Загальна біотехнологія

Глибинне культивування мікроорганізмів. Цей спосіб має ряд очевидних переваг перед поверхневим, оскільки дозволяє значно скоротити виробничі площі, виключити важку непродуктивну ручну працю, поліпшити гігієну праці, спрощує механізацію та автоматизацію виробництва, робить можливим перехід на безперервний спосіб культивування. При глибинному способі культивування раціональніше використовуються живильні речовини середовищ, що дають можливість значно скоротити відходи виробництва у вигляді нерозчинних осадів твердого живильного середовища, отримувати препарати з меншим вмістом домішок і більшою питомою активністю. Глибинне культивування проводять у вертикальних герметичних ємностях різного розміру, що називаються ферментаторами (рис. 7, 8). Основна вимога до ферментатора - можливість проведення процесу культивування продуцента в асептичних умовах при інтенсивній аерації середовища. Для підтримання стерильних умов ферментатори мають бути абсолютно герметичними, а всі лінії трубопроводів мають бути доступні до обробки гарячою парою. В процесі культивування доводиться мати справу з складною трифазною системою рідина - тверда суспензія - газ. У такій системі ускладнені процеси масообміну і тому ускладнюється апаратурне оформлення всієї стадії вирощування. Сучасні ферментатори містять вимірювальні прилади та регулюючі пристрої. Ферментатори обладнані пристроями для піногасіння та оглядовими люками. Ферментатори також обладнані арматурою та трубопроводами для подачі живильного середовища, води, пари, розчину, що регулює рН, піногасників, повітря, тощо.

Використовуються ферментатори з пневматичним перемішуванням і аерацією середовища. Усередині таких ферментаторів вмонтовуються форсунки, дифузори, барботери для подачі повітря. Такі ферментатори можуть бути циліндричними, кульоподібними, горизонтальними із звичайним і інтенсивним масообміном.

Дуже важливо переконатися, що у ферментаторі забезпечуються асептичний режим культивування, дотримання всіх параметрів зростання мікроорганізму і створюються сприятливі умови біосинтезу цільового продукту. Для дотримання цієї вимоги ферментатори повинні витримувати жорстку стерилізацію і працювати протягом всього культивування під невеликим надмірним тиском.

Послідовність процесу культивування мікроорганізмів є загальною як для глибинного (рис. 9), так і для поверхневого (рис. 10) способу культивування. Вона включає стадії приготування посівного матеріалу, приготування живильного середовища, його стерилізації, охолоджування, засіву посівним матеріалом і вирощування. Проте залежно від способу культивування апаратурне оформлення технологічної схеми істотно розрізняється.

Технологічні схеми глибинного культивування (див. рис. 9) аеробних і анаеробних мікроорганізмів майже не відрізняються одна від одної, за винятком того, що в схемах культивування анаеробних мікроорганізмів виключається стадія підготовки повітря і використовуються ферментатори без аеруючих і перемішуючих пристроїв.

Порядок виконання роботи

1. Розглянути та зарисувати технологічні схеми поверхневого та глибинного культивування мікроорганізмів у біотехнологічній промисловості.

2. Засіяти рідке та тверде живильне середовище чистою культурою промислового мікроорганізму та здійснити культивування.

3. Після культивування вивчити морфологію мікроорганізмів та порівняти способи вирощування.

4. Зробити висновки та оформити роботу.

Контрольні питання:

1. Наведіть технологічні стадії культивування мікроорганізмів.

2. Наведіть промислові способи культивування мікроорганізмів.

3. Наведіть переваги глибинного культивування мікроорганізмів.

4. Наведіть складнощі, що виникають під час глибинного культивування мікроорганізмів та шляхи їх подолання.

5. Яка апаратура являється основною під час глибинного культивування та які вимоги висуваються до неї?

6. Наведіть способи поверхневого культивування мікроорганізмів, їх переваги та недоліки.

7. У яких апаратах відбувається процес основної ферментації?

8. Наведіть будову кювети?

9. Наведіть засоби механізації та автоматизації глибинного способу культивування?

Лабораторна робота №5

Тема: Ріст мікроорганізмів у періодичній (статичній) культурі. Вплив умов культивування на показники росту мікроорганізмів.

Мета: Дослідження росту культури при періодичному культивуванні. Побудова кривої росту. Розрахувати кінетичні показники періодичного культивування.

Матеріали та обладнання: конічні колби (250 мл), пробірки, піпетки (2, 5, 10 мл), реактиви для приготування живильного середовища, мікроскоп, камера Горяєва, чисті культури досліджуваних мікроорганізмів, спиртівка (сухе паливо), стерильна водопровідна вода.

До промислових способів культивування мікроорганізмів належать періодичне, безперервне культивування та культивування іммобілізованих клітин. Найбільш поширений спосіб періодичного культивування. При даному способі інокулят вносять у живильне середовище, яке містить задану кількість всіх необхідних поживних речовин. При цьому ні один з істотних компонентів живильного середовища не надходить у систему у процесі культивування, тобто це закрита система. Періодичне культивування застосовується як для поверхневих культур (на поверхні твердого живильного середовища), так і глибинних культур (в рідкому живильному середовищі). Зростання мікроорганізмів у живильному середовищі припиняється тоді, коли зміст якого-небудь з необхідних компонентів середовища досягає мінімуму або у середовищі накопичуються продукти метаболізму, що інгібують ріст мікроорганізмів.

Крива, що описує залежність логарифма числа живих клітин від часу, називається кривою росту. Типова крива росту періодичної культури мікроорганізмів, зображена на рисунку, має S-подібну форму і характеризується різними фазами, пов'язаними із зміною складу живильного середовища, складом біомаси та фізіолого-біохімічними властивостями мікроорганізмів.



І - лаг-фаза; II - фаза прискореного росту; III - фаза логарифмічного росту (експоненціальна); ІV - фаза уповільненого росту через нестачу джерел живлення або через накопичення інгібуючих продуктів; V - стаціонарна фаза; VI - фаза відмирання клітин; VII - фаза виживання клітин

Під час культивування мікроорганізмів у безперервній культурі всі компоненти живильного середовища постійно надходять у систему і виводяться з неї. Це відкрита система і культивування здійснюється тільки в глибинній культурі, найчастіше аерованій.

Культивування іммобілізованих клітин відбувається шляхом прикріплення клітин мікроорганізмів (іммобілізація) на будь-які інертні носії. Живильне середовище постійно надходить у систему й виводиться з неї, тобто це теж відкрита система.

