Размещено на http://www.allbest.ru/

РЕФЕРАТ

Буханков В.М. разработка методики применения наночастиц серебра для терапии гнойного воспаления у лабораторных животных. Магистерская диссертация 78 с., 12 рис., 2 табл., 47 источников.

НАНОЧАСТИЦЫ СЕРЕБРА, МЕТОДЫ ПРИМЕНЕНИЯ НАНОЧАСТИЦ СЕРЕБРА, РАЗРАБОТКА МЕТОДИКИ, РЭМ - СПЕКТРОСКОПИЯ, ГНОЙНО-ВОСПОЛИТЕНЫЕ ЗАБОЛЕВАНИЯ.

Целью данной работы являлось исследовать и оценить размеры, оптических свойств и агрегативной устойчивости наночастиц серебра в водных растворах и разработать методику по применению наночастиц серебра.

Объектом исследования являлись наночастицы серебра.

В работе был изучен синтез наночастиц с использованием совместного применения физических факторов: ультрафиолетового излучения, ультразвука, равномерного перемешивания. Так же изучены противомикробные свойства антисептического средства на основе коллоидного раствора наносеребра, полученного с использованием технологии диффузионно-кавитационного фотохимического восстановления раствора нитрата серебра. Полученные результаты позволяют сделать вывод о перспективности создания лекарственной и антисептической формы коллоидного раствора с наночастицами серебра с антимикробной активностью по отношению к P. aeruginosa, A. baumanii и E. coli. на основе разработанного способа диффузионно - кавитационного фотохимического восстановления серебра.



СОДЕРЖАНИЕ

противомикробный наносеребро коллоидный раствор

ВВЕДЕНИЕ

1. Литературный обзор

1.1 Наночастицы серебра

1.1.1 Свойства наночастиц серебра

1.1.2 Оптические свойства наночастиц серебра

1.1.3 Квантово-размерные эффекты наночастиц серебра

1.1.4 Поверхностные эффекты наночастиц

1.2 Применение наночастиц серебра

1.2.1 Применение наночастиц серебра в медицине

1.2.2 Терапия в медицине с наночастицами серебра

1.2.3 Применение ультразвука в терапии и хирургии

1.2.4 Применение наначастиц серебра в биологии

1.3 Этиология гнойно - воспалительных заболеваний

1.3.1 Этиология и патогенез абсцессов

2 Основные методы получения наночастиц серебра

2.1 Хемилюминесценция

2.1.1 Качественный анализ

2.1.2 Количественный анализ

2.1.3 Собственное свечение клеток и тканей животных

2.2 Получение наночастиц серебра методом химического восстановления в растворах

2.3. Получение наночастиц серебра методом фотолиза

2.4.Получение наночастиц серебра с помощью лазерного излучения

2.5. Просвечивающая электронная микроскопия

2.6 Растровая электронная микроскопия (РЭМ)

2.6.1 Рентгенофазовый анализ (РФА)

2.6.2 Рентгеноструктурный анализ (РСА)

2.6.3 Дифракционный анализ

3 Материалы и методы экспериментального исследования

Результаты и обсуждения

Заключение

Список использованных источников



ВВЕДЕНИЕ

В современной медицине наносеребро находит весьма разнообразное применение: лечение ран, дезинфекция поверхностей, покрытие имплантов, что объясняется, в том числе широкой аллергизацией [1] населения к лекарственным антибактериальных средствам и достаточно частым развитием различных побочных эффектов при приеме антибиотических препаратов, для лечения различных микробных инфекций, в связи с чем все большее значение приобретают препараты на основе серебра. Разработка эффективных антисептиков с целью снижения риска гнойно - септических осложнений в хирургии продолжает оставаться одной из важнейших проблем в современной медицине, а ионы серебра имеют широкий спектр антимикробной активности и обладают меньшими побочными эффектами, выработка резистентности у бактерий к ионам серебра не обнаружена. С недавнего времени также приобрели актуальность препараты серебра в форме наночастиц, так как они создают депо ионов серебра и позволяют поддерживать равномерное содержание ионов серебра в растворе в течение длительного времени. Кроме того, наночастицы серебра обладают более выраженной антимикробной активностью благодаря иным механизмам воздействия на микробную клетку, чем ионы. Современная фармацевтическая промышленность предлагает целый ряд серебросодержащих препаратов: растворы нитратов серебра, коллоидные взвеси протеинатов серебра, металл-белковые композиции, но их применение ограничивается тем, что оказываемое ими цитотоксическое действие распространяется не только на микробные клетки, но и на клетки макроорганизма. В этом плане перспективным представляется использование наноструктурированных препаратов серебра, так как они эффективны при значительно более низких концентрациях частиц металла.

