Исследование факторов роста

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Введение

В организме синтезируются факторы роста, которые, обеспечивают оптимальное преобразование структуры различных тканей. Такое структурное преобразование (ремоделирование) обеспечивает наилучшее выполнение функций в изменяющихся условиях, т.е. адаптацию.

Кроме того, действие факторов роста на ткани организма лежит в основе восстановления ткани после повреждений.

Таким образом, факторы роста фактически обеспечивают молодость различных тканей и препятствуют их разрушению и старению. Такие свойства факторов роста обуславливают желание представителей фармацевтической индустрии создавать препараты на их основе. Оказывается, экзогенное поступление факторов роста может спровоцировать запускание канцерогенеза. В этом мы видим огромную актуальность проблемы и считаем, что скрупулезные фундаментальные исследования позволят внести ясность и регламентировать медикаментозные вмешательства с применением факторов роста.

Целью прохождения производственной практики является закрепление знаний, умений и навыков, полученных в процессе обучения, а также сбор информации на тему «Факторы роста в инициации канцерогенеза».

Задачи производственной практики:

- ознакомится с физиологической ролью факторов роста в организме;

- изучить участие факторов роста в канцерогенезе;

- ознакомиться с последствиями генной терапии, на примере факторов роста;

- исследовать методы, применяемые для изучения факторов роста;

- привести данные результатов исследований, демонстрирующие усиление экспрессии VEGF в неопластической ткани.

1. Физиологическая роль факторов роста в организме HIF, VEGF, IGF

Факторы роста, взаимодействуя с рецепторами, расположенными на поверхности клеток, или с внутриклеточными рецепторами, они стимулируют в клетке каскад событий, приводящих к активации генов, ответственных за синтез белков, обеспечивающих рост и деление клеток.

Гипоксия-индуцибельный фактор-1 (HIF-1) - транкрипционный фактор впервые был идентифицирован Грегом Семензой с сотрудниками из университета Джона Хопкинса в Балтиморе в 1992 году как регулятор экспрессии эритропоэтина (EPO) [24].

Экспрессия HIF-1alpha и уровень этого белка зависят от концентрации и парциального давления кислорода (рО2) в крови [11] - в состоянии гипоксии наблюдается повышение активности HIF-1alpha. Он обеспечивает быстрые и адекватные ответы на гипоксический стресс, включает гены, регулирующие процесс ангиогенеза, вазомоторный контроль, энергетический метаболизм, эритропоэз и апоптоз [5,16,18,22,25].

Можно выделить несколько основных функций HIF - фактора:

- экспрессия генов, улучшающих доставку кислорода (среди них - синтез эритропоэтина, эндотелиального фактора роста VEGF, трансферрина и других белков);

- реакции, контролирующие метаболические пути (ферменты гликолиза и транспорта глюкозы).

Среди факторов роста одно из ключевых мест занимает фактор роста эндотелия сосудов (vascular endothelial growth factor, VEGF), который принимает участие в индукции и регуляции как нормального, так и патологически измененного ангиогенеза, стимулирует пролиферацию эндотелиоцитов [14].

В норме VEGF содержится в тканях в незначительном количестве, но экспрессия его гена значительно активируется при гипоксии через индукцию, знакомого нам транскрипционного фактора HIF-1 [23].

Фактор роста эндотелия сосудов был впервые описан в 1989 г. как гепарин-связывающий ангиогенный фактор роста, который оказывает выраженное митогенное воздействие на эндотелиальные клетки. Этот фактор показал себя мощным ангиогенным белком в различных экспериментальных системах.

VEGF, влияя на развитие новых кровеносных сосудов и выживание незрелых кровеносных сосудов (сосудистая поддержка), связывается с двумя близкими по строению мембранными тирозинкиназными рецепторами (рецептором-1 VEGF и рецептором-2 VEGF) и активирует их.

Эти рецепторы экспрессируются клетками эндотелия стенки кровеносных сосудов. Связывание VEGF с этими рецепторами запускает сигнальный каскад, который в конечном итоге стимулирует рост эндотелиальных клеток сосуда, их выживание и пролиферацию [7,8,10,15].

VEGF обеспечивает выход из сосудов плазменных белков (фибронектин, витронектин, фибриноген, факторы коагуляции) и активирует экспрессию тканевого фактора (клеточный инициатор коагуляции крови), что ведет к формированию зацепок для мигрирующих эндотелиальных и гладкомышечных клеток. После образования новых сосудов фактор VEGF выступает как фактор выживаемости и подавляет апоптоз эндотелиоцитов [7,8,10,15].

