Исследование ферментативного гидролиза лигноцеллюлозных материалов из недревесного растительного сырья

Размещено на http://www.allbest.ru/

49

Размещено на http://www.allbest.ru/

ПОЯСНИТЕЛЬНАЯ ЗАПИСКА К ДИПЛОМНОЙ РАБОТЕ

по дисциплине: «Теоретические основы биотехнологии»

Исследование ферментативного гидролиза лигноцеллюлозных материалов из недревесного растительного сырья



СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ

1. АНАЛИТИЧЕСКИЙ ОБЗОР

1.1 Характеристика целлюлозы и ее производных

1.2 Характеристика сырья

1.3 Применение целлюлозы

1.4 Ферментативный гидролиз лигноцеллюлозных материалов

1.5 Факторы, влияющие на ферментативный гидролиз ЛЦМ

1.6 Ферменты, участвующие в биоконверсии ЛЦМ

1.7 Обоснование выбора направления исследования

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1 Основные показатели используемых материалов

2.2 Основные характеристики вспомогательных материалов

2.2.1 Вода дистиллированная

2.2.2 Кислота соляная

2.2.3 Спирт этиловый

2.2.4 Гидроокись натрия

2.2.5 Кислота уксусная

2.2.6 Хлорное железо

2.2.7 Ацетат натрия

2.2.8 3,5 - динитросалициловая кислота

2.2.9 Виннокислый калий-натрий

2.3 Приготовление реактивов

2.3.1 Приготовление раствора орсина

2.3.2 Приготовление ацетатного буфера

2.3.3 Приготовление реактива на основе 3,5 - динитросалициловой кислоты

2.3.4 Приготовление 17,5 %-го раствора гидроксида натрия

2.3.5 Приготовление 9,5 %-го раствора гидроксида натрия

2.4 Методики анализов

2.4.1 Методика определения концентрации редуцирующих веществ в пересчете на глюкозу на спектрофотометре Unico UV-2804

2.4.2 Методика определения массовой доли пентозанов

2.4.3 Методика определения влажности

2.4.4 Определение содержания альфа-целлюлозы весовым методом

2.5 Характеристика ферментных препаратов

3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

3.1 Ферментативный гидролиз ЛЦМ в ацетатном буфере и в водной среде

3.2 Зависимость ФГ от концентрации субстрата

3.3 Зависимость эффективности ФГ от условий перемешивания

3.4 Зависимость ФГ от сырья для получения ЛЦМ

3.5 Реакционная способность к ферментации ЛЦМ плодовых оболочек овса разными ферментными препаратами

3.6 Зависимость эффективности ФГ от способа подготовки ЛЦМ

4. БЕЗОПАСНОСТЬ ЖИЗНЕДЕЯТЕЛЬНОСТИ

4.1 Требования охраны труда

4.2 Требования охраны труда перед началом работы

4.3 Требования охраны труда во время работы

4.4 Техника безопасности на производстве

4.5 Уничтожение отходов

5. МЕТРОЛОГИЯ И СТАНДАРТИЗАЦИЯ

5.1 Перечень нормативной документации

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ПЕРЕЧЕНЬ УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ



ВВЕДЕНИЕ

Ферментативный гидролиз лигноцеллюлозных материалов в раствор сахаров является важнейшим этапом в технологии биоэтанола. Растительное сырье, используемое в качестве источника энергии, является возобновляемым ресурсом с практически неисчерпаемым запасом, что делает его альтернативой ископаемому топливу, а этанол, получаемый биохимическим путем из того же растительного сырья, представляет собой практическую альтернативу бензину [1].

Современные технологи позволяют использовать для производства биоэтанола практически любое сахаро- и крахмалосодержащее сырье: сахарный тростник, сахарную свеклу, картофель, кукурузу, пшеницу, ячмень, рожь и т.д. Проблема использования целлюлозосодержащего сырья для производства биоэтанола остаётся нерешенной.

Одними из нетрадиционных источников целлюлозы, используемых в ИПХЭТ СО РАН, являются мискантус и плодовые оболочки овса. Их объединяет следующее: недревесное происхождение, общедоступность, легкая возобновляемость. ПОО представляет собой одну часть растения, предназначенная для сохранения семени злака - зерно, а мискантус представлен всеми надземными частями растений - стеблем, листьями и т.д. [2].

Ферментативный гидролиз целлюлозы является перспективным процессом, обладающим, в отличие от кислотно-катализируемого гидролиза, рядом преимуществ: меньшие энергозатраты, мягкие условия протекания процесса, более высокий выход сахаров и отсутствие токсичных отходов.

Целью дипломной работы является исследование ферментативного гидролиза (ФГ) лигноцеллюлозных материалов (ЛЦМ) из недревесного растительного сырья. Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

1 изучить ферментативный гидролиз ЛЦМ в ацетатном буфере и в водной среде;

2 показать зависимость ФГ от концентрации субстрата;

3 исследовать зависимость эффективности ФГ от условий перемешивания;

4 установить зависимость ФГ от сырья для получения ЛЦМ;

5 изучить реакционную способность к ферментации ЛЦМ плодовых оболочек овса разными ферментными препаратами;

6 установить зависимость эффективности ФГ от способа подготовки ЛЦМ.



1. АНАЛИТИЧЕСКИЙ ОБЗОР

1.1 Характеристика целлюлозы и ее производных

Как известно, основной структурной единицей растения является клетка, которая состоит из стенки, протопласта и вакуоли. Отличительный признак растительной клетки - целлюлозная стенка. Она хорошо оформлена, очень прочна и сохраняется после отмирания протопласта. Клеточная стенка включает тонкий внутренний выстилающий слой (третичную стенку), содержащую целлюлозу и гемицеллюлозу, широкую вторичную стенку, состоящую из целлюлозы, лигнина и гемицеллюлоз, и первичную стенку.

По современным представлениям, макромолекулы целлюлозы образуют длинные, не имеющие разветвлений, упругие нити, состоящие из остатков глюкопиранозы, соединенных в- глюкозидными связями в положении 1 - 4.

Рисунок 1 - Строение целлюлозы

Характер взаимного расположения макромолекул целлюлозы в природным и искусственных волокнах и пленках оказывает существенное влияние на их прочность, растяжимость, эластичность, гигроскопичность, реакционную способность, растворимость, склонность к мокрому разлому, прокрашиваемость и многие другие свойства [3].

