Описано пятнадцать биохимических реакций (таблица 1), катализируемых коферментными формами витамина - 5-дезоксиаденозил-В₁₂ и СН3-В12. Все реакции, кроме рибонуклеотидредуктазной, катализируемые 5'-дезоксиаденозил-В₁₂, связаны с переносом водорода. При этом имеет место 1,2-гидридный сдвиг с одновременным перемещением группы в противоположном направлении: В случае рибонуклеотидредуктазы роль донора и акцептора водорода выполняют различные молекулы. Реакции, происходящие при участии СН3-В₁₂, включают перенос метильных групп, и СН3-В₁₂ выступает в качестве интермедиата в реакциях трансметилирования. В организме животных и человека витамин В₁₂ участвует в образовании метионина из гомо - цистеина и в изомеризации метилмалонил-КоА в сукцииил-КоА.

Таблица 1. Ферментативные реакции, катализируемые аденозилкобаламином

Глава 2. Методы исследования

2.1 Продуценты витамина В₁₂

Рисунок 4 - Строение коферментной формы

Известны две коферментные формы витамина В₁₂: аденозилкобаламин (рисунок 4) и метилкобаламин (коферментная форма II). Более 80% всех синтезированных пропионовокислыми бактериями корриноидов находится в коферментной форме I, которая, как уже указывалось, в качестве лиганда содержит 5-дезоксиаденозил.

Источником аденозила служит АТФ. Коферментная форма содержит Со-С-связь и является первым кобальторганическим соединением, обнаруженным в живых системах. Метилкобаламин обычно содержится в клетках в незначительных количествах, но у М. barkeri метил-фактор III, который содержит в нуклеотидной части 5-оксибензимидазол, составляет до 80% от суммы всех корриноидов.

Регуляция биосинтеза витамина В₁₂ осуществляется по принципу репрессии. Витамин В₁₂ угнетает только свой собственный синтез, не оказывая влияния на образование других тетрапирролов и, как полагают, действует на стадии метилирования УПГ III. В качестве регулятора выступает лишь полная нуклеотидсодержащая молекула витамина. Гем оказывает координированную репрессию синтеза ферментов начальных стадий биогенеза тетра - пирролов.

Функциональной формой витамина является аденозилкобаламин (5,6-диметилбензимидазолил) - Со-5-дезоксиаденозилкобамид) и метилкобаламин (а (5,6-диметилбензимидазолил) - Со - метилкобамид).

Как и большинство витаминов, В₁₂ может существовать в различных формах и принимать различные наименования. Названия для витамина B₁₂ содержат словоформу "кобальт", так как кобальт - минерал, найденный в центре витамина: кобринамид, кобинамид, кобамид, кобаламин, гидрокскобаламин, метилкобаламид, аквакобаламин, нитрокобаламин, и цианокобаламин.

2.3 Получение витамина В ₁₂

В настоящее время для получения витамина В ₁₂ используют следующие микроорганизмы Prop, freudenreichii ATCC 6207, Prop, shermanii ATCC 13673, Prop, shermanii BKM-103 и их варианты и мутанты. Наибольший интерес представляют штаммы, способные к самостоятельному синтезу 5,6 ДМБ. Поскольку синтез 5,6 ДМБ лучше происходит при доступе воздуха, осуществляют двустадийный процесс, в котором получают наиболее высокий выход продукта. На 1 стадии культуру выращивают в анаэробных условиях до полной утилизации сахара. На 2-й стадии включают аэрацию, тем самым создавая условия для синтеза 5,6 ДМБ и превращения этиокобаламнна в дезоксикобаламин. Обе стадии осуществляют в двух разных ферментерах или в одном. Анаэробно выросшие клетки можно собрать путем центрифугирования и инкубировать густую суспензию на воздухе и, если нужно, в присутствии 5,6 ДМБ и цианида. Добавление ДМБ производят только во 2-й стадии ферментации (если бактерии не синтезируют его самостоятельно), поскольку в его присутствии образуются полные формы витамина, ингибирующие его синтез. Среда для ферментации обычно содержит глюкозу или инвертированную-мелассу (10 - 100 г/л), небольшие количества солей Fe, Mn и Mg, а также Со (10 - 100 мг/л), источники азота. В среду добавляют кукурузный экстракт (30 - 70 г/л), содержащий молочную и пантотеновую кислоты, усиливающие рост бактерий. Пантотеновую кислоту, стимулирующую также синтез витамина, рекомендуют вносить в среду дополнительно. Бактерии культивируют при 30°, поддерживая рН на уровне 6,5-7,0 путем введения (NH4) OH. Ферментацию производят в ферментерах на 500 л, содержащих 340 л среды, инокулированных 7 л посевного материала. В первые 80 ч культура растет под небольшим давлением N2 и слабым перемешиванием (без аэрации), в следующие 88 ч включают аэрацию (2 м3/ч) и перемешивание. Возможны некоторые вариации в культивировании. Витамин В₁₂ сохраняется в клетках бактерий, поэтому проводят его экстракцию:

