 - кювета с исследуемым раствором; 3 - детектор (фотоприемник); Ф₀ - падающий поток световой энергии; Ф - поток световой энергии, прошедший через раствор, поглощающий часть энергии

2.2.3 Двуволновые спектрофотометры

В начале 50-х годов прошлого века Брайтон Чанс предложил новый метод измерения очень маленьких изменений поглощения сильно рассеивающих и мутных образцов. Основная идея очень проста. В то время как в двулучевой спектроскопии, где две кюветы, с образцом и сравнением, облучаются светом одной, но переменной длины волны , в двуволновой абсорбционной спектрофотометрии используется только одна кювета с образцом, которая облучается двумя различными длинами волн, и измеряется разница поглощений между ₁ и ₂ т.е. .

Схема стандартного двуволнового спектрофотометра приведена на рис.8. Разрешение по длине волны здесь, в отличие от светосилы, имеет второстепенное значение. Поэтому в качестве "монохроматора" двуволнового спектрофотометра вполне подойдут узкополосные интерференционные фильтры. Они обладают большей светосилой, чем решеточные монохроматоры. Два луча света с длинами волн ₁ и ₂ посредством колеблющегося с частотой от 30 до 100 Гц зеркала попеременно облучают образец. Соответствующие сигналы I (₁) и I (₂) поступают на вход фазочувствительного усилителя, выходной сигнал которого после определенного преобразования подается для обработки на компьютер.

Рис.8. Схема типичного двуволнового спектрофотометра.

Два ортогональных луча, излучаемые одной лампой, разделяются, коллимируются и диспергируются интерференционными фильтрами с длинами волн пропускания ₁ и ₂. Далее лучи света фокусируются на маленькое колеблющееся зеркало (типичная частота колебания составляет 120 Гц). Генерированная последовательность световых импульсов длин волн ₁, ₂, ₁, ₂, … в большей степени поглощается оптически плотным образцом, а малая интенсивность прошедшего света детектируется фотоумножителем. Выходной сигнал фотоумножителя преобразуется синхронным усилителем и подается на компьютер для обработки. Использование полупрозрачного зеркала и соответствующего блокирующего фильтра между образцом и детектором, чрезвычайно малого светового излучателя (актиничной лампы с интерфильтром 3) позволяет распознавать чрезвычайно низкие изменения поглощения (А < 0,0001) при большом оптическом фоне (Е " 4). Кювета с образцом находится в специальном термостатированном держателе, гарантирующем постоянную температуру измерений.

2.2.4 Спектрофотометры с фотодиодной решеткой

Особым типом спектрофотометров являются приборы с фотодиодной решеткой или матрицей (PDA). Здесь свет от источника направляется непосредственно на образец и уже после этого - на дифракционную решетку, которая проецирует разложенный по поддиапазонам свет на фотодиодную решетку или матрицу. Последние содержат определенное количество фотодиодных датчиков, преобразующих световую энергию в электрические импульсы. Поэтому любой диапазон длин волн при подобной конструкции спектрофотометра дает свой "отклик" практически мгновенно, а не последовательно, как это имеет место в традиционной спектрофотометрии. Электрические импульсы с фотодиодов обычно обрабатываются микрокомпьютером с выводом результатов на дисплей. В зависимости от используемого для работы диапазона волн используются дейтериевая и/или вольфрамовая лампы.

Количество фотодиодов определяет разрешающую способность спектрофотометрического прибора. Применение фотодиодной решетки является важным элементом проведения кинетических исследований, что позволяет одновременно производить замеры исследуемого субстрата и образующегося в ходе реакции продукта при различных длинах волн. Использование данной схемы обеспечивает высокое быстродействие при работе спектрофотометра в режиме сканирования: менее одной секунды на диапазон сканирования.

