Создание линий Drosophila melanogaster для исследования функций гена семейства d4 в нервной системе

Глава 1. Литературный обзор

1.1 Белковые факторы транскрипции

1.2 ДНК-связывающие домены, важнейшие семейства

1.3 Домен "цинковых пальцев", строение и функции

1.4 LIM-домен

1.5 RING-домен

1.6 PHD-домен

1.7 Гомеодомены

1.8 Семейство генов d4

1.9 Система GAL4/UAS у дрозофилы

1.9.1 Компоненты системы GAL4/UAS

1.10 Балансирование хромосом

Глава 2. Экспериментальная часть

2.1 Материалы и методы

Глава 3. Результаты и обсуждение

3.1 Получение линий для визуализации нервной системы в организме D. melanogaster

3.2 Исследование нервной системы у «нулевых» по гену tth эмбрионов D. melanogaster

Выводы

Список использованной литературы

Работа генов обеспечивается регуляторными белками: репрессорами, активаторами, транскрипционными факторами и др. Транскрипционные факторы - белки, которые обладают способностью связываться со специфическими участками ДНК, они выполняют свою функцию либо самостоятельно, либо в комплексе с другими белками. Например, с белками- репрессорами, которые обеспечивают снижение, или белками-активаторами, повышающими связывающую способность РНК-полимеразы с регуляторными последовательностями гена (например, промоторами). Факторы транскрипции обладают, отличающей их от других белков, ДНК-связывающей активностью, так как в их структуре присутствуют ДНК-связывающие домены.

В настоящее время различают общие (базовые) и специфические факторы транскрипции. Базовые транскрипционные факторы (ТФ) инициируют транскрипцию на всех типах промоторов. Они формируют преинициаторный белковый комплекс на сайте инициации транскрипции, который помогает РНК- полимеразе II найти стартовую точку транскрипции. Общие факторы транскрипции вместе с РНК-полимеразой образуют базовый транскрипционный аппарат. Общие факторы транскрипции к настоящему времени очищены и выделены. Их шесть: TFIIA, TFIIB, TFIID, TFIIE, TFIIF и TFIIH (по некоторым данным, семь -- описан TFIIJ) (Жимул?в, 2007).

Такой базовый транскрипционный аппарат может функционировать, но с низкой эффективностью, поэтому, чтобы достичь более высокого уровня функционирования, нужны специфические факторы транскрипции. Это регуляторные белки, необходимые для контроля процессом образования белкового комплекса на промоторе. Специфические факторы транскрипции должны обладать двумя важнейшими свойствами: 1) опознавать специфические последовательности-мишени, расположенные в энхансерах, промоторах и других регуляторных элементах данного гена (ДНК-белковые взаимодействия);

2) взаимодействовать с другими компонентами транскрипционного аппарата (белок-белковые взаимодействия) или корегуляторами.

Транскрипционные факторы являются модульными по структуре и содержат следующие домены:

· ДНК-связывающий домен (DBD) -- взаимодействует со специфичными последовательностями ДНК, характерными для промоторов и энхансеров. Специфичность распознавания определенных последовательностей определяет набор генов, подверженных регуляции данным транскрипционным фактором;

· Транс-активирующий домен (TAD) -- содержит участки связывания других белков, например, транскрипционных - корегуляторов;

· Сигнал-распознающий домен (SSD) (например, лиганд- связывающий домен) -- является чувствительным к внешним сигналам и отвечает за передачу сигнала к другим компонентам транскрипционного комплекса, что вызывает повышение или понижение уровня экспрессии.

1.2 ДНК-связывающие домены, важнейшие семейства

LIM-домен состоит из 55 аминокислотных остатков, его аминокислотная последовательность может быть представлена в виде формулы СХ2СХ16- 23НХ2СХ2СХ2СХ16-23СХ2С/H/A (где С - цистеин, Н - гистидин, A - аспарагин, а Х - любая аминокислота). Эта последовательность связывает два иона Zn2+, по

одному с каждой стороны домена, образуя тетраэдрическую структуру с координационными связями (Рис. 1.3). Третичная структура LIM-домена в разных LIM-содержащих белках одинакова, но аминокислотная последовательность сильно различается.