1) выделение витамина из клеток и превращение его в цианокобаламин;

2) выделение неочищенного продукта (80% чистоты), который можно использовать в животноводстве;

3) дальнейшую очистку до уровня 91-98% (для медицинских целей).

Для экстракции витамина из клеток последние нагревают при 80°-120° в течение 10-30 мин при рН 6,1-8,5. Превращение в CN-кобаламин достигают, обрабатывая горячий раствор или клеточную суспензию цианидом или тиоционатом, часто в присутствии NaNO2 или хлорамина В. Корриноиды сорбируют на различных носителях: амберлите IRC-50, А12О3, активированном угле и элюируют водными спиртами или водно-фенольными смесями. В значительных количествах образуют витамин В12 ацетогенные клостридии Cl. thermoaceticum, Cl. for - micoaceticum и Acetobacter ivoodi. Из водных растворов корриноиды экстрагируют фенолом или крезолом, или смесью этих спиртов с бензином, бутанолом, углеродистым тетрахлоридом или хлороформом. При упаривании различных растворителей получают осадок или кристаллы витамина, которые растворяют в соответствующем растворителе до нужной концентрации. Природные штаммы пропионовокислых бактерий образуют 1,0 - 8,5 мг/л корриноидов, но получен мутант P. shermanii М-82, с помощью которого получают до 58 мг/л витамина.

Но есть патентное сообщение (Франция) о достижении невероятно высокого выхода - 216 мг/л.

В семействе Propionibacberiaceae есть и другие представители, способные к высокому накоплению витамина В₁₂ в клетках. Это прежде всего Eubacterium limosum (Butyribacterium rettgerii). Как продуценты витамина практический интерес имеют многие представители актиномицетов и родственных микроорганизмов. Истинный витамин В₁₂ в значительных количествах синтезирует Nocardia rugosa. Путем мутаций и отбора получен штамм N. gиgosa, накапливающий до 18 мг/л витамина В₁₂. Активные продуценты витамина обнаружены среди представителей рода Micro-monospora: М. purpureae, М. echinospora, М. halophitica.М. fused, М. chalceae. Высокой кобаламинсинтезирующей активностью обладают метаногенные бактерии, например, Methanosarcina barkeri, М. vacuolata и отдельные штаммы галофильного вида Methanococcus halophilus. Последний организм синтезирует более 16 мг корриноидов на грамм биомассы. Столь высокого содержания корриноидов не отмечeнo ни у одного другого из изученных микроорганизмов. Причина высокого содержания корриноидов у метаногенных бактерий не установлена.