Особый интерес представляет создание антисептиков для использования при дезинфекции поверхностей, которые найдут широкое применение в различных лечебных учреждениях, а также детских образовательных учреждениях в связи со снижением трудозатрат на частую обработку поверхностей и увеличением эффективности их микробицидного действия. Одним из вариантов оценки антисептической активности является изучение воздействия исследуемого вещества или композиции на условно-патогенные бактериальные штаммы, в том числе E. coli. Отдельного внимания заслуживает то, что в последние годы отмечается отчетливый рост заболеваемости госпитальными инфекциями, возбудителями которых являются неферментирующие грамотрицательные бактерии. Ведущее место в этиологической структуре этих инфекций занимают P. aeruginosa и A. baumanii. Лечение внутрибольничных инфекций, вызванных этими возбудителями, осложнено исходно высоким уровнем устойчивости микроорганизмов к традиционным антибактериальным препаратам, что актуализирует проблему создания новых терапевтических средств.

Сохраняющийся интерес к совершенствованию способов получения наночастиц серебра объясняется несовершенством существующих технологий и попытками улучшения таких свойств получаемого продукта, как стабильность и биоактивность, а также поиском путей для снижения производственных затрат. На сегодняшний день существует множество методов синтеза наночастиц серебра, однако большинство из них используют в своей основе токсичные реагенты, используемые либо для стабилизации получаемых наночастиц, либо для восстановления ионов серебра. В то же время для использования наночастиц в медико-биологических целях необходимо исключить использование токсичных веществ на каком-либо этапе синтеза. Еще одной актуальной проблемой остается устойчивость при хранении образующихся нанокластеров серебра, так как многие из них склонны коагулировать под действием кислорода воздуха и испарения компонентов раствора при хранении и синтезе.

Целью проведенного исследования явилась оптимизация физико-химических условий получения наночастиц серебра для увеличения срока хранения полученных растворов и сохранения возможности их медико-биологического применения, в том числе повышения противомикробной активности коллоидных растворов наночастиц серебра, полученных путем диффузионно-кавитационного фотохимического восстановления, в отношении условно-патогенных штаммов Escherichia coli. и клинических штаммов неферментирующих грамотрицательных бактерий: Pseudomonas aeruginosa и Acinetobacter baumanii.

1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

1.1 Наночастицы серебра

Наночастицы серебра - хорошие антисептики [2]. Благодаря высокой электропроводности они активно используются в производстве товаров широкого потребления - пищевых добавок, одежды, бытовой техники, игрушек. В связи с этим важно выяснить, не вредят ли они здоровью людей и животных. Исследователи из Института общей генетики им. Н. И. Вавилова под руководством Александра Рубановича при содействии коллег из НИИ общей патологии и патофизиологии РАМН и Научно - производственной компании «Наномет» выяснили, что инъекции наночастиц серебра убивают млекопитающих, но ионы серебра безвредны. На рисунке 1 показана картинка наночастицы серебра [3].

Рисунок 1 - Наночастицы серебра

Наночастицы серебра авторы работы получили методом биохимического синтеза путем восстановления ионов металла [4] биологически активным веществом из группы флавоноидов. Начальная концентрация наночастиц в водном растворе составляла 0.54 г/л. Действие раствора сравнивалось с действием ионов Ag+ в эквивалентных концентрациях[5], для чего использовался раствор азотнокислого серебра (начальная концентрация 0.85 г/л).