Рисунок 1.3. Схема организации LIM-домена

Впервые LIM-домены были найдены в тр?х гомеодоменных белках. Первый из них, Lin-11, участвует в асимметричном делении вторичных бластоцитарных клеток вульвы Caenorhabditis elegans. Второй, Isl1, связывается с энхансером крысиного гена инсулина, играет большую роль в развитии некоторых нейронов. Третий, Mec-3, необходим для дифференцировки механочувствительных рецепторных нейронов у C.elegans. По первым буквам этих белков и были названы LIM-домены (Karlsson et al., 1990; Freyd et al., 1990).

LIM-домены были обнаружены как в ядерных, так и в цитоплазматических белках позвоночных и беспозвоночных животных, растений, дрожжей и простейших.

Белки, входящие в LIM-домены классифицируют в несколько групп. Функционально большинство белков первой группы регулируют транскрипцию на разных уровнях. Известно, что белки второй и третьей группы принимают участие во внутриклеточном транспорте белков, передаче внутриклеточных сигналов и организации цитоскелета.

Из этих функций наиболее изученной является участие LIM-белков в регуляции транскрипции различных генов. Большинство этих генов отвечают за раннюю дифференцировку различных тканей и клеток. Например, белок LIM-1 (Lhx-1) участвует в развитии осевого скелета позвоночных. В норме он экспрессируется в районе организатора Шпемана в развивающейся нейроэктодерме и дорсальной мезодерме (Curtiss, 1998). Отсутствие этого гена у мыши вызывает гибель эмбрионов на стадии 9,5 дней после оплодотворения, и у таких эмбрионов наблюдается отсутствие всех головных структур, лежащих непосредственно перед вестибулярно-слуховой областью (Shawlot, 1995; Taira et al., 1992). У беспозвоночных, а в частности у дрозофилы, примером такого гена является ген apterous (ap), необходимый для правильного развития крыльев. Мутации по этому гену выражаются в отсутствии жужжалец и крыльев у взрослой особи, на личиночной стадии - отсутствие некоторых мышц, неправильный рост аксонов некоторых нейронов и более мелкие дефекты развития (Diaz-Benjumea, 1993; Blair et al., 1994; Butterworth et al., 1965). В таблице 1.1 приведены примеры других белков, участвующих в регуляции развития различных организмов.

Таблица 1.1. Примеры LIM-белков в различных организмах

LIM-домены регулируют взаимодействия гомеодоменов с ДНК и участвуют в создании транскрипционных комплексов. Есть данные, что в отсутствие регуляторных партнеров LIM-домен стерически или конформационно связывается с гомеодоменом и блокирует его доступ к ДНК. Когда появляется LIM-связывающий белок, он вытесняет LIM-домен из комплекса с гомеодоменом, и образуется активирующий транскрипцию комплекс гомеодомена с регуляторной последовательностью ДНК (Sanchez- Garcia, 1993). Это было показано пут?м внесения точечных мутаций в LIM- домен. Молекулы с мутациями, нарушающими функции LIM-домена, не способны связывать промоторы ДНК и активировать транскрипцию. Однако мутантные белки, в которых LIM-домен отсутствовал полностью, свободно связывались с промоторами ДНК и участвовали в активации транскрипции.

Таким образом, LIM-домены широко представлены как в ядерных, так и в цитоплазматических белках, обладающих разными функциями. Хотя идентичность аминокислотной последовательности LIM-доменов около 30-35% они имеют очень сходную тр?хмерную структуру. Исследования белок- белковых взаимодействий индивидуальных LIM-доменов указывают на их высокую специфичность к определ?нным последовательностям других белков. Это молекулярное узнавание играет важную роль во многих сложных процессах развития и функционирования организмов.