Получение витамина В₁₂ с помощью бактерии Pseudomonas denitrificans

Ряд штаммов рода Pseudomonas образует в значительных количествах B₁₂, но чаще всего используют мутант Ps. denitriflcans, у которого в результате мутагенеза уровень витамина В₁₂ удалось поднять с 0,6 мг/л (дикий штамм) до 60 мг/л. Бактерии культивируют с аэрацией и перемешиванием в периодических (или проточных) условиях в среде (а) следующего состава: свеклосахарная меласса - 100 г, дрожжевой экстракт - 2 г, (NHtb НРО4 - 5 г, MgS04 - 3 г, MnS04 - 200 мг, CoNO3 - 188 мг, 5,6 ДМБ - 25 мг, ZnSO4 - 20 мг, Na2MoO3 - 5 мг, вода водопроводная - до 1 л, рН 7,4. Меласса богата бетаином и глутаминовой кислотой, оказывающими положительный эффект на выход витамина. Бетаин стимулирует синтез б-АЛК и, возможно, также изменяет проницаемость мембраны. Культуру сохраняют в лиофилизированном состоянии, поддерживают в вышеприведенной среде. Пересев осуществляют в пробирку с плотной средой (б). Состав среды (б): свеклосахарная меласса - 60 г, пивные дрожжи - 1 г, N-Z-амин - 1 г, (МН4ЬНРО4 - 2 г, MgSO4 - 1 г, MnSO4 - 200 мг, ZnS04 - 20 мг, MoSO4 - 5 мг, агар - 25 г, вода водопроводная - до 1 л, рН 7,4. Инкубируют 4 дня при 28°. Далее клетки переносят в 150 мл жидкой среды того же состава (но без агара), налитую в литровую колбу Эрленмейера. Инкубируют 3 дня при 28° на качалке. Содержимое колбы вносят в ферментер на 5 л, содержащий 3,3 л среды (см. выше), стерилизованный 75 мин при 120°. Инкубируют 90 ч при 29° с перемешиванием (420 об/мин) и аэрацией (0,2 м3/ч). Чистый витамин В₁₂ получают в результате проведения следующих последовательных операций:

Культуральная жидкость с клетками Ps. denitrificans (3,3л) нагревание 30 мин при 20°С, охлаждение, доведение Рн до 8,5, добавление KCN, перемешивание 16 ч при 25°, добавление ZnCl2 (200 г), доведение рН до 8,0, перемешивание, фильтрация.

Фильтрат:

· Трехкратная экстракция 350 мл смесей

· крезола и углеродистого тетрахлорида (1: 2 - соотношение)

· Органический экстракт I

· Водный экстракт

· Трёхкратная экстракция 30 мл. смеси крезола и

· углеродистого тетрахлорида (1: 2 соотношения)

· Органический экстракт II

· Добавление 200 мл ацетона и 120 мл эфира

· Неочищенный витамин В₁₂

В результате процесса экстракции получают цианкобаламин 98%-й чистоты и выходом 75%. Конечный выход - 59-60 мг/л, CN-кобаламин - стабильная форма витамина.

Получение витамина В₁₂ с помощью штамма бактерий Pseudomonas fluorescens BKM В-2224Д

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается нового штамма бактерий Pseudomonas fluorescens BKM В-2224Д, продуцирующего витамин В₁₂, который применяется как антианемический препарат в медицине и в производстве кормовых добавок для сельскохозяйственных животных и птицы.

Целью изобретения является получение штамма бактерий, способных синтезировать витамин В₁₂ в более высокой концентрации, чем известные микробные продуценты.

Условия биосинтеза витамина В₁₂ штаммом Pseudomonas fluorescens BKM В-2224Д.

Биосинтез витамина В₁₂ культурой Pseudomonas fluorescens BKM В-2224Д осуществляется по следующей схеме: посевная культура на агаризованной среде - -> посевная культура на колбах на жидкой среде - -> культура на жидкой среде в посевном аппарате - -> биосинтез на жидкой среде в ферментере.

В качалочную колбу объемом 750 мл с объемом среды 50 мл вносят культуру из пробирки в количестве 0,1%.

Выращивают культуру при температуре 30^oС в течение 48 часов.

Условия ферментации: постоянное перемешивание, температура 28-32^oС, при подаче воздуха 02-05 л/л среды в минуту в течение 40-60 часов до оптической плотности больше 0,2.

Полученным посевным материалом в дозе засевают стерильную ферментационную среду.

Ферментацию проводят при температуре культуральной жидкости 28-32^oС, при постоянном перемешивании, избыточном давлении 0,5 ати, при расходе воздуха 0,2 л/л среды в минуту.

Культура Pseudomonas fluorescens BKM - 2224Д характеризуется тем, что ее рост происходит параллельно с биосинтезом витамина В₁₂ в аэробных условиях на протяжении всего процесса ферментации.

Содержание витамина В₁₂в культуральной жидкости к концу ферментации составляет 120-150 мкг/мл при определении микробиологическим методом с использованием в качестве тест-культуры Е. соli 113-3 или спектрофотометрическим методом. При культивировании пропионово-кислых бактерий содержание витамина B₁₂ в культуральной жидкости равно 40-50 мкг/мл.

