Біосинтез антибіотика доксорубіцину

Размещено на http://www.allbest.ru//

Размещено на http://www.allbest.ru//

РЕФЕРАТ

Проект присвячено вивченню процесу біосинтезу антибіотика доксорубіцину, продуцентом якого є актиноміцет Streptomyces peucetius. Складається зі вступу, п`яти розділів, графічних матеріалів та списку використаної літератури.

Дипломний проект викладений на ___ сторінках друкованого тексту, містить 7 таблиць, 5 рисунків.

Основними положеннями в даній роботі є вибір та характеристика біологічного агента - продуцента антибіотику, характеристика кінцевої продукції виробництва, підбір обладнання для ферментаційних та після ферментаційних процесів

У роботі дано обґрунтування та викладено технологічний процес ділянки біосинтезу виробництва препарату, який включає блок допоміжних робіт і стадії вирощування культури.

Ключові слова: Streptomyces peucetius, доксорубіцин, антрацикліновий антибіотик, протипухлинний антибіотик, поживні середовища, біосинтез, культуральна рідина.



ВСТУП

біосинтез антибіотик культивування

Розробка протипухлинних лікарських засобів є пріоритетним напрямком біотехнологічних досліджень в світі. Близько 60 % розроблюваних біотехнологічних засобів призначені для лікування раку або захворювань, пов'язаних з ним. Японія займає друге місце в світі після США. Поряд із США та Японією біотехнологія швидкими темпами розвивається і в країнах Західної Європи. За оцінкою Interpharm Press, скоординувавши свою діяльність, ці країни можуть в майбутньому зробити значний вплив на кон'юнктуру ринку біотехнологічних продуктів [8].

В Україна нині не приділяється належна увага формуванню ринку біотехнологічної продукції. Тому сучасний стан галузі характеризується наявністю науково-технологічного потенціалу і відсутністю структури, яка б сприяла широкому впровадженню біотехнологічних розробок [16].

Однією з вимог до проектування біотехнологічного виробництва є економічна доцільність вибору типового обладнання. Найважливішою стадією в проектуванні біотехнології є стадія біосинтезу. Отже ферментаційні системи та обладнання - одна з основних складових біотехнологічного процесу, як по складності реалізації, так і за впливом на рентабельність виробництва. Існуючі методи розрахунку і прогнозування змін технологічних параметрів ферментації досі залишаються недосконалими. Тому слід проводити роботи з удосконалення обчислювальних алгоритмів з метою оптимізації періодичних процесів мікробного синтезу [4].

Утворення антибіотиків - це спадково закріплена особливість метаболізму організмів [32]. Це специфічна особливість виду або штаму мікроорганізмів, яка виникла в результаті еволюційного розвитку як одна з пристосувальних особливостей щодо проявлення антагоністичних відносин, що дуже розповсюджені в світі мікроорганізмів [14].



Природні мікроорганізми, як правило, володіють низькою продуктивністю тих речовин, виробництво яких необхідно. Для біотехнології потрібні високопродуктивні штами мікроорганізмів. Їх створюють методами селекції - спрямованого відбору спонтанних або індукованих мутантів. У результаті селекції продуктивність продуцентів вдається збільшити в сотні або тисячі разів.

Одним з найбільш успішних і економічно вигідних напрямків мікробіологічної промисловості є виробництво медичних препаратів. Зазвичай вони ефективні у відносно малих кількостях і мають досить високу вартість. Отримання їх в ферментерах дозволяє знизити собівартість. Тому є доцільним розглядати найбільш ефективні методи отримання медичних препаратів [2].

Актуальність. Доксорубіцин відноситься до класу речовин, які володіють не тільки протимікробною, але і протипухлинною активністю [7]. Одним з важливих та перспективних завдань вітчизняної біотехнології є виробництво ефективних протипухлинних антибіотиків. Їх потреба в Україні висока у зв'язку із постійним зростанням числа онкологічних захворювань. Дані препарати активно використовуються при лікуванні злоякісних пухлин різного походження, таких як: різних гематологічних видах раку, саркомах м'яких тканин, карцинома тощо [22].

Новизна. Пропонується використовувати рекомбінантний штамів Streptomyces peucetius ATCC 27952, що володіє зниженою чутливістю до наявності продукованого ними доксорубіцину в середовищі. Це дозволяє збільшити вихід продукту більше, ніж у 2 рази (з 2,1 мг/л до 5 мг/л). Для біосинтезу доксорубіцину, в даному проекті використовується поживне середовище, яке за собівартістю є дешевшим ніж середовища, які зазвичай використовуються [27].



РОЗДІЛ 1. ХАРАКТЕРИСТИКА КІНЦЕВОЇ ПРОДУКЦІЇ ВИРОБНИЦТВА

Доксорубіцин (лат. Doxorubicinum, англ. Doxorubicin) - один з антрациклінових антибіотиків, що продукується штамами Streptomyces coeruieorubidus або Streptomyces peucetius. У 1969 році DXR вперше був виділений із S. peucetius var. Caesius ATCC 27952, мутантний штам, отриманий із S. peucetius ATCC 29050 [6].

Антрацикліновий антибіотик доксорубіцин володіє високою протипухлинною і протилейкозною активністю при низькій вибірковості дії.

DXR утворюється C-14 гідроксилюванням його безпосереднього попередника даунорубіцину, а також виконує свою антипроліферативну дію на ракові клітини за допомогою двох різних механізмів: інтеркаляції та інгібування ферменту. Обидва ці механізми спричиняють руйнування ДНК, що в кінцевому результаті призводить до загибелі клітин [12].

Механізм цитотоксичної дії антибіотика пов'язаний, головним чином, з інгібуванням синтезу нуклеїнових кислот (ДНК та РНК) шляхом інтеркаляції між парами азотистих основ, порушенням вторинної спіралізації ДНК за рахунок взаємодії з топоізомеразою II, а також зв'язуванням з ліпідами клітинних мембран, що супроводжується зміною транспорту іонів і клітинних функцій [26].

Після введення доксорубіцин швидко розподіляється в плазмі та в тканинах. Вже через 30 с препарат виявляється в печінці, легенях, серці та нирках. Він не проникає крізь гемато-енцефалічний бар'єр, однак є проникним через плацентарний бар'єр і виявляється в грудному молоці.

Період напіввиведення доксорубіцину та його метаболіту становить від 20 до 48 год [34].

Доксорубіцину гідрохлорид є кристалічний або аморфний порошок оранжево-червоного або червоного кольору. Гігроскопічний, розчинний у водних розчинах кислот, бутанолі, хлороформі, важкорозчинний в метанолі та ацетоні, у воді розчинність становить 2600 мг /л при 25 ° С. Водні розчини мають жовто-помаранчевий колір при кислотному рН, оранжево-червоний при нейтральному рН, і фіолетово-синій при рН > 9. Водні розчини залишаються незмінними після зберігання протягом місяця при 5° С , але нестабільні при високих температурах або при кислій або лужній реакції середовища. рН 4,0-5,5.

Температура плавлення: 205° С з розкладанням [33].

Молекулярна маса: 580 [33].

Формула: C27H29N O11 [33].

Назва за ІЮПАК: (8S-цис)-10(3-аміно-2,3,6-тридезокси-альфа-L-ліксогексо-піранозил)окси-7,8,9,10-тетра-гідро-6,8,11-тригідрокси-8-(гиіроксил-ацетил)-1-метокси-5,12-нафтацендіон [33].

