Розробка технології культивування ооцит-кумулюсних комплексів in vitro за осциляції рН і температури середовища їх дозрівання

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Розробка технології культивування ооцит-кумулюсних комплексів in vitro за осциляції рН і температури середовища їх дозрівання

Розробка технології отримання доімплантаційних ембріонів in vitro - важливе наукове завдання, над яким працюють науковці усього світу. На цьому шляху досягнуто вражаючих результатів. Тим не менше, усі ланки біотехнологічного процесу отримання ембріонів in vitro поступаються ефективністю перед такими, що мають місце in vivo. Покращення розвитку ооцит-кумулюсних комплексів (ОКК) in vitro теж залишається не вирішеною проблемою.

Фізіологічні процеси принципово нелінійні. Перехід клітин з одного крайнього фізіологічного стану, у якому переважають анаболічні процеси, в інший, у якому переважають катаболічні процеси, подібний до коливання механічного маятника, осциляції. Результат розвитку біологічного об'єкта-процесу не лише запрограмований, а визначається й впливом зовнішніх умов середовища. З усіх відомих способів використання зовнішніх умов середовища для покращення росту й розвитку клітин і ембріонів найбільш адекватним їхній природі є спосіб застосування та підтримання біоритмічної осциляції величин параметрів цих умов. Найвідоміша й найзрозуміліша теоретична підстава для розширення застосування осциляції умов середовища розвитку гамет, клітин і ембріонів - природна біоритмічна осциляція величин їхніх параметрів і зовнішнього оточення. Найзагальніша теоретична підстава - сприяння взаємопереходу протилежних властивостей біооб'єктів в їх кількісних і якісних змінах.

Теорія й практика біології та медицини свідчать про те, що дію специфічних факторів росту й розвитку живого можна деякою мірою замінити та доповнити дією неспецифічних факторів [1, 2, 3, 11], зокрема, зміною температури та концентрацій різних іонів, особливо катіонів водню [9, 10, 19, 20]. Та разом із тим є дослідження, які наштовхують на думку про шкідливість будь-якого маніпулювання з температурою середовища культивування, окрім підтримання її постійною [21, 22]. Але інші факти свідчать про те, що парадигма постійності (стабільності) є обмеженою. Так, показано, що запліднення ооцитів ссавців in vitro породжує в них осциляцію [18]. І хоча в зиготах миші така осциляція триває зовсім недовго, порівняно з тривалістю культури доімплантаційних ембріонів in vitro [14], якщо її підтримувати й далі, розвиток ембріонів значно покращується [15, 16].

А тому можна сподіватися на успішне застосування біоритмічної осциляції рН і температури як факторів, що стимулюють ріст і розвиток ОКК. У зв'язку з цим метою роботи стала розробка технологій створення осциляції рН і температури in vitro для культивування ОКК за цих умов. Розробка цієї біотехнології включала створення таких технологій і систем біоритмічної осциляції рН і температури in vitro, які дозволили б культивувати в таких умовах ОКК, а в майбутньому - і доімплантаційні ембріони.

ОКК отримували з яєчників свіні, привезених з м'ясокомбінату. Яєчники транспортували в термосі при температурі, не нижчій ніж 20°С. Час від узяття першого яєчника до початку виділення ОКК - від 2 год до 3 год. У лабораторії, в універсальній настільній бактерицидній камері УНБК-1, в яку вмонтовано бінокулярний мікроскоп, яєчник обмивали стерильним фізіологічним розчином з температурою від 25° С до 39° С. ОКК разом з фолікулярною рідиною (ФР) вилучали з фолікулів піпеткою з металевою голкою.

Використовували фолікули з діаметром, не меншим за 2 мм. Відсмоктану піпеткою ФР з ОКК виприскували у флакончик об'ємом 20 мл. Зібраній у такий спосіб ФР з ОКК давали відстоятися 5 хв, щоб останні осіли на дно. ФР відбирали, залишаючи ОКК на дні флакона, й центрифугували її 5 хв за 3 тис. об./хв. Центрифуговану ФР додавали в кількості 10 або 20% до середовища дозрівання ОКК. Залишок ФР з ОКК знову збовтували й виливали в чашку Петрі, у якій ОКК відшукували й переносили в середовище дозрівання. Деякі елементи цієї й наступних методик викладені в роботах [12, 13].