1.5 RING-домен

RING-домен был обнаружен при скрининге компьютерных библиотек с помощью N-концевой последовательности белка RING-1 (really interesting new gene 1). Сейчас известно уже свыше 200 белков (Borden, 2000), которые содержат эту цистеин-обогащенную последовательность. Аминокислотная последовательность RING-мотива описывается формулой: CX2CX(9-32)CX(1- 3)HX(2-3)CX2CX(4-48)CX2C (где С - цистеин, H - гистидин, а Х - любая аминокислота (Рис. 1.4). Различия между конкретными RING- последовательностями обычно касаются расстояния между цистеин- гистидиновыми лигандами, например, между Сys2 и Cys3 или Cys5 и Cys6. С другой стороны, расстояния между Cys1 и Cys2, между Cys4 и Cys5, а также Cys7 и Cys8 всегда постоянно (Saurin et al., 1996). Этот консерватизм определяет сходность тр?хмерного строения этих белков. Структурные исследования показали, что RING-домен имеет уникальную тр?хмерную структуру, названную «cross brace» мотив (Barlow et al., 1994; Takahashi et al., 1988). Некоторые районы RING-домена обладают высокой вариабельностью аминокислотной последовательности.

Рисунок 1.4. Схема организации RING-домена

Некоторые члены семейства RING-белков имеют измененные по сравнению с классическими RING-доменами. На сегодняшний день не было найдено белков, содержащих два и более RING-доменов (Табл. 1.2). Однако, другие домены, в том числе и другие типы «цинковых пальцев» могут соседствовать с RING-доменом, формируя большой общий мотив. Например, RBCC (Ring-B-Box-coiled-coil), кроме RING-домена содержит, один или два цинк-связывающих домена, известных как B-Box-мотив, а также домен «лейциновой молнии» (leucine coiled-coil) (Reddy et al., 1992; Reddy et al., 1991; Kastner at al., 1992).

Таблица 1.2. Примеры RING-белков в различных организмах

Классификация RING-содержащих белков основана на роли, выполняемой белками in vivo (Saurin et al., 1996).

1. RING-белки, связанные с опухолеобразованием.

Существуют RING-белки, которые тем или иным образом связаны с онкогенными потенциями клеток. Например, белок, кодируемый геном предрасположенности к раку молочной железы BRCA1 (breast cancer susceptibility gene 1), протоонкогены RET-finger protein (Rfp), Cbl, Bmi-1 и Mel18, транскрипционный интермедиаторный фактор 1 (TIF1), ДНК- связывающий ядерный белок, выделенный из меланомы и другие (Freemont, 1993). Все они участвуют в разных процессах, связанных с проявлением онкогенной активности клеток. К примеру, Mel18 обладает опухолевой супрессорной активностью, как негативный регулятор транскрипции, и он был найден в больших количествах во всех опухолевых клетках (Kanno et al., 1995).

2. RING-белки и вирусные инфекции.

Белки, содержащие RING-домены широко представлены в вирусах, и проводимые исследования показывают, что RING-домен необходим для развития вирусной инфекции.

3. RING-белки и передача сигналов в клетке.

Были опубликованы исследования об участии RING-белков в процессе утилизации ненужных молекул с помощью присоединения к ним убиквитина, который является маркером внутриклеточной элиминации белков (Joazeiro et al.; 1999, Barinaga, 1999). Среди них два белка, участвующие в контроле клеточного роста: Cbl, мутации которого могут приводить к опухолевому росту и BRCA1, являющийся продуктом гена предрасположенности к раку молочной железы.

4. RING-белки и биогенез пероксисом.

Пероксисомы необходимы для нормального развития млекопитающих и их дефекты приводят к различным нарушениям (Bioukar and Deschatratte, 1993). Одно из таких нарушений, синдром Цильвегера, возникает при удалении С- конца, где находится RING-домен, у интегрального мембранного белка Paf1p.

Кроме того, существуют другие белки, например, Per8p и Pas7p, мутации в RING-доменах которых, приводят к разрушению пероксисом (Per8p) и к невозможности формирования пероксисомной ламины (Pas7p) (Saurin et al., 1996).

На сегодняшний момент, не существует убедительных данных, что RING- домен участвует в непосредственном связывании с ДНК. Когда RING-домен был идентифицирован, думали, что он может быть специфическим ДНК- связывающим доменом. Хотя некоторые RING-белки и/или RING-домены могут связываться с синтетическими олигонуклеотидами и/или с ДНК- целлюлозой, данные о тр?хмерной структуре позволяют предположить, что это неспецифическое связывание обеспечивается наличием положительно- заряженной поверхности в RING-домене (Takahashi et al., 1988; Lovering et al., 1993).