Молодые экспериментальные мыши, которым делались инъекции растворов серебра в разных формах и концентрациях, были разделены на несколько групп. Животные 30 суток содержались в виварии, где ученые наблюдали за их состоянием и ежедневно вели учет павших. В первые часы после инъекции у грызунов, которым вкалывались наночастицы, снижалась двигательная активность, возникали судороги и паралич задних лапок. Смерть наступала через 12 - 24 часов после введения препарата. Специалисты предположили, что животных губило воздействие нанопрепарата на нервную ткань. Грызуны, которым были введены ионы серебра, остались живы в полном составе, равно как и контрольная группа, которым вкалывали дистиллированную воду. Токсическое действие наночастиц на генетический материал ученые оценивали по количеству патологически измененных спермиев у самцов мышей и степени повреждения ДНК лимфоцитов и других клеток селезенки.

1.1.1 Свойства наночастиц серебра

Свойства коллоидного раствора [6], в том числе и наночастиц серебра, определяются возможностью коагуляции и перекристаллизации, т. е. агрегативной устойчивостью, а также седиментационной устойчивостью и возможностью их окисления кислородом воздуха. Анализ литературных данных показал, что для описания устойчивости нанодисперсии серебра во времени могут быть использованы несколько методов. Метод визуального наблюдения за системой может дать предварительные и общие закономерности относительной устойчивости исследуемой дисперсии. Может быть зафиксировано изменения окраски системы и образования осадка в ней. Для наночастиц серебра цвет систем от красного (желто - коричневого) меняется до серого и даже черного. Визуальный метод наблюдения может сыграть определяющую роль при исследовании седиментационной устойчивости.

Малые размеры наночастиц приводят к многократному увеличению удельной поверхность материалов [7], что способствует транзиту самых различных веществ за счет увеличения адсорбционной емкости. Возрастает химическая реакционная способность и каталитические свойства вещества. На эти параметры прямо влияют также физико - химические свойства [8], включая форму, поверхностную структуру, полярность. Поэтому увеличивается вероятность развития различных процессов внутри отдельных клеточных структур: органелл, биологических мембран, проникновение и контакт с клеточным ядром и ДНК. Во многом цитотоксические свойства наночастиц объясняются их способностью к агрегации внутри клеток [9].

Было найдено [10], что при радиационно-химическом восстановлении ионов Ag+[10] в присутствии наночастиц гетерополисоединений в оптическом спектре возникают полоса золя металла с максимумом при 392 нм и полоса при 650 нм, обусловленная продуктом восстановления («синь»).

Напуск воздуха приводит к окислению «сини», интенсивность полосы наночастиц серебра при этом существенно уменьшается и смещается в длинноволновую область ( = 410 нм). Повторное г - облучение раствора восстанавливает предшествующий спектр поглощения. Указанную процедуру «окисления - восстановления» можно провести несколько раз, при этом достигаются те же оптические эффекты. Таким образом, восстановление гетерополисоединения, составляющего стабилизирующий слой наночастиц серебра, обеспечивает повышение электронной плотности на металлическом ядре, что вызывает увеличение интенсивности полосы поглощения и ее «синее» смещение. Соответственно, окисление приводит к обратному эффекту.

Анализируя спектры поглощения, можно предположить, что появление дополнительной полосы поглощения в длинноволновой части спектра говорит о возможной коагуляции и перекристаллизации, происходящих в системе. Aгрегативную устойчивость можно охарактеризовать при помощи метода электронной микроскопии. Он позволяет получить распределение частиц по размерам и формам, а также дает представление о расположение наночастиц в пространстве (несвязанные, коагулированные).

Согласно теории Ми. Друде (Mie. Drude) положение максимума полосы поглощения поверхностных плазмонов в металле определяется по уравнению:

л²_макс = (2рc)²m(е₀ + 2n)/4рN_еe² (1)

где c - скорость света;

m - эффективная масса электрона;

e - заряд электрона;

е₀ - диэлектрическая проницаемость металла;

n - показатель преломления среды;

Ne - плотность свободных электронов в металле.

Рассеяние света мелкими частицами обусловливает широкий класс явлений, которые можно описать на основе теории дифракции света на диэлектрических частицах. Многие характерные особенности рассеяния света частицами удаётся проследить в рамках строгой теории, разработанной для сферических частиц английским учёным А. Лявом (1889) и немецким учёным Г. Ми (1908, теория Ми). Когда радиус шара r много меньше длины волны света ln в его веществе, рассеяние света на нём аналогично нерезонансному рассеянию атомом. Сечение (интенсивность) рассеяния в этом случае сильно зависит от r и от разности диэлектрических проницаемостей e и вещества шара и окружающей среды: s ~ ln --4r6(e - ) [11]. С увеличением r до r ~ ln и более (при условии e > 1) в индикатрисе рассеяния появляются резкие максимумы и минимумы -- вблизи так называемых резонансов Ми (2r = mln, m = 1,2, 3) сечения сильно возрастают и становятся равными 6pr² рассеяние вперёд усиливается, назад -- ослабевает; зависимость поляризации света от угла рассеяния значительно усложняется.