Как известно, основной структурной единицей растения является клетка. Она состоит из стенки, протопласта и вакуоли. Отличительный признак растительной клетки - целлюлозная стенка. Она хорошо оформлена, очень прочна и сохраняется после отмирания протопласта. Клеточная стенка включает тонкий внутренний выстилающий слой (третичную стенку), содержащую целлюлозу и гемицеллюлозу, широкую вторичную стенку, состоящую из целлюлозы, лигнина и гемицеллюлоз, и первичную стенку. Первичные стенки соседних клеток (волокон) соединены между собой коензивным межклеточным веществом, или срединной пластиной. Имеются указания на содержание в ней метилового эфира полигалактуроной кислоты, гемицеллюлоз и белка. В период роста клетки срединная пластинка на 2/3 состоит из пектиновых веществ. Затем происходит сильная лигнификация межклеточного вещества, и оно приобретает устойчивость к различным механическим, химическим и энзиматическим воздействиям [4].

В первичной стенке, имеющей толщину около 0,1 мкм, микрофибриллы целлюлозы занимают 1/3 объема. Они переплетаются между собой, образуя сетчатую систему. Микрофибриллы погружены в аморфный матрикс, который составляет основную массу этой оболочки. В период роста клетки он состоит из гемицеллюлоз и пектиновых веществ. Позднее основная часть вещества матрикса (до 70 %) замещается находящимся в аморфном состоянии лигнином. Далее следует целлюлоза, гемицеллюлоза и пектиновые вещества. В аморфном участке микрофибриллы, лигнин и гемицеллюлоза могут проникать между макромолекулами целлюлозы.

Компоненты, входящие в состав первичной клеточной стенки, можно условно разделить на четыре группы [5]: структурные, представленные целлюлозой; компоненты матрикса стенки - гемицеллюлозы, пектины, белки, липиды; инкрустирующие стенку - лигнин и суберин; откладывающиеся на её поверхности - кутин и воск. Кроме того, клеточные стенки могут содержать значительное количество минеральных веществ: силикатов и карбонатов кальция.

Вторичная клеточная стенка хлопкового и древесного волокна, основным компонентом которого является целлюлоза, состоит из множества концентрических слоев, которые в результате определенных химических и физических воздействий распадаются на микрофибриллы. Вторичный слой определяет форму клетки, механические свойства ткани, и микрофибриллы в нем расположены параллельно.

Толщина третичной стенки (включая внутренние слои вторичной стенки) не более 70…80 нм. Лигнина в ней больше, чем во вторичной стенки, и химически она более устойчива. Микрофибриллы целлюлозы здесь расположены под углом друг к другу в виде пучков диаметром 2…3 нм [6].

Состав и строение древесины различных пород разнятся вследствие морфологической неоднородности структур. Так, хвойная древесина отличается от лиственных пород. Генетически обусловленный состав полисахаридов клеточной стенки постоянен внутри одного вида [7].

Целлюлоза и ее производные характеризуются повышенной скелетной жесткостью. На структуру и реакционную способность целлюлозы большое влияние оказывают водородные связи. Специфика морфологической структуры целлюлозы определяется в первую очередь ее функцией в клеточной стенке. Мембраной растительной клетки целлюлоза выделяется в виде плотно упакованных фибрилл, образующих подобие кристаллической решетки. Фибриллы, обеспечивающие прочностные свойства клетки, находятся в сложном взаимодействии с аморфным матриксом других полисахаридов и веществами белковой природы. В результате создается мощная структурная упаковка.

Целлюлоза - очень прочное соединение, способное сохраняться без изменения.

Она не растворяется в воде даже при кипячении, не переваривается в желудке многих животных, нерастворима во многих кислотах и щелочах. Она растворяется лишь в аммиачных растворах солей меди.

При воздействии на целлюлозу концентрированных растворов щелочи изменяются ее химические, физико-химические и структурные свойства: отмечается интенсивное набухание, изменяется степень кристалличности. Высокомолекулярная фракция целлюлозы, нерастворимая в 17,5 %-ной NaOH, называется б-целлюлозой. Хлопок состоит из б- целлюлозы, а другие растения и древесина содержат главным образом в-целлюлозы, растворимые в концентрированном растворе щелочи.

Целлюлоза представляет собой наиболее высокомолекулярный полисахарид, линейный в-1,4-глюкан с видовой специфичностью степени полимеризации. Химический состав целлюлозы соответствует формуле (C6H10O5)n. Элементарным звеном макромолекулы является ангидро-D-глюкоза, которая содержит три гидроксильные группы у 2, 3 и 6-го атомов углерода. Однако по данным инфракрасного и рентгеноструктурного анализа, элементарной единицей целлюлозы является ангидроцеллобиоза, а не ангидроглюкоза. Таким образом, хотя в химическом отношении целлюлоза представляет собой линейный полимер в-D-глюкопиранозы, целлобиоза является главным промежуточным продуктом расщепления целлюлозы целлюлолитическими и бактериальными ферментными системами. Целлобиоза, целлотриоза и целлотетраоза растворимы в воде. Целлюлозные молекулы со степенью полимеризации более 6000 считаются нерастворимыми, что обусловлено наличием водородных связей между целлюлозными молекулами. Такие водородные связи в целлюлозе имеются между глюкозными остатками в самой цепи глюкана и между цепями [2].

Элементарные звенья макромолекул целлюлозы (ангидро-D-глюкопираноза) соединены между собой в-гликозидной связью. Целлобиоза - продукт неполного гидролитического расщепления макромолекул. В гидролизатах также могут быть обнаружены целлотриоза и целлотетраоза. При полном гидролизе целлюлозы образуется D-(+)-глюкоза. Элементарные волокна целлюлозы состоят из множества линейных макромолекул с поперечным сечением до 0,7 нм. Полагают, что макромолекула целлюлозы состоит из большого числа остатков D-глюкопиранозы в конформации кресла, соединенных в-1,4-гликозидными связями. Различные химические и физические воздействия, однако, способствуют переходу звеньев в другую конформацию. Участки целлюлозы с высокой степенью упорядоченности называются кристаллическими, а участки с беспорядочной ориентацией - аморфными. Аморфная целлюлоза имеет более рыхлую структуру и поэтому более доступна для кислоты или ферментов.

Существуют различные мнения относительно числа целлюлозных молекул в кристаллических участках и способа их организации. Целлюлозные молекулы образуют элементарные фибриллы посредством водородных связей. Эти фибриллы в свою очередь образуют микрофибриллы, и затем волокна. Волокнистую структуру целлюлозы можно наблюдать в микроскоп.