Для культивування мікроорганізмів необхідна наявність життєздатної засівної культури (інокуляту), живильного середовища, що містить всі необхідні елементи живлення (джерело енергії, вуглецю, макро- і мікроелементів і, у разі потреби, фактори росту), відсутність у середовищі різного роду інгібіторів росту. Необхідна, також підтримка оптимальних для росту мікроорганізмів фізико-хімічних умов навколишнього середовища (температура, рН, тиск, умови аерації, джерела світла та ін.).

Основні параметри росту мікроорганізмів: Х - концентрація біомаси, г/л; N - кількість клітин в одиниці об'єму (титр культури, щільність популяції), кількість клітин у 1 мл; м - питома швидкість росту - приріст біомаси або числа клітин за одиницю часу, віднесений до концентрації біомаси або кількості клітин, год^-1.

Для кількісної характеристики культивування мікроорганізмів користуються двома показниками - середньою та питомою швидкістю росту. Середня швидкість росту V характеризується приростом біомаси за одиницю часу:

,

де х₀ - кількість біомаси на початку культивування, кг/м³; х - біомаса за час культивування ф, кг/м³; ф₀ і ф - початковий і кінцевий час відліку відповідно, год.

Питома швидкість росту характеризує годинний приріст на одиницю зростаючої біомаси:

.

Математична модель зростання кількості біомаси - рівняння Моно - застосовується для кількісного опису динаміки росту біомаси:

.

Величину µ за певний проміжок часу можна знайти, вирішивши рівняння питомої швидкості росту шляхом логарифмування:

або .

Розмірність питомої швидкості µ, год-¹. З наведених рівнянь виходить, що питома швидкість росту залежить від кількості біомаси дріжджів, які засіваються та отримуваних, від тривалості процесу.

Для визначення росту мікроорганізмів використовуються ряд методів, які поділяються на прямі і непрямі методи визначення. До прямих методів належать:

- визначення біомаси ваговим або турбідиметричним методом;

- визначення кількості клітин мікроорганізмів при використанні лічильних камер або при висіванні на тверді середовища.

При використанні непрямих методів проводять визначення маси окремих компонентів клітини (білок, клітинний азот, нуклеїнові кислоти, аденозінтрифосфорна кислота та ін.), маси спожитого субстрату (джерела вуглецю, азоту, кисню та ін.), маси утворених продуктів метаболізму тощо.

Порядок виконання роботи

Робота полягає в експериментальному проведенні процесу культивування дріжджів роду Saccharomyces і бактерій та у визначенні параметрів їх росту в залежності від умов культивування.

Техніка культивування мікроорганізмів містить наступні операції:

1. Підготовка живильного середовища.

2. Підготовка інокулята (засівного матеріалу).

3. Засів підготовленого живильного середовища.

4. Культивування при встановлених умовах протягом визначеного часу.

Робота проводиться за трьома етапами.

На першому занятті:

Підготовка живильного середовища для вирощування дріжджів роду Saccharomyces:

Живильне середовище (I) (г/л): глюкоза - 10,0; (NH₄)₂SO₄ - 3,5; NH₄H₂PO₄ - 0,8; KCI - 0,5; MgSO₄х7H₂O - 0,25; FeSO₄ - 0,15; ZnSO₄ - 0,015; MnSO₄ - 0,015; дріжджовий автолізат - 1 мл або пептон - 10,0 г/л.

Живильне середовище (II) (г/л): сахароза або глюкоза - 50,0; пептон - 10,0; КН₂РО₄ - 0,5.

Кожне середовище готується ву об'ємі 1 л. Визначається рН в обох середовищах.

Кожне підготовлене живильне середовище розливається по 50 мл у 10 конічних коливальних колб та по 50 мл у 10 колб для термостату і стерилізується при 0,5 атм. 20 хв. Загальна схема досліду надана у таблиці 3.

Таблиця 3

Склад живильного середовища	Дріжджі
	t,°C	умови аерації
1. Середовище I	26-32	інкубують на качалці
2. Середовище I	26-32	стаціонарні умови
3. Середовище IІ	26-32	інкубують на качалці
4. Середовище IІ	26-32	стаціонарні умови

На другому занятті:

1. Підготовка інокулята (засівного матеріалу).

Чисті культури дріжджів і бактерій вирощуються на твердому живильному середовищі (косяки): сусло-агарі і МПА (м'ясо-пептоновий агар) відповідно, протягом 48 год при температурі відповідно 28-32⁰С і 37-38⁰С відповідно. Культури, що виросли, використовують в якості посівного матеріалу. Дозволяється проводити розведення пресованих дріжджів роду Saccharomyces у водопровідній воді.

2. Порахувати кількість клітин у суспензії, що засівається. Підрахунок вести у камері Горяєва, роблячи розведення для зменшення кількості клітин у полі зору. Зробити перерахунок кількості клітин враховуючи об'єм суспензії, що засівається.

3. Засів підготовленого живильного середовища. Засівають підготовлене до досліду живильне середовище таким об'ємом засівної суспензії, щоб забезпечити у дослідній колбі кількість засівного матеріалу 0,5% і 1% (залежно від варіанта досліду). Або вносять відому кількість клітин у поживне середовище. Інокулят вносять при використанні техніки, що забезпечує стерильність операції. У кожну колбу із 50 мл живильного середовища вносять 0,5 мл, або менше, приготованої суспензії дріжджових клітин, залежно від вихідної кількості клітин у приготовленій суспензії.

Для визначення кількості клітин також можна застосовувати фотоелектрокалориметр (ФЕК). Вимірюють на фотоелектроколориметрі величину світлорозсіювання суспензії культур, що виросли, які використовують в якості інокулята. Живильне середовище для мікроорганізмів, в якому передбачається визначати біомасу за світлорозсіюванням, має бути оптично прозорим. Якщо помутніння середовища пов'язане з випаданням в осад солей, найчастіше фосфатів, то перед виміром світлорозсіювання середовище підкисляють декількома краплями концентрованої соляної кислоти. Для виміру світлорозсіювання вибирають світлофільтр, що забезпечує максимум пропускання світла даної суспензії. Світлорозсіювання суспензії дріжджів у безбарвних середовищах вимірюють із зеленим або синьо-зеленим фільтром проти води і виражають в одиницях оптичної щільності. За високих концентраціях клітин у культуральному середовищі розсіювання світла посилюється, що призводить до отримання занижених результатів. Тому, суспензію з високою щільністю клітин, перед виміром світлорозсіювання, слід розводити середовищем або водою. Для культур, що досліджуються за даними графіками залежності показників фотоелектроколориметра від числа клітини і біомаси, визначають вміст клітин або сухої біомаси в одиниці об'єму середовища.