Рассеяние света большими частицами (r > ln) рассматривают на основе законов геометрической оптики с учётом интерференции лучей, отражённых и преломленных на поверхностях частиц. Важная особенность этого случая -- периодический (по углу) характер индикатрисы рассеяния и периодическая зависимость сечения от параметра r/ln. Рассеяние на крупных частицах обусловливает ореолы, радуги, гало и др. явления, происходящие в аэрозолях, туманах и пр.

Рассеяние средами, состоящими из большого числа частиц, существенно отличается от рассеяния отдельными частицами. Это связано, во - первых, с интерференцией волн, рассеянных отдельными частицами, между собой и с падающей волной. Во - вторых, во многих случаях важны эффекты многократного рассеяния (переизлучения), когда свет, рассеянный одной частицей, вновь рассеивается другими. В - третьих, взаимодействие частиц друг с другом не позволяет считать их движения независимыми.

Как уже отмечалось, свойства у наночастицы серебра на самом деле уникальные.

Во-первых, это феноменальная бактерицидная и антивирусная активность. Об антимикробных свойствах [12], присущих ионам серебра, человечеству известно уже очень давно. Наверняка большинство читателей слышали о целительных способностях церковной святой «воды», получаемой путем прогонки обычной воды сквозь серебряный фильтр. Такая вода не содержит многих болезнетворных бактерий, которые могут присутствовать в обычной воде. Поэтому она может храниться годами, не портясь и не «зацветая».

Кроме того, такая вода содержит некоторую концентрацию ионов серебра, способных нейтрализовать вредные бактерии и микроорганизмы [13], чем и объясняется ее благотворное влияние на здоровье человека. На рисунке 2 представлены вирусы атакующие клетку. Скорость, с которой вирус атакует клетку, превышает скорость пули.

Рисунок 2 - Вирусы атакующие клетку

Установлено, что наночастицы серебра в тысячи раз эффективнее борются с бактериями и вирусами, чем серебряные ионы [14].Как показал эксперимент, ничтожные концентрации наночастиц уничтожали все известные микроорганизмы (в том числе и вирус СПИДа), не расходуясь при этом.

Кроме того, в отличие от антибиотиков, убивающих не только вредоносные вирусы, но и пораженные ими клетки, действие наночастиц очень избирательно: они действуют только на вирусы, клетка при этом не повреждается. Дело в том, что оболочка микроорганизмов состоит из особых белков, которые при поражении наночастицами перестают снабжать бактерию кислородом. Несчастный микроорганизм больше не может окислять свое «топливо» глюкозу и гибнет, оставшись без источника энергии. Вирусы, вообще не имеющие никакой оболочки, тоже получают свое при встрече с наночастицей. А вот клетки человека и животных имеют более «высокотехнологичные» стенки, и наночастицы им не страшны.

В настоящий момент проводятся исследования возможностей использования наночастиц серебра в фармацевтических препаратах. Но уже сейчас они находят огромное количество применений.

Например, фирма «Гелиос» выпускает зубную пасту «Знахарь» с наночастицами серебра, эффективно защищающую от различных инфекций. Также небольшие концентрации наночастиц добавляют в некоторые кремы из серии «элитной» косметики для предотвращения их порчи во время использования. Добавки на основе серебряных наночастиц применяются в качестве антиаллергенного консерванта в кремах, шампунях, косметических средствах для макияжа и т.д. При использовании наблюдается также противовоспалительный и заживляющий эффект.

Ткани, модифицированные серебряными наночастицами, являются, по сути, самодезинфицирующимися. На них не может «ужиться» ни одна болезнетворная бактерия или вирус. Наночастицы не вымываются из ткани при стирке, а эффективный срок их действия составляет более шести месяцев, что говорит о практически неограниченных возможностях применения такой ткани в медицине и быту. Материал, содержащий наночастицы серебра, незаменим для медицинских халатов, постельного белья, детской одежды, антигрибковой обуви и т.д., и т.п.