Число гликозидных связей, доступных действию ферментов, в большей степени зависит от степени набухания целлюлозы. Увеличение степени набухания достигается за счет механической и физической предобработки, такой, как пропаривание, размалывание, обработка ультразвуком. Минеральные кислоты и щелочи в высоких концентрациях увеличивают набухание всего волокна, так как они способны разрывать водородные связи и проникать в кристаллические участки.

Одним из основных факторов, определяющих свойства целлюлозы и других высокомолекулярных полисахаридов, является надмолекулярная структура. Цепи молекул целлюлозы объединяются в пучки - мицеллы. Максимальный диаметр одной молекулы целлюлозы 0,8 нм. Эти молекулы образуют элементарные мицеллы с максимальным диаметром 10 нм. Элементарные мицеллы объединяются в пучки, называемые микрофибриллами, которые имеют ширину 25 нм и содержат до 2000 молекул целлюлозы. Микрофибриллы объединяются в волокна - макрофибриллы шириной 0,4 мкм, они содержат 5000000 молекул целлюлозы. В волокнах вторичной оболочки 200 млн. молекул целлюлозы. Стенки клеток различаются главным образом расположением микрофибрилл. Различают параллельную ориентацию микрофибрилл по отношению к оси клетки и продольно-поперечную или беспорядочную ориентацию.

Свойства целлюлозы определяются не столько взаимным расположением макромолекул, сколько строением и взаимным расположением элементов надмолекулярной структуры. Особенности организации древесной целлюлозы, обусловленные наличием водородных связей между целлюлозой и гемицеллюлозой, делает ее менее доступной для целлюлолитических ферментов. Гемицеллюлозы выполняют структурные функции, участвуя в формировании скелета растений, играют роль запасных веществ, используемых в процессе обмена. Компонентом растительной клетки наряду с целлюлозой и гемицеллюлозой является лигнин. Этот полимер с трехмерной структурой построен в основном из фенилпропановых групп древесины. В естественных условиях лигнин как таковой не существует и структурно связан с полисахаридами. Лигнин делает целлюлозу и гемицеллюлозу плохо перевариваемыми [1].

Помимо соединений полисахаридной природы и лигнина растительные ткани обычно содержат эфиры, белки, могут также включать смолы, воск, терпены и другие органические соединения, которые адсорбируются как на поверхности целлюлозных микрофибрилл, так и включаются внутрь. Несмотря на всю сложность и низкую реактивность целлюлозосодержащих материалов, в природных условиях макромолекулы, входящие в состав растительной клеточной стенки, расщепляются благодаря действию специфических ферментов микроорганизмов, главным из которых являются целлюлолитические и лигнолитические.

При рассмотрении вопросов биоконверсии лигноцеллюлозных растительных субстратов в белок и другие продукты, а также энзиматического осахаривания целлюлозы не всегда в должной мере принимаются во внимание особенности строения того или иного субстрата, наличие нежелательных компонентов не только в виде лигнина, но и в виде пектиновых и других веществ. Однако именно особенности строения субстрата существенно влияют на эффективность биотрансформации.

Применение ферментных препаратов для гидролиза крахмала и лигноцелюлозы позволяет сохранить пищевую ценность крахмалопродуктов, избежать появление примесей. Благодаря специфичности ферментов метод ферментативного гидролиза дает возможность регулировать углеводный состав крахмалопродуктов [7].

1.2 Характеристика сырья

Растительная биомасса (фитомасса) образуется в результате фотосинтетической деятельности растений. Исходными веществами при биосинтезе растительных тканей является диоксид углерода, поступающий из воздуха, и вода, подводящая к листьям главным образом из почвы через корневую систему растений. В процессе фотосинтеза растения выделяют в атмосферу кислород. Практически весь кислород воздуха имеет растительное происхождение.

Таким образом, помимо образования биомассы фотосинтетическая деятельность растений обеспечивает стабильность состава атмосферы, условия и возможность существования жизни на Земле. Использование биомассы растений для технических целей должно проводиться на научной основе без нарушения экологического равновесия в природе [8].

Целлюлоза содержится в каждом растении, однако далеко не каждое из них пригодно для промышленного извлечения из него целлюлозы. Промышленное значение в производстве целлюлозы приобрели растения немногих видов. Из хвойных древесных пород наибольшее применение имеют ель, сосна, пихта, из лиственных - тополь разных видов, осина, берёза, бук и некоторые другие. Из не древесного сырья используется солома злаковых культур - овса, ржи, пшеницы, ячменя, риса, кукурузы и т.п.

К не древесному сырью относятся также хлопок, лен, конопля, джут и другие, используемые преимущественно в текстильной промышленности. Из хлопка благодаря высокому содержанию в нем целлюлозы может быть получена несложными методами наиболее чистая целлюлоза, применяемая для химической переработки. Древесина - самое распространенное сырьё, однако, получение из него целлюлозы требует более сложного технологического процесса [9].

Многолетние травянистые растения такие, как мискантус китайский (Miscanthus sinensis), получивший популярность, как растение для декора садов ещё в 1935 году, а в 1994 году о нём заговорили, как о перспективном высокоэнергетическом растении для производства топлива [9] и шелуха овса могут быть также успешно использованы для получения высококачественных целлюлоз [10].

Вид растения Мискантус пришел из тропиков и субтропиков, но различные виды находят во многих климатических регионах Восточной Азии, а теперь также в Европе и Северной Америке, где он сначала служил декором (из Японии в 1930-х), а после стал перспективным энергетическим растением в виду его превосходной продуктивности, быстрого роста и высокой устойчивости к заболеваниям. Мискантус представляет собой высокое корневищное растение, принадлежащее семейству злаковых, с механизмом фотосинтеза С4. В виду своей многолетней природы и высокой продуктивности, этот вид является привлекательным источником биомассы. Мискантус обладает высокой продуктивностью, то есть возможностью получать высокие урожаи ежегодно (вплоть до 30 тонн/га/год сухого вещества на плантациях южной Европы), а также возможностью служить хорошим источником биомассы для твердых топлив и строительных материалов в виде ДСП. К тому же, химическое совершенствование процессом «Органосолв» фракционирования его основных компонентов (целлюлоза, гемицеллюлоза, лигнин) возможно использование некоторых из них при производстве метилцеллюлозы, карбоксиметилцеллюлозы, клеящих веществ, этанола и активированного углерода, наряду с прочими продуктами. Эти результаты открывают многообещающие перспективы для комплексного использования Мискантуса [11].

