Оценка влияния новых галогенированных производных фуранонов на физиологические и биохимические особенности Serratiamarcescens

Размещено на http://www.allbest.ru//

Размещено на http://www.allbest.ru//

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АГЛ - ацилированныйгомосеринлактон

ГСЛ - гомосеринлактон

ДМСО - Диметилсульфоксид

QS - quorumsensing



ВВЕДЕНИЕ

В последние 10-15 лет внимание многочисленных исследователей, работающих с микроорганизмами, было обращено на феномен, получивший название QuorumSensing. В системе кворума участвуют молекулы гомосеринлактона. Фураноны- это аналоги гомосеринлактона. QuorumSensing (QS) - это процесс, с помощью которого бактерии регулируют экспрессию генов, которые зависят от их плотности популяции. Этот процесс позволяет группам организмов выполнять скоординированные действия. Было показано, что соединения фураноновой природы конкурируют с АГЛ за участок связывания с рецепторными белками LuxR типа [Manefield, 2002].

Действие фуранонов приводит к подавлению различных клеточных процессов, регулируемых QS, например:биолюминесценции Vibriofischeri; продукции факторов вирулентности у P. aeruginosa, Erwiniacarotovora; образования биопленок. Например, формирование биопленки у Р. Aeroginosaнаходится под контролем реакции кворума.Для подавления инфекций, вызванных P.aeruginosa, растущих в биопленках, требуются существенно более высокиедозы антибиотиков. Микроколонии в зрелой биопленке расположены в матриксе. Например, Vibriofischeriне светится, если плотность популяции низкая [Makriset al.,2009].

Выше сказанное свидетельствует о том, что изучение систем кворума представляет новое поле деятельности для исследователей в различных областях медицины и биологии. Изучение кворум-сенсинга различных микроорганизмов может открыть новые регуляции в клеточных процессах и механизмах .Приведенные данные показывают, что производные фуранонов перспективны для получения на их основе терапевтических агентов, которые направлены против патогенности бактерий. Большинство испытанных к настоящему времени соединений, способных подавлять QS-регуляцию, токсичны для человека [Hentzer, 2003], для микроорганизмов [Гимадеева, 2011], влияют на активность протеолитических ферментов [Маргулис, 2012].

Актуальную и перспективную задачу представляет модификация и поиск новых, нетоксичных веществ, пригодных для клинического применения. В связи с вышесказанным, целью работы явилась оценка влияния новых галогенированных производных фураноновна физиологические и биохимические особенности Serratiamarcescens.

В задачи входило:

Оценить токсические эффекты новых производных фуранонов.

Охарактеризовать мутагенные эффекты исследуемыхфуранонов.

Описать влияние фуранонов на изменение состава метаболитов в клетках и культуральной жидкости Serratiamarcescens.

Оценить влияние фуранонов на образование биопленок.

Охарактеризовать изменение состояния мембраны и морфологии клеток при действии фуранонов.

кворум сенсинг микроорганизм спектроскопия



1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Кворум - зависимые системы у бактерий

Понятие Quorum Sensing было предложено в 1994 году. Термин QuorumSensing наводит на мысль, что высокие плотности бактериальной популяции, скорее всего, связаны с повышенными концентрациями ключевой молекулы. Это позволяет предположить, что определенные бактерии могут использовать систему кворума для координации своего поведения в соответствии с минимальной плотностью популяции. Бактерии традиционно рассматривали как простые одноклеточные организмы, мы теперь знаем, что бактериальные популяции и сообщества часто демонстрируют слаженные действия, такие как: межвидовые и внутривидовые коммуникации, сотрудничества и другие [Carnes,2010].

Феномен клеточной плотности, зависящий от контроля экспрессии генов, называемых аутоиндукцией, уже давно является предметом интереса и исследования в области биолюминесценции морских бактерий. Теперь становится ясно, что многие бактерии, в том числе животные и растения используют аутоиндукцию для регулирования различных процессов.Плотность-зависимая экспрессия генов является превосходным примером многоклеточного поведения в царстве прокариот, где одна клетка способна осуществлять коммуникацию. Регулирование бактериальной биолюминесценции изучалось в течение многих лет и представляет лучшие модели для понимания механизма плотно-зависимой экспрессии [Schinelleret al.,1995].

Интересными в данном аспекте являются производные фуранонов, которые по сути представляют из себя аналоги гомосеринлактонов, обладающие антагонистическими эффектами за счет связывания и встраивания вместо гомосеринлактонов в реакциях кворум-сенсинга[Manefield, 1999]. Отсюда все больше внимания учёных привлекает исследования биологической активности галогенированныхфуранонов.

Известны механизмы многих из этих процессов, определены факторы межклеточной коммуникации, отвечающие за процессы, зависящие от плотности популяции [Олескин, 2000].

Изучение механизмов кворум-реакций открывает новые возможности для предупреждения и лечения болезней, вызванных микробными агентами.

Механизмы реакций кворум-сенсинга различаются у грамположительных и грамотрицательных бактерий [Олескин, 2000].

Quorumsensing позволяет бактериям следить за плотностью популяции.QSопирается на взаимодействие аутоиндуктора с активатором транскрипции белка. Эти сигнальные молекулы диффундируют из бактериальных клеток и накапливаются в окружающей среде. Как только пороговое значение концентрации достигает своего максимума, эти сигналы служат индукторами для регуляции целевых генов. У грамотрицательных бактерий аутоиндукторы относятся к семейству ацилированных гомосеринлактонов. Ацилированные гомосеринлактоны в межклеточной коммуникации играют роль в регулировании различных функций, таких как биосинтез антибиотика, продукция факторов вирулентности, биосинтез экзополисахаридов и другие[Bedmaretal.,2001].

Было показано, что фураноны ингибируют экспрессию бактериальных экзоферментов, которые активно разрушают компоненты иммунной системы, таким образом ,усиливая иммунную реакцию [Decho,2010]. Например, Serratiamarcescens- это оппортунистический патоген, вызывающий тяжелые инфекции мочевыводящих путей. Инфекции, вызываемые Serratiamarcescens, представляют большой интерес из-за устойчивости к анбитиотикам. Межклеточные коммуникации (QS системы) Serratiamarcescens выступают в качестве глобального регулятора почти всех факторов вирулентности, в основном, например, образование биопленок. Так, QS системы Serratiamarcescens обеспечивают улучшение стратегии в борьбе с лекарственной устойчивостью [Bakkiyarajet al.,2012].По секреции и выявлению ряда сигнальных молекул, бактерии способны координировать экспрессию генов. Широко использованный сигнальный механизм - система - кворума. Известны несколько систем, описанные для Serratiamarcescens. Галогенированные фураноны, известные как ингибиторы кворума, эффективно подавляют кворум-системы Serratiamarcescens.Было высказано, галогенированные фураноны тормозят систему кворума и возможности применения их в предотвращении инфекций, вызванные серрацией [Taoetal.,2008].

