Мониторинг внутриклеточного протеасомо-опосредованного гидролиза белков в физиологических условиях с применением ДНК-кодируемой резоруфин-лигазы

Размещено на http://www.allbest.ru/

Мониторинг внутриклеточного протеасомо-опосредованного гидролиза белков в физиологических условиях с применением ДНК-кодируемой резоруфин-лигазы



Содержание

Введение

1. Протеасомо-опосредованный гидролиз белков и методы его мониторинга

1.1 Протеосома

1.1.1 Строение и функции протеасомы

1.2 Убиквитин

1.2.1 Модификации убиквитином

1.2.2 Узнавание убиквитина

1.2.3 Убиквитин-зависимый путь деградации белков

1.3 Система убиквитирования/деубиквитирования

1.4 Современные методы исследования белков

1.5 LplA лигаза

1.6 Функции и синтез липоевой кислоты в Escherichia coli

1.7 Использование LplA-лигазы в биохимических исследованиях

2. Материалы и методыисследования

2.1 Материалы исследования

2.2Методы исследования

2.3 Работа с нуклеиновыми кислотами

2.4 Методы работы с бактериями Escherichia coli

2.5 Методы работы с эукариотическими клетками HEK

2.6 Денатурирующий электрофорез в полиакриламидном геле

3. Результаты и обсуждение

Выводы

Список литературы



Введение

белок гидролиз бактерия кислота

Модификация белков убиквитином, приводящая к направленной деградации внутриклеточных белков 26S протеасомой, является одним из фундаментальных клеточных процессов. На настоящий момент считается, что как минимум половина белков в клетке разрушается при участии системы убиквитинилирования, насчитывающей, в свою очередь, более тысячи индивидуальных представителей в составе клеточного протеома.

Несмотря на множество методик, предложенных для наблюдения протеасомо-опосредованного гидролиза белков, подавляющее большинство из них подразумевает добавление специфических веществ, останавливающих белковый синтез, и последующее необратимое разрушение клеток. Добавление к исследуемым белкам высокомолекулярных ДНК-кодируемых флуорофоров приводит к значительным изменениям субстратных свойств изучаемых мишеней, что также значительно ограничивает подобную методику. В настоящей работе нами предложен альтернативный подход к решению описанной задачи с использованием липоат-лигазы типа А (LplA).

Объект - убиквитин-протеасомная система.

Предмет - клеточный метаболизм протеасом-зависимых и независимых белков, а также важнейшего представителя убиквитин-протеасомной системы - убиквитина.

Цель исследования - анализ внутриклеточного протеасом- опосредованного гидролиза белков в физиологических условиях с применением ДНК-кодируемой резоруфин-лигазы.

Задачи исследования:

1. Теоретический анализ литературы отечественных и зарубежных авторов по теме исследования.

2. Создание генетических конструкций, кодирующих в составе полицистронной кассеты белковые субстраты и мутантную липоат-лигазу LplA, совмещенную с репортерным белком ZsGreen1.

3. Отработка оптимальных условий внутриклеточной конъюгации белков- мишеней с резоруфином, катализируемое LplA.

4. Изучение внутриклеточного метаболизма ряда белков и убиквитина с применением разработанной методики.

Для решения поставленных задач и проверки исходных положений была определена методологическая база и методы исследования: методы теоретического анализа; эксперимент; методы генетической инженерии; электрофоретическое разделение белков в полиакриламидных гелях; измерение флуоресценции; блоттинг по Вестерну; прижизненная флуоресцентная микроскопия; методы компьютерной математической обработки полученных данных с построением графиков (SigmaPlot 11.0).

Теоретическая значимость:

– рассмотрены имеющиеся данные о убиквитин-протеасомной системе;

? проанализированы результаты научно-исследовательских публикаций по изучению методов анализа внутриклеточной деградации белков;

– описана методологическая основа специфического внутриклеточного мечения белков низкомолекулярными флуорофорами;

– обозначены молекулярно-биологические аспекты исследуемой проблемы.

Практическая значимость:

– получены данные по времени полужизни важного аутоантигена при рассеянном склерозе основного белка миелина (МВР), уточнены параметры метаболизма одной из главных мишеней при терапии онкологических заболеваний дегидрофолатредуктазы (DHFR), а также главного элемента протеасомной системы деградации белков - убиквитина - в истинно физиологических условиях.

Работа выполнена на базе Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук (ИБХ РАН) в Лаборатории биокатализа (Отдел пептидно-белковых технологий).

Автор выражает благодарность коллективу Лаборатории биокатализа ИБХ РАН, заведующему лабораторией чл.-корр. РАН, д.х.н., проф. Габибову Александру Габибовичу, старшему научному сотруднику к.х.н. Белогурову Алексею Анатольевичу за научное руководство и помощь на всех этапах работы, Кудряевой Анне Анатольевне за терпение и искреннюю помощь в выполнении практической части настоящего исследования.



1. Обзор литературы по теме протеасомо-опосредованный гидролиз белков методы его мониторинга

1.1 Протеасома

Протеасома - высокомолекулярный белковый комплекс, обладающий протеолитической активностью с широкой субстратной специфичностью. 20S протеасома в качестве протеолитического ядра входит в состав 26S протеасомы. Основной задачей протеасомы является расщепление отслуживших и дефектных клеточных белков. Есть несколько путей деградации белков протеасомой, но самым распространенным и высококонсервативным является АTP-зависимый путь с участием белка убиквитина (Ub), длиной 76 аминокислотных остатков. Около 90% короткоживущих и 70% долгоживущих белков разрушаются 26S протеасомой по убиквитин-зависимому пути. Для протеасомы основным сигналом для разрушения белка является полиубиквитиновая цепь связанная с субстратом. Маркировку белков осуществляет сложная система ферментов, называемая системой убиквитинилирования. Тем не менее, есть источники показывающие, что убиквитин-независимая деградация белков также возможна. При этом маркером для деградации может служить аминокислотная последовательность внутри самого белка, либо некая вспомогательная молекула. Протеасомы есть в клетках всех живых организмов, от архебактерий до высших эукариот, что свидетельствует об их огромной значимости для нормального функционирования клетки [1].