Все больше проясняется вопрос об участии RING-белков в формировании мультипротеиновых комплексов (Borden and Freemont, 1996). Мультипротеиновые комплексы часто видны как ядерные или цитоплазматические структуры и их формирование иногда зависит от клеточного цикла. Размеры макромолекулярных соединений могут варьировать от очень больших PML-ядерных частиц (Grimwade and Solomon, 1997) и комплексов RAG1/RAG2 (recombinase activating gene) (Leu and Schatz, 1995) до очень маленьких, как в случае RING1 (Saurin A.J., unpublished date), MAT1 (menage a trois 1) или BRCA1 (Scully et al., 1996). Формирование таких комплексов происходит за счет взаимодействия RING-домена с другими доменами. Было показано, что взаимодействия RING-доменов делятся на два типа: взаимодействия друг с другом и взаимодействия с другими не RING- доменами.

RING-RING взаимодействия были хорошо охарактеризованы для белка BRCA1. В экспериментах было установлено, что ВRCA1 формирует гомодимеры и гетеродимеры с другим RING-белком, BARD1 (BRCA-1- associated RING domain 1) (Brzovic et al., 1998; Meza et al., 1999).

Взаимодействия RING-белков с RING-связывающими доменами очень специфичны. Например, RING-домен BRCA1 взаимодействует с убиквитин гидролазой, BAP1 (BAI-associated protein) (Jensen D.E. et al., 1998).

1.6 PHD-домен

PHD-домен менее изучен, чем Lim- и RING- домены. Изначально он был описан у двух близкородственных гомеодоменных белков растений - HAT 3.1 и HOX 1A (Aasland et al., 1995; Schindler et al., 1993).

PHD-домен состоит из 50-80 аминокислотных остатков, и его последовательность описывается формулой СХ2 - СХу - СХ2 - СХ2 - НХ2 - СХу - СХ2 - С - (где С - цистеин, Н - гистидин, а Х - любая аминокислота) (Aasland et al., 1995). Эта последовательность связывает два иона Zn2+ по одному с каждой стороны домена, образуя тетраэдрическую структуру с координационными связями (Рис. 1.5). О тр?хмерном строении этого домена до сих пор точно ничего не известно.

Рисунок 1.5. Схема организации PHD-домена

В отличие от Lim- и RING-доменов, которые обычно имеются в количестве одной копии, PHD-домен часто встречается в двух-трех копиях на белковую молекулу. Можно условно разделить все белки с PHD-доменами на 5 классов.

1. Белки, в которых встречаются только PHD-домены, например, некоторые белки, относящиеся к Polycomb группе или белки RBP1 и RBP2 (Retinoblastoma gene product) (Fattaey et al., 1993).

2. Белки, в которых кроме PHD-домена содержится гомеодомен, например, транскрипционный фактор AtHat31 (Schindler et al., 1993).

3. Белки, содержащие бромодомен, такие как Br140 (Thompson et al., 1994).

4. Белки, содержащие домен, сходный с С-концевой последовательностью белка Enhancer of zeste (E(z)). К этим белкам относится, например, белок Trithorax (Trx) (Jones and Gelbart, 1993).

5. Белки, содержащие другие цистеин-обогащенные последовательности, например, белки семейства d4 (Mertsalov et al., 2000).

Гены группы Polycomb у Drosophila melanogaster - это гены, которые вовлечены в репрессию гомеозисных регуляторных генов во время развития организма (Paro, 1993; Kennison, 1993). Молекулярное сходство белков группы Polycomb с белками, ассоциированными с гетерохроматином (Paro, 1990), позволило сделать вывод, что такая репрессия может происходить в результате их взаимодействия с регуляторными областями, приводящего к локальной конденсации хроматина этих районов. PHD-домен встречается почти во всех белках группы Polycomb, что, вероятно, свидетельствует о его функциональной значимости. С другой стороны, существуют гены группы Trithorax, продукты которых необходимы для поддержания стабильной экспрессии гомеозисных локусов. У них тоже имеются PHD-домены. Эти две группы генов создают систему контроля репрессии-экспрессии гомеозисных локусов во время развития дрозофилы. Показано, что эти белки, образуя макромолекулярные комплексы, влияют на хроматин, связываясь с ним в районах локализации гомеозисных генов (Paro, 1990). Можно предположить, что PHD-домены принимают участие во взаимодействии со специфическими регуляторными последовательностями ДНК. С другой стороны, принимая во внимание сходство Lim-, RING- и PHD-доменов, можно сделать вывод, что PHD-домен является модулем, осуществляющим белок-белковые взаимодействия при образовании макромолекулярных комплексов.