Кворум бактерии вырабатывают и высвобождают химические сигнальные молекулы, называемые аутоиндукторами, увеличение концентрации влияет на клеточную плотность. При максимальной плотности популяции происходит выброс аутоиндуктора. Обнаружение минимального порога концентрации аутоиндуктора приводит к экспрессии генов. Грамположительные и грамотрицательные бактерии используют различные кворум системы для регулирования различных физиологических функций. Эти процессы включают в себя симбиоз, вирулентность, компетентность, подвижность, спорообразование и образование биопленок. Последние достижения в этой области свидетельствуют о том, что межклеточные связи через аутоиндукторы происходит как внутри, так и между видами. Хотя природа химических сигналов, сигнальных механизмов и целевых генов, контролируемых бактериальной кворум-системой отличаются, но в каждом случае возможность взаимодействовать друг с другом позволяет бактериям координацию экспрессии генов, и, следовательно, поведение всей популяции [Milleret al.,2001].

1.1.1 Реакции кворум-сенсинга у грамотрицательных микроорганизмов

Более чем у 450 видов грамотрицательных бактерий обнаружены кворум-зависимые системы, в которых сигнальными молекулами служат различные ацилгомосеринлактоны.

У грамотрицательных бактерий в большинстве кворум-зависимых система утоиндукторами (феромонами) служат ацилированные гомосеринлактоны. Они связываются c R-белками, а затем активируют транскрипцию генов, отвечающих за кворум-зависимые процессы. Если плотность бактериальных клеток достаточно высокая, то бактерии начинают вести какие-то новые процессы: например, морские бактерии Vibriofischeriи Vibrioharveyiначинают светиться [Waters, 2005].

Система включает 2 основных блока генов. Ген luxI, входящий в один из блоков, кодирует белок (LuxI, 193 аминокислоты), который функционирует как синтаза химического агента межклеточной коммуникации, чьё накопление в среде сигнализирует клеткам V. fischeri о достижении пороговой плотности (кворума) для биолюминесценции. Агент коммуникации синтезируется из S-аденозилметионина и 3-оксогексаноил-кофермента А и представляет собой N-(3-оксогексаноил)-L-лактон гомосерина (3-ОГЛГ) [Олескин, 1999].АГЛ осуществляют и межклеточную коммуникацию внутри одного вида бактерий, и межвидовую коммуникацию, а также взаимодействие между бактериями и высшими организмами. Понимание биологической активности АГЛ и экологических последствий такой деятельности, может дать нам возможность манипулировать составом и функциями сложных биологических комплексов.

1.1.2 Реакции кворум-сенсинга у грамположительных микроорганизмов

У грамположительных бактерий распространены quorum-sensing системы, в которых роль феромонов (аутоиндукторов) играют пептиды, которые могут быть линейными или включать в себя тиолактоновое кольцо. Эти QS-системы являются двухкопонентными: содержат сенсорную гистидиновую киназу, которая в ответ на связывания феромонафосфорилирует второй компонент системы - белковый регулятор ответа [Miller,2004].

У грамположительных бактерий наиболее подробно изучены несколько систем, принимающих участие в контроле вирулентности Staphylococcusaureus, в регуляции компетентности (т.е. способности принимать экзогенную ДНК при трансформации)Streptococcuspneumoniae, регуляции компетентности и споруляцииBacillussubtilis. Лучше всего изучена система QS уStaphylococcusaureus. S. aureus инфицирует макроорганизм при помощи двухфазной стратегии. На первом этапе инфекции при низкой плотности популяции бактерии продуцируют белковые факторы, способствующиеадгезии и колонизации; при высокой плотности популяции (второй этап) синтез этих факторов подавляется, и бактерии начинают секретировать токсины и протеазы [Novick, 2003; Waters, 1999].

У других грамположительных бактерий, стрептомицетов, к которым относятся основные продуценты антибиотиков, аутоиндукторами QS-систем служат соединения иной природы - гамма-бутиролактоны. QS у этих бактерий участвует в регуляции морфологической дифференцировки и продукции вторичных метаболитов. Интересно, что сигнальные молекулы стрептомицетов структурно сходны с N-ацил-гомосеринлактонами грамотрицательных бактерий[Waters, 2005].

Многие из изученных бактерий одновременно содержат несколько QS-систем. Они могут функционировать параллельно или последовательно, могут конкурировать или противодействовать друг другу.

Как уже известно, грамотрицательные и грамположительные бактерии используют в качестве феромонов также фураноны. Если гомосеринлактоны и пептиды видоспецифичны, то фураноны воспринимаются как сигналы представителями разных видов бактерий и служат для межвидового общения в микробных ассоциациях [Олескин, 2000].

Образование биопленок является одной из основных стратегий выживания 99,9% бактерий в окружающей среде. В составе биопленки бактерии защищены от антибактериальных препаратов, включая антибиотики, бактериофаги или фагоциты. Поэтому, нет ничего удивительного в том, что антибиотикотерапия и механизмы естественной защиты макроорганизма (антитела и фагоциты) бессильны перед такими инфекциями. Структура биопленки и особенности физиологии составляющих ее клеток обеспечивают многократно повышенную по сравнению с аналогичными свободно живущими бактериями устойчивость членов сообщества к антимикробным препаратам, будь то антибиотики или факторы иммунной защиты макроорганизма [Fuxetal., 2005].

Очень часто, система кворума (QS) cпособствует образованию биопленок. Предполагается, что формирование биопленок регулируется с-di-GMP. Это известный вторичный мессенджер [Sharma,2014].

1.2 Фураноны как ингибиторы кворум - сенсинга

После обнаружения эффекта фуранонов, образуемых D. pulchra, в различных лабораториях провели широкий скрининг природных соединений и химически синтезировали производные фуранонов, ингибиторов QS, в том числе производные фуранонов с ацильными цепями различной длины. Оказалось, что даже производные фуранонов без ацильной цепи с двумя атомами брома ингибировало QS-систему P. aeruginosa. Обнаружено, что производные фуранонов продуцируются различными организмами: морскими зелеными, красными и бурыми водорослями, грибами, асцидиями, актиномицетами и другие [Martinellietal., 2004].

Изучение механизма действия этих веществ на QS системы показало, что соединения фураноновой природы конкурируют с АГЛ за участок связывания с рецепторными белками LuxR типа. Связывание фуранонов с рецептором влияет на стабильность комплекса белок-лиганд, приводя к быстрому расщеплению рецепторного белка [Manefield, 2002].