Согласно [12] мискантус имеет следующий средний химический состав (% сухого вещества): зола - 5,7; вещества, экстрагируемые холодной водой - 6,3; вещества, экстрагируемые горячей водой - 9,6; вещества, экстрагируемые 1 %-м NaOH - 44,9; вещества, экстрагируемые толуолом/этанолом - 3,2; общее количество сахаров - 65,9; лигнин - 23,6.

Плодовые оболочки злаков являются широко распространенным недревесным целлюлозосодержащим сырьем в сельскохозяйственных регионах. Содержание целлюлозы в них достигает 47 %. В ИПХЭТ СО РАН активно проводятся исследования по применению плодовых оболочек овса в качестве перспективного ЦСС.

ПОО являются отходом производства крупы. К достоинствам этого вида ЦСС можно отнести их концентрирование на перерабатывающих предприятиях, низкую стоимость и небольшой размер частиц, что позволяет использовать их для выделения целлюлозы без предварительного измельчения.

1.3 Применение целлюлозы

Одним из наиболее важных факторов, определяющих развитие большинства отраслей промышленности, является устойчивая сырьевая база, и в частности углеродсодержащее сырье: нефть, каменный уголь и природный газ. Образование запасов этих природных ресурсов происходило в течение геологических периодов, по продолжительности сравнимых с продолжительностью существования самой Земли. Расходование же сырья идет всевозрастающими темпами, что делает весьма актуальным решение проблемы поиска альтернативных источников углеродсодержащего сырья. Однако эта проблема успешно решена самой природой. В результате биохимических процессов фотосинтеза различные наземные и водные растения из углекислого газа и воды продуцируют до 400 млрд. т в год сухой биомассы, аккумулируя в тканях огромное количество углерода, и являются, таким образом, источником непрерывно возобновляемого углеродсодержащего сырья. Наибольший интерес среди продуктов фотосинтеза растений на протяжении всего времени существования человеческой цивилизации привлекала целлюлоза, ежегодный прирост количества которой составляет около 100 млрд. т. Целлюлозные материалы занимают видное место в удовлетворении потребностей человека: природные целлюлозные волокна (прежде всего хлопок, лен и другие лубяные волокна) и сегодня являются существенной частью в балансе сырья для текстильной промышленности. Хлопковая и древесная целлюлоза широко применяются для изготовления бумаги и картона, искусственных волокон, некоторых пластмасс и лаков, эмульгаторов и загустителей для нефтяной, текстильной, пищевой, фармацевтической и других отраслей промышленности. Целлюлоза и ее производные широко используются во многих отраслях промышленности (текстильной, целлюлозно-бумажной, искусственных волокон, пищевой, фармацевтической и др.) [13].

Целлюлозу и целлюлозосодержащее сырье используют для получения эфиров целлюлозы, в частности, карбоксиметилцеллюлозы, которая может найти применение в некоторых отраслях промышленности и, в частности, нефтегазодобывающей [14], а также в производстве композитных материалов [15]. Широкие возможности использования целлюлозы определяются особенностями химического строения, структуры и свойств этого природного полимера [13].

1.4 Ферментативный гидролиз лигноцеллюлозных материалов

Промышленные производства этилового спирта на основе ферментативного гидролиза целлюлозы реализованы в США, Японии, Великобритании и др. странах мира. Суть способа, предложенного американскими исследователями, состоит в том, что целлюлозосодержащее - древесину, хлопчатобумажные ткани, рисовую и пшеничную солому, бумагу измельчают и осахаривают культуральной жидкостью микроорганизмов Trichoderma viride или Trichoderma reesei. Полученный раствор глюкозы сбраживают с образованием спирта, используя дрожжи Saccharomyces cerevisiae, Pichia или Rhizopus javanikus. Способ предусматривает присутствие в ферментационной среде целлюлазы, участвующей в превращении целлюлозы в глюкозу, и микроорганизма, образующего этанол из глюкозы. Исследование процесса ферментативного гидролиза целлюлозы фильтратами культуральной жидкости Trichoderma viride показало, что процесс ферментативного гидролиза наиболее активно протекает при T = 45…50 , следовательно, целесообразно использование термофильных штаммов микроорганизмов. Было установлено, что выход этанола зависит от концентрации фермента, активности отдельных компонентов целлюлазного комплекса и концентрации целлюлозы. Присутствие целлюлаз не подавляет накопление этанола в ферментационной среде, а увеличение концентрации фермента повышает его выход.

При рассмотрении вопросов биоконверсии лигноцеллюлозных растительных субстратов в белок и другие продукты, а также энзиматического осахаривания целлюлозы не всегда в должной мере принимаются во внимание особенности строения того или иного субстрата, наличие нежелательных компонентов не только в виде лигнина, но и в виде пектиновых и других веществ. Однако именно особенности строения субстрата существенно влияют на эффективность биотрансформации [7].

В работе [16] анализируются технологии, касающиеся кислотного и ферментативного гидролиза целлюлозы и гемицеллюлозы в мономерные сахара для последующего получения этилового спирта. Подчеркивается, что разрушение целлюлозы и гемицеллюлозы кислотным гидролизом или обработкой органическими растворителями требует больших затрат. Возникает проблема удаления кислот из продуктов и регенерации растворителей.

Применение ферментных препаратов для гидролиза крахмала и лигноцеллюлозы позволяет сохранить пищевую ценность крахмалопродуктов, избежать появления примесей. Благодаря специфичности ферментов метод ферментативного гидролиза дает возможность регулировать углеводный состав крахмалопродуктов [17].

Предложен способ [18] получения этилового спирта, по которому растительное сырье, содержащее лигноцеллюлозу, подвергают двухстадийному ферментативному гидролизу с раздельным отбором гексозной и пентозной фракций, используя при сбраживании разные группы микроорганизмов. Гексозную фракцию направляют на сбраживание дрожжевыми микроорганизмами Saccharomyces serevisiae, а пентозную ферментируют в присутствии штамма дрожжей, взятых из ряда Pachysolen tannophillus, Candida shenatal при Т = 30, рН = 4,3. Далее культуральные жидкости предлагается соединить и направить на перегонку и ректификацию. Описанный способ позволяет обеспечить комплексную переработку целлюлозосодержащего субстрата. Однако отмечается, что ферментолиз лигноцеллюлозы протекает медленно, что связано с тремя факторами:

1. Целлюлоза в лигноцеллюлозе имеет устойчивую кристаллическую структуру;

2. Лигнин, окружающий целлюлозу создает физический барьер для ферментов;

3. Возможных точек контактов ферментов с целлюлозой немного [7].