ОКК розсаджували наздогад у дослідні та контрольні скляні чашки з поживним середовищем. Скляні чашки культивування власноручно виготовляли з флаконів з-під інсуліну. Діаметр чашки - 15 мм, висота - 10 мм.

Температуру й рН контрольного середовища дозрівання підтримували постійними. Температуру й рН дослідного середовища дозрівання примушували осцилювати. Перед постановкою ОКК на культуру вимірювали їхній діаметр.

Чашки з ОКК вкладали в газові камери, у яких їх продували газовою сумішшю з СО2 й повітря. Флакони вкладали в термостат та термоосцилятор.

Для дозрівання ОКК використовували середовище NCSU, яке готували самостійно за літературним прописом [17]. Його склад такий: хлорид натрію - 108,7 мМ, хлорид калію - 4,78 мМ, лактат кальцію п'ятиводний - 1,71 мМ, калій фосфорнокислий однозаміщений - 1,19 мМ, сульфат магнію семиводний - 1,19 мМ, глутамін - 1,0 мМ, глюкоза - 5,55 мМ, таурин - 7,0 мМ, гіпотаурин - 5,0 мМ, піруват натрію - 0,33 мМ, гідрокарбонат натрію - 25,07 мМ, гентаміцину сульфат - 20 мкг/мл, цистеамін - 0,57 мМ. Отримане середовище стерилізували фільтруванням за допомогою власноручно зібраної установки. Вакуум створювали вакуумним компресором. Приготоване середовище продували газовою сумішшю, що давала рН від 7,3 од. до 7,4 од., й зберігали в холодильнику. Напередодні культивування середовище розливали по скляних камерах, по 0,7 мл й нашаровували на нього вазелінову олію, теж по 0,7 мл. Скляні камери з середовищем вкладали в газові камери, або витягували з них за допомогою спеціального пінцета. Стерильне середовище доповнювали 10% або 20% ФР, 10 МО/мл хоріонічного гонадотропіну людини та 10 МО/мл хоріонічного гонадотропіну коня, гормонами, які повсюдно додаються до середовища культивування ОКК свині [10].

Через 24 год. культивування ОКК їхній діаметр вимірювали повторно й визначали процент його відносного приросту за формулою Броді [8]: процент відносного приросту = 2 х 100 х [(М2 - М1)] / [(М2 + М1)], де М1 - діаметр ОКК до культивування, М2 - діаметр ОКК через добу культивування.

Осциляцію рН середовища культивування з добовим періодом створювали за методом Денисюка [4, 5] за новим призначенням [7]. Для цього використовували спеціально сконструйовані газові камери - алюмінієві бюкси з напівпроникними для газів трубками із силіконової гуми [5]. ОКК переносили в скляні камери з середовищем дозрівання, на яке попередньо нашаровували вазелінову олію. Ці камери вкладали в газові камери. Останні продували сумішшю СО₂ з повітрям, яка надавала середовищу мінімальний рН у 7,2 од. й уставляли в термостат або термоосцилятор залежно від того, який варіант культивування здійснювали - лише осциляцію рН, чи й осциляцію температури. Через добу рН середовища ставав значно лужним завдяки виходу СО₂ із середовища у простір газової камери, а потім із нього - в повітряний простір термостата чи термоосцилятора за градієнтом його концентрації. У цей час, за умов досягнення максимального рН середовища, скляні камери витягували з газових, розглядали ОКК й вимірювали їхній діаметр. Вимірювали також діапазон осциляції рН.

Осциляцію температури з 40-хвилинним періодом у термостаті ТС-80 створювали в такий спосіб укладали в термостат закриті пляшки з водою [6].

Термостат приєднували до електричної мережі через декілька послідовно з'єднаних таймерів фірм «Вгіїих» та «Бегоп», розробивши графік почергового, через кожні 20 хв, увімкнення-вимкнення термостата, й відповідно запрограмували на умикання-вимикання таймери.

Амплітуду осциляції температури регулювали шляхом зміни в термостаті об'єму води. Чим менший об'єм води містився в термостаті, тим більшою була амплітуда осциляції температури. Робота термостата в такому режимі перетворює його в термоосцилятор. Температуру в камері культивування вимірювали ртутним термометром.