Считается, что основным физиологическим действием этого белка является митогенный эффект на клетки эндотелия сосудов. При этом он практически не влияет на пролиферацию других клеток. В физиологических концентрациях фактор роста эндотелия сосудов действует как фактор, обеспечивающий выживание эндотелия.

Основные функции, выполняющие VEGF в организме:

- ангиогенное действие;

- иммунорегуляторные функции [6];

- влияет на гемопоэз;

- дифференцировку и созревание дендритных клеток[15], а также лимфоцитов. Т и. В[12].

Инсулиноподобный фактор роста-1, или IGF-1, или соматомедин С. IGF-1 представляют собой группу факторов роста, которые структурно похожи на инсулин.

IGF-I и IGF-II имеют, соответственно, 43% и 41% гомологии с инсулином. Основным источником IGF в организме человека является печень, но эти пептиды также синтезируются в большинстве тканей организма. Оба фактора в крови человека циркулируют в виде белкового комплекса, состоящего из IGFBP-3, молекулы IGF-I или IGF-II и кислото-лабильной субъединицы, только около 5-6% IGF остаются в свободной форме[2].

В периферических тканях именно IGF-1 обеспечивает практически все физиологические эффекты соматотропного гормона.

Так же как и СТГ, оба IGF действуют на гипоталамус и аденогипофиз по принципу обратной связи, контролируя синтез соматолиберина и соматостатина и секрецию СТГ.

При низком уровне IGF-1 в крови, секреция соматолиберина и соматотропина возрастает, при высоком - снижается.

Рецептор IGF- I типа (IGF-1R) - член семейства рецепторных тирозинкиназ, состоит из двух субъединиц и двух в-субъединиц. При активации IGF-1R путем связывания с IGF с экстрацеллюлярной б - субъединицей происходит активация киназного домена, что, в свою очередь, ведет к рекрутированию в область в - субъединиц адаптерных молекул, таких как субстраты инсулинового рецептора 1 и 2. В результате активируются множественные сигнальные пути, включающие путь с вовлечением митоген-активируемой протеинкиназы и фосфатидилинозитол-3-киназный путь, которые ведут к стимуляции клеточной пролиферации, подавлению апоптоза в клетках, клеточной подвижности и другим эффектам [27].

Инсулиноподобный фактор роста-1 имеет следующие биологические свойства:

§ стимулирует включение сульфатов в хрящ;

§ обладает не подавляемой инсулиноподобной активностью;

§ стимулирует размножение клеток;

§ обладает выраженной анаболической активностью;

§ связывается со специфическими транспортными белками;

§ обладает выраженными иммуностимулирующими функциями.

2. Факторы роста HIF, VEGF, IGF в инициации канцерогенеза

Как же влияют факторы роста на развитие канцерогенеза, при использовании их в генной терапии?

Очевидно, что если гены, кодирующие рецепторы, трансдукторы сигналов и транскрипционные факторы, изменены вследствие мутаций таким образом, что экспрессируются постоянно, то контролируемый рост заменяется неограниченной пролиферацией[3].

В раковом процессе HIF может обеспечивать как адаптацию тканей к гипоксии и ангиогенез, способствуя поддержанию кислородного гомеостаза в физиологических условиях, так и провоцировать рост опухолевых тканей. Повышенный уровень HIF - 1 alpha в опухолевых тканях по сравнению с уровнем в окружающих нормальных тканях обычно коррелирует со степенью развития рака и смертностью[17].

Это связано с тем, что в развитии раковых опухолей важным фактором является гипоксия. Пока первичная опухоль не сформировала адекватное кровоснабжение, уменьшенная диффузия кислорода провоцирует экспрессии

HIG - 1alpha, а следовательно, васкуляризацию, рост опухоли и метастазирование.

В том случае, если применяют VEGF экзогенно для лечения таких, заболеваний как ишемия сердца, хроническая ишемия нижних конечностей, атеросклеротическое поражение сосудов, усиливается процессы образования и роста кровеносных сосудов не только в пораженных сосудах, но ускоряется неоангиогенез в неопластической ткани.

Известно, что практически все опухоли продуцируют VEGF и уровень его содержания в циркуляции может существенно возрастать. [13,19].

Рост опухоли возможен, благодаря формированию новой системы кровоснабжения. Oпухолевый ангиогенез, является неотъемлемой частью при распространении опухолевых клеток и росте метастазов.