Действие фуранонов приводит к подавлению различных клеточных процессов, регулируемых QS: биолюминесценции Vibriofischeri; продукции факторов вирулентности у P. aeruginosa, Erwiniacarotovora; образования биопленок. Многие химически синтезированные фураноны значительно эффективнее, чем природные [Hentzer, 2003].

В последнее время появляются данные, что фураноны обладают следующими фармакологическими активностями:

- противовоспалительная;

- противоопухолевая;

- антибактериальная;

- противогрибковая;

- противопаразитарная;

- противовирусная;

- антиоксидантная [Singetal., 2011].

1.3 Влияние биологически-активных веществ на физико-химические характеристики клетки

Известно, что многие пигменты проявляют антибиотические свойства.Пигментообразование является стойким признаком. Между пигментацией и образованием вторичных метаболитов существует такая тесная корреляция, что при наличии пигментов можно с большой долей вероятности ожидать образования антибиотиков и других биологическиактивных веществ. Пигменты у многих микроорганизмов представляют собой вторичные метаболиты. Образуются пигменты не у всех микроорганизмов. Уже по их структуре можно понять, что они являются производными метаболитов или структурными компонентами клеток. Например, на средах, где развивается Serratiamarcescensярко- красная окраска её колоний, а также клеточных суспензий обусловлена присутствием пигмента продигиозина. Молекула продигиозина содержит три пиррольных кольца [Пигменты бактерий].

Продигиозин выполняет активную роль в метаболизме S.marcescens и связан,по-видимому, с энергообменом клетки.Serratiamarcescens - бактерии семейства Enterobacteriaceae, которым свойственна способность синтезировать пигмент-продигиозин. Пигмент локализован в клеточной оболочке. Роль продигиозина в метаболизме клетки-продуцента до сих пор не ясна [Андреева, 1999].

Бактериальные клеточные стенки - это нерастворимые полимеры. Сшитые пептидные боковые цепи пептидогликана имеют меньше степеней свободы, чем точки роста пептидогликанов, содержащие несшитые пептидные цепи; последние и служат центрами комплексообразования с антибиотиками [Егоров, 1986].Клеточные стенки бактерий и плесневых грибков сильно отличаются от клеточной оболочки животных клеток. Именно, многие нетоксичные антибиотики блокируют образование клеточных стенок. Например, так действуют пенициллин, бацитрацин, цефалоспориныи другие антибиотики [Егоров, 1986]. Антибиотик полимиксин связывается с клеточной мембраной многих грамотрицательных бактерий и нарушает функцию клеточной мембраны. Известно, хлорамфеникол специфически блокирует этот процесс у многих бактерий [Биотехнология]. Гормоны влияют и меняют проницаемость мембран клетки и органоидов. В результате этого изменяются условия мембранного транспорта субстратов, ферментов, ионов и метаболитов и, соответственно, все виды метаболизма [Геннис,2000].Влияния гормонов на плазматическую мембрану является взаимодействие, благодаря которому осуществляется липолитический и антилиполитический эффект гормонов [Онкология].

Фосфолипиды влияют на активность белков, ферментов, которые входят в состав их мембраны. Изменяют конформацию, а также создают гидрофобную среду [Биологический форум].

Фураноны, в свою очередь, также способны влиять на активность белков, их конформацию, ферментативную активность клетки и т.д. [Гимадеева с соавт., 2011; Митько с соавт., 2011; Маргулис с соавт., 2012; Белоногова с соавт., 2013].



1.4 Биопленки как фактор патогенности

Способность бактерий образовывать биопленки является фактором патогенности. Биопленки - это гетерогенные структуры, состоящие из бактериальных клеток, окруженные матрицей и прикрепленные к твердой поверхности. Бактерии в биопленках в 100-1000 раз устойчивы к противомикробным препаратам. Избавление от биопленок сложный процесс, например, они вызывают следующие заболевания: муковисцидоз, инфекции мочевыводящих путей, заболевание пародонта и другие [Olsen,2015].

Cтадии развития биопленки

первичное прикрепление (адгезия, сорбция). Эта стадия обратима.

окончательное (необратимое) прикрепление (фиксация).

созревание.

рост.

дисперсия (выброс бактерий).

Основные свойства биопленки:

- микроорганизмы в биопленке устойчивы к антибиотикам, антимикробным веществам, стрессовым факторам;

- бактерии в биопленке вырабатывают вещества, которые они не образуют, будучи в культуре;

- взаимодействие разных типов микроорганизмов;

- бактерии собраны в микроколонии;

-микроколонии окружены защитным матриксом;

- внутри микроколоний - различная среда;

- бактерии имеют примитивную и простую систему связи;

- бактерии в биопленке ведут себя не так, как в культуральной среде [Биопленки].

Многие бактерии приспособились к жизни в биопленках. Определяющей чертой биопленок является образование внеклеточного матрикса, который связывает клетки вместе. Матрица биопленок обеспечивает многочисленные преимущества, включая защиту от стрессовых воздействий окружающей среды, повышение доступности питательных веществ [Nadellet al.,2015].

Биопленки обладают высокой устойчивостью к антимикробным препаратам и защищают себя от внешних воздействий любыми путями. Биопленки являются цепко, прикрепленными к поверхности и препятствуют проникновению молекул и клеток. С другой стороны, некоторые биопленки полезны для своего хозяина и содержат защитные микроорганизмы. Микроорганизмы в биопленках представляют патоген-ассоциированные молекулярные структуры и антигены, которые могут быть представлены как врожденные иммунные клетки и опсонины, ведущие к активации нейтрофилов и других лейкоцитов. Нейтрофилы - часть первой линии защиты и содержат антимикробные стратегии, позволяющие им атаковать патогенные биопленки. Биопленки частично, но не полностью защищены от действия нейтрофилов, которые включают в себя процессы фагоцитоза, дегрануляции, образование нейтрофильных ловушек. Эти факторы могут быть решающими в возникновении заболеваний пародонта, воспаление с последующим некрозом [Hirschfeld,2014].

Бактериальные биопленки трудно лечить. Биопленки позволяют бактериям сохранять устойчивость к антибиотикам. Существует гипотеза, что ультразвук разрушает биопленки, оставляя бактерии более уязвимыми для антисептиков или антибиотиков [Croneet al.,2015].

Например, образование биопленок является критически важным для экологического выживания и передачи холерного вибриона. Vibriocholerae- патоген, вызывает холеру и другие кишечные инфекции. Образование биопленок индуцируется при низких температурах через повышение уровня сигнальной молекулы, циклическая дигуанилатная молекула (ц-ди-ГМФ) [Townsleyet al.,2015].



1.4.1 Биопленки в промышленности

Биопленки вызывают серьезные трудности в промышленности,например:

- биокоррозия трубопроводов;

-обрастания технологического оборудования;

- обрастания нефтяных платформ.