Установлено, что целлюлоза в лигноцеллюлозе находится как в виде кристаллов, так и в виде аморфных компонентов. Аморфные компоненты разрушаются ферментами быстрее, чем кристаллические, поэтому любые способы, которые способствуют увеличению содержания аморфной целлюлозы в лигноцеллюлозе, ускоряют процесс ферментолиза. Лигнин препятствует процессу ферментолиза еще в большей степени. В связи с этим встает задача предобработки лигноцеллюлозы, которая сводится к разделению лигноцеллюлозы на лигнин и свободную целлюлозу, к увеличению поверхности соприкосновения ферментов и целлюлозы, обеспечивая тем самым значительное ускорение процесса ферментолиза. Все способы предобработки подразделяются на физические и химические. Физические способы в свою очередь подразделяются на механические и немеханические [7]. К физическим методам относятся обработка г-лучами или потоком электронов, обработка микроволновым излучением (2400…2500 МГц), нагревание на воздухе или в атмосфере СО2 (100 ), действие ультразвука и т.д. Облучение высокой энергии приводит к деполимеризации целлюлозы, образованию радикалов. В результате облучения также уменьшаются размеры частиц ЦСС и имеет место некоторое разрушение лигнина. Замораживание целлюлозы способствует уменьшению ее СП, определенному изменению структуры и увеличению поверхности. Структура целлюлозы разрушается также и при ее нагревании и повышении давления. Влияние ультразвука на целлюлозу (в водной среде) сопряжено с действием силы звуковой волны, эффектом ударной волны при схлопывании кавитационных полостей, с возникновением окислительной термодеструкции. Физические методы обработки увеличивают реакционную способность ЦСС в 2…5 раз.

Механические методы предобработки ЦСС заключаются в их измельчении на различных видах мельниц и дробилок, диспергировании на вальцах и т.д. Измельчают ЦСС как в сухом, так и во влажном виде. Использование механических методов приводит к разрушению кристаллической структуры целлюлозы, увеличению поверхности, доступной целлюлолитическим ферментам и, как следствие, к значительному возрастанию реакционной способности ЦСС (в 10 и более раз) [1].

Наиболее часто применяются химические способы предобработки, с помощью которых можно не только разделить лигноцеллюлозу на фракции, но провести ее химическую модификацию [7]. Химические методы предобработки основаны на способности тех или иных химических соединений растворять лигнин или целлюлозу, либо приводить к набуханию или разрушению ее структуры. Химические методы предобработки, основанные на аморфизации или набухании целлюлозы, приводят к 10…15-кратному увеличению ее реакционной способности; делигнификация, паровой взрыв и другие методы увеличивают реакционную способность в 5…10 раз [1].

Биологические методы предобработки основаны на использовании лигнолитических микроорганизмов, способных избирательно по отношению к целлюлозе утилизировать лигнин в качестве источника углерода [19, 20]. Эти методы предобработки еще недостаточно изучены. К настоящему времени, очевидно, что они требуют достаточно большого времени (несколько недель) и относительно эффективны (есть данные, что они увеличивают реакционную способность ЦСС до 10 раз [19]).

Каждый из приведенных методов предобработки имеет достоинства и недостатки. Основным их плюсом является значительное увеличение реакционной способности ЦСС. Основным минусом - достаточно высокая стоимость в силу их материало- и энергоемкости, необходимость использовать специальные конструкционные материалы, нейтрализовать и регенерировать реагенты и т.д. [1].

Ферментативный способ получения моносахаридов во многом лишен недостатков, присущих способу, основанному на кислотном гидролизе, поскольку осуществляется в гораздо более мягких условиях по температуре, давлению и кислотности среды. Это требует значительно меньших расходов энергии, предотвращает деструкцию сахаров и образование трудно утилизируемых отходов, снижающих биологическую ценность гидролизатов. Наконец, следует иметь в виду возможность решения экологических проблем, связанных с необходимостью создания биотехнологических методов утилизации отходов и вторичных продуктов промышленной и сельскохозяйственной переработки растительного сырья.

Важной особенностью процесса ферментативной деструкции целлюлозы и других полисахаридов является то, что он осуществляется на поверхности нерастворимого субстрата, причем реакционная способность субстрата является функцией ряда его физико-химических и структурных свойств, и, как правило, убывает в ходе деструкции [1].

Специфика в данном случае заключается в том, что субстрат имеет упорядоченную (кристаллическую) структуру, во многих случаях содержит в своем составе сопутствующие вещества (в первую очередь лигнина), которые служат физическим барьером, затрудняющим доступ ферментов к глюкозидным связям. Важную роль играют размеры поверхности, доступной молекулам ферментов, а также адсорбционные и диффузионные процессы, предшествующие и сопровождающие гидролитическое превращение нерастворимых субстратов.

Химические реакции целлюлозы можно разделить на гомогенные и гетерогенные. В гомогенных реакциях целлюлоза сначала переходит в раствор, а затем вступает в реакцию. Реакции целлюлозы могут начинаться в гетерогенной среде и заканчиваться в гомогенной (например, ацетилирование целлюлозы). Однако большинство реакций целлюлозы, в том числе реакции ферментативного гидролиза, от начала до конца протекают в гетерогенной среде.

Существует три типа гетерогенных реакций целлюлозы.

1. Поверхностные реакции - протекают в аморфных участках целлюлозного волокна и на поверхности кристаллических участков (в этих зонах расположено до 25…30 % гидроксильных групп).

2. Поверхностно-гетерогенные реакции - их первая стадия протекает на поверхности кристаллических участков и в аморфной части целлюлозы, а на второй стадии реагент протекает внутрь кристаллических участков и нарушает их структуру (участвует 35…50 % гидроксильных групп).

3. Молекулярные реакции - характеризуются быстрым проникновением реагента внутрь кристаллических участков. При этом, в целом, течение реакции оказывается таким же, как и в случае гомогенной реакции (эти реакции называют квазигомогенными).

Реакции ферментативного гидролиза относятся к поверхностным, хотя не исключена возможность их протекания как поверхностно-гетерогенных [1].

Эффективность биохимических процессов в значительной степени зависит от состава субстрата. Химический состав влияет на доброкачественность полупродуктов, причем различают химическую доброкачественность по относительному содержанию целевых продуктов и биологическую доброкачественность.