Таким образом, можно отметить, что PHD-домен встречается в белках, выполняющих различные функции, и его наличие необходимо для нормального функционирования организмов. Удаление или нарушения в строении PHD- домена ведет к различным генетическим заболеваниям или летальному исходу на ранних стадиях развития организма. Изучение структуры и механизмов функционирования PHD-домена является важной проблемой для решения как практических медицинских, так и теоретических научных задач.

1.7 Гомеодомены

В начале 90-х годов группой В.Л. Бухмана был идентифицирован ранее неизвестный нейроспецифический ген, neuro-d4. Этот ген стал родоначальником семейства генов d4. Гены семейства d4 отличаются сильным эволюционным консерватизмом. Анализом компьютерных баз данных геномов других организмов, они были обнаружены у человека, крысы, мыши, цыпленка, шпорцевой лягушки, а также в геномах нематоды, гидры и дрозофилы, отсутствуют только у прокариот и низших эукариот (дрожжей). В это семейство входят три гена: neuro-d4, ubi-d4/Requiem и Cer-d4 (или Dpf1, Dpf2 и Dpf согласно нуклеотидной базе данных http://www.ncbi.nlm. nih.gov/nucleotide). На рисунке 1.6 представлена схема строения белков семейства d4. В их N- концевой области находится уникальный домен 2/3, который содержит сигнал ядерной локализации, вероятно, необходимый для проникновения белков в ядро клетки (Куликова и др., 2013).

Белки, кодируемые генами этого семейства, обладают общим планом строения и высокой гомологией аминокислотных последовательностей структурных доменов.

Рисунок 1.6. Общий план строения белков D4

Обоз н ачен и я : Domain 2/3 - домен 2/3, специфичный для белков семейства d4, NLS - сигнал ядерной локализации, Krьppel - последовательность, гомологичная Їцинковому пальцу? Крюппель-типа, acidic последовательность отрицательно заряженных аминокислот, d4- domain - домен, специфичный для белков генов семейства d4 и содержащий два последовательно расположенных парных Їцинковых пальца? PHD-типа.

В центральной части белковой молекулы расположен домен, гомологичный известным ДНК-связывающим последовательностям цинковых пальцев Krьppel-типа и последовательность отрицательно заряженных аминокислот (предполагаемый активатор транскрипции) (Buchman et al., 1992). В С-концевой области находится домен d4, структура которого представляет собой расположенные друг за другом два Їцинковые пальца? PHD-типа (Aasland et al., 1995), которые участвуют во взаимодействии с модифицированными гистоновыми белками Н3 и Н4 (Lange et al., 2008).

Несмотря на то, что общая структура белков этого семейства сходна, кодирующие их гены, различаются по своей организации, по времени и паттерну экспрессии. Ниже каждый из этих генов будет описан отдельно.

Neuro-d4

Как уже было сказано, этот ген является родоначальником семейства d4. Его клонировали из коры головного мозга крысы. Было показано, что этот ген состоит из двенадцати экзонов, при этом границы экзонов и интронов гена человека и мыши соответствуют границам экзонов и интронов гена крысы (Buchman et al., 1992; Chestkov et al., 1996). Neuro-d4 - это нейроспецифический ген, экспрессия которого изменяется в эмбриональном и

постнатальном периодах развития млекопитающих и сохраняется на довольно высоком уровне в течение жизни в центральной и периферической нервной системе (Buchman et al., 1992). Нозерн-блот анализа и гибридизации in situ показали, что neuro-d4 у мыши экспрессируется в большинстве зрелых постмитотических нейронов центральной и периферической нервной системы кроме нейробластов.