1.1.1 Строение и функции протеасомы

Протеасома - мультисубъединичный ферментный комплекс, осуществляющий расщепление белков в клетке [2]. 26S-протеосома состоит из надмолекулярных комплексов двух типов: центральной частицы в форме бочонка 20S и регуляторной частицы 19S на обоих ее концах (Рис. 1)[3]. 20S- протеасома представляет собой цилиндр длиной 15-17 нм и диаметром 11-12 нм, состоящий из четырех сложенных в стопку гептамерных колец, структура протеосомы была выяснена с помощью рентгеноструктурного анализа [4]. Внешние кольца цилиндра состоят из семи гомологичных субъединиц б-типа, а каждое из внутренних колец - из семи похожих консервативных субъединиц в- типа. Масса каждой субъединицы колец составляет около 20-35 кДа. Просвет образованный кольцами делится на три полости [5]. Центральная протеолитическая полость сформирована двумя в-кольцами и отделена от двух внешних полостей, сформированными другими сторонами в-колец и б- кольцами [6]. Каталитические центры расположены на N-концах в-субъединиц, лежащих во внутренней полости цилиндра[7]. в-субъединицы (в1, в2 и в5) ответственны за каталитическую активность, на каждой из них локализовано по одному каталитическому центру, а N-концевые остатки треонина этих субъединиц действуют как нуклеофилы [8].

Рис. 1 Схема строения и сборки 26S протеосомы

Механизм катализа был установлен методами рентгеноструктурного анализа, а каталитически важный остаток - методом мутагенеза [9]. В ходе реакции протон гидроксильной группы треонина переносится на аминогруппу этой же аминокислоты, а молекула воды в активном центре действует как основание. По подобному механизму работают еще три других фермента: пенициллинацилаза (в активном центре N-концевой серин), глутамин- амидотрансфераза (в активном центре N-концевой цистеин), аспартилглюкозаминидаза (в активном центре N-концевой треонин). В эукариотической протеасоме 4 из 7 в-субъединиц содержат N-концевой треонин. Существуют предположения, что аминокислотные остатки Lys33 и Glu17 также находятся в активном центре и участвуют в катализе. Функции остальных в-субъединиц неизвестна. Структура протеосомы поддерживается б-субъединицами, хотя они и не имеют каталитической активности. Важность роли взаимодействий между субъединицами можно доказать тем что при распаде протеосомы на субъединицы каталитическая активность утрачивается полностью.

Один из активных центров протеасомы катализирует протеолиз со специфичностью по типу трипсина (расщепление полипептидной цепи после положительно заряженных аминокислотных остатков), другой - по типу химотрипсина (после ароматических аминокислотных остатков), третий - по типу каспазы (после отрицательно заряженных аминокислотных остатков). Дополнительная активность протеасомы способная расщеплять полипептидную цепь практически между любыми аминокислотными остатками сильно зависит от того, какие именно аминокислоты находятся по обе стороны от сайта расщепления.

В норме 20S протеасома существует в неактивном состоянии, так как б- субъединицы за счет своих N-концевых гидрофобных участков блокируют вход в центральный канал, препятствуя случайному протеолизу. Изменение параметров центрального канала при взаимодействии б-субъединиц с 19S регуляторным комплексом и активатором PA28, приводит к активации 20S протеасомы. Основной задачей регуляторных комплексов протеасомы является узнавание белков и подготовка к их деградаци. Подготовка состоит из двух этапов, первое это узнавание полиубиквитиновой цепи и связывание субстрата, с дальнейшим отщеплением убиквитина, второе разворачивание и перенос субстрата в протеолитическую камеру 20S частицы[10].

PA700 (19S-частица) регуляторный комплекс протеасом эукариот состоит по крайней мере из 19 субъединиц и имеет молекулярную массу около 1 МДа. В его структуре можно выделить два основных элемента: “крышку” (lid) и “основание” (base). “Основание” состоит из шести субъединиц, имеющих АТФазную активность (Rpt1-6, Regulatory particle triple-A type1 proteins), членов ААА-семейства (ATPase Associated with different cellular Activities) и трех не АТФазных субъединиц (Rpn1, 2, 10), оно присоединяется непосредственно к б-кольцу каталитического ядра и обеспечивает разворачивание белковых субстратов. “Крышка” регуляторной частицы представляет собой комплекс массой 400 кДа, состоящий из 6 не АТФазных субъединиц (Rpn3, 5-9, 11-12, Regulatory particle non-ATPases) и отвечает за распознавание, связывание и деубиквитинилирование субстрата [11]. АТФазные субъединицы “основания” формируют гексамерное кольцо, которое непосредственно взаимодействует с гептамерным б-кольцом 20S протеасомы, открывая вход во внутреннюю протеолитическую камеру, а также разворачивают нативные белки [12]. “Основание” 19S-комплекса отвечает за связывание неправильно свернутых белков: для 19S комплексов дрожжей и млекопитающих была показана способность связывать некоторые неправильно свернутые белки и подавлять агрегацию последних [13].

Регулятор РА28 - гептамерный комплекс массой 180-200 кДа, состоит из IFNг- индуцибельных б и в-субъединиц. Он способен присоединяться к обоим концам протеолитического ядра или замещать 19S регулятор в 26S протеасоме. Существует гибридная протеасома, к которой с одного конца присоединен PA28, а с другого - 19S регулятор. PA28 связывается с 20S протеасомой обратимо, для этого процесса не требуется АТФ [14]. При этом открывается канал, ведущий в каталитическую полость протеасомы, что в десятки раз увеличивает ее активность [15].

Кроме разрушения отслуживших белков, протеасома выполняет множество различных функций:

1) Участие в регуляции клеточного цикла

2) Процессинг регуляторных белков и транскрипционных факторов

3) Участие в работе иммунной системы - гидролиз клеточных белков до антигенных пептидов

4) Защита клетки от воздействия высоких температур

5) Участие в процессе апоптоза.

1.2 Убиквитин

Убиквитин (Ub) - это 76-аминокислотный белок с хорошо изученной б/в укладкой (Рис. 2). Он высококонсервативен среди эукариот, но отсутствует у бактерий и архей. У эукариот есть несколько генов, кодирующих убиквитин. Часто он синтезируется в виде неактивного полиубиквитинового предшественника, в котором число повторов моноубиквитина может отличаться у разных организмов. Для активации Ub (экспозиции С-концевого остатка Gly) необходим процессинг деубиквитинилирующими ферментами. Чаще всего Ub присоединяется к субстратам путем образования изопептидносвязи между С-концевым остатком Gly и е-аминогруппой остатка Lys в молекуле субстрата. Ub образует разные типы модификаций. Простейшая из них - моноубиквитинилирование - это присоединение к белку одной молекулы Ub [16].



Рисунок 2 Строение убиквитина (ленточная диаграмма)

1.2.1 Модификации убиквитином

Существует несколько видов модификаций убиквитином:

1. Моноубиквитинилирование является распространенной регуляторной модификацией.

2. Мультиубиквитинилирование или множественное моноубиквитинилирование.