4. Відлік часу культивування слід починати з моменту внесення до живильного середовища засівних дріжджів. Культура інкубується у 10 колбах на термостатованих качалках (аеробні умови) та у 10 колбах у термостаті (умовно анаеробні умови) при 28-32єС окремо для кожного живильного середовища.

Домашнє завдання: відбір проб протягом трьох діб, 2 рази на добу.

На третьому занятті:

1. У динаміці визначаються параметри росту культури. Для цього темпорально (наприклад кожні 2 год), при дотриманні стерильності операції відбирається, 1 мл суспензії культури або знімається 1-2 досліджуванні колби. Дослідні колби, що знімаються, ставляться до холодильника і підраховуються на третьому занятті. Дослід проводити не більше 3-х діб, що являється оптимальним часом зростання дріжджів роду Saccharomyces. Визначається оптична щільність суспензії, при вирощуванні дріжджів підраховується кількість клітин у камері Горяєва, культури мікроскопуються.

Для підрахунку дріжджів 1-2 краплі живильного середовища з біомасою клітин відібрати піпеткою, нанести її на поверхню рахункової камери, попередньо притерши покривне скло до сторін камери до появи веселкових кілець (кільця Ньютона). Камеру помістити на предметний столик і з об'єктивом 8х знайти зображення сітки, а потім замінити об'єктив на 40х. Вести підрахунок через 3-5 хв від моменту заповнення. Підрахувати кількість клітин у 10 великих або 20 малих квадратах сітки, розташованих по діагоналі. Врахувати всі клітини, що лежать у квадратику сітки і пересікають верхню та праву сторони квадрата. Визначити середнє число N_ср дріжджів у квадраті. Число дріжджів в одному квадраті не має бути більше 20, інакше роблять розведення вихідної суспензії і повторюють розрахунок. Кількість клітин у 1 мл суспензії обчислити за формулою:

,

де N_ср - середнє число дріжджів у квадраті, шт.; h - глибина камери (0,1), мм; S - площа квадрату сітки (великого 1/25, малого 1/400), мм².

Зробити перарахунок кількості клітин із урахуванням об'єму живильного середовища (50 мл).

2. При мікроскопіюванні дріжджів готується препарат «роздавлена крапля», забарвлений метиленовим синім, і мікроскопується з об'єктивом 40х. Дослід закінчується при зниженні приросту біомаси.

3. За одержаними даними будується графік - крива росту, визначається тривалість лаг-фази, розраховується величина питомої швидкості росту в логарифмічній стадії і вихід біомаси від заданого субстрату при завершенні експерименту. Все це робиться для обох живильних середовищ, таким чином визначають кращі умови культивування для дріжджів роду Saccharomyces.

Результати дослідження вносити до таблиці 4.

Таблиця 4. Визначити параметри росту культури (м,) і записати у вигляді таблиці

Варіант досліду	Тривалість культивування, год	Середнє число клітин у 10 квадратах, шт.	Кількість клітин у 1 мл, шт.	м, год-1

Контрольні питання

1. Назвіть основні відмінності періодичного і безперервного культивування?

2. Які фази розвитку проходить біомаса клітин в умовах періодичного культивування?

3. Які показники використовують для характеристики процесів зростання популяції мікроорганізмів?

4. У яких одиницях вимірюється питома швидкість росту, загальна швидкість росту?

5. Як можна змінити питому швидкість росту?

Лабораторна робота №6

Тема: Технологічний контроль на підприємствах біотехнологічної промисловості.

Мета: Вивчити види контролю на біотехнологічних підприємствах. Здійснити контроль якості сировини та готового продукту.

Матеріали та обладнання: стерильна водопровідна вода, стерильні серветки, борошно, молоко, МПА, мікроскоп.

Санітарно-мікробіологічний контроль методом змивів

На підприємствах біотехнологічної промисловості санітарно-бактеріологічний або мікробіологічний контроль є обов'язковим і здійснюється органами санітарного нагляду в плановому порядку, а також позапланово за епідемічними показниками.

Як показник санітарного стану діючого закладу широко використовується характеристика мікробного засівання поверхні різних об'єктів - приладів та обладнання, інвентарю, одягу, рук персоналу. Основними тестами мікробної забрудненості предметів є загальна кількість мікроорганізмів на одиницю поверхні досліджуваного предмета (мікробне число) і наявність на предметах санітарно-показових та недопустимих мікроорганізмів (Escherichia coli, Clostridium perfringens та ін.).

Основним методом взяття проб для дослідження мікробної забрудненості поверхні будь-якого предмета є його змив з певної площі. З цією метою стерильною серветкою, ватним тампоном, змоченими у стерильній воді, протирають певну площу поверхні об'єкта і переносять серветку / тампон у пробірку зі стерильною водою. Обережно збовтують суміш для десорбції мікроорганізмів і одержану суспензію використовують для аналізу. Змиви з рук, рушників і санітарного одягу здійснюють до початку і після роботи. Кількість мікроорганізмів (мікробне число) у змивах часто визначають за методом Коха і виражають на одиницю поверхні досліджуваного об'єкта, найчастіше на 1 см². Залежно від ступеня мікробного засівання із різних розведень змиву беруть по 1 мл і висівають на МПА у чашках за загальноприйнятою методикою. Мікробне число визначають за такою формулою:

= ,

де М - мікробне число; n - кількість мікроорганізмів, які містяться в 1 мл вихідного розведення змиву (для визначення цієї кількості число колоній, які виросли на МПА в чашках, перераховують з огляду на розведення); 10 - кількість рідини, яка використовувалася для десорбції мікрофлори, мл; S - площа, з якої зроблено змив, см².

Санітарний стан поверхні досліджуваного об'єкта вважається дуже відмінним, якщо загальна кількість мікробів на 1 см² складає не більше 100, добрим - якщо їх від 100 до 1000, задовільним - якщо мікробів понад 1000, поганим - якщо їх більше 10000.