По окончании процесса ферментации культуральную жидкость подкисляют серной кислотой до значения рН 5,8 ед., проводят лизис культуры при температуре 90 - 10^oС. Для получения готового продукта культуральная жидкость может быть переработана на распылительной сушилке с наполнителями (мел, соль, отруби и др.) или отправлена на стадии получения и выделения витамина B₁₂ в чистом виде.

Получение витамина B₁₂ с помощью метаногенных бактерий

В клетках метанобразующих бактерий витамин В₁₂ присутствует от 4,1 нмоля/мг сухих клеток у Methanosarcina barkeri до 0,65 наномолей/мг сухих клеток у Metanobacterium formicum. Биосинтез кобаламинов архебактериями (изучали на М. barkei) сходен с биосинтезом корриноидов у анаэробных эубактерий. У метанотрофа Mtb. thermoautotrophicum большая часть клеточного кобамида локализована во фракции мембран и связана с мембранным белком. Предполагают, что содержащий кобамид интегральный мембранный белковый комплекс играет существенную роль в метаболизме этих бактерий при утилизации H2 + CO2, которая, видимо, сводится к переносу электронов. Корриноиды у метанобразующих бактерий участвуют также в катаболизме ацетата и метанола. Превращение метанола в метан у Mis. barkeri происходит через образование СНз-СоМ, в метилировании которого за счет метанола участвуют две метилтрансферазы, зависимые от кобамида. Корриноид, видимо, служит простетической группой фермента. Во Франции из ила сточных вод выделили мезофильные метаногенные бактерии и инкубировали их в ассоциации с другими бактериями в полупроточном режиме в среде, содержащей метанол (3-12 г/л), мелассу, кукурузный экстракт, NH4, Co, ортоксилидин и 5,6 ДМБ. Ферментацию ведут при 35° в ферментере на 1000 м3 с ежесуточной заменой 10% бродящего субстрата свежей средой. Биомассу отделяют на сепараторах и высушивают на распылительной сушилке. Высушенный концентрат усредняют мелом до стандартной активности 1000 мкг/г препарата, который используют в таком виде как добавку к кормам. Сухой концентрат до усреднения содержит - 3000 мкг/г витамина B12 что составляет 45-50% суммы корриноидов, фактор III - 10-15% и другие неполные корриноиды - 40-50%. Термофильные штаммы метанотрофных бактерий родов Methanobacillus и Methanobacterium образуют 2 мг/л кобаламина при содержании в среде 8 г/л метанола. В России производство кормового препарата витамина B12 основано в основном на переработке барды (отхода ацетонобутилового или спиртового производства) биоценозом бактерий, осуществляющих термофильное метановое брожение сточных вод. Используют сложный консорциум анаэробных микроорганизмов, включающих углеводсбраживающие, аммонифицирующие, сульфатвосстанавливающие и метанобразующие бактерии. К, барде добавляют метанол - до 2%, СоСl2-6Н2О - 10 г/м3, мочевину - 300 г/м3 и сухие кормовые дрожжи - 230 г/м3. Дозировку обогатителей производят автоматически. Барду подают в нижнюю часть ферментатора метантенка (па 4-5 тыс. м3), в котором автоматически регулируют параметры процесса, обеспечивая контроль температуры (55-57°С), рН (7,5-8,0) и длительности брожения. Брожение ведут непрерывно, ежесуточно заменяя 20-25% бродящей жидкости на свежую барду. В качестве пеногасителя используют рыбий жир. Для получения кормового препарата бражку выпаривают и сушат. Поскольку витамин В12 неустойчив при тепловой обработке, особенно в щелочной среде, его стабилизируют. Для этого получаемую в процессе брожения жидкость перед выпариванием подкисляют до рН 5,0-5,3 и добавляют к ней сульфит натрия (0,1-0,25%). Содержание витамина В12 в исходной сброженной жидкости - 4,4 г/м3. Сгущение сброженной барды осуществляют на выпарных аппаратах (до 14-17% содержания сухих веществ), а сушку в распылительной сушилке. Концентрация витамина B12 в высушенном препарате - 500-600 мг/кг. Истинный витамин составляет 20-25% от суммы корриноидов, фактор III - 35-40%, фактор В и другие - 40-45%. Получаемый препарат называют КМБ-12.