На рис. 1 наведено графік синусоїдальної зміни температури середовища культивування з 40-хвилинним періодом у термоосциляторі. Величину амплітуди осциляції температури вимірювали вранці.

Як газову фазу середовища культивування використовували суміш 5% СО₂ з повітрям. Суміш СО2 з повітрям створювали шляхом змішування потоків СО₂, з балона, і повітря, яке подавали за допомогою акваріумного компресора. Змішування потоків газів проводили в колбі Боброва, заповненій бідистильованою водою. Потрібної для культивування величини постійного рН досягали шляхом збільшення чи зменшення одного з газових потоків за безперервного контролю цього показника середовища культивування рН-метром [2, 4, 5].

Усього було досліджено 22 культури. Усі дослідження проведені в лабораторії фізіології Інституту свинарства і агропромислового виробництва НААН України.

Графік зміни температури середовища культивування ОКК з 40-хвилинним періодом її осциляції в термоосциляторі

біотехнологія ембріон ооцит

Результати та їх обговорення

Розроблено технологію культивування ОКК in vitro із застосуванням біоритмічної осциляції рН і температури як факторів стимуляції їх росту й розвитку.

Порівняння процента приросту діаметра ОКК за постійної та осцилюючої температури, незалежно від інших умов культивування (табл.), показує відсутність достовірних відміностей між цими величинами.

Приріст діаметра ОКК за постійної та осцилюючої температури

Примітка. Відмінність між відповідними значеннями приросту не достовірна.

Так само, відсутня достовірна різниця й між процентом приросту діаметра ОКК за постійного та осцилюючого рН, не залежно від інших умов культивування (табл. 2). В обох випадках її можна пояснити недостатньою тривалістю культивування. Можна припустити, що якщо процес культивування подовжити до запліднення ооцитів і культивування ембріонів до стадії бластоцисти, відмінність у впливові постійного й осцилюючого факторів на ці біологічні об'єкти стане достовірною. Потрібно також віднайти найкращий діапазон осциляції рН і температури.

Виявлена слабка й недостовірна кореляція між приростом діаметра ОКК і величиною розмаху осциляції температури (рис.).

Приріст діаметра ОКК за постійного та осцилюючого рН

Примітка. Відмінність між відповідними значеннями приросту не достовірна.

Залежність процента приросту величини середнього діаметра ОКК від величини розмаху осциляції температури (г - коефіцієнт кореляції; г² - коефіцієнт регресії)

На підставі цих даних можна припустити, що розмах осциляції, менший за 0,5°С, активує слабо, а розмах осциляції, що перевищує 2,2°С, починає пригнічувати розростання все більшої кількості ОКК.

Процент приросту діаметра ОКК за осцилюючого рН середовища культивування негативно з середньою силою достовірно корелював з величиною розмаху осциляції рН (рис.).

Залежність процента приросту величини середнього діаметра ОКК від величини розмаху осциляції рН (г - коефіцієнт кореляції; г² - коефіцієнт регресії)

Якщо зважати на всю картину цієї залежності, можна дійти висновку, що рис. 3 вказує на шкідливість застосування осциляції рН. Але потрібно зважити на такі обставини. Точки на графіку цієї залежності, які відповідають розмаху рН в 1,35 од., отримані за відносно малої величини початкового середнього діаметра ОКК, - 10-те й 12-те місце в ранжованому ряду від більшої величини до меншої серед 13-ти величин, відповідно до 13-ти культур. Точка на графіку цієї залежності, яка відповідає розмаху рН в 1,13 од., отримана за найменшої величини початкового середнього діаметра ОКК, - 13-те місце в цьому ранжованому ряду. Як бачимо, розмір початкового середнього діаметра дуже впливає на цю закономірність. Точка на графіку цієї залежності, яка відповідає розмаху рН в 0,98 од., отримана за величини початкового середнього діаметра ОКК, яка займає 2-ге місце в цьому ранжованому ряду. Вона фактично випадає з множини результатів, отриманих за осцилюючого рН. Адже результат виявився найгіршим в ранжованому ряду, - 13-те місце з-поміж 13-ти результатів. А розмах осциляції рН в 0,96 та 1,02 од. дав хороші результати. Щоб бути обережним, слід припустити, що розмах осциляції рН, більший за 1,0 од., може бути тим шкідливішим, чим він більший за 1,0 од. Виходячи з того, що середній розмах осцилюючого рН по 13-ти культурам - 0,86 ± 0,1 од., рН можна піддавати осциляції в діапазоні від 7,2 од. до 8,06 ± 0,1 од. (до 7,96-8,16 од.). Не слід забувати й про можливу нелінійність залежності процента приросту діаметра ОКК від величини розмаху осциляції рН середовища їх дозрівання. Припускаємо, що в подальшому можливе точніше визначення величини оптимального розмаху осциляції рН із метою отримання оптимального приросту діаметра ОКК за їх дозрівання in vitro.