Регулирование транскрипции может влиять от моноубиквитинилирования гистонов и транскрипционных факторов. Присоединение одной молекулы убиквитина к белкам PCNA и FANCD2 играет важную роль при репарации ДНК. Моноубиквитинилирование различных поверхностных клеточных рецепторов является сигналом для их эндоцитоза и последующей деградации в лизосомах. Другая форма модификации - мультиубиквитинилирование или множественное моноубиквитинилирование - характеризуется тем, что несколько остатков Lys на субстрате могут связыватся с одиночными молекулами Ub. Такая модификация приводит к эндоцитозу субстрата и его последующей деградации в лизосомах [17].

Молекулы Ub могут конъюгироваться между собой, формируя различные варианты цепей. Присоединение таких цепей убиквитина к субстрату - это полиубиквитинилирование [18]. Убиквитин содержит семь остатков Lys (Lys-6, Lys-11, Lys-27, Lys-29, Lys-33, Lys-48 и Lys-63). Предполагается, что все остатки Lys могут участвовать в образовании полиубиквитиновой цепи. Наиболее изученными и распространёнными механизмами образования полиубиквитиновых цепей происходит с участием Lys-48 и Lys-63 [19]. Сигналами для деградации белка протеосомой служат Lys-48- полиубиквитиновые цепи [20]. В свою очередь Lys-63-полиубиквитиновые цепи вовлечены в регуляцию эндоцитоза, репарацию ДНК, активацию протеинкиназ [20]; в экспериментах in vitro они могут приводить к деградации субстратов [21]. Полиубиквитиновые цепи, образованные через Lys-6, Lys-11, Lys-27, Lys-29 и Lys-33, встречаются достаточно редко, и их функции до конца не ясны [22].

1.2.2 Узнавание убиквитина

За распознавание полиубиквитинилированного белка ответственна одна из субъединиц регуляторной частицы 19S протеосомы - Rpn10 [23]. Rpn10 связывается с убиквитином благодаря наличию убиквитин-связывающего сайта в С-концевом гидрофобном кластере, содержащем мотив LALAL [24]. Изолированная субъединица Rpn10 с одинаковой эффективностью связывает разные формы поли-Ub, в которых отдельные молекулы убиквитина соединены через Lys-6, Lys-11 или Lys-48, тогда как 26S протеасома связывает убиквитин, сшитый через Lys-48 [25]. Это свидетельствует о существовании механизмов, обеспечивающих не только эффективное, но и правильное связывание субстрата. Вероятно, корректное узнавание четвертичной структуры полиубиквитиновой цепи и специфичность связывания субстрата обуславливают вспомогательные лабильно ассоциированные белки, такие как Rad23 (hHR23a, hHR23b) и Dsk2 (hPLIC) [26]. Опыты на S. cerevisiae по удалению Ub-связывающего сайта у Rpn10 показали, что фенотипически такие мутанты не отличаются от дикого типа [26]. Это свидетельствует о том, что Rpn10 - не единственная субъединица протеасомы, способная связывать полиубиквитиновую цепь. По-видимому, в связывание полиубиквитинированного субстрата вовлечены также субъединицы Rpn1, Rpn2, Rpn13 и Rpt5 [27,28].

1.2.3 Убиквитин-зависимый путь деградации белков

Деградация белков по убиквитин-зависимому пути проходит в два основных этапа:

1. Присоединение убиквитина (полиубиквитиновой цепи) к белку-мишени.

2. Гидролиз убиквитин-связанного белка 26S протеасомой с высвобождением свободного убиквитина.

Последний процесс осуществляется деубиквитинилирующими ферментами (deubiquitinating enzymes, DUBs). Ковалентное присоединение убиквитина к белками, предназначенными для расщепления, происходит с помощью трех групп ферментов (E1, E2 и E3) (Рис. 3)[29]

Рисунок 3. Схема убиквитин-зависимого пути деградации белков

1.3 Система убиквитинилирования/деубиквитинилирования

В эукариотической клетке белки, направленные на гидролиз в протеасому, помечены не одним убиквитином, а полиубиквитиновой цепью. Процесс присоединения убиквитина к белку-мишени проходит в три стадии. На первом этапе убиквитин-активирующий фермент Е1, используя АТР, активирует убиквитин с образованием промежуточного комплекса (E1-S~Ub). Затем, один из убиквитин-переносящих ферментов Е2 через образование еще одного промежуточного комплекса (E2-S~Ub) переносит активированный убиквитин к Е3-лигазе, специфично связанной с субстратом. В случае RING-домен- содержащих Е3-лигаз убиквитин переносится лигазой сразу на субстрат. В случае НЕСТ-домен-содержащих Е3-лигаз перенос убиквитина на субстрат проходит через образование еще одного промежуточного комплекса - E3-S~Ub. После того как присоединен первый убиквитин к субстрату, Е3-лигаза последовательно присоединяет еще несколько молекул убиквитина к остатку Lys на первой молекуле [30].

Свободная карбоксильная группа С-конецевого остатка Gly Ub формирует изопептидную связь с е-аминогруппой остатка Lys в молекуле субстрата, но в некоторых случаях Ub может конъюгировать через N-конец субстрата или через боковую цепь цистеина [31]. Считается, что для большинства белков минимальным сигналом деградации для протеасомы является цепь из четырех молекул Ub, последовательно соединенных изопептидной связью между С- концом одной молекулы и Lys48 другой молекулы [32].

Система убиквитинирования у млекопитающих содержит несколько сотен разных ферментов, включая один Е1-фермент, ~50 Е2-ферментов и ~500 Е3- лигаз. Е3-лигазы играют ключевую роль в убиквитин-зависимой протеасомной деградации белков, так как именно они обеспечивают специфичность полиубиквитинирования субстрата (Рис. 4).



Рисунок 4 Трехстадийный процесс присоединения убиквитина ферментативным комплексом лигаз к белку

Перед попаданием субстрата в протеолитическую полость протеасомы с него должен быть удален Ub. Реакция деубиквитинилирования осуществляется деубиквитинилирующими ферментами (DUBs). Все известные DUB-ферменты являются цистеиновыми протеазами, которые специфично гидролизуют изопептидную связь сразу после С-концевого остатка Ub (Gly-76). У млекопитающих обнаружено ~100 деубиквитинирующих ферментов, и по крайней мере четыре из них (Rpn11, Ubp6, UCH37, Doa4) являются компонентами 26S протеасомы или часто обнаруживаются в комплексе с ней. Основываясь на данных об их молекулярной массе, гомологии в аминокислотной последовательности и каталитически важных остатках в пептидазном центре, их подразделяют на два больших подсемейства: UCHs (ubiquitin COOH-terminal hydrolases) и USPs (или UBPs, ubiquitin-specific proteases). Ферменты UCH - это, как правило, небольшие белки (20-30 кДа), отщепляющие Ub от коротких и неструктурированных полипептидных цепей. Как и все цистеиновые протеазы, в пептидазном центре они содержат каталитическую триаду аминокислотных остатков - Cys, His и Asp - и дополнительный консервативный остаток Glu. Ферменты USP - более гетерогенная группа белков (30-100 кДа), которые расщепляют изопептидую связь как между Ub и субстратом, так и между двумя молекулами Ub. Белки этого семейства также содержат каталитическую триаду аминокислотных остатков (Cys, His и Asp) в пептидазном центре[33].