Належить до полікетидних продуктів ІІ типу. Молекула доксорубіцина складається з тетрациклічного антрахіноїдного аглікона доксорубіцинона, з'єднаного глікозидним зв'язком з аміноцукром даунозаміном (рис. 1.1)[19].

Рис. 1.1. Структурна формула молекули доксорубіцина

Застосовується для лікування гострого лімфобластного і мієлобластного лейкозу; злоякісної лімфоми ходжкинського і неходжкинського типу; раку молочної залози, легень, сечового міхура, щитовидної залози, яєчників; остеогенної саркоми; саркоми м'яких тканин; саркоми Юінга; нейробластоми; пухлин Вільмса [35].

Пригнічує кровотворення, має імуносупресивну і кардіотоксичну дію. Летальна доза для щурів при підшкірному введенні LD 50 = 21800 мкг / кг. Може викликати віддалені ефекти у вигляді розвитку вторинних злоякісних пухлин (ризик підвищується при тривалому вживанні). Виявляє канцерогенну дію у тварин і потенційно канцерогенний для людини. Але доксорубіцином було проявлено кращу активність, ніж даунорубіцин проти пухлин у мишей. Впливає на статеву функцію, але у людини це дія слабкіша, ніж дія, що виявляється в дослідах на мишах [28]. У експериментах на тваринах проявляє ембріотоксичний і тератогенний ефект.

Однією з характерних токсикологічних особливостей доксорубіцину є кардіотоксичність. Оскільки прояв кардіотоксичної дії залежить від дози і різко підвищується при високих кумулятивних дозах, протипухлинну активність доксорубіцина не можна реалізувати повністю. Включення цитостатика в ліпосоми дозволяє оптимізувати протипухлинний ефект.

При одночасному вживанні з циклоспорином спостерігається підвищення концентрації доксорубіцина в плазмі і посилення мієлотоксичної дії; з циклофосфамідом, мітоміцином, дактіноміцином -- можливе посилення кардіотоксичної дії доксорубіцина. При вживанні доксорубіцина (протягом 3 діб) в комбінації з цитарабіном (у вигляді інфузії протягом 7 днів) описані випадки розвитку некротичного коліту і важких інфекційних ускладнень. Доксорубіцин несумісний з розчином гепарину (поява осаду) [35].

Фармакодинаміка. Доксорубіцин чинить виражену протипухлинну і протилейкозну дію. Препарат швидко проникає в клітини, зв'язується з пери нуклеїновим хроматином, пригнічує поділ клітин та синтез нуклеїнових кислот, виявляючи специфічну дію на фазу S поділу клітин, спричиняючи хромосомні аберації.

Фармакокінетика. Після внутрівенного введення Доксорубіцин швидко розподіляється в плазмі та тканинах - вже через 30 с препарат виявляється в печінці, легенях, серці та нирках. Об'єм розподілу в рівноважному стані становить 20 - 30 л/кг. Протягом години після введення Доксорубіцин частково метаболізується в печінці в активний метаболіт. Не проникає крізь ГЕБ. Період напів виведення для Доксорубіцину та його метаболіту становить від 20 до 48 годин. Виводиться з жовчю в незміненому вигляді (приблизно 40 % протягом 5 днів) та нирками в незміненому вигляді та у вигляді метаболітів (майже 5 - 12 % протягом 5 днів).

Показання: гострий лімфобластний та мієлобластний лейкоз, хронічні лейкози, лімфогранулематоз (хвороба Ходжкіна), неходжкінська лімфома, множинна мієлома, остеосаркома, саркома Юінга, саркома м'яких тканин, нейробластома, рабдоміосаркома, пухлина Вільмса, рак молочної залози, рак ендометрія, яєчників, передміхурової залози, легень, шлунка, щитовидної залози, несеміноматозного раку яєчок, перехідного раку сечового міхура.



РОЗДІЛ 2. ХАРАКТЕРИСТИКА БІОЛОГІЧНОГО АГЕНТА

2.1 Обґрунтування вибору біологічного агента

Бактерії Streptomyces peucetius var. сaesius (штами S. peucetius АТСС 29050, S. peucetius var. caesius АТСС 27952) є продуцентами доксорубіцину, який використовується в якості протипухлинного засобу [5].

Бактеріальні штами, виділені з природи зазвичай виробляють лише дискретні кількості вторинних метаболітів На основі біосинтетичних досліджень і аналізу кінцевого продукту, різних чинників, що впливають на його виробництво штамом S. peucetius ATCC 27952, розглядається, щоб уникнути недоліків у виробництві DXR, тим самим забезпечуючи ідеї генної інженерії промислових штамів S. peucetius [10]. Тому проводилися дослідження у клонуванні генів стійкості S. peucetius АТСС 27952 до доксорубіцину. Останні 3 реакції біосинтезу кінцевого продукту каталізуються одним ферментом, активність якого знижується з підвищенням концентрації антибіотику.

Рекомбінантні плазміди, pDrrAB25, pDrrC25 і pDrrABC25 були побудовані надекспресією drrAB, drrC і drrAB в S. peucetius АТСС 27952 відповідно.

Олігонуклеотиди були використані для ампліфікації нуклеотидних послідовностей drrA і drrB одночасно з геномної ДНК S. peucetius, і продукт ПЛР клонували в pIBR25 на сайтах XbaI і EcoRI, щоб отримати рекомбінантну експресійну плазміду pDrrAB25. Аналогічно була побудована плазмида pDrrC25 на сайтах EcoRI і Hin DIII [27].

Рекомбінантними штамами продукувалося більше доксорубіцину, ніж батьківський штамом: 2,2-кратне збільшення з pDrrAB25 (2,6 мг/л), 5,1-кратним збільшенням pDrrC25 (6,5 мг/л) і 2,4-кратним збільшенням з pDrrABC25 (3 мг/л).

Також доксорубіцин продукується штамом Streptomyces coeruleorubidus, але його здатність продукувати доксорубіцин нижча , ніж у S. рeucetius. Тому

S. coeruleorubidus використовують для отримання іншого антибіотику - даунорубіцину.

Отже, наведені дані свідчать про можливість використання мутантів, стійких до даунорубіцину i доксорубіцину, у селекції S. peucetius var. сaesius. та здатність мутантів до перетворення екзогенного даунорубіцину у доксорубіцин. Для культивування обрано рекомбінантний штам S. peucetius pDrrC25, який синтезує 6,5 мг/л доксорубіцину [27].

2.2 Наведення складу поживного середовища

Виробничий штам Streptomyces peucetius ATCC 27952 пропонується вирощувати на середовищі, складу, г/л:

Декстроза	60
Пивні дріжджі	25
NaCl	2
КН2РО4	1
CaCO3	2
MgSО4	0,1
FeSО4 7H2О	0,01
ZnSО4 7H2О	0,01

2.3 Морфолого-культуральні та фізіолого-біохімічні ознаки біологічного агента

Морфолого-культуральні ознаки

S. peucetius - типовий представник стрептоміцетів, які являють собою тонкі (0,3-1,5 мкм) нитки - міцелій, що проявляється у них в оптимальних для існування умовах.

Склад оболонок близький до бактеріального. Клітинна стінка 1-го типу, містять L-діамінопімелінову кислоту, гліцин і невеликі кількості арабінози. Характеризуються високим вмістом ГЦ пар у ДНК [3]. Грам-позитивна культура.

Рід Streptomyces є найбільшим родом, що синтезує антибіотики і використовується з 1940-1950 р. в їх промисловому виробництві [3].