Наночастицы способны долго сохранять бактерицидные свойства после нанесения на многие твердые поверхности (стекло, дерево, бумага, керамика, оксиды металлов и др.). Это позволяет создать высокоэффективные дезинфицирующие аэрозоли длительного срока действия для бытового применения. В отличие от хлорки и других химических средств обеззараживания, аэрозоли на основе наночастиц не токсичны и не вредят здоровью людей и животных.

Люди всегда искали способы борьбы с инфекциями, передаваемыми воздушно - капельным путем -гриппом, туберкулезом, менингитами, вирусным гепатитом и т. п. Но, увы, воздух в наших квартирах, офисах и особенно в местах массового скопления людей (больницы, общественные учреждения, школы, детские сады, казармы, тюрьмы и т. п.) перенасыщен патогенными микроорганизмами, выдыхаемыми зараженными людьми [15].

Традиционные способы профилактики не всегда справляются с этой проблемой, поэтому нанохимики предложили для ее решения очень элегантный способ: добавить в лакокрасочные материалы, покрывающие стены заведений, наночастицы серебра. Как оказалось, на покрашенных такими красками стенах и потолках не может «жить» большинство патогенных микроорганизмов.

Наночастицы, добавленные в угольные фильтры для воды, практически не вымываются с ней, как это происходит в случае обычных серебряных ионов. Это говорит о том, что срок действия таких фильтров будет несоизмеримо больше, а качество очистки воды возрастет на порядок.

Короче говоря, крошечные, незаметные, экологически чистые серебряные наночастицы могут применяться везде, где необходимо обеспечить чистоту и гигиену: от косметических средств до обеззараживания хирургических инструментов или помещений. При этом, как уверяют ведущие российские ученые в данной области, стоимость средств и материалов, созданных на их основе, будет не намного дороже традиционных аналогов, и с развитием нанотехнологий они станут доступны каждому. Фирма Samsung уже добавляет наночастицы серебра в сотовые телефоны, стиральные машины, кондиционеры и т.д.

1.1.2 Оптические свойства наночастиц серебра

Оптические свойства наночастиц серебра [16] сильно зависят как от характеристик индивидуальных частиц (их размера, формы и состава, наличия и структуры адсорбционных слоёв), так и от их окружения, в т. ч. и от способа пространственного упорядочения частиц. Характерной особенностью спектров поглощения и рассеяния [17] металлических наночастиц размером более 2 нм является присутствие интенсивной и широкой полосы в видимой области или в прилегающих к ней ближних ИК - и УФ - областях. Эту полосу называют полосой поверхностного плазмонного резонанса (ППР) или, реже, полосой резонанса Ми (по имени Густава Ми, внёсшего наиболее заметный вклад в теоретическое объяснение этого явления). Из всех металлов серебро имеет наибольшую интенсивность полосы ППР, у золота и меди она немного слабее. Серебро обладает самым высоким коэффициентом экстинкции в максимуме полосы ППР не только среди металлов, но и среди всех других известных материалов, поглощающих в той же области спектра (т.е. НЧ серебра пропускают свет в этой спектральной области в меньшей степени, чем любые другие частицы такого же размера). Возникновение полосы ППР - это результат взаимодействия падающего на поверхность НЧ света с электронами проводимости металла. Согласно теории электронного газа, электроны внутренних оболочек локализованы вблизи атомного ядра, а электроны внешних валентных оболочек могут свободно перемещаться внутри металлической частицы, и обусловливают, в частности, высокую электропроводность металлов. Под действием переменного электрического поля светового луча подвижные электроны проводимости смещаются. Если размер частицы много меньше длины волны падающего света, то перемещение электронов приводит к возникновению диполя, колеблющегося с частотой возбуждающего электрического поля. Если частота колебаний падающего света совпадает с собственной частотой колебаний электронов проводимости вблизи поверхности частицы, то наблюдается резонансное поглощение и рассеяние света, называемое ППР. Колеблющийся диполь, образовавшийся вблизи поверхности при смещении электронов проводимости, обычно называют поверхностным плазмоном. Для частиц несферической формы или частиц, находящихся в неоднородном окружении, различные ориентации частицы по отношению к падающей световой волне неравноценны. Области положительного и отрицательного заряда, сформировавшиеся вблизи поверхности наночастицы в результате смещения электронов проводимости, вызывают поляризацию окружающей среды, в которой находится частица металла. Такая поляризация приводит к уменьшению величины и частоты колебаний индуцированного диполя и, как следствие, к сдвигу полосы ППР в длинноволновую область. Эти эффекты выражены тем сильнее, чем больше способность окружающей среды к поляризации, т.е. чем больше диэлектрическая проницаемость окружающей среды [18].