В пищевой промышленности образование биопленок на продуктах питания повышает риск заражения патогенными микроорганизмами. В результате чего наблюдается возникновение инфекций у людей. В природных условиях могут вызывать ухудшение экологического состояния, например, изменения качества и чистоты воды [Биопленки].

Подземные воды используются в качестве ценного ресурса для питьевой воды в мире. Возрастающая антропогенная деятельность оказывает возрастающее давление на ресурсы подземных вод. Одним из последствий увеличения отбора подземных вод в сочетании с увеличением отбора воды в сухую погоду приводит к снижению уровня грунтовых вод в водоносных горизонтах. Биопленки в пределах водоносных горизонтов подземных вод обеспечивают защиту подземных вод путем удаления загрязнителей, поступающих в систему землепользования. Провели следующий эксперимент, влияние высыхания на биопленки, присутствующих в водоносных горизонтах подземных вод с использованием полевых и лабораторных экспериментов. В обоих экспериментах наблюдалось снижение активности ферментов (глюкозидазы, эстеразы и фосфатазы), но в высушенных образцах эффект сильнее проявляется по сравнению с влажными образцами. Тем не менее, сопоставляя все данные вместе, никаких существенных различий между образцами не было обнаружено.

Исследование показывает, что биопленки в системах подземных вод являются устойчивыми и могут выдерживать периоды высыхания [Weaveret al.,2015].

1.4.2 Влияние обработки поверхностей различными химическими средствами на формирование биопленок

Биопленка - это не только источник патогенной микрофлоры в воде, но и является причиной поломки труб, в результате чего нарушения целостности трубопроводов. Является причиной снижения теплопроводности труб. Например, диоксид хлора способен проникать внутрь биопленки и разрушает клетки бактерий [Биопленки и трубы].

Биопленки могут образовываться на катетерах. Микроорганизмы, образующие биопленки на катетерах - это Staphylococcusaureus,Pseudomonasaeruginosa, Klebsiellapneumoniaи другие. Существует немало разработок для покрытия материалов, протезов, катетеров. Например, описан метод покрытия синтетических материалов слоем металлического серебра. Результаты показали, что покрытый серебром материал вызвал меньший воспалительный ответ, чем необработанный [Микробные биопленки].

Известны такие агенты, которые блокируют феномен чувствительности микроорганизмов (под его контролем находится синтез экзотоксинов и образование биопленок). Агенты, которые подавляют кооперативную чувствительность, способны ингибировать рост бактериальной культуры, воздействия на их сигнальные системы. К таким агентам можно отнести фураноны. Показано, что при нанесении на полимеры фураноны сохраняют антибактериальные свойства и не нарушают, не действуют на свойства полимера. Использовали фураноны для покрытия контактных линз. Утверждают, что фураноны перспективны в качестве антибактериальных свойств [Мембрана].

С помощью фуранонов можно предотвратить образование биопленок. Высказано такое предположение, что фураноны не убивают бактерий, а блокируют их способность посылать сигналы друг другу и тем самым предотвращают бактериальную коммуникацию [Антибактериальные поверхности].

Ученые хорошо изучили механизмы образования биопленок, а сейчас идут поиски их разрушения. Как уже известно, антибиотики не активны в этой области, а другие вещества и соединения симптоматические. Идет поиск антипатогенных препаратов, которые обладали бы способностью снижать или вообще блокировать вирулентность. Мишенью могут стать кворум-системы бактерий, которые контролируют эксперессию факторов вирулентности. Используют различные методы в этой области, включая подавление образования аутоиндукторов в QS. Появились данные о веществах, которые способны блокировать синтез аутоиндукторов. Например, для Pseudomonasaeruginosa- это различные аналоги S- аденозилметионин [Стволовые клетки].



2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1 Штаммы, используемые в работе

В работе использовали следующие штаммы микроорганизмов: Serratiamarcescens, SalmonellatyphimuriumTA 100hisG46, rfа-, pKm 101,ДuvrBbio- и Micrococcuslysodeikticus(коллекция каф. микробиологии).

Все сконструированные Эймсом с соавторами [Amesetal., 1975] тестерные штаммы исходно получены из штаммаSalmonellatyphimuriumдикого типа LT2. Для повышения чувствительности этих штаммов к химическим мутагенам и канцерогенам в геном бактерий введены некоторые добавочные маркеры.

Оценку мутагенности проводили в тесте Эймса на мутантном штамме SalmonellatyphimuriumTA 100 - hisG46, rfa, uvr-, pkm 101, bio-. Мутация в гистидиновом опероне (his-) вызывает ауксотрофность по этой аминокислоте у мутантов. Штамм ТА 100 регистрирует мутации типа замены пар оснований (hisG46). Мутация в гене uvrB приводит к нарушению процесса эксцизионной репарации, благодаря чему возникшее повреждение ДНКостается неисправленным и, таким образом, увеличивается чувствительность тестерного штамма к некоторым мутагенам. Делеция в гене uvr проходит также и через ген bio. При rfa-мутации (“шероховатые колонии”) нарушается синтез липополисахаридов, в результате чего клетка теряет патогенность, а также возрастает проницаемость ее клеточной стенки и облегчается проникновение мутагенов в клетку. Штамм ТА 100 несет также плазмиду устойчивости к ампициллину pKm 101[Maron, Ames, 1983]. В тесте на токсичность также использовали мутантный штамм S. typhimurium ТА 100.



2.2 Соединения, которые применяли в работе

На рисунке 1 представлены модифицированные бромом и хлором производные фуранонов, которые применяли в работе. Соединения синтезированы на кафедре органической химии КФУ под руководством к.х.н. доцента Курбангалиевой А.Р.

Рисунок 1- Формулы хлорсодержащих (Ф8,10,11,13) и бромсодержащих (Ф7,8,9,10,11,12,13,14) производных фуранонов.



2.3 Питательные среды и растворы

LB-бульон: триптон-10 г, дрожжевой экстракт-5 г, NaCl-5 г, дистиллированная вода-1000 мл.

2% LB-агар: LB-бульон-1000 мл, агар-20 г.

0.6% LB-агар: LB-бульон-1000 мл, агар-6 г.

2% голодный агар- 20 г агара на 1000 мл дистиллированной воды, рН 7.2-7.4.

20% раствор глюкозы- 20 г глюкозы, дистиллированная вода-1000 мл.

Полужидкий 0.6% агар; агар-6.0 г, NaCl-6.0 г, вода дистиллированная - 1000 мл. После автоклавирования добавить раствор биотина с гистидином.