В частности, доброкачественность гидролизата по РВ (ДРВ) и по моносахаридам (ДМС) находят по формулам:

(1)

, (2)

где СРВ, СМС, Сс.в - соответственно концентрации РВ, суммы моносахаридов и сухих веществ гидролизата.

Определение доброкачественности полупродуктов проводится при химико-техническом контроле ксилитного производства и при получении кормового гидролизного сахара. При биохимической переработке субстратов определения ДРВ или ДМС недостаточно, так как дрожжи ассимилируют наряду с моносахаридами содержащиеся в гидролизате органические кислоты и неорганические вещества. В то же время токсичные ингибиторы биохимических процессов, содержащиеся в следовых количествах и не оказывающие влияния на величину химической доброкачественности, могут существенно замедлить или полностью остановить протекание процессов жизнедеятельности микроорганизмов.

В связи с этим в дрожжевом и спиртовом производстве широко применяют понятие биологическая доброкачественность. Об относительной биологической доброкачественности субстратов судят по величине выхода биомассы дрожжей, этанола или другого целевого продукта в сопоставимых условиях. В качестве субстрата для сравнения может быть использована синтетическая питательная среда или очищенный гидролизат с известной характеристикой [8].

1.5 Факторы, влияющие на ферментативный гидролиз ЦСС

Факторами, влияющими на гидролиз целлюлозосодержащих материалов, являются концентрация субстрата, способ его предобработки, возможность повторного использования фермента, температура и рН реакционной среды, продолжительность воздействия препарата. Многие из этих факторов взаимозависимы, и это делает весь процесс довольно сложным. В оптимальном случае реакция должна быть быстрой и полной, с образованием больших концентраций глюкозы без существенной потери активности фермента [21].

На скорость гидролиза существенно влияют физико-химические и структурные свойства субстрата: степень упорядоченности структуры, размер поверхности, доступной для молекул ферментов, степень полимеризации и наличие нецеллюлозных компонентов (в основном гемицеллюлоз и лигнина). Реакционная способность природного целлюлозосодержащего сырья при ферментативном гидролизе, как правило, невелика, поэтому возникает необходимость предварительной обработки ЦСС с целью увеличения реакционной способности. Смысл предобработки заключается в разрушении кристаллической структуры целлюлозы и (или) удаление лигнина. Происходит также увеличение поверхности целлюлозы, что оказывает дополнительное положительное влияние на скорость гидролиза. Считается, что лигнин образует физический барьер воздействию ферментами. Некоторые исследователи обнаружили, что делигнификация биомассы повышает выход моносахаридов, получаемых ферментативным гидролизом [1].

Есть мнение, что степень кристалличности целлюлозы является главным фактором, влияющим на ферментативный гидролиз субстрата. Сообщалось, что снижение кристалличности целлюлозы особенно влияет на начальную скорость гидролиза целлюлозы целлюлазой. [22].

По другим источникам [23], фактором, определяющим изменение скорости гидролиза, является не степень кристалличности, а необратимая адсорбция фермента на субстрате в процессе гидролиза с одновременной потерей каталитической функции.

Выдвинуто несколько гипотез для объяснения этого вопроса по снижению скорости, в том числе дезактивации фермента, снижения синергетического эффекта, изменений реакционной способности субстрата и ингибирования продукта. В условиях ферментативного гидролиза сила сдвига и термическая неустойчивость ферментов служат главными причинами дезактивации фермента. Хотя встряхивание в процессе гидролиза должно приводить к однородной реакции, было обнаружено, что ферменты дезактивировались под воздействием поверхности раздела воздух - жидкость при встряхивании или перемешивании.

Так же как и скорость любых химических превращений, скорость ферментативных реакций зависит от многих факторов. Основными из них являются следующие - время протекания ферментативной реакции (время инкубации), температура и рН окружающей среды.

1) Время протекания

По мере того, как время инкубации фермента увеличивается, скорость реакции снижается. Это может происходить по различным причинам, главными из которых являются: уменьшение концентрации субстрата, увеличение скорости обратной реакции (в результате накопления продукта), ингибирование фермента продуктом реакции, денатурация фермента. При кинетических исследованиях проводят измерения начальной скорости реакции.

2) Температура

Согласно правилу Вант-Гоффа для химических реакций повышение температуры на 10 °С приводит к увеличению скорости реакции в 2…4 раза. Скорость ферментативной реакции с повышением температуры увеличивается, достигая максимума при какой-то оптимальной температуре (температурный оптимум фермента), а затем падает до нуля (рисунок 2 а). Следует заметить, что температурный коэффициент увеличения скорости для ферментативных реакций меньше, чем для обычных химических реакций: при увеличении температуры на каждые 10 °С скорость возрастает не более в два раза.

Снижение скорости реакции до нуля вызвано инактивацией фермента вследствие денатурации его белковой части. Большинство ферментов инактивируются при температурах 40…50 °С. Отдельные ферменты инактивируются при температурах, близких к 0 °С. Высокой термостабильностью отличаются ферменты, являющиеся гликопротеинами, поскольку углеводный фрагмент придает белку термоустойчивость. Такие ферменты работают в микроорганизмах, обитающих в горячих источниках.

3) рН среды

Изменение рН среды приводит к изменению степени ионизации кислотных и основных групп как активного центра фермента, так и самого субстрата. Следовательно, изменение рН влияет на сродство субстрата к активному центру фермента и на каталитический механизм реакции. Обычно зависимость скорости ферментативной реакции от рН среды имеет колоколообразную форму (рисунок 2 б), поскольку для каждого фермента существует свое оптимальное значение рН, при котором фермент проявляет наибольшую каталитическую активность (оптимум рН фермента). Значение рН в оптимуме отвечает наилучшему связыванию субстрата ферментом и наибольшей скорости катализа.

Рисунок 2 - Графики зависимости скорости ферментативной реакции от температуры (а) и рН среды (б)

Проблема гидролиза является нерешённой, и влияние многих факторов остаётся неисследованным. Интенсификация ферментативного гидролиза позволит эффективно использовать колоссальные резервы растений и древесины, образующихся в процессе фотосинтеза.