1.4 Современные методы исследования белков

Метаболизм большинства внутриклеточных белков зависит от работы убиквитин-протеасомной системы, называемой также UPS. Как уже упоминалось, убиквитин-протеасомная система состоит приблизительно из 1000 белков и основная часть из них имеют решающее значение для нормального функционирования клеток [34]. Одним из наиболее важных характеристик UPS-субстратов является время полураспада в клетке. Знание метаболизма белков является основной составляющей в понимании функционирования белковой машинерии, которая участвует во всех без исключения внутриклеточных процессах от ее деления до апоптоза.

В настоящий момент возможно использовать несколько методов определения скорости убиквитин-протеасомного гидролиза белков. Классический метод «pulse-chase» требует введения радиоактивных элементов в клетки (например 35S-метионин) с последующей промывкой «холодной» средой и дальнейшей изоляцией интересующего белка с использованием аффинных реагентов в выбранных точках времени. Другой классический метод основан на ингибировании белкового синтеза (например циклогексимидом [35]) и последующим анализом количества белка в разные периоды времени с помощью Вестерн-блоттинга. Самым очевидным недостатком этого метода является клеточный стресс после полной остановки синтеза белка, что приводит к значительным изменениям в клеточном метаболизме и к трудностям в изучении долгоживущих белков [36]. Объединение таких методов как масс-спектрометрия и «pulse-chase» привели к методу, известному как стабильная маркировка белков изотопными аминокислотами в клеточной культуре (SILAC, [37]). SILAC не требует изоляции интересующего белка и позволяют анализировать время полураспада сотен белков в одном эксперименте, однако, он чрезвычайно чувствителен к подготовке образцов и требует специального масс-спектрометрического оборудования.

Мониторинг деградации белков в реальном времени стал возможным с помощью слияния белка-мишени с ДНК-закодированным флуоресцентным зондом (например, GFP). Использование фотоактивируемых флуоресцентных белков (PAFP) делает возможным отслеживание деградации внутриклеточных белков-мишеней без добавления циклогексимида [38,39]. Другой метод, называемый «bleach-chase», позволил исследователям наблюдать динамику флуоресцентно-меченых белков в живых клетках H1229. Различия в флуоресценции между клетками, обесцвеченными коротким импульсом света, и нативными клетками были использованы для оценки периода полураспада белков. Периоды полураспада в диапазоне 0.75-22.5 ч были измерены на 100 YFP-меченных белках [40]. Развитие различных флуоресцентных меток можно также рассматривать в качестве подхода для мониторинга стабильности белка в физиологических условиях [41]. Несмотря на очевидные выгоды, слияние белка с более чем 20-килодальтонной флуоресцентной меткой несомненно несет опасность изменения структуры, функции, связывающих свойств, локализации и стабильности белка, что в свою очередь может непредсказуемо изменить его синтез или деградацию [42].

Последние достижения в маркировке белков химическими флуорофорами внутри живых клеток также можно применять для мониторонга стабильности белка. Удаление флуорофора из среды имитирует классическую "pulse-chase" методологию, вновь синтезированный белок не будет подвергаться мечению. Относительно недавно был разработан метод PRIME (Probe Incorporation Mediated by Enzymes), в основе которого лежит использование лигазы липоевой кислоты Escherichia coli, содержащей ряд замен в активном центре (LplA).

Данная лигаза способна присоединять химический флуорофор к ?-аминогруппе лизина в составе короткого 13-членного пептида [43,44]. Этот метод сочетает в себе преимущества высокоспецифических белковых меток и небольших химических флуорофоров [45-47]. Мы предполагаем, что метод PRIME может быть эффективно использован для мониторинга стабильности белка в физиологических условиях в режиме реального времени.

LplA(AAG) лигаза

1.5 Функции и синтез липоевой кислоты в Escherichia coli

Серия генетических, биохимических и физиологических исследований в Escherichia coli пролили свет на механизм синтеза липоевой кислоты - так были выяснены функции белков-ферментов, которые участвуют в присоединении липоевой кислоты, а также ферментов, которые катализируют сопряженные реакции модификации. Некоторые аспекты механизмов синтеза и присоединения липоевой кислоты имеют сильное сходство с метаболизмом биотина [48].

Липоевая кислота представляет собой серосодержащие кофакторы, которые найдены в большинстве прокариотических и эукариотических организмах. Гомологи липоевой кислоты найдены во всех царствах жизни. В Escherichia coli и других организмах липоевая кислота необходима для функционирования нескольких ключевых ферментов, участвующих в окислительных реакциях и метаболизме пируватдегидрогеназы (PDH), 2- оксоглутарат дегидрогеназы (2-OGDH), разветвленной цепью 2- оксиддегидрогеназы и ацетоиндегидрогеназы [49,50]. В каждом ферменте определенная субъединица модифицируется присоединением липоевой кислоты к конкретным остаткам лизина в доменах этих субъединиц. При этом амидная связь образована между карбоксильной группой липоевой кислоты и аминогруппой боковой цепи лизина [51]. Наш интерес был направлен не на саму липоевую кислоту, а на механизмы присоединения липоевой кислоты и ее предшественника, октановой кислоты, к белкам.

Существование липоил-лигазы (Lipoate-Protein Ligase LplA) было впервые описано Ридом и его сотрудниками (1958) в E. Faecalis и в E.coli. Очищенная LplA-лигаза представляет собой белок с массой 38 кДа, которая представлена мономерной формой [52]. Липоил-лигаза катализирует как АТФ-зависимую активацию липоата до липоил-AMP, так и передачу этого активированного липоила к апопротеинам с сопутствующим высвобождением AMP. Липоил- лигаза способна использовать липоат и несколько его аналогов в качестве доноров для посттрансляционной модификации E2 апобелков в естественных условиях [53].

1.6 Использование LplA-лигазы в биохимических исследованиях

Химические флуорофоры имеют много преимуществ по сравнению с флуоресцентными белками, но является более сложными в работе. Флуоресцентные белки используются повсеместно в биовизуализации, но их большие размеры (~27 кДа) могут нарушать сворачивание и функцию белка. Сайт-специфическая маркировка белка является сложной задачей, потому что эти флуорофоры генетически не кодируются, следовательно, они должны быть посттрансляционно доставлены внутрь клетки. Для достижения специфической маркировки, по эффективности, сопоставимой с флуоресцентными белками, ранее группой авторов был разработан метод внутриклеточного мечения рекомбинантных белков с использованием липол-лигазы E.coli путем присоединения химического флуорофора к остатку лизина в составе 13- членной аминокислотной последовательности. Авторами былсделан ряд замен в активном центре лигазы для распознавания низкомолекулярного химического флуорофора резоруфина [54,55].