Солевой концентрат: цитрат натрия трехзамещенныйNa3C6H5O7 -2.0 г, К2НРО4 х 3Н2О-42.0 г, КН2РО4 -18.0 г, (NH4)2 SO4 -4 г, вода дистиллированная до 1000 мл. Соли растворяют с соблюдением указанного порядка.

1% раствор сернокислого магния MgSO4 - 1 г сернокислого магния, дистиллированная вода до 100 мл.

Нижний агар (НА) для учета ревертантов в тесте Эймса.2% голодный агар -300 мл, 20% раствор глюкозы -10 мл; солевой концентрат - 100 мл, 1% раствор сернокислого магния - 2 мл. В расплавленный голодный агар стерильно добавляют солевой концентрат , глюкозу, сернокислый магний. Температуру смеси доводят до 50-60 0С , разливают в чашки Петри.

0.6% верхний агар (ВА): полужидкий 0.6% агар- 90 мл, 0.5 мМ раствор гистидин/биотина.

2.4 Методы определения токсичности и мутагенности веществ

Оценка токсичности биологических, химических соединений и различных физических воздействий по отношению к тестерными микроорганизмам - обязательный этап, необходимый для подбора диапазона оптимальных концентраций и доз, при тестировании их на токсичность и мутагенность.

2.4.1 Тест на токсичность по отношению Salmonellatyphimuium

Для определения возможных токсических эффектов в работе применяли тест на определение токсичности по отношению к микроорганизмам. В тесте использовали Salmonellatyphimuium.

Ход эксперимента:

За 12-15 ч. до проведения эксперимента делают пересев культуры тестерного штамма SalmonellatyphimuriumTA 100 с косяка в 5 мл LВ-бульона для получения "ночной" культуры.

2% LВ-агар разливают в чашки Петри.

Делают разведения "ночной" культуры в водопроводной воде.

Растопленный 0.6% LВ-агар разливают стерильно по 3 мл в пробирки и ставят в водяную баню при 45С.

В пробирки с 3 мл полужидкого 0.6% LВ-агара вносят 0.1 мл бактериальной суспензии нужного разведения и 0.1 мл раствора вещества в исследуемой концентрации (в нашем случае опытным вариантом служили облученные образцы). Раствор перемешивают и наслаивают на нижний 2% LВ-агар в чашки Петри. В контроле вместо раствора вещества добавляют 0.1 мл растворителя (в случае облучения опытных образцов добавления растворителя в контроль не требовалось). После 24ч. инкубации при 37С подсчитывают числоколоний, выросших на чашках Петри в опытном и контрольном вариантах. Для оценки степени токсичности исследуемого вещества (в нашем случае - доз облучения) используют критерий "выживаемость" тестерного штамма при действии определенной дозы вещества.



число колоний в опыте

Выживаемость = --------------------------------------- х 100%

число колоний в контроле

В нашем случае разведение культуры делали до 10-5. Полученные результаты представлены на рисунке (число КОЕ/ч.Петри).

2.4.2 Тест Эймса (Salmonellatyphimurium)

Тест Эймса получил широкое распространение при первичном выявлении генетической активности агентов различной природы. Это тест-система, разработанная в 60-е годы XX века американским исследователем Брюсом Эймсом, который длительное время изучал мутации в генах, контролирующих биосинтез гистидина у Salmonellatyphimuium (Ames, 1971). В тесте Эймса используются ауксотрофные по гистидину штаммы Salmonellatyphimuium, которые под действием мутагенов способны ревертировать к прототрофности. Некоторые мутантные штаммы содержат мутации типа замены пар оснований (hisG46), а другие - мутации типа сдвига рамки считывания (his 3052). В настоящее время тест Эймса усовершенствован: наряду с хорошо изученными мутациями потребности в гистидине в геном сальмонеллы введена делеция по одному из генов репарации (uvrB-bio), что повышает чувствительность бактерий к мутагенам. Также в геном тестерных штаммов введена rfa-мутация, блокирующая синтез липополисахаридной капсулы, для повышения проницаемости клеток. Некоторые тестерные штаммы Salmonellatyphimurium содержат несут плазмидуpKM 101, содержащую гены, повышающую чувствительность клеток к агентам, усиливающим рекомбинацию ДНК и индуцирующим SOS-мутагенез. Также, благодаря данной плазмиде, клетки тестерных штаммов резистенты к ампициллину, что используется как маркер присутствия плазмиды. С применением теста Эймса впервые были показаны мутагенные эффекты огромного числа химических соединений, сигаретного пепла, некоторых пищевых консервантов, красителей для волос, образцов природных комплексов (вода, почва) и другие.

Сущность теста заключается в том, что ауксотрофные по гистидину тестерные штаммы бактерий Salmonellatyphimurium культивируют на специальной среде, на которой могут расти лишь мутанты этих штаммов, у которых произошла мутация от ауксотрофности по гистидину к прототрофности. Без внешних воздействий такие мутации происходят с низкой частотой. Если в среду культивирования ввести химический мутаген, то частота мутаций значительно увеличивается, что регистрируется по числу колоний прототрофных микроорганизмов, выросших на данной селективной среде. Следует отметить, что определенным ограничением применения теста Эймса является невозможность тестирования образцов, содержащих свободный гистидин.

Метод дает возможность исследовать мутагенность как исходного препарата, так и его метаболитов. Метаболические превращения соединения происходят в слое полужидкого агара, в который вместе с культурой вносят микросомную фракцию, полученную из клеток печени крыс, предварительно обработанных индукторами монооксигеназ смешанных функций.

В работе используют набор мутантных штаммов S.typhimurium:

Ход эксперимента:

За 12-15 ч. до проведения эксперимента делают пересев культуры тестерного штамма с косяка в 5 мл LВ-бульона для получения "ночной" культуры. При выращивании штаммов, несущих плазмидурКm 101, в питательный бульон вносят ампициллин в концентрации 25 мкг/мл. Культуру инкубируют при 37оС.

В день постановки эксперимента 5 мл "ночной" культуры переносят в 20 мл свежего LВ-бульона с ампициллином (25 мкг/мл) и инкубируют с принудительной аэрацией при 37оС в течение 2 - 2.5ч до достижения культуры экспоненциальной фазы роста (плотность суспензии 1-2.109кл/мл). Затем культуру переносят в стерильные центрифужные пробирки и центрифугируют 20 мин. при 5000 об/мин. Осадок ресуспендируют в 0.02М фосфатном буфере или растворе солевого концентрата, разведенном дистиллированной водой в соотношении 1:4.

Растворы исследуемых препаратов готовят в стерильной дистиллированной воде или диметилсульфоксиде (ДМСО). Каждое соединение необходимо тестировать не менее чем в 5 концентрациях, отличающихся, например в 10 раз (Дурнев с соавт., 2011).