Висновки

Розроблено технологію культивування in vitro ОКК у середовищі, температуру якого піддають осциляції в діапазоні від 37°С до 39°С з 40-хвилинним періодом. Розроблено технологію культивування in vitro ОКК у середовищі, рН якого піддають осциляції в діапазоні від 7,2 од. до 8,1 од. з періодом в одну добу. Було показано, що немає достовірної відмінності між процентами приросту діаметра ОКК за постійної та осцилюючої температури. Доведено, що немає достовірної вдмінності між процентами приросту діаметра ОКК за постійного та осцилюючого рН. Хоча експериментально нами показано, що осцилюючі умови культивування не гірші за постійні, наведені літературні дані, й наше відповідне обґрунтування, беззаперечно свідчать про перспективність використання саме осцилюючих умов як неспецифічних факторів, що стимулюють ріст і розвиток ОКК in vitro.

Враховуючи перспективи подальших досліджень, вважаємо, що потрібно дослідити вплив застосування осцилюючих рН і температури на запліднення in vitro дозрілих in vitro ооцитів та на подальший розвиток отриманих у такий спосіб ембріонів. Адже чим довше продовжуватиметься культура за осцилюючих рН і температури, тем більшою буде імовірність того, що збільшиться відмінність між результатами культивування за постійних умов, з одного боку, та за осцилюючих, з іншого, імовірно, - на користь осцилюючих умов.

Література

1. Денисюк П.В. Принципиально новый метод культивирования доимплантационных эмбрионов млекопитающих / П.В. Денисюк, Н.А. Мартыненко // Доповіді НАН України. - 1995. - №11. - С. 148-149.

2. Денисюк П.В. Вплив рН середовища на розвиток in vitro доімплантаційних ембріонів свині: автореф. дис. на здобуття наук. ступеня канд. біол. наук: спец. 03.00.13. «Фізіологія людини і тварин» / П.В. Денисюк. - Х., 1997. - 25 с.

3. Денисюк П.В. Теоретичні та експериментальні основи осциляторного способу утримання птахів і ссавців / П.В. Денисюк, О.Г. Чирков // Наук. вісн. ЛНАВМ ім. С.З. Ґжицького. - 2004. - Т. 6, №3, Ч. 3. - С. 42-52.

4. Пат.10067 А, Україна, клас 5 С12 N5/00 Спосіб культивування доімплантаційних ембріонів ссавців поза організмом / Денисюк П.В.; заявник і патентоутримувач Інститут свинарства УААН. - №93111621; заявл. 23.04.1993; опубл. 30.09.1996, Бюл. №3.

5. Пат. 46186 А, Україна, клас 6 А61М1/14, C/12N5/06. Спосіб примусової осциляції рН середовища культивування біологічних мікрооб'єктів / Денисюк П.В.; заявник і власник патенту Інститут свинарства УААН. - №98094883; заявл. 17.09.1998; опубл. 15.05.2002, Бюл. №5.

6. Пат. 62419 Україна, МПК (2011.01) A01 63/00. Спосіб культивування поза організмом ооцит-кумулюсних комплексів (ОКК) за температури, осцилюючої з одногодинним періодом / Корчан Н.О., Денисюк П.В.; заявник і власник патенту Інститут свинарства ім. О.В. Квасницького НААН України. - № u201101851; заявл. 17/02/2011; опубл. 25.08.2011. Бюл. №16.