2. Материалы и методы исследования

2.1 Материалы исследования

В работе использовали:

Клетки линии HEK293^ стабильно трансдуцированные следующими конструкциями:

pLХ303 MBP-LAP2_IRES-ZsGreen1-LplA(AAG) pLХ303 DHFR-LAP2_IRES-ZsGreen1-LplA(AAG) pLХ303 Ub-DHFR-LAP2_IRES-ZsGreen1-LplA(AAG) pLХ303 LAP2-Ub_IRES-ZsGreen1-LplA(AAG)

Ингибиторы рибосом: циклогексимид, анисомицин. Ингибиторы протеасомы: PS341, MG-132.

Модифицированный химический флуорофор: резоруфин

2.2 Методы исследования

2.3 Работа с нуклеиновыми кислотами

Амплификация фрагментов ДНК методом полимеразной цепной реакции. Полимеразную цепную реакцию проводили на приборе PTC-200 M&J Research, США.

Готовили инкубационную смесь следующего состава:

• однократный буфер для Tersus-полимеразы

• по 10 pM каждого праймера

• по 2 мМ каждого дезоксирибонуклеотидтрифосфата

• 1-2 ед. Tersus-полимеразы

* 0.1-0.2 мкг ДНК

Амплификацию проводили по следующей схеме: А

предварительная денатурация 95°С, 1 мин. 1 цикл.

Б

денатурация 95°С, 15 сек.

отжиг праймеров 50-65°С, 30 сек

элонгация 72°С, 20 сек-1 мин.

25 циклов. В

элонгация 72°С, 20 сек-1 мин.

1 цикл

Расчет температуры отжига праймера (Х) производили по формуле: Х = 2°С Ч n (А/Т) +4°С Ч n (G/C) -5°С,

где n - число соответствующих нуклеотидов. Для праймеров длиной более 24 нуклеотидов использовали температуру отжига 65°С или максимальную возможную температуру, определенную экспериментально.

Рестрикция. Рестрикцию ПЦР продуктов вели 14-16 часов, плазмидной ДНК - 1-2 часа, в термостате при 37°С. При рестрикции плазмидной ДНК, добавляли рибонуклеазу до конечной концентрации 1 мкг/мл.

Лигирование. Лигирование вели в объеме 20 мкл, при молярном соотношении вектора и вставки 1:10, в течение 1-12 часов при комнатной температуре. Затем в лигазную смесь очищали китом для выделения ДНК из реакционных смесей Cleanup Standard(Евроген, Россия)

Выделение плазмидной ДНК. Выделение плазмидной ДНК в большинстве случаев проводили китом для выделения плазмидной ДНК Plasmid Mini- или Midiprep (Евроген, Россия). Одну колонию бактерий инкубировали в 5 мл LB или 2xYT с добавлением селективного антибиотика и растили при 37°С с хорошей аэрацией в течение 18-22 часов. Осаждали клетки центрифугированием на скорости 5000 об/мин в течение 3 минут при комнатной температуре последовательно в одну микропробирку. Ресуспендировали в 250 мкл «ресуспендирующего раствора». Затем добавляли 250 мкл «лизирующего раствора» осторожно перемешивали содержимое пробирки до тех пор пока лизат не стал прозрачным. Затем быстро нейтрализовали 350 мкл «нейтрализирующего раствора», перемешивали переворачиванием и 1 минуту инкубировали при комнатной температуре до образования белого осадка, который осаждали центрифугированием на скорости 13200 oб/мин при комнатной температуре в течение 10 минут(Далее все центрифугирования проводили на скорости 13200 oб/мин). Супернатант переносили в, микроколонку и центрифугировали 1 минуту. Дальше добаляли 200 мкл «раствора для удаления эндотоксинов» и центрифугировали 1 минуту. Далее промывали 600 мкл «промывочного раствора» и центрифугировали 1 минуту. Спин-колонку помещали в новую пробирку и элюировали 30-50 мкл автоклавированной водой. Выделение плазмидной ДНК для секвенирования производилось согласно приведенной выше методике 300 нг в 6 мкл воды.

Электрофорез ДНК в агарозном геле. Для проведения электрофореза использовали 1% агарозный гель, приготовленный на однократном TBE с бромистым этидием в концентрации 0.5 мкг/мл. Пробы смешивали в соотношении 1:10 с буфером нанесения, содержащим 0.1% бромфеноловый синий, 0.5% ДСН, 0.1 М ЭДТА, pH 8.0, 50% глицерина. Электрофорез вели в буфере TBE при напряжении 5 В/см. По окончании электрофореза ДНК визуализировали в ультрафиолетовом свете при длине волны 254 нм.

Гомологичная рекомбинация. Данную процедуру проводили согласно протоколу фирмы-производителя (Invitrogen, США).

Электроэлюция. Фрагменты ДНК элюировали из однопроцентных агарозных гелей. После завершения электрофореза, гель окрашивали в растворе бромистого этидия (1 мкг/мл) и визуализировали в ультрафиолетовом свете, далее вырезали нужный фрагмент геля, помещали его в пробирку. Конечную очистку ДНК проводили китом для выделения ДНК из агарозных гелей (Евроген, Россия).



2.4 Методы работы с бактериями Escherichia coli

Получение электрокомпетентных клеток. Клетки из музея истощающим штрихом высевались на чашку Петри с LB-агаром без антибиотика, инкубировались 14 часов при 37°С в воздушном термостате. Отдельную колонию инокулировали в 5 мл 2хYT без антибиотика для получения ночной культуры и растили при 37°С с хорошей аэрацией. 250 мкл и 750 мкл ночной культуры высевали с разбавлением 1:1000 и 1:333 соответственно в две конические колбы, содержащие по 250 мл среды SOB, и растили при 37°С с хорошей аэрацией до оптической плотности 0.4 ОЕ, но не более двух часов. Затем клетки охлаждали во льду около десяти минут, стерильно переносили в охлажденные центрифужные стаканы на 250 мл, центрифугировали 10 минут 4000 об/мин при 0°C. Клетки суспендировали в небольшом объеме ледяной стерильной деионизированной воды, переносили в стерильные охлажденные центрифужные стаканы на 35 мл, доливали водой до верху, центрифугировали в тех же условиях. Повторяли еще 2 раза промывку водой, затем промывали охлажденным 10% глицерином. Осадок суспендировали в 2-3 мл 10% глицерина, разносили по 100 мкл в стерильные охлажденные эппендорфы, после чего замораживали в жидком азоте и хранили при -70°С. Компетентность клеток проверялась трансформацией плазмидой с известной концентрацией и принималась равной количеству выросших колоний поделенной на количество плазмиды в мкг.