Контроли. Каждый эксперимент предусматривает два обязательных контроля: в качестве негативного контроля служит использованный в работе растворитель. Положительный контроль - растворы известных мутагенов. Позитивный контроль специфичен для каждого тестерного штамма. Для штаммов ТА 1535, ТА 100 - азид натрия (NaN3) - 1.5 - 3 мкг/чашку, нитрозометилмочевина - 100 мкг/чашку. В варианте с метаболической активацией - циклофосфан (500 мкг/чашку). Для штаммов ТА 1538, ТА 98 - 2-нитрофлуорен 10 мкг/чашку. В варианте с метаболической активацией - 2-аминофлуорен (10 мкг/мл).

В стерильные чашки Петри разливают нижний агар.

В пробирки разливают 0.6% верхний агар по 3 мл с микродобавками биотина и гистидина и ставят на водяную баню при температуре 45оС.

В верхний агар вносят 0.1мл бактериальной суспензии, 0.1 мл раствора исследуемого соединения, в случае с метаболической активацией - 0.5 мл микросомной активирующей смеси (МАС), содержащей кофакторы. Все перемешивают и наслаивают на нижний селективный агар. После полного застывания агара чашки переносят в термостат при 37оС.

Учет результатов проводят по индукции обратных мутаций к гистидиновой прототрофности через 48ч. инкубации. Сравнивают число колоний-ревертантов, выросших при действии исследуемого соединения и в негативном контроле контроле.

Предложена следующая система оценки соединений на мутагенную активность [Фонштейн с соавт., 1985]:

число колоний-ревертантов, выросших при действии исследуемого соединения, и в негативном контроле достоверно различается менее чем в 2.5 раза - делается заключение об отсутствии мутагенной активности;

число колоний-ревертантов, выросших при действии исследуемого соединения, от 2.5 до 10 раз превышает число колоний-ревертантов в негативном контроле - исследуемое соединение обладает слабой мутагенной активностью;

число колоний-ревертантов, выросших при действии исследуемого соединения, от 10 до 100 раз превышает число колоний-ревертантов в негативном контроле - исследуемое соединение обладает средней мутагенной активностью;

число колоний-ревертантов, выросших при действии исследуемого соединения превышает спонтанный фон мутирования (негативный контроль) более чем в 100 раз - вещество обладает сильной мутагенной активностью.

В нашем случае опытными служили образцы с разными концентрациями фуранонов, контрольным - без фуранонов.

2.5 Определение метаболитов в клетках и культуральной жидкости методом 1H-ЯМР-спектроскопии

1-й день: посев культуры S.marcescens.

2-й день: добавление фуранонов к 18-часовой культуре:

1. 5мл L- бульона, 100мкг 18-часовой культуры и 100мкг фуранона в конечной концентрации 10 мкг/мл.

2. 5мл L-бульона ( ж), 100мкг 18-часовой культуры.(контроль)

После образования пигмента подсчитывали количество клеток в камере Горяева и измеряли оптическую плотность.

Центрифугировали (20 мин при 6000 оборотов), отдельно клетки разводили физраствором, отдельно сливали надосадочную жидкость, по 1 мл каждого варианта стерильно перелили в эппендорфы. Получили 4 образца: КЖ (культуральная жидкость) - без фуранона, КЖ с фураноном, клетки в физрастворе и клетки с фуранонами в физрастворе. Каждый из вариантов исследовали на ЯМР-спектрометре.

ЯМР спектры на ядрах 1H записывали на ЯМР-спектрометре «BrukerAvanceIII-400» с рабочей частотой 400.17 МГц., с использованием в качестве растворителя дейтерированной воды (D2O) для образцов клеток и КЖ и дейтерохлороформа для чистых соединений.

2.6 Определение способности к образованию биопленок по планшетному методу, описанному встатье «Growingandanalyzingstaticbiofilms» [Merritt, 2005]

В 3-5 мл LB выращивали ночные культуры исследуемых штаммов при 37°С.

Ночную культуру разводили (1:100)в соотношении 5940 µl среды к 60 µl культуры.

Вносили по 250 µl каждой разведенной культуры, в 96-луночные планшетные чашки с круглым дномдля культур клеток. В качестве контроля использовали среда LB. Инкубировали планшетыв течении 48 часов при температуре 37°Си30°С.

Лунки освобождали от жидкости встряхиванием и промывали погружая планшеты в дистиллированную воду. Затем снова освобождали лунки от жидкости вытряхиванием.

В каждую лунку вносили по 200 µl0.1% раствора Crystalviolet и оставляли с красителем в течение10 минут.

Содержимое лунок вытряхивали.Промыли водопроводной водой не связавшийся краситель. Лишнюю жидкость удаляли.

В лунки вносили по 200 µl95% этанола и ждали в течение 10 - 15 минут при комнатной температуре.

Из лунок отбиралипо 125 µl содержимого.

Измеряли оптическую плотность содержимого лунок при 500 нм.

2.7 Определение изменения микровязкости мембраны при действии фуранонов

1) 18-часовые культуры микроорганизмов выращивали на питательном LB-бульоне, при температуре 37°С.

2) Сливали пробирки с ночной культурой микрококка в одну и определяли плотность клеток на ФЭКе.

3) Разливали по 1 мл культуры в 8 эппендорфов. Центрифугировали 20 минут при 6 тыс. оборотов для осаждения клеток.

4) Сливали стерильно надосадочную жидкость и разливали в эппендорфы по 1 мл чистого питательного бульона. Хорошо взбалтывали и сливали содержимое всех эппендорфов в одну пробирку.

5) Добавили определенный фуранон в определенной концентрации (0.1, 0.01,0.001 мкг\мл соответственно) в соотношении 1:9.

6) Далее выращивали в термостате 15 минут и 24 часа.

7) Затем измеряли проницаемость мембраны Micrococcuslysodeikticusaureus с помощью флуоресцентного зондирования на спектрофлуориметре LS55 (PerkinElmer) после добавления кНК с фураноном0.1 объема спиртового раствора пирена в концентрации 100 µМ/л.

8) Проводили анализ жизнеспособности по учету ОЧК, КОЕ и измеряли плотность культуры на ФЭКе.

9) Исследование состояния мембраны проводили по известной методике Ю.А. Владимирова и Г.Е. Добрецова [Владимиров, Добрецов, 1980; Максим с соавт., 2006].