Схема представлена на рисунке 5. Ацетоно-бутиловая барда из нижней части бражной колонны поступает в сборник барды 1 и насосом подается в декантатор 3. Отстой барды собирается в сборнике 4 и используется на корм скоту. Декантат, охлажденный до температуры 55-57°С, метанол и хлористый кобальт поступают в ферментер 12. Сброженную массу из верхней части ферментера отбирают и направляют в реактор 19, где осуществляют стабилизацию витамина B₁₂ путем добавления сульфита натрия и соляной кислоты, смешанных в смесителе 18. Из стабилизированной бражки удаляют газы в сепараторе газов 22, бражку упаривают в выпарной установке 24 и собирают в сборниках 26. Сгущенная метановая бражка перекачивается насосом 27 в сборник метановой бражки 28, а оттуда насосом 29 в распылительную сушилку 31.

В качестве теплоносителя для сушки используют газы брожения, сжигаемые в печи 39. Сухой порошок поступает в бункер 33 и расфасовывается в полиэтиленовые мешки, вложенные в крафт-пакеты.

Отсутствие промышленных отходов, доступность сырья, непрерывность метода, не требующего стерильных условий, делают его экономичным.

Кормовой витамин В₁₂ получают в Советском Союзе на Грозненском ацетоновом и Ефремовском биохимическом заводах. Для производства витамина В₁₂ предусмотрены и за последнее время внедрены системы автоматизации основных стадий технологического процесса.

Сухой концентрат КМБ-12, помимо витамина В₁₂ (100 мг/кг препарата), содержит ряд других ростстимулирующих веществ. Особенно хорошие результаты в животноводстве получают при сочетании витамина B₁₂ с малыми дозами антибиотиков, в частности с биомицином. Реализация в нашей стране описанного способа и получение концентрата витамина В₁₂ позволили полностью обеспечить животноводство этим витамином.

В США почти все вырабатываемые комбикорма для свиней и птиц обогащают витамином В₁₂. Показано, что белок животного происхождения можно заменить растительным белком при условии обогащения кормосмесей витаминов В₁₂ в дозе 60 мкг/кг.

Рисунок 5 - Технологическая схема получения концентрата витамина В12 с помощью смешанной культуры метанообразующих бактерий: 1 - сборник барды; 2 - насос для барды; 3 - декантатор барды; 4 - сборник сгущенной барды; 5 - сборник декантата барды; 6 - насос для декантата барды; 7 - холодильник для охлаждения декантата барды, 8 - сборник-мерннк метанола; 9 - насос-дозатор метанола; 10 - сборннк-мерннк раствора хлористого кобальта; 11 - насос-дозатор раствора хлористого кобальта; 12 - ферментатор для метанового брожения; 13 - насос для метановой бражки; 14 - сборник-мерннк соляной кислоты; 15 - насос-дозатор соляной кислоты; 16 - сборник-мерник раствора сульфита натрия; 17 - насос-дозатор раствора сульфита натрия; 18 - смеситель метановой бражки, соляной кислоты и раствора сульфита натрия, 19 - реактор для стабилизации витамина Bi2 в метановой бражке; 20 - насос для стабилизированной метановой бражки; 21 - подогреватель стабилизированной метановой бражки; 22 - сепаратор газов, выделяющихся из метановой бражки; 23 - насос для подачи стабилизированной метановой бражки на выпарную установку; 24 - подогреватели метановой бражки; 25 - выпарная установка для сгущения метановой - бражки (а-1 корпус, 6-II корпус, s - III корпус, г-IV корпус, д-барометрический конденсатор, е - вакуум-насос); 26-сборник сгущенной метановой бражки; 27-насос для сгущенной метановой бражки; 28 - сборник сгущенной метановой бражки (передаточный); 29 - насос для сгущенной метановой бражки; 30 - подогреватель сгущенной метановой бражки; 31 - распылительная сушилка с центробежным распылением; 32 - циклоны распылительной сушилки; 33 - бункер сухого концентрата; 34 - расфасовка в мешкн; 35 - скруббер для очистки дымовых газов сушилки от порошка концентрата; 36 - установка для каталитического сжигания газов, выделяющихся при подкисленни и нагревании метановой бражки; 37 - газгольдер для газов брожения; 38 - холодильник для отделения воды из газов брожения; 39 - газовая печь распылитель ной сушилки.