Стрептоміцети ростуть в рідкому середовищі у вигляді плівки на поверхні, іноді утворюють пухнастий осад, залишаючи середовище абсолютно прозорим, на відміну від типових бактерій. При рості на твердому середовищі утворюють добре розвинений повітряний міцелій, що не розпадається в процесі розвитку на окремі клітини [3].

Спори, що проростають на твердому середовищі або фрагменти міцелію дають гіфи, проникаючі в агар (субстратний міцелій), а також гіфи, які багаторазово гілкуються і щільно переплітаються на поверхні агару, утворюючи щільні колонії діаметром 1 - 10 мм. [3]. Ступінь щільності колоній залежать від складу середовища. Ріст колоній S. peucetius зображено на рис. 2.1.

Рис. 2.1. Ріст колоній S. peucetius на поверхні агару

У деяких штамів роду Streptomyces колонії покриває повітряний міцелій - вільні гіфи, які мають гідрофобну оболонку і зростають вертикально вгору від поверхні колонії. На стадії утворення спор колонії стрептоміцетів стають порошкоподібними чи бархатистими, їх легко відрізнити від типових бактеріальних колоній.

Фізіолого-біохімічні ознаки

Streptomyces peucetius - хемоорганогетеротроф, облігатний аероб. Оптимальна температура для біосинтезу та розвитку S. peucetius 30°С [14]. Оптимальне значення рН 6,5-8 [14].

Вважається що актиноміцети більш стійкі до висушування ніж неміцеліальні бактерії, завдяки чому вони домінують в пустельних грунтах. Актиноміцети ростуть при більш низькій вологості, ніж більшість грамнегативних бактерій [14].

Незважаючи на те, що штами S. peucetius АТСС 29050 та S. peucetius АТСС 27952 є продуцентами DNR та DXR, їх стійкість до власних антибіотиків значно нижча, ніж до актиноміцину D (Act D). Якщо Act D повністю пригнічує ріст цих штамів (на МС) лише у концентрації 200 мкг/мл то DNR та DXR - у концентрації 30 та 50 мкг/мл [5].

2.4 Таксономічний статус

Таксономічне положення S. peucetius згідно ІХ видання Керівництва Бергі з систематики бактерій

Царство	Procaryotae
Відділ	Firmicutes
Клас	Thallobacteria
Порядок	Actіnomycetales
Родина	Streptomycetaceae
Рід	Streptomyces
Вид	Streptomyces peucetius



Таксономічне положення S. peucetius згідно філогенетичної класифікації

Клас	Proteobacteria
Група	Перша (І)
Підгрупа	Actіnomycetes
Рід	Streptomyces
Вид	Streptomyces peucetius

Таксономічне положення S. peucetius згідно Х видання Керівництва Бергі з систематики бактерій

Відділ	Actinobacteria
Клас	Actinobacteria
Підклас	Actіnobacteridae
Порядок	Actinomycetales
Підпорядок	Streptomycineae
Родина	Streptomycetaceae
Рід	Streptomyces
Вид	Streptomyces peucetius



РОЗДІЛ 3. ТЕХНІКО-ЕКОНОМІЧНЕ ОБҐРУНТУВАННЯ

3.1 Потреба у цільовому продукті

У 1974 році доксорубіцин був удосконалений для застосування в США. Всі дослідження в той час були спрямовані на розробку такого похідного доксорубіцину, яке виявляло б такий або більший протипухлинний ефект, але при цьому мало б менш виражену кардіотоксичність.

Нові винайдені препарати мають ту ж загальну структуру антрациклінового кільця, але вони були дещо модифіковані. За останні 30 років досліджувалася протипухлинна дія більше ніж 2000 препаратів. Клінічні випробування деяких з них проводяться і зараз , але доксорубіцин залишається найбільш широко застосовуваним препаратом з усіх антрациклінів.

Антрацикліни - клас протипухлинних препаратів, що володіють широким спектром активності на злоякісні пухлини в організмі людини, за винятком раку товстої кишки [38].

На сьогодні в світі на препарати від ракових захворювань витрачається 895.2 млрд. доларів , а серцеві - 753 млрд., і все інше - набагато менше: 298.2 млрд. - такі витратина лікування від судинних захворювань, 204.4 млрд. - від ДТП , 193.3 - від СНІДу , 125.8 млрд. - від респіраторних захворювань (включаючи пневмонію).

За даними IMS, обсяг продажів в 2016 доксорубіцину гідрохлорид для ін'єкцій в США перевищив $ 30 мільйонів. Станом на 2016 рік в Україні на обліку в онкологічних установах знаходиться 960 тис. людей, смертність склала - 77417.

Рак є однією з основних причин смерті у світі - в 2014 році зафіксовано 7,6 млн випадків смерті від раку. Основними типами раку є:

рак легенів - 1,37 мільйона випадків смерті;

рак шлунка - 736000 випадків смерті;

рак печінки - 695 000 випадків смерті;

рак товстого кишечника - 608 000 випадків смерті;

рак молочної залози - 458 000 випадків смерті;

рак шийки матки - 275 000 випадків смерті.

Україна на другому місці в Європі за темпами поширення раку. Ризик розвитку онкологічних захворювань становить 27,7% для чоловіків і 18,5% для жінок. Злоякісні новоутворення вражають в Україні кожного четвертого чоловіка і кожну шосту жінку.

Щорічно в Україні більше 160 тис. чоловік дізнаються, що вони онкохворі. Щороку від раку помирають близько 90 тис. осіб, з них 35% люди працездатного віку.

За розрахунками фахівців, до 2020 року кількість вперше захворілих на рак в Україні перевищить 200 тис.

За останні десять років кількість хворих зросла на 25%, загальна чисельність населення скоротилася на 4 млн. чоловік. Онкологічна захворюваність стабільно зростає на 2,6-3% на рік, і рак продовжує «молодіти». Здавалося б, за цими показниками ми не сильно відрізняємося від розвинених країн, проте слід враховувати, що середня тривалість життя українців на 10-20 років нижча, а захворюваність на рак істотно зростає після 50 років. І далеко не кожен українець доживає до «свого раку», вмираючи від інших причин.

Основними фірмами-виробниками доксорубіцину є:

«Фармстандарт-біолек» (Україна) - харківське підприємство з виробництва імунобіологічних та лікарських препаратів. Являється одним з найстаріших фармацевтичних підприємств на Україні. Було засновано в 1898 році і стало першим в Україні підприємством з виробництва імунобіологічних препаратів, вакцин і сироваток. Пріоритетним напрямком є ??випуск цитотоксичних антибіотиків для лікування онкологічних захворювань, також засобів для наркозу, гормональних і ферментних препаратів та інше.

ТОВ «Сінбіас Фарма» (Україна) - донецька компанія, яка займається виробництвом протипухлинних субстанцій. На підприємстві створено повний цикл виробництва антрациклінових антибіотиків. В даний час протиракові препарати поставляються в багато країн світу. У 2005 р. отримані Європейські Сертифікати Відповідності, а також Сертифікат Належної Виробничої Практики (GMP ) від уповноваженого відомства Німеччини, що дозволяє підприємству авторизувати свою продукцію для використання в ЄС.

"Омутнинская научная опытно-промышленная база" (Росія) утворена в 1974 році для виконання науково-дослідних робіт, пов'язаних з випробуванням технологічного обладнання та з відпрацюванням дослідно - промислових технологій. На сьогодні в Росії в даному ринковому сегменті ВАТ "Омутнинская научная опытно-промышленная база" - одне з найбільших вітчизняних підприємств з випуску субстанцій протипухлинних препаратів.