Оценку текучести мембран проводили с помощью флуоресцентного зондирования на спектрофлуориметре LS55 (PerkinElmer). Определение текучести глубоких слоев липидного бислоя проводили после добавления к объему суспензии клеток микрококка 0.1 объема спиртового раствора пирена в концентрации 100 µМ/л [Максим с соавт., 2006]. Измеряли спектры флуоресценции его эксимеров при длине волны флуоресценции 470 нм, мономеров при длине волны флуоресценции 371.5 нм, возбуждении 340 нм (MolecularProbes). Определяли коэффициент эксимеризациипиренаFвеличина которого обратно пропорциональна микровязкости мембраны [Добрецов, 1989]. Расчет производили по формуле:

F=(I470пир-I470б/пир)-I470ф/пир/(I370пир-I370б/пир)-I370ф/пир, где

I470пир - интенсивность флуоресценции клеточной суспезии в присутствии пирена

I470б/пир - интенсивность флуоресценции клеточной суспезии в отсутствии пирена

I470ф/пир - интенсивность флуоресценции фуранона с пиреном

аналогичный смысл у подстрочных обозначений для I370

Флуоресценция клеточной суспензии в отсутствии пирена (I470б/пир) является фоновой флуоресценцией клеток при облучении светом с длиной волны 340нм, которая вычитается из значения флуоресценции клеточной суспензии в присутствии пирена (I470пир).

2.8 Оценка влияния фуранонов на морфологию клеток Serratiamarcescens

1. 18-часовые культуры микроорганизмов выращивали на питательном LB-бульоне, при температуре 37°С.

2. Фосфатным буфером отмыли клетки от среды 4 раза.

3. Сливаем на досадочную жидкость и заливаем 1.5 мл глютарового альдегида, должны пройти сутки.

4. Обезвоживание в 30%, 50%, 70%, 80%,90% спирте.

5.Ценитрифугируем клетки от глютарового альдегида. Сливаем на досадочную жидкость.

6. Заливаем 30% спирт и ждем 15 минут. Центрифугируем, сливаем на досадочную жидкость. Добавляем 50% спирт и дальше по аналогии с другими спиртами. С 70% спиртом клетки остаются на сутки.

7. В 90% спирте клетки остаются на 1 час.

8. Эппендорфы встряхиваем и 1 каплю наносим на обезжиренное покровное стекло.

Оценку влияния фуранонов на морфологию клеток проводили с помощью автоэмиссионного сканирующего электронного микроскопа (CarlZeissMerlin).

2.9 Статистическая обработка результатов

Математическую обработку полученных результатов проводили стандартными методами в компьютерной программе Microsoft-Excel. Для проведения математического анализа пользовались следующими формулами:

,

где - среднее арифметическое;

- сумма конкретных величин, полученных в опыте;

- число опытов (повторностей)

где - среднее квадратичное отклонение среднего арифметического;

- отклонение каждого члена ряда от величины среднего арифметического.

,

где - средняя ошибка среднего арифметического.

Результаты считали достоверными при среднеквадратичном отклонении < 10%. В качестве критерия достоверности полученных разностей использовали критерий Стьюдента, принимая Р< 0.05 за достоверный уровень значимости.



3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1 Токсические эффекты исследуемых соединений

Токсические эффекты производных фуранонов показаны на Рисунке 2.Проверке на мутагенность должна обязательно предшествовать оценка токсичности образца для исключения ложноотрицательных результатов в испытаниях на мутагенность. В тесте использовали мутантный штамм SalmonellatyphimuriumTA100 из набора для теста Эймса.

В тесте на токсичность были проверены исследуемые производные фуранонов (обозначения здесь и далее: К - контроль, Ф7 - фуранон под номером 7 и Ф8 - фуранон под номером 8).

Рисунок 2 - Токсические эффекты исследуемых фуранонов.

Из рисунка 2 видно, что образцы 7 и 8 не обладают токсичностью по отношению к тестерному штамму SalmonellatyphimuriumTA100 в концентрациях от 0.1 до 100 мкг/мл.

В результате определения возможных токсических эффектов было выявлено, что ни один из образцов не обладает токсичностью по отношению к тестерному штамму SalmonellatyphimuriumTA100в исследуемых концентрациях, за исключением фуранона №9 и №10. Они обладают токсичностью в диапазоне концентрации от 1 до 100 мкг\мл. Рост в этих образцах практически отсутствовал. Поэтому мы провели эксперимент для более низких концентраций.

Рисунок 3 - Токсические эффекты исследуемых фуранонов.

Из рисунка видно, что образцы не обладают токсичностью по отношению к тестерному штамму.

Исходя из данных эксперимента на токсичность различных концентраций фуранонов, было установлено, что исследовать данные концентрации в экспериментах на определение мутагенности можно.

3.2 Мутагенные эффекты по отношению к Salmonella typhimuium

Мутагенные эффекты исследуемых соединений по результатам классического теста Эймса представлены на Рисунке 3.

Рисунок 4 - Мутагенные эффекты исследуемых фуранонов.

Из рисунка видно, что образцы 7 и 8 не проявили мутагенных эффектов в исследуемом диапазоне концентраций.

Также показано, что образцы фуранонов 11 и 12 не проявили мутагенных эффектов по отношению к тестерному штамму SalmonellatyphimuriumTA 100, т.к. превышение числа ревертантов над контролем отсутствовало. Однако образцы фуранонов 13 и 14 продемонстрировали иные результаты.

На рисунке 4 - мутагенные эффекты фуранона №14, содержащего серу и бром. У фуранона №14 в концентрациях 10 мкг\мл и 1 мкг\мл было зафиксировано превышение количества колоний-ревертантов над контролем в 1.5 -2 раза.

Рисунок 5 - Мутагенные эффекты фуранона №14.

Мутагенные эффекты фуранона №13, содержащего серу, бром и хлор, показаны на рисунке 5. Количество колоний-ревертантов превышено над контролем приблизительно в 2.5 - 3 раза.

Рисунок 6 - Мутагенные эффекты фуранона №13.

Фуранон №9 и фуранон №10, содержащий бром и хлор, в виду их гипертоксичности в высоких концентрациях, в тесте Эймса не использовали.



3.3 Результаты ЯМР-спектроскопии

Контрольную и обработанную фураноном культуру Serratiamarcescensпосле образования пигмента (4 сутки) центрифугировали и делили на две фракции: клетки и культуральная жидкость. Предварительно было определено количество клеток в камере Горяева (М= 350*104) и была замерена оптическая плотность (Dopt. = 0.287 нм).

Далее были подготовлены образцы для ЯМР-спектроскопии (обработка проводилась Фураноном 8):

Клетки в физ.растворе - без фуранона;

Клетки в физ.растворе - с фураноном;

Надосадочная жидкость - без фуранона;

Надосадочная жидкость - с фураноном;

Чистый бульон (контроль)

Фуранон 8, концентрация 10 мкг/мл.

На рисунке 7 представлен спектр Ф8 в дейтерированном хлороформе.