7. Пат. 68013 Україна, МПК (2012.01), 02N 5/00, А61М 1/00. Застосування примусової біоритмічної осциляції рН середовища культивування поза організмом як способу, призначеного для збільшення міри розростання ооцит-кумулюсних комплексів (ОКК) / Корчан Н.О., Денисюк П.В.; заявник і власник патенту Інститут свинарства і агропромислового виробництва НААН України. - № u 2011 10439; заявл. 29.08.2011; опубл. 12.03.2012, Бюл. №5.

8. Brody S. Bioenergetics and growth. With special reference to the efficiency complex in domestic animals / Brody S. - N.Y.: Hafner, 1945. - 1023 p.

9. Cooke S. Objective assessment of temperature maintenance using in vitro culture techniques / S. Cooke, J.P.P. Tyler, G. Driscoll // J. of Assisted Reprod. and Genetics. - 2002. - Vol. 19, №8. - P. 368-375.

10. Ju J.C. Nuclear and cytoskeletal alterations of in vitro matured porcine oocytes under hyperthermia / J.C. Ju, J.K. Tseng // Mol. Reprod. and Dev. - 2004. - Vol. 68, Is. 1. - P. 125133.

11. Koike T. In vitro culture with a tilting device in chemically defined media during meiotic maturation and early development improves the quality of blastocysts derived from in vitro matured and fertilized porcine oocytes / T. Koike, K. Matsuura, K. Naruse, H. Funahashi // J. Reprod. Dev. - 2010. - Vol. 56, №5. - P. 552 - 557.

12. Effects of in vitro fertilization conditions on preimplantation development and quality of pig embryos / D.B. Koo, Y.J. Kim, I. Yu et al. // Anim. Reprod. Sci. - 2005. - Vol. 90, Is. 12. - P. 101-110.

13. Krisher R.L. Oocyte Physiology and Development in Domestic Animals / Krisher R.L. - John Wiley & Sons, 2013. - 248 c.

14. Marangos P. Ca²+ oscillations at fertilization in mammals are regulated by the formation of pronuclei / P. Marangos, G. Fitzharris, J. Carroll // Development. - 2003. - Vol. 130. - P. 1461-1472.

15. Ozil J.P. Role of calcium oscillations in mammalian egg activation: experimental approach /

J.P. Ozil // Biophis. Chem. - 1998. - Vol. 72, №1-2. - P. 141-152.

16. Ozil J.P. Egg activation events are regulated by the duration of a sustained [Ca (2+)] (cyt.) signal in the mouse / J.P. Ozil, S. Markoulaki, S. Toth et al. // Dev. Biol. - 2005. - Vol. 282. - P. 39-54.

17. Petters R.M. Culture of pig embryos / R.M. Petters, K.D. Wells // J. Reprod. Fertil. - 1993. - Suppl. 48. - P. 61-73.

18. Saunders C.M. PLC zeta: a sperm - specific trigger of Ca (2+) oscillations in eggs and embryo development / C.M. Saunders, M.G. Larman, J. Parrington et al. // Development. - 2002. - Vol. 129, N. 15. - P. 3533-3544.

19. Shi D.S. Effects of temperature gradients on in vitro maturation of bovine oocytes / D.S. Shi, B. Avery, T. Greve // Theriogenology. - 1998. - Vol. 50, №4. - P. - 667-674.

20. Suzuki H. Influence of incubation temperature on meiotic progression of porcine oocytes matured in vitro / H. Suzuki, Y. Takashima, K. Toyokawa // J. Mamm. Ova Res. - 2001. - Vol. 18. - P. 8-13.

21. Tseng J.K. In vitro thermal stress induces apoptosis and reduces development of porcine /

J.K. Tseng, P C. Tang, J.C. Ju // Theriogenology. - 2006. - Vol. 66 (5). - P. 1073-1082.

22. Heat shock at the germinal vesicle breakdown stage induces apoptosis in surrounding cumulus cells and reduces maturation rates of porcine oocytes in vitro / Y. Yuan, Z.D. Hao, J. Liu et al. // Theriogenology. - 2008. - Vol. 70. - Is. 2. - P. 168 - 178.

Размещено на Allbest.ru