ЗАТ «Бринцалов-А» - «Ферейн» (Росія) є одним з найстаріших і великих фармацевтичних підприємств країни діє з 1912 року. Сьогодні ЗАТ "Бринцалов-А" виробляє високоефективні медичні препарати: антибіотики, серцево-судинні препарати, антидепресанти, онкологічні препарати та ін.

«Ленс-Фарм» (Росія) - компанія, яка працює на фармацевтичному ринку з 1991 року. У 1999 році фірма «Ленс-Фарм» розпочала реалізацію програми виробництва онкологічних препаратів, яка вважається одним з головних напрямків у роботі фірми в даний час.

«Teva Pharmaceutical Industries» -- міжнародна фармацевтична компанія зі штаб-квартирою в Ізраїлі. Компанія являється значним світовим виробником препаратів-генериків, що входять до топ-10 фармацевтичних компаній. Історія Teva в Україні почалася в 1997 році з відкриття представництва та виведення на фармацевтичний ринок доступних генеричних онкологічних препаратів.

«EBEWE Pharma» (Австрія) - 1934 року займає провідне місце в австрійській фармацевтичної промисловості. Фірма має один із найсучасніших у Європі високоякісної технологією виробництва, яка відповідає вимогам GMP, що висуваються до виготовлення фармацевтичних препаратів. Лікарські препарати фірми EBEWE застосовуються в різних областях медицини, таких як: неврологія, кардіологія, гастроентерологія, онкологія і т.д.

«Schering Plough» (Німеччина) - корпорація, яка була заснована в 1851 році Ернстом Християном Фрідріх Шерінгом як «Schering AG». «Schering Plough» випускає фармацевтичні препарати, найбільш відомими з яких є протиалергенні «Кларитин» і «Clarinex» та протипухлинний препарат «Temodar» (для лікування пухлини головного мозку). Доксорубіцин випускається під торговою назвою «Келикс».

3.2 Розрахунок потужності виробництва

Доксорубіцин застосовується в хіміотерапії майже всіх видів пухлин: гострий лімфобластний і мієлобластний лейкоз; злоякісна лімфома ходжкинського і неходжкинського типу; рак шлунка, рак підшлункової залози; рак сечового міхура; раку молочної залози, легень, сечового міхура, щитовидної залози, яєчників; рак ендометрія, рак шийки матки, рак передміхурової залози, гострий лімфобластний лейкоз, гострий мієлобластний лейкоз, хронічний лімфолейкоз, мієломна хвороба; остеогенна саркома; саркома м'яких тканин; саркоми Юінга; нейробластома [35].

Згідно даних Інституту раку за 2014 рік в Україні 960 тис. осіб перебувають на обліку в онкологічних установах. І приріст щорічно складає в середньому 0,6%. Отже станом на 2015 рік кількість хворих складає 960000Ч1,006 = 971555 осіб.

За тими ж даними склад хворих такий: 1/3 - чоловіки, 2/3 - жінки.

Схема курсу лікування: препарат вводиться пацієнту протягом 4 тижнів по 3 дні в кількості 20-30 мг/м2 . За курс необхідно 4Ч3 = 12 введень. Дозу беремо в середньому 25 мг/м2. Підрахувавши 25Ч12 отримаємо 300 мг/м2, тобто за 1 курс хворому необхідно ввести 300 мг/м2 препарату.

Згідно даних Держкомстату МОЗ України при лікуванні раку 33,92 % обирають хірургічний спосіб, 24 % - гормонотерапію, 18 % - променеву терапію, 23,28 % - хіміотерапію і 0,8 відмовляються від лікування. Провівши підрахунки робимо висновок, що лікують пухлини за допомогою хіміотерапії 971555Ч0,2328 = 226178 осіб.

Як протипухлинні, на сьогодні, застосовують понад 50 препаратів, а потенціальних засобів вивчено понад 500000. Головним недоліком більшості протипухлинних препаратів є мала вибірковість дії стосовно пухлинних клітин. Крім того, швидко виникає звикання клітин до препаратів.

Процес звикання можна уповільнити шляхом комбінованого застосування препаратів з різною структурою і неоднаковим механізмом дії. Протибластомним засобам властиві тяжкі побічні і токсичні ефекти. При цьому уражаються кістковий мозок, слизові оболонки кишечнику, виявлено негативний вплив на статеві залози (застосування протибластомних препаратів може зумовити стерильність). Ці засоби також виявляють імунодепресивну, мутагенну і тератогенну дії. В деяких випадках для зменшення токсичної дії і підвищення ефективності препаратів їх вводять внутрішньоартеріально безпосередньо до пухлини. Останнім часом як один з компонентів комбінованої терапії при пухлинних захворюваннях використовують імуностимулювальні засоби. В основі комбінованої терапії пухлин лежить принцип використання препаратів з різною хімічною будовою і механізмом дії.

Класифікація протипухлинних засобів

Алкілювальні засоби (циклофосфан, тіофосфамід, мієлосан)

Антиметаболіти (меркаптопурин, метотрексат, фторурацил)

Алкалоїди (колхамін, вінбластин, вінкристин)

Антибіотики (брунеоміцин, блеоміцин, доксорубіцин, даунорубіцин, дактиноміцин, ідарубіцин, іксабепілон, мітоміин, епірубіцин)

Гормональні та антигормональні засоби (фосфестрол, флутамід)

Ферментні засоби (L-аспарагіназа).

Кожен з наведених препаратів має сильно виражену побічну дію: нудота, блювання, алопеція, лейкопенія, геморагічний цистит, агранулоцитоз з явищами геморагічного діатезу, анемія, анорексія, аменорея, тромбоцитопенія, гіпоплазія або аплазія кровоносної системи тощо.

Серед антибіотичних препаратів велика кількість належить до напівсинтетичних, тобто молекула була штучно покращена. Антибіотичні препарати також мають достатньо високу вартість, що також слід враховувати при виборі хіміотерапевтичних препаратів.

При розробленні проекту ми обираємо як препарат лікування саме доксорубіцин. Даний препарат характеризується порівняно незначними побічними реакціями та невисокою вартістю (100 грн за 10 мг) порівняно з іншими.

Для проходження курсу лікування одним хворим треба 300 мг/м2 доксорубіцину, а для лікування всіх хворих - 300Ч226178 = 67853400 мг/м2 =67853,4 г/м2 тіла препарату.

Враховуючи, що в середньому поверхня тіла чоловіків складає 1,9 м2 , а жінок - 1,6 м2 , а співвідношення кількості хворих чоловіків до жінок 1:2 отримаємо, що середня площа поверхні тіла пацієнта (1,9+1,6+1,6)/3 = 1,7 м2.

Якщо середня поверхня тіла хворого 1,7 м2, а пацієнтів всього 226178 і на лікування одного за курс витрачається 300 мг/м2 препарату, то для проходження повних курсів лікування всіх осіб необхідно 1,7Ч226178Ч300 = 115350780 мг = 115,5 кг доксорубіцину.

В Україні Доксорубіцин у вигляді лікарського препарату випускається лише двома фірмами (ПАО «Фармстандарт-Биолек» та Корпорація «Артеріум»), а решта постачається в нашу країну закордонними імпортерами. Проект виробництва спрямований на ліквідацію іноземної продукції з українського ринку. Враховуючи кількість продукції, випускаємої вітчизняними виробниками, дане виробництво забезпечить 70% потреби в антибіотику.