1.6 Ферменты, участвующие в биоконверсии ЛЦМ

Ферментативная деструкция целлюлозы происходит, как правило, под действием не отдельных ферментов, а полиферментных систем (комплексов). Ферментам, входящим в состав этих систем, присуща определенная специализация: один из них эффективно гидролизуют «внутренние» гликозидные связи между моносахаридными остатками, удаленными от концов полисахарида (их называют эндополимеразы, эндоглюканазы, эндоферменты); другие предпочтительно расщепляют «внешние» гликозидные связи, находящиеся на концах полисахаридной молекулы (экзодеполимеразы, экзоглюканазы, экзоферменты). Глюкозидазы осуществляют гидролиз гликозидных связей ди- и олигосахаридов [24].

Гидролиз целлюлозы осуществляется целлюлазными полиферментными системами. Целлюлазный комплекс состоит из ферментов четырех типов: эндо-1,4-в-глюканазы, экзо-1,4-в-глюкозидазы и целлобиазы.

Целлюлолитические ферменты относятся к классу карбогидраз, катализирующих гидролиз О-гликозидной связи, и являются одними из самых распространенных в природе ферментов; они встречаются в животных организмах, высших и низших растениях, микроорганизмах [1].

В настоящее время «базовой» моделью действия целлюлазного комплекса является следующая. Эндоглюканаза гидролизует целлюлозу, осуществляя ее деполимеризацию, диспергирование и в определенной степени разрушение кристаллической структуры. Одновременно происходит подготовка субстрата для действия целлобиогидролазы. Оба этих фермента в качестве растворимого продукта дают целлобиозу, которая под действием в-глюкозидазы (целлобиазы) гидролизуется до глюкозы.

Существует модификация «базовой» модели. Предполагается, что эндоглюконаза расщепляет аморфные участки целлюлозы, далее целлобиогидролаза гидролизует целлюлозу с повышенной кристалличностью. Следует отметить, что в большинстве случаев гомогенная целлобиогидролаза гидролизует аморфную целлюлозу, но не активна по отношению к кристаллической [1]. В работе [25] описан механизм, предполагающий, что напротив, эндоглюконаза обладает высокой активностью к кристаллической целлюлозе, но не способна гидролизовать высокомолекулярные продукты собственного действия.

Характерным свойством, присущим целлюлазному комплексу, явление синергизма, выражающееся во взаимном увеличении скорости и глубины гидролиза целлюлозы до конечных (растворимых) продуктов при совместном (одновременном) действии компонентов целлюлазного комплекса по сравнению с индивидуальным действием этих компонентов. Синергизм был обнаружен при изучении целлюлазных комплексов из различных источников [26, 27, 28]. В большинстве случаев синергизм отмечается между компонентами, принадлежащими определенному целлюлазному комплексу, однако встречается и перекрестный синергизм между компонентами, относящимся к комплексам из различных источников [1].

Адсорбция целлюлаз является стадией, предшествующей гидролизу, причем скорость процесса адсорбции существенно превышает скорость гидролитической стадии. В количественном отношении адсорбция зависит от относительной концентрации ферментов и субстрата, структурных параметров целлюлозы и степени ее набухания в воде, рН, температуры, скорости перемешивания в реакционной смеси [28]. Адсорбция целлюлолитических ферментов увеличивается с понижением температуры, не меняется в интервале рН 3,5…5,0, но значительно уменьшается с увеличением рН до 6…7.

Процесс адсорбции может носить многостадийный характер, когда за быстрой стадией связывания основного количества фермента наблюдается медленная стадия адсорбции относительно незначительного количества фермента [28]. Не исключено, что это обусловлено наличием как обратимого, так и необратимого связывания, хотя в некоторых работах высказывается предположение, что причины заключаются в относительно медленном диспергировании целлюлазного субстрата и соответствующем увеличении его поверхности [1, 29].

Важно подчеркнуть, что целлюллолитические ферменты, обладающие одинаковой специфической активностью, разделяются на две формы с точки зрения их адсорбционной способности на целлюлозе: прочно и слабо адсорбирующиеся на ней. Другими словами, в состав целлюлазного комплекса могут входить прочно и слабо адсорбирующиеся эндоглюконазы, целлобиогидролазы и т.д. Это приводит к тому, что при гидролизе целлюлозы часть ферментов действует на субстрат, находясь в растворе (слабо адсорбирующиеся ферменты), другая часть действует в адсорбированном состоянии (прочно адсорбирующиеся ферменты). Характерно, что слабо адсорбирующиеся ферменты не обладают заметной способностью адсорбироваться на целлюлозе при повторном их смешивании с ней. Напротив, десорбция прочно адсорбирующихся ферментов невелика и становится заметной только при достижении значительной глубины гидролиза целлюлозы. Наличие двух форм целлюлолитических ферментов, отличающихся по адсорбционной способности, обусловлено, по-видимому, существованием множественных форм ферментов, обладающих различной адсорбционной способностью [1].

1.7 Обоснование выбора направления исследований

Ферментативный гидролиз целлюлозосодержащего сырья обычно проводят в ацетатном буфере [30]. Однако уксусная кислота является ингибитором спиртового брожения, поэтому для получения доброкачественных гидролизатов и, в последующем, биоэтанола, ФГ следует проводить в водной среде.

В ИПХЭТ СО РАН успешно проведено исследование ФГ технических целлюлоз из нетрадиционного целлюлозосодержащего сырья в ацетатном буфере, процесс масштабирован в ферментёре объёмом 11 л и проведён в водной среде [31]. В данной работе в качестве субстрата был выбран лигноцеллюлозный материал (ЛЦМ), полученный их плодовых оболочек овса и биомассы Мискантуса китайского - более многокомпонентный и сложный субстрат, чем техническая целлюлоза.

Целью работы является исследование ферментативного гидролиза (ФГ) лигноцеллюлозных материалов (ЛЦМ) из недревесного растительного сырья. Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

1 изучить ферментативный гидролиз ЛЦМ в ацетатном буфере и в водной среде;

2 показать зависимость ФГ от концентрации субстрата;

3 исследовать зависимость эффективности ФГ от условий перемешивания;

4 установить зависимость ФГ от сырья для получения ЛЦМ;

5 изучить реакционную способность к ферментации ЛЦМ плодовых оболочек овса разными ферментными препаратами;

6 установить зависимость эффективности ФГ от способа подготовки ЛЦМ.



2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1 Основные показатели используемого материала

В качестве материалов для проведения ферментативного гидролиза, были использованы лигноцеллюлозные материалы (ЛЦМ) из плодовых оболочек овса (ПОО) и Мискантуса китайского (М), полученные методом азотнокислой варки в лабораторных условиях и на опытном производстве (ОП) ИПХЭТ СО РАН.