Рисунок 7 - Раствор фуранона F8 в ДМСО (Растворитель (ДМСО) был досуха вакуумирован, и полученный остаток был растворен в дейтерохлороформе). Здесь и далее: ось 0Х - область ЯМР-химического сдвига, ось 0Y - интенсивность сигнала.

На рисунке видно, что основные пики фуранона в спектре приходятся на области 3.5, 4 и 4.2 ppm.

На рисунке 8, заимствованном из диссертации Гурьянова Ивана Дмитриевича (каф.микробиологии КФУ), представлен ЯМР-спектр очищенного продигиозина, снятый в дейтерированном хлороформе.

Рисунок 8 - ЯМР-спектр очищенного пигментного препарата - продигиозина.

ЯМР-химические сдвиги продигиозина были следующими: 0.92 p.p.m., 1.31 p.p.m., 1.33 p.p.m., 1.60 p.p.m, 2.40 p.p.m., 2.55 p.p.m., 4.00 p.p.m., 6.08 p.p.m., 6.35 p.p.m., 6.68 p.p.m., 6.99 p.p.m., 7.27 p.p.m., 7.55 p.p.m.

На рисунках 9-13 представлены спектры исследуемых образцов, включая контрольный (бульон). Проанализировав спектры, мы выяснили, что ЯМР-химические сдвиги, соответствующие чистому фуранону, практически отсутствуют в обработанных образцах, что говорит о том, что вещество метаболизировано. Также мы видим ЯМР-химические сдвиги в области, схожей со сдвигами, характерными для продигиозина. Характерно, что в образце КЖ, обработанной фураноном, эти сдвиги более очевидны.

Рисунок 9 - Спектр ЯМР 1Н образца №1 (клетки бактерий без обработки фураноном) в D2O.

Рисунок 10 - Спектр ЯМР 1Н образца №2 (клетки бактерий после обработки фураноном) в D2O.



Рисунок 11 - Спектр ЯМР 1Н образца №3 (надосадочная жидкость без фуранона, от образца №1) в D2O.



Рисунок 12 - Спектр ЯМР 1Н образца №4 (надосадочная жидкость после обработки фураноном, от образца №2) в D2O.



Рисунок 13 - Спектр ЯМР 1Н образца №5 (чистый бульон (контроль)) в D2O.

Наиболее интересным результатом нам представляется наличие ЯМР-химического сдвига в области 2.582-2.585. Этот сдвиг отсутствует в контрольном варианте, а также отсутствует в КЖ без обработки фураноном. Мы видим его в образце клеток без обработки фураноном, однако сигнал незначительный. В вариантах для клеток с обработкой фураноном этот сигнал становится гораздо более выраженным (увеличение в 3-3.5 раза), а особенно в образце КЖ (возрастает еще в 6-7 раз по сравнению с обработанными клетками). Стоит отметить, что этот сигнал отсутствует в образце чистого фуранона. Мы предполагаем, что этот ЯМР-химический сдвиг может характеризовать некий комплекс метаболитов, синтезируемый клетками Serratiaв небольших количествах, практически не выделяющийся в среду. Однако обработка клеток фураноном приводит к резкому увеличению его синтеза и активному выделению в КЖ. В настоящий момент, исходя из области сдвига, мы можем предварительно охарактеризовать его как комплекс ароматических углеводородов [Аниськов с соавт., 2010; Преч, 2006].

3.4 Определение способности к образованию биопленок по планшетному методу, описанному в статье «Growingandanalyzingstaticbiofilms» [Merritt, 2005]

Способность к образованию биопленок показаны в таблице 1.

Таблица 1 - Влияние фуранонов на формирование биопленок

Концентр.	Ф7	Ф8	Ф9	Ф10	Ф11	Ф12	Ф13	Ф14
100	61%	66%			64%	81%	61%	55%
10	56%	54%			59%	64%	42%	45%
1	49%	51%			59%	57%	46%	44%
0,1	49%	44%	65%	79%	57%	56%	48%	56%
0,01			64%	62%
0,001			49%	55%
Контроль	100%

Влияние фуранонов на образование биопленок показаны на рисунке 14.

Рисунок 14 - Способность к образованию биопленок.

Как видно из графика, полученные нами значения меньше, чем в контрольном варианте. Это свидетельствует о том, что исследуемые фураноны препятствуют образованию биопленок. Фуранон №9 в концентрации 0,001 в большей степени способен подавлять образование биопленок. А фуранон №10 в концентрации 0,1 в меньшей степени подавляет образование биопленок.

3.5 Определение изменения микровязкости мембраны при действии фуранонов

Показано, что интенсивность флуоресценции эксимера пирена клеточной суспензии после добавления фуранона №10в концентрации 0,1 мкг\мл, рассчитанная как = (I470пир-I470б\пир)- I470ф/пир =37,59 усл.ед. Интенсивность флуоресценции мономера, рассчитанная по формуле (I370пир-I370б\пир)-I370ф/пир =32,53 усл.ед. Коэффициент эксимеризации F=37,59/32,53=1,155.

Интенсивность флуоресценции эксимерапирена клеточной суспензии после добавления фуранона №9 (токсичный) в концентрации 0,1 мкг\мл,рассчитанная как = (I470пир-I470б\пир)-I470ф/пир=30,99 усл.ед. Интенсивность флуоресценции мономера, рассчитанная по формуле (I370пир-I370б\пир)-I370ф/пир=44,21 усл.ед. Коэффициент эксимеризации F= 30,99/44,21=0,701.

Интенсивность флуоресценции эксимера клеточной суспензии без добавления фуранона, рассчитанная аналогичным образом равна 20,55 усл.ед. Интенсивность флуоресценции мономера этой же клеточной суспензии равна 47,98 усл.ед. Коэффициент эксимеризации F=20,55/47,98=0,43.

Известно, что интенсивность эксимеризации обратно пропорциональна микровязкости мембраны [Добрецов, 1989]. Иными словами, увеличение коэффициента эксимеризации пирена в присутствии фуранона свидетельствует о том, что они способны воздействовать на мембрану Micrococcuslysodeikticus.

С пиреном не взаимодействует соотношение I470/370 (возбуждение 340)=0,135 для фуранона №9 и 0,1302 для фуранона №10 (результат измерений фуранонов с пиреном без клеток).

Интересно то, что фураноны, особенно Ф10, увеличивают коэффициент эксимеризации. У клеток коэффициент эксимеризации без фуранонов =0,43; с фураноном Ф9 коэффициент эксимеризации =0,7, а для Ф10 коэффициент эксимеризации=1,155. Это свидетельствует о стимуляции фуранонами перехода мембраны в жидкокристаллическое состояние (о том, что в присутствии фуранонов больше доменов мембраны в жидкокристаллическом состояние, чем в гель-состоянии).