Отже, потужність виробництва складає 82 кг доксорубіцину за рік.

Зважаючи на те, що не всі хворі будуть використовувати доксорубіцин при лікуванні приймемо, що 30 % виробленої продукції буде експортовано.

Оскільки вихід доксорубіцину (концентрація у культуральній рідині) становить 0,85 г/л = 0,85 кг/м3, а потреба в Україні 82 кг/рік, то розрахуємо об'єм культуральної рідини за рік:

VКРріч= 82/0,85 = 92,59 м3

Окрім цього, нам необхідно врахувати втрати, які можуть виникнути в процесі виробництва, вони становлять 10%, отже, з урахуванням втрат річний об'єм культуральної рідини становитиме:

VКРріч =92,59+92,59 Ч 0,1=111 м3

3.3 Розрахунок кількості виробничих циклів

для отримання річної потреби цільового продукту і геометричного об'єму ферментера

1. Приймаємо кількість робочих днів на рік - 300.

Ефективний фонд робочого часу Nеф. = 300Ч24 = 7200 год.

Розрахуємо цикл роботи ферментера:

Tцф = Tф+Tдр = 148+14 = 162 (год), де

Tф - тривалість виробничої ферментації (біосинтезу);

Tдр - тривалість допоміжних робіт (допоміжні роботи включають: миття та огляд (4 год), перевірка на герметичність (2 год), стерилізація (2 год), охолодження (1 год), завантаження середовища (2 год), засів (1 год), вивантаження культуральної рідини (1 год).

3. Кількість циклів за рік становитиме:

nц==44,4, округлюємо до 44 циклів.

Об'єм культуральної рідини, який треба одержати за цикл:

VКРц= VКРріч/ nц=111/44=2,5 м3

Обираємо ферментер об'ємом 5 м3 з коефіцієнтом заповнення Кз = 0,5. Об'єм культуральної рідини становить Vк.р = 2,5 м3, що більше за розрахований.

3.4 Розрахунок кількості стадій підготовки посівного матеріалу

Виробничий біосинтез здійснюють у ферментері об'ємом 5 м3 з коефіцієнтом заповнення, 0,5.

Робочий об'єм ферментера (Vроб) визначають за формулою:

Vроб.=Vг.ф.ЧКзап., (2.1)

де: Vг.ф. - геометричний об'єм ферментера;

Кзап- коефіцієнт заповнення, 0,5.

Vроб.=5Ч0,5 =2,5 м3

Кількість посівного матеріалу (доза) становить 10 % від об'єму поживного середовища. Отже, для одержання 2,5 м3 культуральної рідини потрібно:

Vроб.1=2,5Ч0,1=0,25 м3 посівного матеріалу.

Для одержання 0,25 культуральної рідини треба мати:

Vроб.2=0,25Ч0,1=0,025 м3 посівного матеріалу.

25 л культуральної рідини можна одержати з використанням

Vроб.3=25Ч0,1=2,5 л посівного матеріалу.

Приготування такої кількості інокуляту здійснюють в качалочних колбах об`ємом 0,75 дм3. Кількість колб - 17 шт..

Для одержання 2,5 л культуральної рідини потрібно мати:

Vроб.4=2,5Ч0,1=0,25 л посівного матеріалу.

Таку кількість посівного матеріалу одержують культивуванням культури штаму Streptomyces peucetius ATCC 27952 в качалочних колбах об`ємом 0,75 дм3. Кількість колб - 2 шт.

Отже, процес одержання посівного матеріалу для забезпечення виробничого біосинтезу доксорубіцину у ферментері об'ємом 5 м3 з коефіцієнтом заповнення 0,5 буде проходити у 4 етапи [10].



РОЗДІЛ 4. БІОСИНТЕЗ ЦІЛЬОВОГО ПРОДУКТУ

4.1 Шляхи катаболізму ростового субстрату у біологічного агента

Основним вуглецевим субстратом для вирощування Streptomyces peucetius є декстран, з якого потім утворюється глюкоза. Катаболізм глюкози здійснюється за гліколізом (шлях Ембдена-Мейєргофа-Парнаса, фруктозо-1,6-дифосфатний шлях). Процеси перетворення глюкози на гліцеральдегід-3-фосфат пов'язані з витратами енергії. Під час подальшого окиснення гліцеральдегід-3-фосфату до пірувату енергія вивільнюється. Перетворення 1,3-дифосфогліцерату на 3-фосфогліцерат спряжено з фосфорилюванням АДФ і утворенням АТФ (фермент фосфогліцераткіназа). Ця реакція є одним з пунктів гліколізу, в яких АТФ утворюється в результаті фосфорилювання на рівні субстрату. Фосфоенолпіруват (ФЕП) - це друга сполука, яка містить фосфорильний зв'язок з високою енергією гідролізу: при утворенні пірувату з ФЕП фосфат переноситься на АДФ з утворенням АТФ (фермент піруваткіназа). Ця реакція є другим пунктом утворення АТФ на рівні субстрату у шляху Ембдена - Мейєргофа - Парнаса. Обидві реакції, які проходять з виділенням енергії (утворенням АТФ) у процесі перетворення гліцеральдегід-3-фосфату на піруват є для анаеробних мікроорганізмів основними етапами, які постачають енергію. Усі реакції за винятком трьох (гексокіназної, фосфофруктокіназної та піруваткіназної), є повністю оборотними [25].

4.2 Біотрансформація ростового субстрату у цільовий продукт

Основними сполуками синтезу доксорубіцину культурою S. peucetius є 7,9,12-декакетиди, що утворюються в результаті конденсації Малон-КоА, метилмалон-КоА і бутаніл-КоА. В утворенні 12-дизоксиакланонової кислоти беруть участь 4 ферменти, 2 з яких належать до кетоацилсинтаз. Під дією

оксидоредуктази утворюється акланонова кислота, яка через метиловий ефір, аклавікетон, родоміцин і похідні карміноміцину перетворюється на доксорубицин [19].

Схему біотрансфомації від мальтози до антибіотика Доксорубіцину у S. peucetius зображено на рис 4.1.

Рис 4.1. Схема біосинтезу доксорубіцину

Ферменти які беруть участь у біосинтезі доксорубіцину

1 - декстраназа; 2 - гексокіназа; 3 - глюкозофосфатізомераза; 4 - фосфофруктокіназа; 5 - фруктозодифосфатальдолаза; 6 - триозофосфатізомераза; 7 - гліцеральдегідфосфатдегідрогеназа; 8 - фосфогліцераткіназа; 9 - гліцератфосфомутаза; 10 - енолаза; 11 - піруваткіназа; 12 - ізоцитратліаза; 13 - глюкозо-6-фосфатдегідрогеназа; 14 - глюконат-6-фосфатдегідрогеназа; 15 - трансельдолаза і транскетолаза; 16 - глюкозофосфатізомераза.

РОЗДІЛ 5. ОБҐРУНТУВАННЯ ВИБОРУ ТЕХНОЛОГІЧНОЇ СХЕМИ

5.1 Обґрунтування способу культивування і типу ферментера

Вибір способу проведення біосинтезу відіграє важливу роль в процесі росту мікроорганізмів. Існують різні види культивування: глибинне, поверхневе, періодичне, безперервне [14].

Найбільш поширений спосіб культивування - періодичний. При даному способі культивування інокулят вносять у поживне середовище, яке містить задану кількість всіх необхідних поживних речовин. При цьому ні один із компонентів поживного середовища не надходить у систему у процесі культивування, тобто це закрита система [14].