Ubi-d4/Requiem

Этот ген был описан группой В.Л. Бухмана и группой Габига. Впервые клонирован в результате скрининга библиотек мыши, цыпленка и человека после их гибридизации с зондом гена neuro-d4 (Chestkov et al., 1996). Группа Габига обнаружила его при попытке изолировать гены, связанные с программированной гибелью клеток. Они использовали интерлейкин- зависимую линию миелоидных клеток млекопитающих, выделенную из селезенки мыши. Габиг предположил, что ген необходим для исполнения программы апоптотической гибели клеток, поэтому и дал ему название - Requiem (Gabig et al., 1994, 1998). Оказалось, что Requiem имеет один единственный транскрипт, который выявляется во всех исследованных эмбриональных и зрелых тканях. При этом уровень его экспрессии во всех тканях (за исключением переднего мозга эмбриона) практически одинаков.

В геноме мыши ген состоит из одиннадцати экзонов, а его общая протяженность составляет около 15.5 т.п.н.

Сer-d4

Третьего представителя семейства генов d4 выявили при анализе генома человека. Его локализовали на хромосоме 14 в районе q24.3-q31 (Chestkov et al., 1996). Затем он был обнаружен в геномах мыши (хромосома 12, район 12D3) и цыпленка (Ninkina et al., 2001). Сво? название этот ген получил из-за высокого уровня своей экспрессии в пирамидальных нейронах мозжечка. У него сложная геномная организация. Его экзон-интронную структуру исследовали сначала у цыпленка, затем у мыши. Оказалось, что у цыпленка этот ген кодирует белковый продукт, типичный для всех остальных членов семейства d4, но отличный по аминокислотной последовательности от двух других представителей белков D4: NEURO-D4 и UBI-D4.

Общие картины экспрессии cer-d4 и neuro-d4 оказались похожими. Существенным отличием является отсутствие экспрессии cer-d4 в эмбриональном переднем мозге и, соответственно, в коре головного мозга в постнатальном периоде. У cer-d4, также как и у neuro-d4 существуют многочисленные сплайс-варианты, часто аналогичные сплайс-вариантам neuro- d4.

В геноме Drosophila melanogaster найден единственный гомолог из этого семейства - drosophila-d4 (dd4) и родственный ему ген toothrin (tth). Как было показано, их экспрессия связана с функционированием нервной и репродуктивной систем (Nabirochkina et al., 2002).

Ген drosophila-d4

Ген дрозофилы, единственный гомолог генов семейства d4 позвоночных, названный drosophila-d4 (dd4), исследуется в настоящее время. Ген dd4 локализуется в 42Е цитологической зоне правого плеча (2R) хромосомы II. Было установлено, что он имеет 3 экзона, отдел?нные двумя небольшими интронами (84 и 52 п.н.). Белковые последовательности, кодируемые этим геном, у дрозофилы в сравнении с гомологичными белками Ubi-d4 и Neuro-d4 млекопитающих имеют наиболее консервативный N-конец, содержащий сигнал ядерной локализации (NLS-сайт) и 2/3-домен. Центральная часть молекул не содержит доменов, типа Kruppel и Acidic, характерных для d4-белков позвоночных животных, зато С-концевой участок белка содержит характерный цинк-связывающий домен D4. Данные, полученные после экспериментов по гибридизации in situ на целых эмбрионах, показали, что ген dd4 обладает материнским эффектом и его транскрипт детектируется убиквитарно на очень ранних стадиях многоядерного синцития, когда гены зиготы еще не работают, а

существующие транскрипты имеют материнское происхождение (Nabirochkina et al., 2002). Гибридизация in situ на срезах самок дрозофил показала наличие транскрипта этого гена в нервных (торакальном и цефалическом) ганглиях и в трофоцитах (клетках-кормилках), питающих растущий ооцит (у самок), или семенниках (у самцов). Анализ эмбрионов поздних стадий и ранних личинок показал, что транскрипция dd4 постепенно специализируется и ограничивается тканями эмбриональной и ранней личиночной центральной нервной системы и клетками гонад. Таким образом, было показано, что dd4 является новым специфическим транскрипционным фактором, участвующим в процессах формирования репродуктивной и нервной систем дрозофилы (Nabirochkina et al., 2002).