В отличие от обычной, нормальной сосудистой сети, которая быстро созревает и стабилизируется, кровеносные сосуды опухоли имеют структурные и функциональные аномалии. В них нет перицитов клеток, функционально связанных с сосудистым эндотелием и крайне важных для стабилизации и созревания сосудистых структур. Кроме того, сосудистая сеть опухоли имеет хаотическую организацию, с извитостью и повышенной проницаемостью сосудов, а ее выживание и пролиферация зависят от ростовых факторов.

Эти сосудистые аномалии, которые в большей степени обусловлены избыточной продукцией ростовых факторов и их инъекцией, с целью активации ангиогенеза при заболеваниях перечисленных выше, формируют условия, благоприятные для роста опухоли.

Фактор IGF-1 активно используется в спорте, т.к. усиливает рост мышц. IGF-1 в мышцах обладает двойной активностью - ростостимулирующей и инсулиноподобной: он ускоряет синтез белка и замедляет его разрушение. Как СТГ, так и IGF-1 сдвигают метаболизм в сторону сжигания жира и ускорения синтеза белка. Кроме того, IGF-1 увеличивает количество двигательных нейронов в мышцах, повышая их дееспособность. Его так же используют для лечения повреждений спинного мозга и амиотрофического склероза.

Эти свойства, активно используются для искусственного нарастания мышечной массы и сжигания жиров.

Но вместе с этим IGF-I и IGF-II оказывают антиапоптотический эффект и являются мощными митогенными факторами для клеток многих злокачественных опухолей [20].

3. Методы исследования

1. Иммуногистоцитохимия - метод идентификации и определения локализации в клетке и тканях различных структур, имеющих антигенные свойства, основанный на реакции антиген-антитело.

Иммуногистоцитохимия является высокотехнологичным методическим дополнением к традиционным гистологическим методам исследования в клинической диагностике.

Так как в настоящее время стало доступным большое количество поли- и моноклональных антител, обладающих высокой специфичностью и авидностью, количество прикладных задач, для решения которых могут использоваться методы ИГХ, стало практически неограниченным.

Эти методы широко используются для:

· дифференциальной диагностики опухолей, определения источника метастаза при неясном очаге опухоли, оценки гормонального статуса опухоли, иммунофенотипирования опухолей, например, опухолей лимфоидной системы, определения факторов прогноза опухолевого процесса;

· идентификации различных микроорганизмов (бактерий, вирусов);

· определения гормонов и их рецепторов и т.д.

Принцип метода

Основой ИГХ-метода является иммунологическая реакция антигена и антитела. ИГХ-методы позволяют локализовать и идентифицировать клеточные и тканевые антигены, основываясь на их связывании с антителам.

Использование антител лежит в основе исследований самых разных молекулярных образований:

 * структурных компонентов клетки;

 * рецепторов клеточной поверхности;

 * клеточных продуктов (гормонов, ферментов, иммуноглобулинов).

Для визуализации места связывания антигена с антителом используется целый ряд меток:

 * флуоресцентные красители;

 * ферментные метки;

 * металлы;

 * металлопротеины;

 * радиоизотопы.

Учет результатов исследования.

Для учета результатов ИГХ-исследования необходим световой микроскоп соответствующего класса. Системы архивации и анализа изображения, состоящие из светового микроскопа, цифровой фотокамеры и компьютера, позволяют сохранаять изображения полученных микропрепаратов в оцифрованном виде и подвергать его различным методам морфоанализа с помощью специализированных программ.

2. Western - Блоттинг

Вестерн-блоттинг - аналитический метод, используемый для определения специфичных белков в образце. На первом этапе использует электрофорез белков в полиакриламидном геле для разделения денатурированных полипептидов по длине (как правило, в присутствии SDS) или по трехмерной структуре белка (в нативном состоянии). Далее белки переносят на нитроцеллюлозную или PVDF мембрану, затем детектируют с использованием антител, специфичных к заданному белку (рис. 1) [1,4].

Рис. 1 Western

4. Результаты

1. Корреляция степени экспрессии VEGF опухолью с неблагоприятным прогнозом.

При целом ряде онкологических заболеваний у человека экспрессия VEGF усиливается (таблица 1). Несколько исследований также продемонстрировали усиление экспрессии VEGF в стромальных клетках, ассоциированных с опухолью; возможно, в них экспрессия усиливается под влиянием факторов окружающей микросреды, созданных самой опухолью.