Украинским научно-исследовательским институтом спиртовой и ликеро-водочной промышленности разработана технология получения кормового концентрата витамина В₁₂ путем сбраживания мелассно-спиртовой барды смешанной культурой метанообразующих бактерий. Предварительно на мелассно-спиртовой барде выращивают кормовые дрожжи. После сепарирования дрожжей получают культуральную жидкость, содержащую 7-8 % сухих веществ. На этой жидкости выращивают метанообразующие бактерии и получают с 1 м¹ исходной барды 1,5-2 г витамина В₁₂.

Культуральную жидкость упаривают до содержания 60-70 % сухих веществ, смешивают с наполнителем и высушивают. В качестве наполнителя используют кукурузную муку, отруби и т.п. Сухой концентрат размалывают и расфасовывают в мешки. В 1 кг кормового концентрата содержится: витамина B₁₂ 18 - 20 мг, В₂ 41 мг, РР 146 мг и другие витамины. Срок хранения 12 месяцев.

Мезофильные и термофильные метаногенные бактерии, в том числе Metanobacterium thermoautotrophi-сит, Mb. thermoformicuin, Mb. bryantii, Metanosarcina barkeri, Ms. vacuolata, Ms. mazei, Methanococcus hatopilus, синтезируют исключительно фактор III. Истинный витамин B₁₂ образуют неспорообразующие метилотрофы: Eubacterium limosum, близкий к нему Butyribacterium methylotrophicum и Acetobacter woodi. Путем создания искусственных биоценозов и подбора условий ферментации возможно целенаправленное регулирование процесса биосинтеза витамина В₁₂. Новые разработки. Для удешевления производства витамина B₁₂ и утилизации дешевого возобновляемого сырья изучалось образование корриноидов бактериями Prop, atidipropionici ATCC 25562 при росте на ксилозе как главной составной части гидролизатов гемицеллюлоз. Используя ксилозу, бактерии аккумулировали 0,35 мг корриноидов в одном литре среды без внесения солей Со. Для продукции корриноидов из ксилозы больше всего подходит UFR-реактор, работающий с ультрафильтрационной рециркуляцией клеток. Иммобилизованные клетки в Японии сразнивали стабильность и продуктивность биокатализатора при включении клеток Propionibacterium sp. в гели каппа - каррагенана, Na-альгината, агара и форполимерные уретановые смолы. Оптимальной подложкой служит форполимер PU-9, полимерная матрица которой не снижала активности включенных в нее клеток. В оптимальных условиях ферментации 5 г иммобилизованных клеток вновь синтезировали и экскретировали 900 мкг витамина за 18 дней повторной периодической ферментации, продемонстрировав возможность проведения многоступенчатого сложного синтеза (подобных примеров известно немного). Усовершенствование штаммов-продуцентов. В последние годы усовершенствование штаммов было достигнуто путем мутаций и селекции. Этим методом в 50 раз увеличена продуктивность по витамину у Ps. denitrificans. Для грамположительных бактерий Propionibac-terium, Bacillus, Streptotnyces применимо слияние протопластов, для грамотрицательных бактерий, например, Pseudomonas, доступны конъюгативные плазмиды. Пока весомых практических результатов этими новыми и мощными методами не получено, но начало таким работам положено. Клонировали 11 генов, кодирующих ферменты биосинтеза витамина B₁₂ у бактерии Вас. megaterium. Полагают, что в геноме содержится всего 20-30 таких генов. Поэтому DNA Вас. megaterium подвергли фрагментированию и крупные фрагменты встраивали в плазмиды, которыми далее трансформировали мутанты-ауксотрофы по В₁₂. Такие мутанты приобрели способность синтезировать витамин В₁₂. Метод может быть использован для получения штамов-продуцентов в производственных масштабах. В бактерии Е. coll клонированы гены Prop, technicum, ответственные за синтез витамина В₁₂. Бактерия Prop. technicum не содержит плазмид, поэтому из этого штамма выделили, очистили и частично разрушили ДНК, получив фрагменты 15 - 20 килобаз. Эти фрагменты включили в расщепленную плазмиду pBR 322 и полученной гибридной плазмидой трансформировали Е. соli. Новые трансформанты отличались от контрольного штамма в отношении морфологических и физиологических признаков.

2.4 Применение витамина В₁₂

Рисунок 6 - Формы отпуска витамина В₁₂ из аптек

Заключение