1.1.3 Квантово-размерные эффекты наночастиц серебра

Уникальные свойства наночастиц, возникающие за счет поверхностных или квантово - размерных эффектов, являются объектом интенсивных исследований [19]. Особое место в этом ряду занимают магнитные характеристики наночастиц. Здесь наиболее отчетливо выявлены различия (иногда очень существенные) между компактными магнитными материалами и соответствующими наночастицами, что вызывает повышенный интерес специалистов различного профиля. Меняя размеры, форму, состав, строение наночастиц, можно в определенных пределах управлять магнитными характеристиками материалов на их основе.

Размерные эффекты наблюдаются при уменьшении размера структурных элементов: частиц, кристаллитов и зерен ниже некоторой пороговой величины. Такие эффекты появляются, когда средний размер кристаллических зерен не превышает 100 нм, и наиболее отчетливо проявляются при размерах зерен менее 10 нм. Квантовые размерные эффекты проявляются в электронных свойствах вещества или материала и связаны с уменьшением размерности электронного газа, что приводит к изменению энергетического спектра.

Влияние размера частиц на физико - химические свойства [20] вещества можно объяснить наличием поверхностного давления, действующего на вещество. Это дополнительное давление, которое обратно пропорционально размеру частиц, приводит к увеличению энергии Гиббса и, как следствие, повышению давления насыщенных паров над наноцастицами, уменьшению температур кипения жидкой фазы и плавления твердой. Изменяются и другие термодинамические характеристики -- константы равновесия и стандартные электродные потенциалы. Так, при уменьшении размера наночастиц серебра стандартный потенциал пары Ag+/Ag может стать отрицательным, и серебро будет растворяться в разбавленных кислотах с выделением водорода [21].

1.1.4 Поверхностные эффекты наночастиц

Под терминами "поверхность" или "межфазная граница" обычно понимают слой вещества конечной толщины, разделяющий различные объемные фазы. Его толщина определяется теми конкретными свойствами, которые изучаются, и составляет, как правило, несколько атомных слоев вещества. Несмотря на то, что при анализе поверхностных явлений обычно используют модель однородной поверхности, даже в случае наиболее совершенных кристаллов поверхность оказывается сильно неоднородной по структурным, электрическим и химическим свойствам. Современные методы исследования позволили установить, что на межфазных границах даже наиболее качественных кремниевых структур помимо точечных дефектов наблюдаются структурные макродефекты в виде кластеров - небольших скоплений атомов Si и молекул SiO2 , других адсорбированных молекул, химических группировок с локальными концентрациями, значительно превосходящими средние величины по всей поверхности. Указанные неоднородности заметно влияют на электрофизические характеристики тонкопленочных структур [22].

При переходе к нанообъектам или системам, включающим наноструктуры в качестве составных частей, ситуация становится еще более сложной. Если все размеры системы уменьшаются, то число атомов в приповерхностном слое (так называемой S - фазе) становится соизмеримо с количеством атомов в остальном объеме (V - фазе) и известные характерные свойства V - фазы существенно изменяются. Эти изменения обычно называют размерными эффектами. Они могут иметь различную природу. Структурные эффекты проявляются в виде изменения межатомных расстояний, перестройки кристаллической структуры вплоть до перехода в аморфное состояние, при химических эффектах изменяется стехиометрический состав вещества. Наиболее ярко наблюдаются некоторые физические размерные эффекты: изменение температуры плавления, резкое изменение электрофизических свойств [23].