3. Устройство и основные узлы спектрофотометра

3.1 Устройство спектрофотометра

Рис 9: 1 - источник световой энергии (видимая область); 2 - поворотный отражатель; 3 - источник световой энергии (ультрафиолетовая область); 4 - оптическая система, направляющая поток энергии на входную щель; 5 - входная щель; 6 - оптическая система, формирующая параллельный поток световой энергии; 7 - диспергирующий элемент (призма или дифракционная решетка); 8 - оптическая система, направляющая поток энергии на выходную щель; 9 - выходная щель; 10 - оптическая система, формирующая поток энергии, проходящий через кювету; 11 - кювета; 12 - фотоприемник; 13 - аналого-цифровой преобразователь; 14 - микро-ЭВМ; 15 - индикатор; 16 - пульт оператора; 17 - интерфейс связи с внешней ЭВМ и регистрирующим устройством

Поворотный отражатель (2) направляет поток световой энергии от одного из источников (1 или 3), через оптическую систему (4) на входную щель (5) монохроматора. С выхода монохроматора через щель (9) поступает монохроматический поток световой энергии с определенной длиной волны л. Установка необходимой длины волны чаще всего осуществляется путем изменения угла падения полихроматического потока световой энергии по отношению к плоскости диспергирующего элемента (7). Оптическая система (10) формирует световой поток таким образом, чтобы при минимально допустимом объеме исследуемого раствора и многократной установке кюветы (11) в кюветное отделение геометрия потока не изменилась.

Полихроматический свет от источника проходит через монохроматор, который разлагает белый свет на цветовые компоненты. Монохроматическое излучение с дискретным интервалом в несколько нанометров проходит через ту часть прибора, где располагается образец с исследуемой пробой.

3.2 Основные узлы спектрофотометра

3.2.1 Источник света

Спектрофотометр UV/VIS (ультрафиолет + видимый свет) имеет два источника света: для видимого участка спектра и источник ультрафиолета - от 200 до 390 нм.

Источником видимого света служит вольфрамовая, как правило, галогенная лампа, дающая постоянный поток света в диапазоне 380 - 950 нм, являясь стабильным и долговечным источником световой энергии со средним сроком службы более 500 ч.

В качестве источника УФ используются водородные или дейтериевые лампы. Ультрафиолетовые лампы, содержащие дейтерий, имеют высокую интенсивность излучаемого потока и непрерывный спектр в диапазоне от 200 до 360 нм.

3.2.2 Кюветы

Как известно исследуемый образец помещается в специальные приставки. Для каждого вида образцов они разные. Для твердых - это специальные зажимы, а при спектральных измерениях жидких образцов используются специальные контейнеры из кварцевого стекла, так называемые кюветы.

В большинстве спектрофотометров применяются стандартные кюветы, которые предназначены для такого размещения, которое предусматривает горизонтальную траекторию луча света. Основным недостатком подобных кювет является то, что только небольшая часть образца (около 10%) освещается измеряющим светом. В случае большой ценности образца или доступности его в небольшом объеме, можно использовать микрокюветы или ультрамикрокюветы с объемом 50 или даже 2,5 мкл. Кюветы очень маленьких объемов проявляют капиллярные свойства, и возникают проблемы с образованием пузырьков воздуха, что требует дегазации. Наконец, из таких кювет сложно извлечь обратно образец. Стандартные кюветы имеют внешние размеры: 12,512,545 мм, а внутренние - 1010 мм. Кюветы с меньшим внутренним объемом, выпускаемые одним производителем имеют тот же внешний размер, что и стандартные, но внутренний, например 101,25 мм.

3.2.3 Диспергирующий элемент

В спектрофотометрах в качестве диспергирующего элемента чаще всего используют призмы и дифракционные решетки.

Дифракционная решетка технологически более сложное изделие, чем призма. Большинство применяемых в настоящее время решеток изготовлены способом выжигания и голографического копирования и представляют собой пластины с большим числом параллельных штрихов - до нескольких сот на миллиметр.

Основным преимуществом использования призмы в спектрофотометре является ее низкая стоимость.

Преимущество дифракционных решеток состоит в том, что они обеспечивают линейную дисперсию света на всем диапазоне видимого и УФ спектров. Отрицательным моментом применения дифракционных решеток является их высокая стоимость в сравнении с призмами и светофильтрами.