Визначення титру кишкової палички у досліджуваних змивах. З цією метою посів змивів здійснюють на середовище Кесслера і ставлять чашки у термостат при температурі 43°С на 24 год. Це перший етап виявлення кишкової палички, який дістав назву бродильної проби. Якщо утворення газів і помутніння не відбувається, роблять остаточний висновок про відсутність бактерій групи кишкової палички.

При виявленні газоутворення і помутніння проводять другий етап визначення кишкової палички. Для цього пересівають культуру, яка виросла на середовищі Кесслера, на диференціально-діагностичне живильне середовище Ендо. Засіяні чашки Петрі розміщують у термостаті при температурі 37°С на 24 год. Після закінчення інкубації відбирають лактозопозитивні (червоні) колонії і виготовляють із них мікропрепарати, фарбують за Грамом і вивчають під мікроскопом. Якщо в полі зору виявляються грамнегативні неспороносні палички, то для остаточної ідентифікації кишкової палички проводять оксидазний тест - третій етап. Цей тест пропонується як експрес-метод для диференціації Е. coli від сапрофітних бактерій, що морфологічно подібні до неї, але відрізняються тим, що мають фермент оксидазу і можуть окислювати фенілендіамінові сполуки до індофенолу. Останній має яскраво синій колір. Для проведення оксидазного тесту бактеріологічною петлею відбирають невеличку кількість колонії, яка виросла на середовищі Ендо, на фільтрувальний папір, просочений розчином фенілендіаміну. Якщо на місці нанесення бактеріальної маси колір паперу не змінюється, то оксидазний тест буде негативним, і, навпаки, якщо бактерії володіють активною оксидазою, папір стає синім протягом 1 хв.

Виявлення у досліджуваних змивах кишкової палички, умовно-патогенних і патогенних мікроорганізмів свідчить про грубе порушення санітарно-гігієнічних правил та необхідність проведення негайних профілактичних заходів!

Мікробіологічний контроль хлібобулочних виробів. У хлібопекарному виробництві мікроорганізми мають важливе значення. Наприклад, такі мікроорганізми, як дріжджі та молочнокислі бактерії, спеціально використовуються для виготовлення тіста. Інші види мікроорганізмів, які потрапляють у сировину із зовнішнього середовища, можуть знижувати якість сировини, викликати псування готової продукції і бути причиною харчових отруєнь.

Сировина, яка використовується для виробництва хліба, часто буває засіяна мікробами. Так, мікрофлора борошна походить переважно від мікрофлори зерна. Кількісний і якісний склад мікроорганізмів борошна залежить від ступеню інфікованості зерна, способу його розмелювання та очистки. Загальна кількість мікробів у 1 г борошна може доходити до 3 млн. Проте, ця цифра змінюється залежно від вмісту вологи, тривалості зберігання тощо. Якість борошна значною мірою визначається вмістом у ньому неспороносних Envina herbicola і спороносних Bacillus mesentericus та Bacillus subtilis мікроорганізмів. Картопляна (B. mesentericus) і сінна (B. subtilis) палички - найбільш поширені збудники мікробного процесу псування хліба. Спори цих бактерій дуже термостійкі, завдяки чому вони зберігаються у хлібі під час його випікання. При повільному охолодженні такого хліба, створюються сприятливі умови для проростання спор, що спричинює в ньому гнильні процеси. У цьому випадку м'якуш хліба стає липким і набуває неприємного запаху. Такий хліб не придатний для споживання. Картопляна хвороба найчастіше вражає пшеничний хліб влітку. Пшеничний і житній хліб часто уражується також і «крейдяною хворобою», при якій на м'якуші хліба з'являється білий мучнистий наліт. Це міцелій цвільових грибів (наприклад Mucor, Penicillium, Aspergillus) і дріжджеподібних мікроорганізмів (наприклад Saccharomyces).

Бактеріологічний аналіз молока. Молоко являє собою дуже сприятливе середовище для розмноження та зберігання різних видів мікроорганізмів. Кількість їх у 1 мл молока може сягати кількох мільйонів. Засівання молока мікробами відбувається переважно під час доїння і зберігання. Традиційно у молоці переважають непатогенні неспороутворюючі мікрококи або паличкоподібні представники відділу Lactobacillales (наприклад, Lactococcus lactis або Lactobacillus acidophilus), молочнокислі бактерії та інші. Молочнокислі бактерії - це група мікроаерофільних грампозитивних мікроорганізмів, що зброджують вуглеводи з утворенням молочної кислоти як одного з основних продуктів. До молочнокислих бактерій також відносять корисну неспороутворюючу мікрофлору молока: рухому паличку, Streptococcus lactis та нерухому «болгарську паличку» Lactobacillus bulgaricus, що викликають природне сквашування. Процес природного сквашування лежить в основі виробництва кисломолочних продуктів: кефіру, йогурту, ряжанки, сирів, тощо.

У забрудненому молоці міститься значна кількість представників групи кишкової палички, а також маслянокислі та гнильні бактерії. За певних умов у молоко потрапляють патогенні мікроби, що може спричинити до виникнення епідемій серед населення. Найчастіше визначають загальну кількість мікроорганізмів у молоці (мікробне число), колі-титр і пробу на редуктазу. Визначення у молоці патогенних мікробів здійснюється в спеціальних мікробіологічних лабораторіях.

Проведення роботи

1. Для виявлення спор картопляної і сінної паличок розводять досліджуване борошно (від 1:10² до 1:10⁵) у простерилізованій водопровідній воді. Суміш старанно збовтують і нагрівають на водяній бані при температурі 95-97°С протягом 10 хв з моменту першого пухирця. При цьому вегетативні клітини бактерій гинуть, а спори залишаються живими. Висівають по 0,5-1,0 мл борошна із розведенням 10-³ у 2 чашки Петрі на поживні середовища МПА та Сабуро та із розведенням 10-⁴ у 2 чашки Петрі на поживні середовища МПА та Сабуро. Під час засіву 2 чашки Петрі із поживними середовищами МПА та Сабуро залишити відкритими у «зоні стерильності». Дослідні чашки Петрі (6 шт.) із живильним середовищем МПА розміщують у термостаті при температурі 37°С на 1-3 доби, із середовищем Сабуро - при температурі 26-28°С на 5-7 діб.