Поверхностные атомы твердого тела или жидкости взаимодействуют с меньшим количеством соседей, чем аналогичные атомы внутри. Например, в кристалле поверхностные атомы образуют меньшее количество химических связей. Поэтому эти атомы имеют высшую энергию, чем средняя энергия атомов в объеме. При увеличении количества поверхностных атомов энергия тела возрастает. Если атомы имеют достаточную подвижность, как, например, в жидкости, то они будут перемещаться так, чтобы попасть в объем. При этом форма, которую занимает жидкость меняться, минимизируя площадь поверхности. В невесомости жидкость стремится сформироваться в шар. В условиях гравитации оптимальная форма капли жидкости может быть несферических [24].

Поверхностная энергия - энергия, необходимой для выполнения работы по увеличению площади поверхности на единицу. Измеряется в Дж/м² или в эрг/см². По физической сущности поверхностная энергия - это избыточная энергия поверхностного слоя на границе двух фаз, обусловленная разницей межмолекулярных взаимодействий в этих фазах.

Поверхностная энергия в термодинамике, избыток энергии в тонком слое вещества у поверхности соприкосновения тел (фаз) по сравнению с энергией вещества внутри тела. Полная поверхностная энергия складывается из работы образования поверхности, т. е. работы, необходимой для преодоления сил межмолекулярного (или межатомного) взаимодействия при перемещении молекул (атомов) из объёма фазы в поверхностный слой, и теплового эффекта, связанного с этим процессом [25].

Поверхностная энергия играет большую роль в формировании структуры нанокомпозитных материалов, т.к. основное преимущество наночастиц - сочетание большой площади поверхности и малого удельного веса. Поэтому необходимо понимать природу сил взаимодействия поверхности, которая позволяет поддерживать наносостояние. Другими словами, необходимо выявить и понять зависимость поверхностной энергии вещества от его площади поверхности.

Доля поверхностных атомов может достигать нескольких десятков процентов; кроме того, развитая поверхность оказывает влияние на решеточные и электронные подсистемы частиц, сильно меняя спектры различных элементарных возбуждений, чувствительных к изменению симметрии и граничных условий. Для наносистем закономерно ожидать резкого возрастания доли именно поверхностной энергии в полном термодинамическом потенциале системы.

Современными учеными проводятся различные эксперименты, позволяющие судить о роли поверхностной энергии в наноразмерных кристаллических объектах [26]. Итогом их исследованием стал вывод о том, что роль поверхностной энергии для наноразмерных систем оказывается гораздо более существенной, чем для массивных объектов, свойства которых определяются в основном объемными вкладами в термодинамический потенциал. Для наночастиц величина поверхностного вклада сравнима по величине с объемным вкладом в энергию системы, что обуславливает уникальные свойства подобных объектов, в частности, описанные в работе размерные эффекты. Особенно интересной является возможность существования состоянием системы с отрицательной поверхностной энергией. Очевидно, что такое состояние системы является, заведомо, нестабильным. При этом можно ожидать резкого изменения адгезионных, структурных и поверхностных свойств вещества [27].

При проведении экспериментов с наночастицами нельзя забывать об окислении если не самих нанокомпозитов то хотя бы внешних слоев, что практически неизбежно. Вопрос об окислении наночастиц представляет собой часть более общей проблемы реакционной способности наночастиц и её количественного сравнения с реакционной способностью соответствующих компактных материалов. Целенаправленных исследований в этом направлении практически нет, имеются лишь отдельные случайные наблюдения.

1.2 Применение наночастиц серебра

Наночастицы не разрушаются при действии длительного облучения. Это их свойство нашло широкое применение в сфере изучения различных биологических процессов и природы явлений. Поэтому, наночастицы могут быть использованы для постоянного контроля динамики процессов в клетках живых организмов от недели до месяца. Одним из наиболее важных направлений, в области применения биомаркеров, является их использование для поиска средств для диагностики рака. Когда наночастицы серебра объединяются с раковыми антителами, раковые клетки становятся «мечеными» и каждая клетка может быть обнаружена с помощью обычного микроскопа, благодаря «усилению» их свойств.