Періодичне культивування застосовується як для поверхневих культур (на поверхні твердого поживного середовища), так і глибинних культур (в рідкому поживному середовищі). Ріст мікроорганізмів у поживному середовищі припиняється тоді, коли вміст якого-небудь з необхідних компонентів середовища досягає мінімуму або у середовищі накопичуються продукти метаболізму, що інгібують ріст мікроорганізмів.

Глибинне культивування мікроорганізмів має ряд очевидних переваг перед поверхневим, оскільки дозволяє значно скоротити виробничі площі, виключити важку непродуктивну ручну працю, покращити гігієну праці, спрощує механізацію та автоматизацію виробництва, робить можливим перехід на безперервний спосіб культивування. При глибинному способі культивування раціональніше використовуються поживні речовини середовищ, що дають можливість значно скоротити відходи виробництва у вигляді нерозчинних осадів твердого поживного середовища, отримувати препарати з меншим вмістом домішок і більшою питомою активністю. Глибинне культивування проводять у вертикальних герметичних ємностях різного розміру, що називаються ферментерами [14].

При поверхневому культивуванні механізація процесу вирощування можлива шляхом створення безперервно діючих установок. В цьому випадку мікроорганізми вирощують на поверхні щільного середовища або в тонкому шарі рідкого середовища, і кисень надходить до них безпосередньо з повітря.

Оскільки S. peucetius накопичує лише 6,5 мкг/мл доксорубіцину, то для забезпечення необхідної потужності виробництва необхідні великі об'єми поживного середовища. Отже застосування поверхневого способу є недоцільним. Також у ході культивування середовище слід підживлювати, що при поверхневому способі культивування є трудомістким.

Тому, враховуючи дані, наведені вище, для культивування S. peucetius обираємо глибинний метод, бо цей мікрорганізм росте у рідкому поживному середовищі, потребує постійної аерації, частого технологічного контролю, також за глибинного методу культивування економляться виробничі площі.

Біореактори (ферментери) складають основу біотехнологічних виробництв. Розрізняють такі типи ферментерів: лабораторні місткістю 0,5-100 л, промислові ємністю 1-100 м3 і більше. Обладнання, що застосовується в біотехнології у ході його експлуатації і поза її повинно бути легко доступним, функціонувати в певних рамках вимог гігієни і санітарії. У разі заміни будь-яких частин або деталей в апараті, чищення вузлів при поточному ремонті, і т. д., забруднення не повинні потрапляти всередину біореакторів, в матеріальні потокові комунікаційні лінії, в кінцеві продукти [14]. 

Проведення культивування S. peucetius передбачає забезпечення інтенсивного перемішування та аерації середовища. В обраному ферментері повинен бути достатній рівень масообміну, що досягається встановленням мішалки та повітря, яке подається через барботер. Застосування турбінної мішалки розташованої над барботером забезпечить високий рівень диспергування повітря, сприяючи збільшенню поверхні контакту фаз та коефіцієнту масопередачі. Оскільки турбінні мішалки забезпечують інтенсивне перемішування по всьому об'єму апарата [14]. Основною перевагою механічного перемішування є те, що можна легко змінювати технологічні умови та ефективно доставляти до зростаючих клітин повітря, що визначає характер розвитку мікроорганізмів і їх біосинтетичну активність. Для подачі гарячої/холодної води ферментер має бути оснащений рубашкою, щоб підтримувати необхідну температуру (30 °С) культивування.

Отже, для культивування S. peucetius найефективнішим являється ферментер з механічним перемішуванням барботажного типу, оснащений рубашкою, оскільки в ньому легко можна варіювати режими перемішування та масообміну, забезпечується рівномірний розподіл мікроорганізмів та компонентів поживного середовища.

5.2 Обґрунтування вибору стадії підготовки повітря

При вирощуванні мікроорганізмів в глибинних умовах потрібна безперервна подача стерильного повітря в ферментер, посівний апарат та інокулятори, на аерацію культуральної рідини. Повітря, що подається в ферментер, не тільки забезпечує культуру киснем, а і відводить газоподібні продукти обміну і фізіологічне тепло, яке виділяється мікроорганізмами в процесі розвитку, дозволяє досягти однорідності мікробної суспензії, збільшує швидкість масопередачі і перемішування рідкого поживного середовища.

Очистка і стерилізація повітря досягаються різними способами, які передбачають перш за все знищення мікроорганізмів або їх відділення. Використовуються методи газової очистки або застосування антисептиків, підвищення або пониження температури, ультрафіолетове випромінення, іонізуюче випромінення. Ці складні прийоми мало економічні через високу стійкість спор і конідій до високих температур і іонізуючого випромінювання. В процесах мікробіологічного синтезу повітря, що подається на аерацію повинно бути очищене на 99,9999 % від домішок і мікроорганізмів розміром до 1 мкм. Ця вимога примушує відмовитись від багатьох методів газової очистки як неефективних, що забезпечують виділення лише великих часток.

Найбільше розповсюдження отримав метод фільтрації повітря через волокнисті, пористі або зернисті матеріали. Такі матеріали недорогі і мають високу ефективність стерилізації.

Для попередньої очистки в даній роботі використовується фільтр ячейковий з пінополіуретаном, який є відносно стійким. Фільтри працездатні і зберігають свої технічні характеристики при температурі повітря, що очищається, від -40 °С до +70 °С. Навколишнє середовище і фільтроване повітря не повинне містити агресивних газів і пари.

Фільтри грубої очистки призначені для уловлювання основної маси забруднень, які потрапили в систему після проходження фільтрів попередньої очистки і компресора. Як правило це фільтри великої ємкості і є головними. Головний фільтр дублює роботу індивідуальних фільтрів і підвищує степінь очистки та стерилізації повітря. У даній технології для грубої очистки використовується рулонний фільтр з волокнами полімеру.

Фільтри тонкої очистки і стерилізації необхідні для уловлювання забруднень пропущених іншими фільтрами, а також всіх інших можливих забруднень, що потрапили в систему випадково. Конструктивно фільтри тонкої очистки дуже схожі на фільтри грубої очистки, тільки вони значно менші за розмірами і в них використовуються більш ефективні фільтруючі матеріали. В даній роботі використовується бактеріальний фільтр з фторопластовою мембраною або тканиною Петрянова, встановлюється звичайно біля кожного ферментатора чи реактора окремо.

Для стерилізації фільтрів та повітряних ліній застосовують найчастіше гостру пару. Цей метод створює дуже жорсткі умови для вибору фільтруючих матеріалів, так як через фільтр під тиском пропускається велика кількість гострої пари, часто забрудненої і з великим вмістом конденсату. Тому більш раціональна двостороння стерилізація фільтрів парою. Пара повинна поступати чиста і суха температурою 120 °С при стабілізованому тиску. Час стерилізації коливається від 30 до 60 хв в залежності від типу фільтруючого матеріалу.

5.3 Вибір мийних та дезінфікуючих засобів

Методи дезінфекції поділяються на фізичні і хімічні. До фізичних методів дезінфекції відноситься термічна дія у різних проявах, ультразвук, ультрафіолетові промені, рентгенівські промені, радіоактивні випромінювання та ін. В процесі виробництва доксорубіцину пропонується використовувати відносно безпечні та зручні методи, такі як оброблення парою (лабораторний посуд) та ультрафіолетовими променями (дезінфекція лабораторного боксу).