По закінченні інкубації оцінюють якість борошна. Для цього вивчають морфологічні й культуральні властивості мікроорганізмів, які виросли на агарових пластинках, та, користуючись альбомами-визначниками, виявляють серед них картопляну і сінну палички. Підраховують кількість колоній цих спорових бактерій (при цьому беруть до уваги, що кожна колонія утворилася з однієї спори) і визначають кількість спор у 1 г борошна (число колоній множать на розведення борошна). При наявності в 1 г борошна до 200 спор якість його вважається нормальною, якщо кількість спор є в межах від 200 до 1000 - сумнівною, а понад 1000 - таке борошно непридатне для використання.

2. Проби молока для мікробіологічних досліджень відбирають, керуючись в основному вимогами ГОСТу 9225-68. Об'єм проби молока повинен бути не меншим за 50 мл. Посуд, в який відбирають пробу, має бути стерильним. Пробу молока необхідно досліджувати зразу після її взяття. У лабораторії її треба зберігати при температурі 4-6°С.

Визначення загальної кількості мікробів у молоці проводять безпосередньо підраховуючи мікроби під мікроскопом (метод Бріда). Для цього готують мазок молока, фіксують його, фарбують і вивчають під мікроскопом. При визначенні мікробного числа молока чашковим методом спочатку із відібраної проби виготовляють розведення (10-¹-10-⁹) за допомогою простерилізованої водопровідної води. При глибинному посіві із розведень молока, які знебарвлюються резазурином до 20 хв (розведення 10-⁴, 10-⁵ і 10-⁶), стерильною піпеткою висівають по 0,5-1,0 мл суспензії в стерильні чашки Петрі. При знебарвленні молока резазурином більш ніж через 20 хв роблять посів з розведень 10-³, 10-⁴, 10-⁵ у чашки і заливають розплавленим і охолодженим до 50°С МПА. Суміш обережно перемішують і розміщують у термостаті при температурі 30°С. Засів можна робити на поверхню застиглого агаризованого середовища (поверхневе культивування), а можна у стерильну чашку Петрі поміщати пробу молока та заливати живильне середовище, охолоджене до 50°С (глибинне культивування). Після триденної інкубації підраховують кількість колоній бактерій, які виросли на МПА, а на четвертий день - кількість колоній дріжджових і цвільових грибів. Потім визначають їх кількість з розрахунку на 1 мл молока.

Існує шкала оцінки якості молока за кількістю мікробів у 1 мл. До першого класу належить молоко, в 1 мл якого налічується до 500 000 мікробів, до другого - від 500 000 до 4 000 000, до третього - від 4 000 000 до 20 000 000 і до четвертого - понад 20 мільйонів. Якість молока першого класу вважається доброю, другого - задовільною, третього - сумнівною, четвертого - незадовільною.

Для оцінки засіяності молока мікробами часто використовують такий орієнтовний метод, як проба на редуктазу. Мікроорганізми молока в процесі життєдіяльності виробляють ферменти типу редуктаз, які каталізують відновні процеси в молоці. Час, необхідний для відновлення фарби-індикатора, обернено пропорційній кількості мікробів у молоці. Основна різниця між визначенням кількості мікроорганізмів на чашках Петрі і редуктазною пробою полягає в тому, що в першому випадку визначають кількість колоній, а в другому - біохімічну активність мікрофлори молока.

Для визначення колі-індексу кількість бактерій групи кишкових паличок n, які виросли із досліджуваного об'єму молока, множать на 1000 і ділять на цей же об'єм V. Найменша кількість мілілітрів рідини, в якій виявляється хоча б одна клітина E. сoli, називається колі-титром.

Одержані результати визначення колі-титру також дозволяють віднести молоко до якогось із чотирьох класів. Якщо колі-титр становить 10-¹, то таке молоко має добру якість і належить до першого класу. До другого класу відносять молоко, колі-титр якого становить 10-². Дуже забруднене молоко має колі-титр 10-⁶ і належить до четвертого класу.

Робота проводиться за трьома етапами:

На І занятті:

1. Для перевірки сировини на забрудненість бактеріальною мікрофлорою приготувати 100 мл живильного середовища МПА до стерилізації за прописом на товарній ємності. Склад МПА (г/л): м'ясна вода (до 1,0 л), пептон ферментативний - 10,0; натрію хлорид - 5,0; агар-агар - 15,0-20,0; рН=7,3.

2. Для перевірки сировини на забрудненість грибковою мікрофлорою приготувати 100 мл поживного середовища Сабуро (%): сахароза (глюкоза) - 4; пептон - 1; КН₂РО₄ - 0,05; агар-агар - 2-2,5; рН=6,5-7,0.

3. Для перевірки молока на забрудненість ентеробактеріями приготувати до стерилізації 40 мл поживного середовища Ендо (г/л): натрій хлорид - 3,4; натрій сульфіт - 0,8; натрій гідрофосфат - 0,5; б-D-лактоза -10,0; фуксин основний - 0,2; агар-агар - 25,0; рН=7,2-7,6.

4. Підготувати 12 пробірок з водопровідною водою до стерилізації: 4 пробірки по 10 мл, інші - 9 мл.

5. Підготувати 12 чашок Петрі та 15 піпеток на 1 мл до стерилізації.

6. На ІІ заняття принести борошно та молоко, придбане на ринку.

На ІІ занятті:

1. Приготувати розведення досліджуваного борошна та молока (від 1:10³ до 1:10⁴) у простерилізованій водопровідній воді за наступною схемою:

На рисунку надана схема готування розведення і посіву молока та борошна для проведення контролю якості сировини на біотехнологічних виробництвах.

2. Для вбивання вегетативних клітин мікроорганізмів за вище описаною методикою нагрівати проби борошна протягом 10 хв.

3. Розлити 100 мл поживного середовища МПА у 5 стерильних чашок Петрі по 20 мл, дотримуючись правил стерильності.

4. Розлити 100 мл поживного середовища Сабуро у 5 стерильних чашок Петрі по 20 мл, дотримуючись правил стерильності.

5. Розлити 40 мл поживного середовища Ендо у 2 стерильні чашки Петрі по 20 мл, дотримуючись правил стерильності.

6. За методикою зробити засів суспензії борошна та різних розведень молока на поживні середовища МПА, Сабуро.

7. За методикою зробити засів різних розведень молока на поживне середовище Ендо.

8. Під час засіву поживних середовищ залишити відкритими у зоні стерильності дві чашки Петрі із поживними середовищами МПА та Сабуро та попередження появи недостовірних результатів, через обсіменіння з повітря.