Таблица 1.

При многих видах опухолей усиление экспрессии VEGF коррелирует с неблагоприятным прогнозом, в том числе с агрессивным ростом опухоли, рецидивами, метастазированием и уменьшением выживаемости. Кроме того, экспрессия VEGF коррелирует с повышением плотности микрососудистой сети в опухоли, что само по себе служит индикатором прогноза при различных онкологических заболеваниях [26].

2. Фактор роста эндотелия сосудов в сыворотке крови больных опухолями надпочечников.

Ангиогенный фенотип опухоли, оцениваемый по числу и плотности сосудов, а так же уровню экспрессии ангиогенных и антиангиогенных факторов, в значительной степени определяет ее биологическое поведение и прогноз заболевания. Целью исследования Московского областного научно-исследовательского института, стало сравнение количественного содержания VEGF в сыворотке крови больных опухолями надпочечников с участием клинических, гормональных и морфологических особенностей заболевания.

Результаты исследования. В сыворотке крови больных опухолями надпочечников среднее содержание VEGF достоверно выше, чем у практически здоровых людей, причем наиболее высокие значения данного фактора роста были обнаружены при адренокортикальном раке. В проведенном исследовании у больных раком коры надпочечника также выявлены наиболее высокие показатели VEGF, однако достоверных различий в средних уровнях этого фактора роста у больных адренокортикальным раком, аденомой и феохромоцитомой не отмечено[21].

Заключение

1. Факторы роста обеспечивают оптимальные рост, развитие и восстановление жизненноважных тканей и органов.

2. Кроме того, что HIG - 1alpha при гипоксическом стрессе включает гены, регулирующие процесс ангиогенеза, вазомоторный контроль, энергетический метаболизм, эритропоэз и апоптоз, то есть процессы адаптации организма к гипоксии, но и провоцирует экспрессию, васкуляризацию, рост опухоли и метастазирование.

3. VEGF стимулирует пролиферацию эндотелиоцитов, принимает участие в индукции и регуляции как нормального, так и патологически измененного ангиогенеза. А рост опухоли возможен, только благодаря формированию новой системы кровоснабжения, что необходимо учитывать при использовании VEGF генной терапии.

4. Инсулиноподобный фактор роста-1 стимулирует включение сульфатов в хрящ, обладает не подавляемой инсулиноподобной активностью, стимулирует размножение клеток, обладает выраженной анаболической активностью, связывается со специфическими транспортными белками, но вместе с этим IGF-I и IGF-II оказывают антиапоптотический эффект и являются мощными митогенными факторами для клеток многих злокачественных опухолей.

5. Применение факторов роста экзогенного происхождения, а так же, мутагенное воздействие на кодирующие их гены, повышают вероятность неопластического перерождения различных тканей организма.

Список использованных источников

1. Бритвин Т.А., Казанцева И.А. Калинин, Сибирский А.П. Фактор роста эндотелия сосудов в сыворотке крови больных опухолями надпочечников: Российская научно-практическая конференция «Актуальные вопросы морфологической, иммуногистохимической и цитологической диагностики злокачественных новообразованй», г. Томск, 10-12 октября 2006 г.: Сибирский онкологичекий журнал. 2006. №3 (19). С. 88-89.

2. Бурлеев В.А., Гаспаров А.С., Аванесян Н.С. Факторы роста и их роль в регуляции репродуктивной функции у больных с синдромом поликистозных яичников // Проблемы репродукции. 1998. №3. C. 17-25.

3. Северин Е.С Изменение в структуре плазматических мембран и структуре // Онкогененз // Биохимия. 2004. С. 728.

4. Спринджук М.В. Корреляция степени экспрессии VEGF опухолью с неблагоприятным прогнозом // УДК 591.41., 2010. Т. ІV. №3. С. 4-13.

5. Ausserer W.A., Bourrat&Floeck B., Green C.J., Laderoute K.R., Sut& herland R.M. Regulation of cjun expression during hypoxic and low glucose stress // Mol Cell Biol. - 1994. - V.14 (8). - P. 5032-5042.

6. Barleon, B., Sozzani, S., Zhou, D., Weich, H.A., Mantovani, A., and Marme, D. (1996) Blood, 87, 3336-3343.

7. Christer Sylven. Angiogenic Gene Therapy. Drugs of Today 2002, 38 (12), 819-827.

8. Ferrara N. Role of vascular enthelial growth factor in the regulation of angiogenesis. Kidney International, Vol 56 (1999), 794-814.