До засобів хімічних методів дезінфекції відносяться хімічні речовини, що мають бактерицидні властивості й відповідають таким вимогам: добра розчинність у воді, швидкість дії, нетоксичність, нешкідливість для обеззаражуваних предметів, забезпечувати нейтралізацію кислих забруднень та омилення жирів (для лужних мийних засобів); забезпечувати повне змочування поверхонь із різних конструкційних матеріалів, видалення механічного, білкового та жирового забруднень шляхом їх диспергування та емульгування; вони не повинні втрачати бактерицидних властивостей при контакті з оброблювальним матеріалами та при зберіганні, бути дешевими та легко транспортуватися.

Протимікробну дію проявляють лише ті препарати, які містять вільний елемент, зокрема хлор, що вивільняється з хлорного вапна, хлораміну Б чи хлоргекседину. Сполуки, до складу яких входять галогени у зв'язаному стані, але вони не вивільняються, наприклад, калію йодид, натрію хлорид тощо, протимікробних властивостей не мають.

Механізм протимікробної дії галогенів полягає в денатурації білків протоплазми мікробних клітин шляхом взаємодії з аміногрупами цих білків. Атоми хлору витісняють із цих груп водень. Денатурований таким чином білок втрачає свої властивості. В присутності органічних речовин їх протимікробний ефект значно зменшується.

Хлор - дуже активний бактерицидний елемент. Він проявляє протимікробну дію у формі недисоційованої хлорної кислоти (HOCl), яка утворюється при розчиненні хлора у воді при нейтральному чи кислому значеннях рН. На підприємствах використовуються хлорвмісні препарати - хлорне вапно, хлорамін Б і хлоргексидин.

Хлорамін Б препарат, що містить 25-29 % активного хлору. З нього цей елемент відщеплюється повільніше, тому засіб діє триваліше. Розчини хлораміну застосовують для дезинфекції приміщень та поверхні обладнання тощо. Хлорамін широко використовується для стерилізації води. 4-8 мг його в змозі простерілізувати 1 л води протягом 15-60 хв, якщо вона не містить значної кількості органічних речовин. Хлорамін Б має здатність знищувати неприємні запахи (дезодоруючі властивості).

Хлоргексидину біглюконат - бісдигуанідиновий дезинфікуючий і антисептичний засіб. Він здатний пошкоджувати плазматичну мембрану мікроорганізмів, особливо грамнегативних. Має бактерицидні властивості відносно грампозитивних і грамнегативних штамів патогенних мікроорганізмів, найпростіших, грибів. Не впливає на мікобактерії і спори.

Очищає і обезмікроблює шкіру, не пошкоджуючи її. Застосовується для обробки рук персоналу, робочих поверхонь в лабораторіях, 0,1 % водним розчином цього антисептика користуються для загальної дезинфекції приміщень, санітарного транспорту й обладнання. Може входити до складу комбінованих препаратів

Фенол, або кислота карболова. Як протимікробний засіб в 3-5 % розчинах застосовується для дезинфекції приміщень та поверхні обладнання.

Спирт етиловий - це засіб, протимікробна дія якого полягає в здатності забирати воду і викликати денатурацію білків протоплазми мікроорганізмів. На спорові форми не впливає. Бактерицидна дія починає проявлятися вже в розчині з концентрацією 20 %. Із її збільшенням цей ефект зростає. Але в білковому середовищі високі концентрації спирту утворюють щільні білкові конгломерати, в середині яких можуть знаходитись живі мікроорганізми. Тому на практиці, наприклад, для знезаражування шкіри, доцільніше використовувати 70 % спирт, тому що в такій концентрації він добре проникає в глибину шкіри, в протоки сальних і потових залоз, забезпечує високий антисептичний ефект в найближчі хвилини. За силою протимікробної дії 70 % спирт етиловий прирівнюється до 3 % розчину фенолу або 0,1 % розчину ртуті дихлориду.

Як протимікробний засіб спирт етиловий застосовується для обробки рук персоналу і робочої зони в лабораторії (70 %), стерилізації інструментів (90-95 %) тощо. Нерідко він використовується в поєднанні з іншими протимікробними засобами у вигляді розчинів.

Розчин перекису водню - прозора безбарвна рідина. Швидко розкладається на світлі, при нагріванні, під впливом різних сполук. Отримують його шляхом розбавлення водою концентрованого розчину перекису водню (пергідролю). Для дезінфекції використовуються 3 % та 6 % розчини перекису водню.

Приготування дезінфікуючих розчинів забезпечує відповідну якість дезінфікуючих розчинів для дотримання потрібного рівня асептики. Дана операція являється підготовчою для наступних операцій санітарної підготовки, які, в свою чергу, включені в технологічну схему для попередження контамінації. Допускається використовувати мийні, дезінфекційні, мийно-дезінфекційні засоби та антисептики, які в установленому порядку зареєстровані в Україні і дозволені до використання на підприємствах хіміко-фармацевтичної та біотехнологічної промисловості.

При використанні мийно-дезінфекційних засобів поєднують стадії миття та дезінфекції об'єктів в одній операції (виключають використання розчинів мийних засобів). Рекомендується чергувати дезінфекційні та антисептичні засоби кожні 1-3 місяці з метою запобігання розвитку та розповсюдженню стійких варіантів мікроорганізмів.

Готують дезрозчини в спеціальному посуді, зберігають обмежений час щоб уникнути зростання мікроорганізмів. Розчини використовують тільки свіжоприготованими. Розчини мийних, дезінфекційних, мийно-дезінфекційних засобів використовують одноразово (вони не підлягають повторному використанню).

В залежності від концентрації перекис водню проявляє бактерицидну, спороцидну дію, в більшій концентрації (6 %) застосовують для позбавлення від цвілі, тобто є універсальним. На відміну від альдегідів не проявляє подразнюючої дії , не накопичується в організмі людини, як сполуки металів, малотоксичний. Саме тому перекис водню доцільно використовувати в технології такого типу.

Таким чином, із запропонованих засобів вибираємо розчини перекіс водню різної концентрації, спирт етиловий та Хлорамін Б.

5.4 Особливості підготовки та стерилізації поживного середовища

В залежності від фізико-хімічних властивостей компонентів поживного середовища та їх об'єму, обирають обладнання для стерилізації [14].

Виходячи з наведених вище розрахунків, проаналізуємо можливі способи стерилізації поживного середовища для різних етапів підготовки інокуляту та для самого процесу біосинтезу.

На першому етапі для приготування посівного матеріалу в колбах потрібно 250 мл поживного середовища, а для першого інокулятора - 2,5 л. Для стерилізації компонентів обираємо автоклав. Поживне середовище для колб стерилізуємо в колбах місткістю 1 л, а середовище для інокулятора стерилізуємо у колбах місткістю 2 л. Важливо відмітити, що окремо від солей стерилізуються карбонвмісні компоненти при t = 112 0C.

Враховуючи, що час культивування в інокуляторі 2, посівному апараті та ферментері значний (по 148 год), то стерилізацію поживного середовища для них проводимо в окремих збірниках. Середовище пропонується поділити на композиції. Композиції будуть наступні:

Композиція 1. декстроза, пивні дріжджі.

Композиція 2. NaCl, КН2РО4, MgSО4, FeSО4 7H2О, ZnSО4 7H2О.

Композиція 3. CaCO3.