Одной из самых важных характеристик монохроматоров является полоса пропускания, выражаемая в единицах длин волн - нанометрах.

Если интерференционные фильтры дают ширину пропускания в диапазоне 6-20 нм, то призмы и дифракционные решетки дают более узкую полосу - менее 5 нм, а следовательно, и большую "чистоту" (монохромность) света, падающего на кювету с образцом. Полоса пропускания является одной из важнейших характеристик спектрофотометра. Уменьшение полосы пропускания влечет за собой повышение разрешающей способности спектрофотометра - значимой характеристики качества спектрофотометрических приборов.

3.2.4 Монохроматоры

Действие спектральных приборов - спектрофотометров - основано на том, что в некоторых физических системах условия прохождения света оказываются различными. Такие системы называются диспергирующими. Обычно в качестве диспергирующего элемента используют призму или дифракционную решетку. Устройства, позволяющие разделить полихроматический свет на монохроматический спектр излучения, называются монохроматорами (рис.10).

Рис. 10. Функциональная схема монохроматора с призмой.

1-входная щель; 2-объектив, формирующий параллельный поток световой энергии; 3-призма; 4 - объектив, направляющий поток энергии на экран; 5 - экран; 6 - выходная щель

Щель (1), на которую падает полихроматический поток световой энергии, находится в фокальной плоскости линзы (2). Эта часть прибора называется коллиматором. Выходящий из объектива (2) параллельный поток световой энергии падает на призму (3). Вследствие дисперсии (обусловленной зависимостью показателя преломления от длины волны) свет различных длин волн выходит из призмы под разными углами. Если в фокальной плоскости линзы объектива (4) поставить экран (5), то линза сфокусирует параллельные потоки энергии для различных длин волн в разных местах экрана. Поворачивая призму (3), можно просканировать через щель (6) монохроматические потоки энергии во всем спектре излучения. Часто в качестве диспергирующего элемента используется дифракционная решетка, которая представляет собой стеклянную или металлическую пластину, на которой нанесены параллельные одинаковые штрихи, расположенные на строго одинаковых расстояниях друг от друга. На рис.11 показана дифракционная решетка, состоящая из чередующихся параллельных друг другу щелей одинаковой ширины b, расположенных на одинаковом расстоянии a друг от друга. Сумма (a+b) является периодом этой структуры и называется постоянной решетки d.

Рис.11. Функциональная схема монохроматора с дифракционной решеткой.

1 - входная щель; 2 - объектив, формирующий параллельный поток световой энергии; 3 - дифракционная решетка; 4 - объектив, направляющий поток энергии на экран; 5 - экран; 6 - выходная щель

Через входную щель (1) полихроматический поток световой энергии линзой объектива (2) трансформируется в параллельный поток, который проходит через щели дифракционной решетки (3). В каждой точке на экране (5), расположенном в фокальной плоскости линзы объектива (4), соберутся те лучи, которые до линзы были параллельными между собой и распространялись под определенным углом Q к направлению падающей волны. Поэтому освещенность в точке Р на экране (5) определяется результатом интерференции вторичных волн, распространяющихся как от разных участков одной щели, так и от разных щелей. Существует направление, распространяясь по которому, вторичные волны от всех щелей будут приходить в точку Р в одной фазе и усиливать друг друга, и другое - когда волны не совпадают по фазе и ослабляют друг друга. Таким образом, на экране наблюдается чередование светлых и темных полос. Условие формирования максимумов от дифракционной решетки, то есть когда волны усиливают друг друга при интерференции, наблюдается тогда, когда разность хода равна целому числу волн. Зависимость формирования максимумов различных длин волн от угла Q дифракционной решетки выражается формулой: d*sinQ = k - 1, где k= 0, 1, 2.

Если на решетку падает свет разных длин волн, то максимумы для различных длин волн располагаются под различными углами Q к первоначальному направлению распространения света. Поэтому дифракционная решетка разлагает полихроматический свет в дифракционный спектр и употребляется как диспергирующий прибор.

4. Экспериментальная часть