Трансформация клеток E.coli методом «теплового шока». К размороженной на льду аликвоте (100 мкл) компетентных клеток добавляли раствор плазмиды или очищенную лигазную смесь, Инкубировали на льду 5-30 минут, далее клетки подвергались тепловому шоку 1 минуту в термостате на 42°С. После клетки снова помещали на лед на 2-5 минут. Затем клетки переносили в 1 мл теплой среды SOC без антибиотиков, инкубировали в воздушном термостате при 37°С 1 час для репарации клеточной стенки и начала экспрессии генов устойчивости к селективным антибиотикам. Далее высевали (100 мкл при трансформации плазмидой, 1 мл при трансформации лигазной смесью) на чашку Петри с LB-агаром, с добавлением селективных антибиотиков, и помещали в воздушный термостат на 37°С на 14-16 часов.

ПЦР c колоний. Амплификацию проводили по следующей схеме. Готовили инкубационную смесь следующего состава:

• 2.5 мкл десятикратного буфера для Taq-полимеразы

• по 10 пM прямого и обратного праймера

• по 2 мМ каждого дезоксирибонуклеотидтрифосфата

• вода до 24 мкл.

Раствор разносили по пробиркам по 22 мкл, в каждую пробирку помещали кусочек парафина. Бактериальные колонии переносили петлей в пробирки и одновременно делали штрихи на свежей, размеченной чашке Петри с твердой питательной средой. Пробирки помещали в прибор, проводили денатурацию при 94°C 3 минуты, на последней минуте первого цикла по пробиркам разносили Taq-полимеразу. Далее осуществляли 25 циклов ПЦР (денатурация: 94°C 30 сек, отжиг праймера Х = 2°С Ч n (А/Т) +4°С Ч n (G/C) -5°С 30 сек, элонгация 72°C 30-90 сек). Продукты полимеразной цепной реакции анализировали электрофорезом в агарозном геле.

Ночная культура. Бактериальную колонию помещали в 5 мл среды LB или 2xYT с добавлением селективного антибиотика, наращивали клетки при 37°С и интенсивной аэрации около 12-14 часов.

2.5 Методы работы с эукариотическими клетками HEK

Поддержание в культуре эукариотических клеток линии HEK. Клетки выращивали в среде DMEM, содержащей 10% бычьей фетальной сыворотки и 2мМ L-глутамина, в инкубаторе при 37°С, 5% СO2 во флаконах (25 см2). При достижении монослоя клетки рассевали. Клетки смывали и ресуспендировали в 4,5 мл среды DMEM с 10% бычьей фетальной сыворотки. Затем клетки рассевали 1/5 по объему суспензии.

Трансфицирование эукариотических клеток методом липофекции. Трансфекцию эукариотических клеток линии HEK 293 созданными конструкциями производили с помощью реагента LTX Plus. Все манипуляции производили в стерильных условиях. За день до трансфекции клетки HEK 293 рассевали в лунки 24-х луночных планшетов по 120 000 клеток в лунку в среде DMEM, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки. В день трансфекции, согласно рекомендациям производителя, 1 мкг очишенной плазмидной ДНК растворяли в 12,5 мкл бессывороточной среды DMEM и добавляли реагент из набора, отдельно смешивали 5 мкл LTX с 12,5 мкл DMEM. Затем по каплям добавляли приготовленный раствор LTX к раствору ДНК и инкубировали 15 минут при комнатной температуре. После чего по каплям добавляли к клеткам приготовленную смесь. Далее клетки вели согласно описанным процедурам.

Трансдукция (производство лентивирусов и заражение ими клеток (создание стабильных клеточных линий)). Лентивирусы были наработаны в клетках HEK293T в соответствии с протоколом производителя трансфецирующего агента Lipofectamine 3000. Супернатанты, содержащие вирусные частицы, собирали через 48 ч после трансфекции, и фильтровали через 0,45 мкм PVDF Durapore фильтр (Millipore Corp., Billerica, MA). Полученные вирусы добавляли в различных титрах к клеткам линии НЕК293.

Сайт-специфическое внутриклеточное мечение белков резоруфином. Клетки промывали средой OptiMEM. В OptiMEM добавляли резоруфин в конечной концентрацией 5 мкM, инкубировали 1 час, после чего снова промывали клетки OptiMEM. Далее добавляли среду DMEM, инкубировали 10 минут. В случае необходимости добавляли ингибиторы с конечной концентрацией: циклогексимид 100 мкг/мкл (1:100); анисомицин 25 мкМ (1:200); PS341, MG- 132 5 мкМ (1:1000). Живые клетки анализировали на микроскопе Nikon Eclipse.

Денатурирующий электрофорез в полиакриламидном геле. Электрофорез проводили по стандартной методике Леммли. Готовили двухкомпонентный гель следующего состава:

концентрирующий гель - 5% смеси акриламид-бисакриламид (соотношение 29:1), 0.1 % ДСН, 0.125 M Трис -HCl, pH 6.8;

разделяющий гель - 12-15% смеси акриламид-бисакриламид (соотношение 29:1), 0.1 % ДСН, 0.375 M Трис -HCl, pH 8.9.

Для полимеризации сначала добавляли N,N,N',N'-тетраметилэтилендиамин до концентрации 0,1%, а затем персульфат аммония до 0,1%.

Образцы белковых препаратов смешивали с буфером нанесения в соотношении 1:1, наносили на гель и вели электрофорез при напряжении 90 В до перемещения красителя в разделяющий гель, после чего выставляли силу тока 20 мA на 1 пластину геля и вели электрофорез до момента выхода краски из разделяющего геля. По окончании электрофореза отделяли разделяющий гель и анализировали флуоресцентный сигнал на приборе Versa Doc MP-4000 (Bio- Rad).