9. Дослідні чашки Петрі перенести в термостат.

На ІІІ занятті:

1. Вивчити морфологічні й культуральні властивості мікроорганізмів, які виросли на поживних середовищах МПА, Сабуро та Ендо.

2. Підрахувати кількість колоній при всіх розведеннях на всіх живильних середовищах.

3. Виявити картопляну і сінну палички.

4. Визначити кількість спор у 1 г борошна, та у 1 мл молока.

5. Оцінити якість борошна та молока

Контрольні питання:

1. Які види технологічного контролю здійснюються на підприємствах біотехнологічної промисловості?

2. Опишіть методику змивів з поверхні?

3. Що передбачає контроль якості сировини?

4. Наявність яких мікроорганізмів не допускається у сировині та готових біотехнологічних продуктах?

5. Які в основному мікроорганізми контролюються у молоці та борошні?

6. Які живильні середовища застосовуються для аналізу на бактеріальне та грибне інфікування? За яких температурних умов?

7. Для чого здійснюють розведення проб сировини, наприклад молока або борошна?

8. Для чого борошно, що підлягає мікробному контролю, потребує попередньої температурної обробки?

9. Опишіть методику розведень?

10. Які існують методи підрахунку мікроорганізмів?

Лабораторна робота №7

Тема: Методи виділення та очищення кінцевих продуктів біотехнологічних виробництв.

Мета: Вивчити методи виділення та очищення кінцевих продуктів біотехнологічного виробництва.

Матеріали та обладнання: культуральна рідина Рleurotus ostreatus, культура Blakeslea trispora, центрифуга, сушильна шафа, ацетон, колба Бунзена, фотоелектроколориметр.

Завершальні стадії біотехнологічного процесу - виділення цільового продукту - істотно різняться залежно від того, накопичується продукт у клітині або він виділяється у культуральну рідину, або ж продуктом є клітинна біомаса. Найбільш складним є виділення внутрішньоклітинного продукту. При цьому клітини необхідно відокремити від середовища культивування, піддати їх руйнуванню, а потім цільовий продукт очистити від залишків зруйнованих клітин.

Виділення продукту істотно полегшується, якщо він екскрактується продуцентом у культуральну рідину. Тому однією з первинних завдань біотехнології є створення промислових штамів мікроорганізмів, які виділяють якомога більшу кількість цінних продуктів у значних кількостях.

Технологія виділення та очищення значною мірою визначається природою цільового продукту. У ряді випадків не потребується ретельне очищення продукту: продукт володіє необхідною активністю в неочищеному стані; домішки сторонніх речовин у продукті не надає жодного небажаного впливу при його застосуванні. Деякі традиційні біотехнологічні процеси взагалі виключають етап відділення продукту.

Першим етапом у процесі очищення цільового продукту є поділ культуральної рідини і клітинної біомаси - сепарація. У деяких випадках перед сепарацією відбувається спеціальна обробка реакційної суміші, яка сприяє більш ефективному відділенню біомаси та стабілізації продукту, що виділяється. Застосовуються різні методи сепарації.

Методи сепарації

Флотація. Метод використовується в тому випадку, якщо клітини продуцента через низьку гідрофільність накопичуються у поверхневих шарах вмісту біореактора. Особливі пристрої (флотатори) різної конструкції видаляють піну разом з прилиплими до бульбашок газу клітинами, що утворюється при культивуванні. Підвищення ефективності відбору біомаси досягається спінюванням рідини з подальшим відділенням її верхнього шару механічним шляхом. Достоїнствами методу є його економічність, висока продуктивність і можливість використання у безперервних процесах.

Фільтрація. Застосовуються різні фільтруючі системи (барабанні, стрічкові, тарілчасті фільтри, карусельні вакуум-фільтри, фільтри-преси, мембранні фільтри) засновані на однаковому принципі - затримки біомаси на пористій фільтруючій перегородці. Недоліком способу є налипання клітин на фільтрі, шар яких знижує швидкість протоку рідини в процесі фільтрування.

Центрифугування. Даний спосіб потребує більш дорогого устаткування, ніж фільтрування, тому він застосовується якщо: а) суспензія фільтрується занадто повільно; б) виникає необхідність максимального звільнення культуральної рідини від частинок, що в ній містяться; в) потрібно забезпечити безперервний процес сепарації, коли фільтри розраховані на періодичну дію.

Центрифугування і фільтрацію в деяких біотехнологічних процесах застосовують у комбінації, тобто застосовуються фільтраційні центрифуги, в яких розподіл рідкої і твердої фаз заснований на двох процесах фільтрування та центрифугування.

Методи руйнування клітин

Руйнування клітин проводиться фізичними, хімічними і ферментативними методами. Найбільше промислове значення мають фізичні способи дезінтеграції:

1. ультразвуком;

2. лопатками або вібрацією - метод, зазвичай використовують у пілотних і промислових установках;

3. струшуванням із скляними намистами;

4. продавлюванням через вузькі отвори під високим тиском;

5. роздавлюванням замороженої маси;

6. розтиранням у спеціальних ступках;

7. за допомогою осмотичного шоку;

8. багатократним заморожуванням і відтаванням;

9. стискуванням клітинної суспензії з наступним різким зниженням тиску (декомпресією).

Фізичні способи дезінтеграції відрізняються більшою економічністю у порівнянні з іншими методами, проте вони характеризуються відсутністю вираженої специфічності, внаслідок чого обробка може негативно впливати на якість одержаного цільового продукту.

Відділення та очищення продуктів

Виділення цільового продукту з культуральної рідини або одержаного у результаті процесів дезінтеграції гомогенату зруйнованих клітин здійснюється шляхом осадження, екстракції або різних методів адсорбції.

Осадження розчинених речовин здійснюється фізичними (нагрівання, розведення або концентрування, охолодження розчину) або хімічними факторами, що переводять розчинну речовину в малорозчинний стан. Залежно від мети і властивостей продукту, що виділяється, підбирається той чи інший метод та фактор дії, тобто підбирається реагент і ін.

Екстракція підрозділяється на твердо-рідиннофазну (при якій продукт з твердої фази переходить у рідку) та рідинно-рідиннофазну (коли забезпечується переведення продукту з однієї рідинної фази в іншу, також рідинну фазу). Твердо-рідиннофазна екстракція зводиться часом до простої обробки твердого зразка водою або органічним розчинником з метою вилучення з нього розчинних сполук. Досить широко застосовуються різні органічні розчинники, зокрема екстрагування ацетоном, який ефективно переводить у розчин ряд ліпідних і білкових компонентів клітин.