Принципиальная технологическая блок-схема получения ЛЦМ:



Были использованы следующие субстраты:

1. № 516 (ЛЦМ ПОО, получен в лабораторных условиях: промывка водой + 4% азотная кислота, 5…6 ч, М = 10, 90…95 );

2. № 592 ЛЦМ М (получен на ОП-4: предварительный гидролиз 1 %-ным раствором азотной кислотой с получением целлюлозосодержащего продукта, затем азотнокислая варка в 4 %-ном растворе азотной кислоты);

3. № 593 (ЛЦМ ПОО, полученный на ОП-4: предварительный гидролиз 1 %-ным раствором азотной кислотой с получением целлюлозосодержащего продукта, затем азотнокислая варка в 4 %-ном растворе азотной кислоты);

4. № 621 (ЛЦМ ПОО, получен в лабораторных условиях: промывка водой, обработка 0,5 % АК при М=15 и температуре 90…96 в течение 2…3 ч, затем обработка 4 % АК при М=15 и температуре 90…96 в течение 4…5 ч, затем промывка водой);

5. № 632 (ЛЦМ М, получен в лабораторных условиях: промывка водой, обработка 0,5 % АК при М=15 и температуре 90…96 в течение 2…3 ч, затем обработка 4 % АК при М=15 и температуре 90…96 в течение 4…5 ч, затем промывка водой).

Таблица 1 - Характеристики сырья

Характеристики м.д., %* на а.с.с.	Номер образца
	№ 516	№ 592	№ 593	№ 621	№ 632
Целлюлоза по Кюршнеру*	?	88,55	79,21	93,13	88,30
Влага, %	7,0	6,2	5,1	9,8	7,5
Зола*	9,85	4,75	8,19	8,68	3,84
Пентозаны*	?	7,89	9,22	23,32	13,8
Лигнин*	17,35	10,82	13,78	13,05	11,83
б-целлюлоза*	73,51	86,76	79,44	80,05	80,09



2.2 Основные характеристики вспомогательных материалов

2.2.1 Вода дистиллированная

Вода дистиллированная (Н2О). Бесцветная прозрачная жидкость без запаха, вкуса и цвета; хорошо растворима в спирте; М = 18,02; Тпл = 0 ; Ткип = 100 ; с = 1 г/см3 [32].

2.2.2 Кислота соляная

Соляная кислота (НСl). Бесцветная жидкость с резким запахом, в воздухе образует белый туман. Сильная кислота, растворяет большинство металлов с образованием солей и выделением водорода; очень хорошо растворяется в воде. Сильными окислителями окисляется до хлора. М = 36,46; Тпл = - 114,2 ; Ткип = - 85,08 ; с = 1,184 [32].

2.2.3 Спирт этиловый

Спирт этиловый (С2Н5ОН). Бесцветная жидкость с характерным спиртовым запахом и жгучим вкусом, хорошо растворимая в воде, эфире, хлороформе, метаноле. М = 46,07; Тпл = - 114,15 ; Ткип = 78,39 ; Твсп = 16,1 ; Тсвспл = 404 ; d420 = 0,7893, nD20 = 1,3611 [32].

2.2.4 Гидроокись натрия

Гидроокись натрия (NaOH). Бесцветные ромбические кристаллы; М = 40,00; плотность 2,13 г/см3; Tпл = 320 єC, Tкип = 1378 єC. Хорошо растворим в этаноле, метаноле, глицерине; плохо растворим в диэтиловом эфире, ацетоне [32].



2.2.5 Кислота уксусная

Кислота уксусная (СН3СООН). Бесцветная прозрачная жидкость с резким запахом; Ткип = 117,8 °C; плотность 1,0492 г/см3; Твсп = 38 °C. Температурный предел взрываемости находится от 35 єC до 76 єC [32].

2.2.6 Хлорное железо

Хлорное железо (FeCl3). Красно-коричневые тригональные кристаллы; М = 162,21; плотность 2,9 г/см3; Tпл = 307,5 єC, Tкип = 315 єC. Хорошо растворим в этаноле, ацетон, диэтиловый эфир [32].

2.2.7 Ацетат натрия

Ацетат натрия (CH3COONa). Бесцветные моноклинные кристаллы; М = 82,03; плотность 1,528 г/см3; Tпл = 324 єC. Плохо растворим в этаноле, диэтиловом эфире [32].

2.2.8 3,5-динитросалициловая кислота

3,5-динитросалициловая кислота (C7H4O7N2). Кристаллический порошок светло-желтого цвета; М = 228,12; Tпл = 173-174 єC. Хорошо растворим в этаноле, эфире, воде. Обладает общетоксическим действием. ПДК в воздухе - 0,5 мг/м3 [32].

2.2.9 Виннокислый калий-натрий

Виннокислый калий-натрий (KOOC(CHOH)2COONaЧ4H2O). Бесцветные кристаллы; М = 282,1; Tпл = 55,6 єC. Хорошо растворим в воде.

2.3 Приготовление реактивов

2.3.1 Приготовление раствора орсина

Массу (0,400 0,025) г орсина растворяют в (9,50,05) моль/дм3 (9,50,05) н. растворе соляной кислоты, добавляют 1 см3 раствора хлорного железа и доводят объем раствора в мерной колбе вместимостью 1000 см3 до метки (срок хранения три недели) [33].

2.3.2 Приготовление ацетатного буфера

29 см3 ледяной уксусной кислоты наливают в мерную колбу вместимостью 500 см3 и доводят объем дистиллированной водой до метки. 41 г ацетата натрия помещают в мерную колбу вместимостью 500 см3 и доводят объем дистиллированной водой до метки. Полученные растворы смешивают [34].

2.3.3 Приготовление реактива на основе 3,5-динитросалициловой кислоты

Предварительно готовят раствор натрия гидроокиси массовой доли 10,7 %. Для этого растворяют 16,05 г гидроокиси натрия в 150 см3 дистиллированной воды. Полученный раствор охлаждают до комнатной температуры.

Для приготовления реактива динитросалициловой кислоты (ДНС) массовой доли 1,0 % в стакан вместимостью 1 л вносят 10,0 г ДНС и 400 см3 дистиллированной воды. Перемешивают в течение 25…30 мин при комнатной температуре. Затем постепенно, при постоянном перемешивании добавляют 150 см3 раствора гидроокиси натрия. При этом окраска раствора меняется от светло-желтой до ярко-желтой.