3. Результаты и их обсуждение

Для анализа внутриклеточного протеасом-опосредованного гидролиза белков в физиологических условиях с применением ДНК-кодируемой резоруфин- лигазы. Нами были проведены ряд экспериментов с использованием мутантной LplA(AAG) [54] лигазы для внутриклеточного мечения белков, содержащих в своем составе пептид LAP, химическим флуорофором (резоруфин), при возбуждении излучающим свет на длине волны 595 нм. Для синхронизации экспрессии LplA и изучаемого белка нами были созданы лентивирусные конструкции. В состав конструкций входили: ДНК, кодирующую интересующий нас белок в рамке считывания с 3FLAG эпитопом и пептидом LAP, а также слитного белка ZsGreen1-LplA(ААG) (далее обозначаемый ZsG- LplA), соединенные сайтом внутренней посадки рибосомы (internal ribosome entry site, IRES) под контролем CMV-промотора (Рис. 5A). Далее клетки, трансдуцированные полученными лентивирусными конструкциями и экспрессирующие протеасомный субстрат МВР-LAP, а также ZsG-LplA, обрабатывали различными концентрациями резоруфина и инкубировали в течение 20 и 60 минут. Промытые клетки лизировали и анализировали электрофорезом в полиакриламидном геле (ПААГ) с последующей детекцией флуоресценции в геле. В качестве оптимальных условий для осуществления внутриклеточной модификации нами были выбраны инкубация с субстратом в конечной концентрации 5 мкМ и временем инкубации 20 минут (Рис. 5Б).



Рисунок 5. (А) Схема лентивирусной конструкции, кодирующей бицистронную мРНК, содержащую последовательности белка, IRES (Internal Ribosome Entry Site, участок внутренней посадки рибосомы), и флуоресцентного белка ZsGreen1, слитного с мутантной LplA лигазой. Внизу представлена схема сайт-специфической конъюгации белка-мишени с резоруфином. Данная конструкция была полученая методом ПЦР с последующим лигированием в лентивирусный вектор pLX303. (Б) Электрофоретический анализ сайт- специфической внутриклеточной конъюгации МВР-LAP с резоруфином под действием LplA(AAG) при различной концентрации резоруфина и времени инкубации клеток с субстратом

Далее мы провели мониторинг изменения количества меченного и тотального белка MBP-LAP и DHFR-LAP с добавлением и без добавления ингибитора синтеза белка анисомицина (ANM). Как и ожидалось, будучи протеасомным субстратом, меченный резоруфином MBP-LAP деградировал независимо от добавления ингибитора. При этом общее количество белка MBP- LAP в клетке снизилось только в случае добавления анисомицина, что было показано методом Вестерн-блоттинга (Рис. 6A). С использованием прижизненной флуоресцентной микроскопии мы подтвердили отсутствие сигнала, соответствующего испусканию резоруфином, в МВР- экспрессирующих клетках, обработанных AMN или DMSO, в то время как флуоресцентный сигнал был обнаружен в клетках, инкубированных с ингибитором протеасомы в присутствии или отсутствии AMN (Рис. 6Б). Белок DHFR-LAP был стабилен в исследованных временных интервалах.

Рисунок 6. (А) Клетки HEK293, трансдуцированные лентивирусными конструкциями, кодирующими МВР-LAP2 или DHFR-LAP2 и резоруфин-лигазу LplA, обрабатывали резоруфином, а затем ингибитором рибосомального синтеза анисомицином (ANM) или ингибитором протеасомы MG132 и инкубировали различные промежутки времени. Представлен анализ клеточных лизатов методом электрофоретического разделения в ПААГ и последующего вестерн-блоттинга и флуоресценции в геле. (Б) Клетки HEK293, трансдуцированные лентивирусной конструкцией MBP-LAP2 - IRES - ZsGreen1-LplA(AAG) и DHFR-LAP2 - IRES - ZsGreen1-LplA(AAG), обрабатывали резоруфином, а затем инкубировали различное время c ингибиторами протеасомы (MG132) и далее определяли содержание белков MBP-LAP2 и DHFR-LAP2 с помощью флуоресценции в живых клетках. Живые клетки анализировали на микроскопе Nikon Eclipse

С применением разработанной методики нами был оценен период полужизни белка DHFR (Рис. 7), который в клетке оказался равен 9 часам. В качестве функционального контроля был использован МВР. Полученные данные соответствуют ранее опубликованным результатам [56](метод «pulse- chase» с введением радиоактивной метки 35S-метионина). Анализ времени полураспада с помощью добавления циклогексимида показал значение приблизительно в 12 часов.

Рисунок 7 Клетки HEK293, трансдуцированные лентивирусными конструкциями, кодирующими МВР-LAP2 или DHFR-LAP2 и резоруфин-лигазу LplA, обрабатывали резоруфином и инкубировали различные промежутки времени. Представлен анализ клеточных лизатов методом электрофоретического разделения в ПААГ и последующего вестерн-блоттинга

На следующем этапе мы проанализировали внутриклеточный метаболизм молекулы убиквитина (Ub), слитной на N-конце с пептидом LAP (LAP-Ub). Клетки НЕК293, стабильно экспрессирующие LAP-Ub, инкубировали с резоруфином и обрабатывали ингибитором протеасомы PS-341 или проводили данные манипуляции в обратном порядке, далее образцы анализировали с применением прижизненной микроскопии или ПААГ (Рис. 8). Полученные результаты свидетельствуют об успешном встраивании LAP-Ub в полиубиквитиновые цепочки.

Рисунок 8 Прижизненная микроскопия (А) и электрофоретический анализ (Б) клеток, стабильно экспрессирующих LAP-Ub и обработанных резоруфином

Следующей задачей было оценить время жизни убиквитина в составе полиубиквитиновых цепей. Для этого клетки, стабильно экспрессирующие LAP-Ub, обрабатывали резоруфином и далее клеточные лизаты анализировали электрофоретически (Рис. 9А). Интересно, что в процессе анализа поли-Ub конъюгатов нам удалось зафиксировать ковалентный конъюгат LAP-Ub с семейством лигаз Е2. Как следует из данных, представленных на рисунке 9 Б, время полужизни Ub составляет порядка 4 часов, что явным образом коррелирует с временем «перезарядки» лигаз семейства Е2. Полученные данные были подтверждены с применением прижизненной флуоресцентной микроскопии (Рис. 9 В).