На першому етапі для вирощування посівного матеріалу в колбах потрібно 5 л поживного середовища. Тому для стерилізації компонентів обираємо автоклав з вертикальним завантаженням Systec VX (Німеччина), об'ємом 25 л [18]. Розчини кукурудзяного екстракту та декстрози стерилізуємо в окремій колбі при t = 112 єС (30 хв). Дані умови обираємо, аби уникнути розкладання, оскільки дані компонент є термолабільними. Розчин крохмалю попередньо заварюємо та стерилізуємо в окремій колбі при t = 112 єС (30 хв). Солі: магнію сульфат, цинку сульфат, натрію хлорид, калію фосфат, заліза сульфат, стерилізують в автоклаві при температурі 130 °С, тиску 0,15 атм. протягом 40 хв. Для запобігання випадання осаду, що може утворитися при взаємодії фосфорних солей з катіонами магнію, слід калій фосфорнокислий одно заміщений стерилізувати оремо, при температурі 130 °С, тиску 0,15 атм. протягом 40 хв [16]. Суспензію крейди стерилізують в автоклаві при температурі 130 °С, тиску 0,15 атм. протягом 40 хв.

Кількість декстрози та пивних дріжджів, необхідних для приготування середовища для вирощування посівного матеріалу в інокуляторі об'ємом 100 л, є невеликою (10 кг), тому її розчин (28 л) стерилізуємо в автоклаві. Розчини солей стерилізуємо разом безпосередньо в інокуляторі попередньо довівши значення рН до 4,5 для попередження випадіння осаду. Для приготування розчину перед інокулятором передбачаємо реактор-змішувач об'ємом 10 л. Суспензію крейди (8 л) стерилізують в автоклаві при температурі 130 °С, тиску 0,15 атм. протягом 40 хв.

Розчини декстрози та пивних дріжджів для приготування середовища, необхідного для одержання посівного матеріалу в посівному апараті об'ємом 1 м3, стерилізуємо в окремому апараті об'ємом 1,5 м3 (100 кг компонентів та 280 л води). Розчин солей стерилізуємо безпосередньо у посівному апараті місткістю 1 м3, попередньо довівши значення рН до 4,5 для попередження випадіння осаду. Перед посівним апаратом передбачаємо реактор-змішувач об'ємом 1 м3 для приготування цього розчину. Суспензію крейди (10 л) стерилізують в окремому апараті, об'ємом 20 л при температурі 130 °С, тиску 0,15 атм. протягом 40 хв. Для приготування суспензії крейди передбачаємо збірник, об'ємом 20 л.

Для виробничого ферментера об'єм середовища становить 2,5 м3. З економічної точки зору доцільніше для стерилізації такої кількості поживного середовища застосовувати установку безперервної стерилізації. Її використання дозволяє зменшити витрати води, пари, теплової енергії і скоротити час обробки поживного середовища. Таку кількість середовища можна простерилізувати в УБС-5, потужністю 5 м3/год. Загальний час стерилізації поживного середовища становить ф = 5/5 = 1 год. Розчин усіх компонентів поживного середовища готується в одному реакторі-змішувачі. Суспензію крейди (50 л) стерилізують в окремому апараті, об'ємом 100 л при температурі 130 °С, тиску 0,15 атм. протягом 40 хв. Для приготування суспензії крейди передбачаємо збірник, об'ємом 0,1 м3.



РОЗДІЛ 6. СПЕЦИФІКАЦІЯ ОБЛАДНАННЯ

Індекс і номер за схемою	Найменування	Кількість одиниць	Матеріал робочої зони	Технічна характеристика
ПЗ-1	Повітрезабірник	1	Сталь
Ф-2	Фільтр грубої очистки	1	Сталь 08Х25Т	Вертикальний циліндричний з еліптичним днищем і кришкою, в середині решітки для укладання фільтрув. матеріалу - скловолокна, об'єм 20м3, діаметр 2400мм, висота 4900мм, креслення «Южгіпробіосинтез» №620.61.000000

Подобные документы

• Біосинтез гіберелінів

  Дослідження властивостей гіберелінів, групи гормонів рослин, які регулюють ріст і різноманітні процеси розвитку. Характеристика етапів синтезу гіберелінів. Огляд методу зануреного культивування грибів фузарій. Вплив аерації та температури на біосинтез.
  
  реферат [961,4 K], добавлен 10.01.2014
  

• Бета-каротин: принцип застосування, культивування мікроорганізмів, аналіз становища і перспектив у виробництві

  Обґрунтування вибору методу та місця впровадження біотехнологічного виробництва. Характеристика біологічного агенту, сировини та допоміжних речовин. Механізм біотехнологічного процесу виробництва бета-каротину. Стандартизація та контроль якості продукції.
  
  дипломная работа [1,6 M], добавлен 19.06.2013
  

• Розробка технології культивування ооцит-кумулюсних комплексів in vitro за осциляції рН і температури середовища їх дозрівання

  Характеристика біотехнології отримання ембріонів in vitro, напрямки та перспективи її вдосконалення. Умови середовища культивування ооцит-кумулюсних комплексів. Впровадження біоритмічно осцилюючих параметрів культивування біологічних мікрооб’єктів.
  
  статья [150,5 K], добавлен 21.09.2017
  

• Інсулін

  Відкриття та дослідження молекули інсуліну, її хімічна будова. Біосинтез інсуліну, регуляція його секреції, функції та перетворення в організмі, властивості та біологічна дія. Методи визначення інсуліну, його застосування для виготовлення препаратів.
  
  реферат [2,7 M], добавлен 09.01.2010
  

• Загальна біотехнологія

  Оптимізація складу живильних середовищ для культивування продуцентів біологічно активних речовин, способи культивування. Мікробіологічний контроль ефективності методів стерилізації. Методи очищення кінцевих продуктів біотехнологічних виробництв.
  
  методичка [1,9 M], добавлен 15.11.2011
  

• Культивування тваринних клітин

  Основні процеси, за допомогою якого окремі клітини прокаріотів і еукаріотів штучно вирощуються в контрольованих умовах. Здатність перещеплених клітин до нескінченного розмноженню. Культивування клітин поза організмом. Основні види культур клітин.
  
  презентация [1,3 M], добавлен 16.10.2015
  

• Природні адсорбенти тваринного походження

  Адсорбція як поглинання кількості речовини з газоподібного середовища або розчину поверхневим шаром рідини. Розгляд основних властивостей адсорбентів: відсутністю каталітичної активності, механічна міцність. Аналіз сорбентів тваринного походження.
  
  курсовая работа [66,1 K], добавлен 12.03.2015
  

• Матричний синтез білка

  Біосинтез білка. Будова рибосом прокаріотів та еукаріотів. Роль мембран у формуванні клітинних компартментнів. Ароморфози як біологічний процес. Асиметричність плазматичної і внутрішніх мембран клітини. Транспортування речовин через мембрани.
  
  контрольная работа [69,2 K], добавлен 04.11.2010
  

• Виробництво кормового білка

  Вивчення середовища для виробництва білкових концентратів із водоростей, бактерій, рослин, дріжджів та грибів. Огляд ферментаторів для стерильного культивування мікроорганізмів. Аналіз флотації, сепарування, випарювання й сушіння для одержання протеїнів.
  
  дипломная работа [126,7 K], добавлен 07.05.2011
  

• Генетично модифіковані організми та їх вплив на людину

  Основні етапи створення генетично модифікованих організмів. Експресія генів у трансформованій клітині. Селекція трансформованого біологічного матеріалу (клону) від нетрансформованого. Перспективні методи рішення проблеми промислових забруднювачів.
  
  презентация [5,1 M], добавлен 05.03.2014
  

• главная
• рубрики
• по алфавиту
• вернуться в начало страницы
• вернуться к началу текста
• вернуться к подобным работам