Адсорбція є досить поширеним методом відділення продукту і розглядається в якості окремого випадку екстракції, при якому екстрагуючим агентом служить тверде тіло. Механізм її зводиться до зв'язування речовини, що виділяється з рідкої або газоподібної фази поверхнею твердого тіла. Традиційними адсорбентами є деревне вугілля, пористі глини та ін.

Більш сучасні методи розділення речовин включають хроматографію, електрофорез, ізотахофорез, електрофокусировку, які засновані на принципах екстракції та адсорбції.

Поділ речовин шляхом хроматографії засновано на їх неоднаковому розподілі між двома фазами, що не змішуються. Розрізняють хроматографію на папері, пластинках і колонках. При хроматографії на папері або на пластинках однією з фаз, що не змішуються, є рухомий розчинник, а іншою (нерухомою фазою) служать волокна паперу або частки покриває пластинку якогось матеріалу (наприклад, силікагелю). При хроматографії на колонках рухомою фазою є розчинник, що протікає через колонку, а нерухому фазу представляє адсорбент, що заповнює колонку (найчастіше це гранульований гель). Хроматографія на колонках допускає масштабування процесу, в результаті чого вона досить широко застосовується в промислових умовах і включає кілька різновидів. Один з них - іонообмінна хроматографія, колонка наповнюється гранулами адсорбенту, які несуть заряджені катіонні (NH₄) або аніонні (SO₄) групи, здатні захоплювати іони протилежного заряду. Даний метод використовується для виділення іонізованих речовин з рідини, а також для очищення нейтральних з'єднань від домішок іонної природи.

Порядок виконання роботи

1. Розглянемо метод відділення - центрифугування у біотехнології на прикладі одержання білкової біомаси базидіального гриба Рleurotus ostreatus з культуральної рідини, після глибинного культивування. Культуру гриба, що виросла в процесі ферментації, відокремити від культуральної рідини центрифугуванням при 5000 об./хв протягом 10 хв у спеціальних сталевих стаканах з фільтрувальною перегородкою, на яку укладається капроновий фільтр. Визначити загальну сиру біомасу вирощеного міцелію Рleurotus ostreatus. Отриманий продукт можна використовувати в сирому вигляді, але він не зберігається. Для зберігання міцелію застосовуються методи обробки сушінням або заморожуванням. Сушіння провести у сушильній шафі при температурі 105⁰С до постійної ваги.

2. Розглянемо метод екстракції на прикладі мукорового гетероталічного гриба Blakeslea trisporа, що являється промисловим продуцентом в-каротину. Метод заснований на екстрагуванні в-каротину з біомаси міцелію грибу ацетоном та визначенні екстинкції забарвленого екстракту на фотоелектроколориметрі. Приготувати розчин двохромовокислого калію, що застосовують як стандарт. 1 мл його за забарвленням відповідає розчину, що містить 0,00208 мг каротину. Близько 0,1 г препарату (сирого міцелію), ретельно розтирають у порцеляновій ступці з дрібним склом або кварцовим піском, додаючи 10 мл етилового спирту. Здрібнену біомасу кількісно переносять у лійку Шотта, куди насипають дрібне скло або кварцовий пісок, відфільтровують і потім багаторазово до повного витягу в-каротину і відповідно до знебарвлення розчину промивають її ацетоном, не допускаючи підсихання осаду на фільтрі. Екстракт з каротином зібрати у колбу Бунзена, а потім перенести у мірну колбу ємністю 100 мл і довести об'єм розчину ацетоном до мітки (розчин А). У випадку інтенсивного забарвлення розчину його треба розбавити у 2 чи більше разів з таким розрахунком, щоб оптична щільність випробуваного розчину була близькою до оптичної щільності стандартного розчину. Оптичну щільність отриманого розчину вимірюють на фотоелектроколориметрі в кюветі товщиною 1 см при довжині хвилі 451 нм.



Рисунок 1. Технологічна схема отримання засівної культури глибинним способом культивування (міцеліальний продуцент) (Грачева І.М., 1987):

1 - вихідна культура продуцента в пробірках; 2 - культура в колбі на сусловому середовищі; 3 - культура на висівках у колбі; 4 - ємність для отримання глибинної культури; 5 - качалка; 6 - холодна кімната; 7 - інокулятор; 8 - фільтри для очищення повітря

Рисунок 2. Технологічна схема отримання засівної культури глибинним способом культивування (бактерійний продуцент) (Грачева І.М., 1987):

1 - пробірки із продуцентом; 2 - матраци із агаризованим середовищем; 3 - колби для засіву; 4 - качалка для колб; 5 - малий інокулятор; 6 - фільтр; 7 - великий інокулятор



Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Рис. 3. Технологічна схема отримання засівної культури поверхневим способом культивування (Грачева І.М., 1987): 1 - вихідна культура продуцента у пробірках; 2 - культура у колбі на висівках; 3 - культура на висівках у банці; 4 - ємність для підігрівання води; 5 - стерилізатор; 6 - ємність для зберігання висівок; 7 - дозатор; 8 - бікс із висівками; 9 - автоклав; 10 - бікс із стерильними висівками; 11 - стьобана ватно-марлева салфетка; 12 - кришка для кювети; 13 - кювета на завантаженні; 14 - стіл; 15 - заповнена кювета; 16 - камера для вирощування; 17 - стілажі; 18 - викидання повітря із калориферу до атмосфери; 19 - фільтри для повітря; 20 - вентилятор; 21 - калорифер; 22 - відбійники; 23 - ручний маніпулятор для завантаження кювет; 24 - готова засівна культура; 25 - стерильний флакон; 26 - забруднена кювета; 27 - ванна для миття кювет; 28 - сушка кювет; 29 - шухляда для стерилізації кювет; 30 - стерильна кювета; 31 - холодна кімната; 32 - ємність для стерилізації та охолодження води; 33 - ємність для поверхово-активної речовини; 34 - дозатор; 35 - ємність для приготування засівної суспензії; 36 - насос

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Рисунок 4. Блок-схема одержання засівної культури міцелію гливи звичайної, поверхневим способом

Рисунок 5. Установка з вертикальними кюветами для вирощування поверхневої культури:

а - Загальна схема:

1 - поворотне коло; 2 - вібраційний стіл для завантаження; 3 - стерилізатор камер; 4 - штовхач; 5 - пристрій для миття камер; 6 - стіл для розвантаження; 7 - коридор з кондиціонерами для вирощування; 8 - транспортер; 9 - зрощувальна камера; 10 - рейковий шлях;

б - Зрощувальна камера;

в-Кювета

Рисунок 6. Апарат для механізованого вирощування мікроорганізмів у товстому шарі середовища:

1 - люк для вивантаження; 2 - вал секції; 3 - опора; 4 - колектор підведення стерильного повітря; 5 - змійовики, що охолоджують; 6 - лопать валу; 7 - колектор відведення відпрацьованого повітря; 8 - кришка; 9 - бобишка манометра; 10 - штуцер; 11 - повітряний клапан; 12 - шестерня приводу вала; 13 - вал; 14 - люк для завантаження; 15 - корпус



Рисунок 7. Схема ферментера із допоміжними пристроями (Беккер, 1974):

1 - корпус ферментера; 2 - вал змішувача із турбінами; 3 - електродвигун із коробкою передач; 4 - сальник вала змішувача; 5 - спіраль теплообмінника; 6 - перфорований барботер; 7 - пристрій для визначення витрати повітря; 8 - фільтр для стерилізації повітря; 9 - повітряний клапан із вентилем регулювання; 10 - уловлювач, наповнений фенолом; 11, 12 - резервуари для стерилізації піногасника та додаткової подачі живильного середовища під час ферментації; 13 - трубопровід для живильного середовища; 14 - вентиль виводу; 15 - вентиль для відбору проб

Рисунок 8. Принципова схема ферментатора (Беккер, 1974):

1 - електродвигун; 2 - редуктор; 3 - муфта; 4 - прокладка; 5 - сальник кришки; 6 - ребра корпусу; 7 - триступеневий змішувач; 8 - тяжі центрування вала змішувача; 9 - теплообмінник; 10 - повітряний барботер; 11 - ложе підшипника; 12 - опора

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Рисунок 9. Принципова технологічна схема глибинного культивування мікроорганізмів (А.А. Світцов, 1986):

1 - змішувач живильного середовища; 2 - стерилізатор у безперервному потоці живильного середовища; 3, 4 - теплообмінники; 5 - інокулятор; 6, 10, 12 - фільтри для очищення повітря; 7 - ферментатор; 8, 9 - насоси; 11 - компресор



Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Рисунок 10. Принципова схема отримання культури мікроорганізму поверхневим способом на твердому середовищі: 1 - бункери; 2 - пристрої для перемішування; 3 - шнек; 4 - циклони для очистки повітря відводу; 5 - вентилятор; 6 - автоматичний дозатор висівок; 7 - стерилізатор сипучих компонентів; 8 - стерилізатор для води; 9 - теплообмінник; 10 - мірник стерильної води; 11 - дозатор; 12 - мірник для концентрованої кислоти; 13 - мірник для розчину соляної кислоти; 14 - ємність для засівної культури; 15 - стіл для завантаження; 16 - кювета; 17 - пересувна етажерка для переміщення кювет; 18 - зрощувальна камера; 19 - кондиціонер; 20 - фільтри тонкого очищення повітря; 21 - фільтри попереднього очищення повітря; 22 - етажерка із готовою культурою; 23 - камера для миття етажерок; 24 - камера для стерилізації етажерок; 25 - кювета на розвантаженні;, 26 - забруднена кювета; 27 - миття кювет; 28 - чиста кювета; 29 - камера для стерилізації кювет; 30 - подрібнювач для готової культури

Список літератури

1. Векірчик К.М. Практикум з мікробіології: Навч. посібник. - К.: Либідь, 2001. - 144 с.

2. Фараджева Е.Д., Федоров В.А. Общая технология бродильных производств. - М.: Колос, 2002. - 408 с.

3. Манаков М.Н., Победимский Д.Г. Теоретические основы технологии микробиологических производств. - М.: Агропромиздат, 1990. - 272 с.

4. Бирюков В.В. Основы промышленной биотехнологии. - М.: Колос, 2004. - 296 с.

5. Биотехнология: Биологические агенты, технология, аппаратура / У.Э. Виестур, И.А. Шмите, А.В. Жилевич. - Рига: Зинатне, 1987. - 263 с.

6. Грачева И.М. Технология ферментных препаратов. - 2-е изд., перераб. и доп. - М.: Агропромиздат, 1987. - 335 с.

7. Сидоров Ю.І., Влязло Р.Й., Новіков В.П. Процеси і апарати мікробіологічної промисловості. - Львів: Вид-во Національного університету «Львівська політехніка», 2004. - 252 с.

8. Елинов Н.П. Основы биотехнологии. Для студентов институтов, аспирантов и практических работников. Изд. фирма «Наука». - С.-Пб., 1995. - 600 с.

9. Биотехнология / М.Е. Беккер, Г.К. Лиепиньш, Е.П. Райпулис - М.: Агропромиздат, 1990. - 334 с.

10. Безбородов А.М. Биотехнология продуктов микробного синтеза - М.: ВО «Агропромиздат», 1991. - 320 с.

11. Бейли Дж., Оллис Д. Основы биохимической инженерии. Пер с англ. в 2-х частях. - М.: Мир, 1989. - 590 с.

12. Биохимические основы микробиологических производств. Никитин Г.А. Учеб. пособие. - 2-е изд., перераб. и доп. - К.: Вища шк., 1992. - 319.

13. Гусев М.В. Микробиология: Учебник для студ. биол. специальностей вузов / М.В. Гусев, Л.А. Минеева. - 4-е изд., стер. - М.: Издательский центр «Академия», 2003. - 464 с.

14. Пирог Т.П. Загальна мікробіологія: Підручник. - К.: НУХТ, 2004. - 471 с.

15. Лысак, В.В. Микробиология: учеб. пособие / В.В. Лысак. - Минск: БГУ, 2007. - 426 с.: ил.

16. Клещев Н.Ф. Общая промышленная биотехнология: Технология бродильных производств: Учеб. пособие / Н.Ф. Клещев, М.П. Бенько. - Харьков: НТУ «ХПИ», 2007. - 200 с. - На рус. яз.

17. Божков А.И. Биотехнология. Фундаментальные и промышленные аспекты. - Харьков: Федорко, 2008. - 364 с.

Размещено на Allbest.ru