Ген toothrin

Любопытным открытием стало выявление у дрозофилы «дальнего родственника» генов семейства d4. Им оказался ген, имеющий общий с генами этого семейства эволюционно консервативный 2/3-домен, а домен d4 у него отсутствовал. Локус получил название toothrin (tth). Было показано, что этот ген, возможно, является специфическим транскрипционным фактором (Simonova et. al., 2005). Косвенные данные указывают на кооперативную деятельность его продукта с продуктом гена dd4. Интересно, что у позвоночных животных нет генов, имеющих 2/3-домен отдельно, без сопровождающих его других доменов, характерных семейству d4. Таким образом, модельная система гена tth является уникальной возможностью исследовать роль этого домена в процессе регуляции специфической транскрипции. Экспрессия генов drosophila-d4 (dd4) и toothrin (tth) связана с функционированием нервной и репродуктивной систем. Однако исследование их затруднено из-за отсутствия в этих генах мутаций.

Недавно в лаборатории генетики морфогенеза (ИБР РАН) методом направленного внесения делеций была получена «нулевая» мутация по одному из генов семейства - гена tth (Мерцалов, неопубл. данные). Видимых фенотипических нарушений морфологических структур мухи эта мутация не вызвала. Тем не менее, так как этот ген экспрессируется в нервной системе, мы решили исследовать е? строение у мутантов. Именно поэтому следующая глава посвящается развитию нервной системы у дрозофилы.

Развитие нервной системы Drosophila melanogaster

Развитие центральной нервной системы

Предшественники ЦНС (нейробласты) происходят из специализированных частей эктодермы, нейрогенных областей, которые показаны на 5 стадии эмбриона (Рис. 1.7) (Campos-Ortega, Goodman and Doe, 1993).

Рисунок 1.7. Нервная система эмбриона пятой стадии. По: Atlas of Drosophila

Development by Volker Hartenstein, 1993.

Обозначения: neuroblasts - нейробласты; neurogenic region - нейрогенная область; mesectoderm (mec) - мезэктодерма; aCenBr - головной мозг; aVenNC - абдоминальная нервная цепочка; aVisSys - висцеральная система.

Вентральная нейрогенная область да?т начало нейробластам абдоминальной (брюшной) нервной цепочки, части ЦНС, принадлежащей к сегментированной зародышевой полосе (Hartenstein and Campos-Ortega, 1984).

Вентральная нейрогенная область отделяется от мезодермы мезэктодермой (mec), состоящей из одного ряда клеток по обе стороны от эмбриона, которые сформируют ряд нейронных предшественников. Процефалическая нейрогенная область генерирует мозг. Рядом с этой областью находится зачаток зрительной доли, который развивает отлично от остальной части мозга. Следует подчеркнуть, что нейрогенные области содержат не только нейробласты, но и предшественники эпидермальных клеток, которые участвуют в образовании вентрального и головного эпидермиса.

Вскоре после гаструляции, стадия 8, (Рис. 1.8) клетки вентральной нейрогенной области набухают.

Рисунок 1.8. Нервная система эмбриона восьмой стадии. По: Atlas of Drosophila

Development by Volker Hartenstein, 1993.

Обозначения: neuroblasts - нейробласты; neurogenic region - нейрогенная область; mesectoderm - мезэктодерма; aCenBr - головной мозг; aMesEc - мезэктодерма; aVenNC - абдоминальная нервная цепочка.

В то время как зачаток дорсального эпидермиса претерпевает свое первое постбластодермальное деление, митоз в нейрогенных областях задерживается.

Начиная со стадии 9 (Рис. 1.9), нейробласты вычленяются из эктодермы.

Рисунок 1.9. Нервная система эмбриона девятой стадии. По: Atlas of Drosophila

Development by Volker Hartenstein, 1993.

Обозначения: neuroblasts - нейробласты; neurogenic region - нейрогенная область; mesectoderm - мезэктодерма; pCenBr - головной мозг; SI - нейробласты первой волны деления, SII - нейробласты второй волны деления; SIII - нейробласты третьей волны деления.