Рисунок 9 (А) Анализ деградации поли-Ub конъюгатов в клетках, стабильно экспрессирующих LAP-Ub и обработанных резоруфином. (Б) Профили интенсивности флуоресценции резоруфина в зависимости от степени торможения в ПААГ. Внизу представлены кривые, описывающие разложение поли-Ub конъюгатов, а также скорость «перезарядки» убиквитин-лигаз Е2. (В) Прижизненная флуоресцентная микроскопия клеток, стабильно экспрессирующих LAP-Ub и обработанных резоруфином, в присутствии и отсутствии ингибитора протеасомы PS-341



Рисунок 10 (А) Клетки HEK293, трансдуцированные лентивирусными конструкциями, кодирующими LAP2-Ub и резоруфин-лигазу, обрабатывали резоруфином, а затем ингибитором протеасом MG132, и инкубировали различные промежутки времени. Представлен анализ клеточных лизатов методом электрофоретического разделения в ПААГ и последующего вестерн-блоттинга и флуоресценции в геле. На панели (Б) представлена зависимость интенсивности флуоресценции резоруфина от молекулярной массы Ub- конъюгатов. На панели (В) показан вычитательный анализ изменения уровня флуоресценции Ub-конъюгатов в зависимости от их молекулярной массы

Детальный анализ профиля полиубиквитиновых конъюгатов, проведенный с применением гелей сверхвысокого разрешения (Рис.10), позволил продемонстрировать, что в случае ингибирования протеасомы полиубиквитиновые цепи перераспределялись в сторону легких масс. Большая часть «сверх»-полиубиквитинилировнных белков (более 18 остатков Ub) не были деградированы протеасомой. Построение зависимости интенсивности флуоресценции резоруфина от массы Ub-конъюгатов показал, что динамическое равновесие между процессами убиквитинилирования и де- убиквитинилирования достигается в среднем в диапазоне 8 Ub мономеров на молекулу белка.



Выводы

1. Созданы генетические конструкции, кодирующие в составе полицистронной кассеты белковые субстраты и мутантную липоат-лигазу LplA, совмещенную с репортерным белком ZsGreen1.

2. На примере ряда природных и искусственных протеасомных субстратов удалось показать работоспособность методики внутриклеточного ферментативного мечения белков резоруфином для последующего мониторинга их внутриклеточной деградации, в том числе в режиме реального времени.

3. С применением разработанного подхода получены данные по времени полужизни важного аутоантигена при рассеянном склерозе основного белка миелина (МВР) и уточнены параметры метаболизма дегидрофолатредуктазы (DHFR) - одной из главных мишеней при терапии онкологических заболеваний.

4. Впервые были определены особенности метаболизма главного представителя системы убиквитинилирования, молекулы убиквитина, в истинно физиологических условиях. Показано, что среднее время жизни убиквитина составляет порядка 4 часов, при этом динамическое равновесие достигается при длине цепи в 8 мономерных единиц.



Список литературы

1. Maupin-Furlow J. A., Humbard M. A., Kirkland P. A., Li W., Reuter C. J., Wright.

A. J., Zhou G. Proteasomes from structure to function: perspectives from Archaea. (2006) Curr. Top. Develop. Biol. 75.

2. Coux O., Nothwang H. G., Silva Pereira I., Recillas Targa F., Bey F., Scherrer K. Phylogenic relationships of the aminoacid sequences of prosome (proteasome, MCP) subunits. (1994) Mol. Gen.Genet. 245.

3. Bochtler M., Ditzel L., Groll M., Hartmann C., Huber R. The proteasome. (1999) Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 28.

4. Lцwe J., Stock D., Jap B., Zwickl P., Baumeister W., Huber R. Crystal structure of the 20S proteasome from the archaeon T. acidophilum at 3.4 Е resolution. (1995) Science. 268.

5. Groll M., Ditzel L., Lцwe J., Stock D., Bochtler M., Bartunik H. D., Huber R. Structure of 20S proteasome from yeast at 2.4 Е resolution. (1997) Nature. 386.

6. Groll M., Huber R. Inhibitors of the eukaryotic 20S proteasome core particle: a structural approach. (2004) Biochim. biophys. acta. 1695.

7. Orlowski M., Wilk S. Catalytic activities of the 20S proteasome, a multicatalytic proteinase complex. (2000) Arch. Biochem. Biophys. 383.

8. Mayr J., Seemuller E., Muller S. A., Engel A., Baumeister W. Late events in the assembly of 20S proteasomes. (1998) J. Struct. Biol. 124.

9. Groll M., Bochtler M., Brandstetter H., Clausen T., Huber R. Molecular machines for protein degradation. (2005) Chembiochem. 6.

10. Dahlmann B. Proteasomes. (2005) Essays Biochem. 41.

11. Walz J., Erdmann A., Kania M., Typke D., Koster A. J., Baumeister W. 26S proteasome structure revealed by three-dimensional electron microscopy. (1998) J. Struct. Biol. 121.

12. Glickman M. H., Ciechanover A. The ubiquitin--proteasome proteolytic pathway: destruction for the sake of construction. (2002) Physiol. Rev. 82.

13. Glickman M. H., Rubin D. M., Coux O., Wefes I., Pfeifer G., Cjeka Z., Baumeister W., Fried V. A., Finley D. A subcomplex of the proteasome regulatory particle required for ubiquitin-conjugate degradation and related to the COP9- signalosome and eIF3. (1998) Cell. 94.

14. Smalle J., Vierstra D. The ubiquitin 26S proteasome proteolytic pathway. (2004) Annu. Rev. Plant Biol. 55.

15. Mishto, M., et al., Modeling the in vitro 20S proteasome activity: the effect of PA28-alphabeta and of the sequence and length of polypeptides on the degradation kinetics. (2008) J Mol Biol, 377(5).

16. Hicke, L., Dunn, R. Regulation of membrane protein transport by ubiquitin and ubiquitin-binding proteins (2003) Annu. Rev. Cell Dev. Biol., 19.

17. Haglund, K., Di Fiore, P.P., Dikic, I. Distinct monoubiquitin signals in receptor endocytosis (2003) Trends Biochem. Sci., 28.

18. Pickart, C.M., Fushman, D. Polyubiquitin chains: polymeric protein signals (2004) Curr. Opin. Chem. Biol., 8.

19. Varadan, R., Walker, O., Pickart, C., Fushman, D. Structural properties of polyubiquitin chains in solution (2002) J. Mol. Biol., 324.

20. Varadan, R., Assfalg, M., Haririnia, A., Raasi, S., Pickart, C., Fushman, D. Solution conformation of Lys63-linked di-ubiquitin chain provides clues to functional diversity of polyubiquitin signaling (2004) J. Biol. Chem., 279.

21. Wu, C.J., Conze, D.B., Li, T., Srinivasula, S.M., Ashwell, J.D. Sensing of Lys 63-linked polyubiquitination by NEMO is a key event in NF-кB activation (2006) Nat. Cell Biol., 8.

22. Kim, I., Rao, H. What's Ub chain linkage got to do with it? (2006) Sci. STKE, 2006, 18.

23. Baboshina, O.V., Haas, A.L. Novel multiubiquitin chain linkages catalyzed by the conjugating enzymes E2EPF and RAD6 are recognized by 26 S proteasome subunit 5 (1996) J. Biol. Chem., 271.

24. Fu, H., Sadis, S., Rubin, D.M., Glickman, M., van Nocker, S., Finley, D., Vierstra, R. D. Multiubiquitin chain binding and protein degradation are mediated by distinct domains within the 26 S proteasome subunit Mcb1 (1998) J. Biol. Chem., 273.