9. Freedman S.B., Jeffrey M. Isner. Therapeutic Angiogenesis for Coronary Artery Disease. REview. Ann. Intern. Med. 2002 (132), 54-71.

10. Gabrilovich, D., Ishida, T., Oyama, T., Ran, S., Kravtsov, V., Nadaf, S., and Carbone, D.P. (1998) Blood, 92,4150-4166.

11. Huang et al., 1998, Kallio et al., 1999, Salceda et al., 1997, Sutter et al., 2000.

12. Huang, Y., Chen, X., Dikov, M.M., Novitskiy, S.V., Mosse, A., Yang, L., and Carbone, D.P. (2007) Blood, 110,624-631.

13. Haung Y., Chen X., Dikov M.M., Novitsky S.V., Mosse. C.A., Yang L., Carbone D.P., // Blood. - 2007. V. 110. P. 624.

14. Isner J.M., Asahara Т., 1999; Carmeliet P., Jain R.K., 2000.

15. Jeffrey M. Isner, Peter Vale, Douglas W. Losordo and el. Angiogenesis and cardiovascular disease. Dialogues in Cardiovascular Medicine, Vol 6, №3 2001.

16. Lando D, Gorman J. J, Whitelaw M. L, Peet D.J. Oxygendependent regulation of hypoxiainducible factors by prolyl and asparaginyl hydroxylation // Eur J Biochem. - 2003.

17. Maxwell P.H., Pugb C.W., Ratcliffe P.J. Activation of the HIF pathway in cancer. Curr Opin Genet Dev. 2001. V. 11 (3). 293-299.

- V. 270 (5) - P. 781-790.

18. Murphy B. J, Andrews G. K, Bittel D, Discher D. J, McCue J, Green C. J, Yanovsky M, Giaccia A, Sutherland R. M, Laderoute K. R, Webster K.A. Activation of metallothionein gene expression by hypoxia involves metal response elements and metal transcription factor-1 // Cancer Res. 1999 - V. 59 (6). - P. 1315-1322.

19. Ohm J.E., Gabrilovich D.I., Sempowski G.D., Kisseleva E., Parman K.S., Nadaf S., Carbone D.P., // Blood. 2003. V. 101. P. 4878.

20. Pennisi A.P., Barr V., Nunez N.P. Reduced expression of insuline-like growth factor I receptors in MCF breast cancer cells leads to a more metastatic phenotype // Cancer Res. 2002. Vol. 62. P. 6529-6537].

21. Renart J, Reiser J, Stark GR (1979). «Transfer of proteins from gels to diazobenzyloxymethyl-paper and detection with antisera: a method for studying antibody specificity and antigen structure». Proc Natl Acad Sci U S A. 76 (7): 3116-3120. DOI:10.1073/pnas.76.7.3116. PMID 91164.

22. Risau W. Mechanisms of angiogenesis // Nature - 1997. - V. 386. - P.671-674; Semenza G.L. O2-regulated gene expression: transcriptional control of cardiorespiratory physiology by HIF1 // J Appl Physiol. - 2004. - V. 96 (3). - P.1173-1177.

23. Safran M., Kaelin W.J. // J. Clin. Invest. 2003. V. 111. P. 779

24. Semenza, G.L. and Wang, G.L. A nuclear factor induced by hypoxia via de novo protein synthesis binds to the human erythropoietin gene enhancer at a site required for transcriptional activation. Mol. Cell. Biol. - 1992. - V.12 - P. 5447-5454.

25. Semenza G.L. Oxygenregulated transcription factors and their role in pulmonary disease // Respir Res. - 2000. - V. 1 (3). - P. 159-162; Wenger, R.H. Cellular adaptation to hypoxia: O2-sensing protein hydroxylases, hypoxiainducible transcription factors, and O2-regulated gene expression // FASEB J. - 2002. - V. 16. - P. 1151-1162.

26. Towbin H, Staehelin T, Gordon J. (1979). «Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications». Proc Natl Acad Sci U S A. 76 (9): 4350-4354. DOI:10.1073/pnas.76.9.4350. PMID 388439.

27. Zhang H., Yee D. Insulin-like growth factor binding protein-1 (IGFBP-1) inhibit breast cancer cell motility // Cancer Res. 2002. Vol. 62. P. 4369-4375.

Размещено на Allbest.ru