Для брюшной нейрогенной области, вычленение нейробластов происходит в три волны (Hartenstein and Campus-Ortega, 1984). Первая волна (начало стадии

9) дает два ряда нейробластов (SI) по обеим сторонам эмбриона. Нейробласты, вычленяющиеся во время второй волны (SII), заполняют промежуток между двумя рядами нейробластов SI. Рисунок стадии 9 изображает SI и SII нейробласты. SIII нейробласты отделяются от преимущественно медиальных положений на протяжении стадии 10 и в начале стадии 11 (Рис. 1.10).

Рисунок 1.10. Нервная система эмбриона 11 стадии. По: Atlas of Drosophila Development by Volker Hartenstein, 1993.

Обозначения: neuroblasts - нейробласты; ganglion mother cells/neurons - ганглионарные материнские клетки/нейроны; mesectoderm/derivatives - мезэктодерма и е? производные; pCenBr - головной мозг; gmc - ганглионарные материнские клетки; nb - нейробласты; pVenNC - абдоминальная нервная цепочка; mp - клетки-предшественники клеток срединной линии.

Картина сегрегации нейробластов процефалической нейрогенной области недостаточно известна; рисунки стадий 9 и 11 дают грубое приближенное представление о популяции процефалических нейробластов, присутствующих на этих этапах. Вскоре после их сегрегации, нейробласты начинают делиться, формируя перпендикулярно ориентированные оси веретена деления. На протяжении стадий 9-13 нейробласты (nb) претерпевают восемь волн митоза (Hartenstein et al., 1987). Их потомки, называемые ганглионарные материнские клетки (gmc), помещаются между нейробластами и мезодермой (ms).

Каждая ганглионарная материнская клетка симметрично делится, в результате чего образуются два нейрона. Ганглионарные материнские клетки и нейроны формируют беспорядочный слой с увеличивающейся толщиной поверх нейробластов. С наступлением явной сегментации на стадии 12 вдоль развивающейся ЦНС появляются глубокие борозды. На протяжении стадий 9 и 10, между слоями нейробластов с обеих сторон формируется мезодерма (mec) в виде двойного ряда клеток. В течение стадии 11 (Рис. 1.10), мезодерма теряет контакт с наружной поверхностью. Посегментные утолщения маркируют появление нейронных предшественников (так называемых прекурсоров нейронов средней линии, срединных нейробластов и срединных глиальных клеток, mp), которые происходят из мезэктодермы.

На стадии 11 клетки, которые будут формировать зрительную долю, все еще находятся в головном отделе эктодермы, где они занимают спинно-боковое положение за развивающимся мозгом (зрительная доля плакоды). В течение стадии 12 эти клетки инвагинируют. В отличие от всех других нейробластов, предшественники зрительной доли сохраняют свои эпителиальные характеристики. На протяжении стадии 13 (Рис. 1.11) и далее, они образуют пузырек, который прикреплен перемычкой к базальной поверхности полушарий головного мозга.

Рисунок 1.11. Нервная система эмбриона 13 стадии. По: Atlas of Drosophila Development by Volker Hartenstein, 1993.

Обозначения: neuroblasts - нейробласты; ganglion mother cells/neurons - ганглионарные материнские клетки/нейроны; mesectoderm/derivatives - мезэктодерма и е? производные; af - передний межсегментарный нерв; co - перемычки в сегменте; cn - связки в сегменте; pf - задний сегментарный нерв; pOOA - внешний оптический зачаток; plOA - внутренний оптический зачаток; VenNC - абдоминальная нервная цепочка; vg - борозды по сторонам брюшной нервной цепочки.

Дифференцировка нейронов начинается на стадии 13 (Goodman and Doe, 1993). Популяция идентифицируемых нейронов ложится на волокна на дорсальной поверхности ЦНС. Позже появляющиеся аксоны располагаются пучком вдоль основного тракта. Продольные волокна образуют связки (cn); поперечные волокна образуют две перемычки (со) в каждом сегменте, которые пересекают срединную линию, контактируя со срединными глиальными клетками, потомками мезэктодермы. Аксоны, которые выходят за пределы ЦНС, образуют передний пучок (af; также называемый межсегментарный нерв) и задний пучок (pf; сегментарный нерв). Врастающие сенсорные аксоны (pn) формируют общий пучок с обоими из этих путей.