Типичные наночастицы серебра имеют размеры 25 нм. Они имеют чрезвычайно большую удельную площадь поверхности, что увеличивает область контакта серебра с бактериями или вирусами, значительно улучшая его бактерицидные действия. Таким образом, применение серебра в виде наночастиц позволяет в сотни раз снизить концентрацию серебра с сохранением всех бактерицидных свойств. Бактерицидная добавка на основе наночастиц серебра является одним из последних достижений отечественной науки в области нанобиотехнологий.

После длительного использования, терапевтическая ценность синтетических антибиотиков уменьшилась из - за появления устойчивых к ним микроорганизмов. Развитие сопротивляемости микроорганизмов к антибиотикам может произойти из - за непосредственной мутации микроорганизма, а также из - за приобретения частей ДНК от других организмов. Уже на протяжении тысячелетий бактерии и вирусы не способны выработать «иммунитет» к серебру. В то время как серебро полностью безопасно для млекопитающих (в том числе человека), рептилий, растений и всех других живых существ, имеющих многоклеточное строение.

В связи со способностью особым образом модифицированных наночастиц серебра длительное время сохранять биоцидные свойства, рационально использовать наносеребро не в качестве дезинфицирующих средств частого применения, а добавлять в краски, лаки и другие материалы, что позволяет экономить деньги, время и трудозатраты [28].

1.2.1 Применение наночастиц серебра в медицине

В последнее время медицина все чаще рассматривается как одна из наиболее перспективных областей применения нанотехнологий [29]. Сегодня можно констатировать появление нового направления медицинской науки - наномедицины. С ней связывают такие уникальные вещи, как:

лаборатории на чипе;

адресная доставка лекарств к пораженным клеткам;

диагностика заболеваний с помощью квантовых точек;

новые бактерицидные и противовирусные средства;

нанороботы для ремонта поврежденных клеток и многое другое.

Официально наномедицину определяют как «область применения макромолекул и наночастиц для диагностики и лечения болезней, а также репарации (восстановления) поврежденных тканей».

Веками человек искал волшебное средство для избавления от многочисленных болезней и ран. Многие современные исследователи верят, что нанотехнология может стать гигантским шагом человечества к этой цели. Еще одной задачей молекулярной наномедицины [30] является оценка возможного токсического воздействия на организм человека наночастиц или установление его отсутствия. Важно также решить этические проблемы, которые появятся в ходе развития наномедицины. Возможные медицинские достижения, которые станут доступными с помощью нанотехнологии, простираются от диагностики до терапии.

Широкое применение в медицинской практике находят наночастицы благородных металлов, в частности серебра и золота. На рисунке 3 представлены наночастицы серебра.

Рисунок 3 - Наночастицы серебра на подложке

Свойства наночастиц серебра уникальны, для них характерна феноменальная бактерицидная и антивирусная активность [31].В отличие от антибиотиков, убивающих не только вредоносные вирусы, но и пораженные ими клетки, действие наночастиц очень избирательно: они действуют только на вирусы, клетка при этом не повреждается.

Это объясняется тем, что оболочка микроорганизмов состоит из особых белков, которые при поражении наночастицами серебра перестают снабжать бактерию кислородом, поэтому микроорганизм больше не может окислять глюкозу и гибнет, оставшись без источника энергии. Вирусы вообще не имеют никакой оболочки, поэтому погибают сразу. Клетки же человека и животных имеют более «высокотехнологичные» стенки, и наночастицы им не страшны [32].

В Институте нанотехнологий Международного фонда конверсии разработан способ получения наночастиц серебра в коллоидных растворах (коллоидное серебро, наносеребро) и впервые в стране налажено их производство в качестве биоцидного модификатора, а также производство дезинфицирующих средств на их основе для промышленного и бытового применения. Производимая продукция реализуется под маркой «AgБион».

Установлено, что наночастицы серебра являются одним из перспективных дезсредств. Они позволяют бороться не только с такими опасными болезнями, как СПИД, легионеллёз, птичий грипп и другие нетипичные пневмонии, гепатит, туберкулез, но и менее опасными, но широко распространенными и причиняющими большое неудобство людям - сальмонеллёз, кишечные и стафилококковые инфекции (в т.ч. вызываемые кишечной палочкой) и т.д. К действию любого антибиотика микроорганизмы приспосабливаются за 7 - 10 лет. В то же время не обнаружено ни одного случая, когда бы микроорганизмы приспособились к действию наночастиц серебра, поскольку они атакуют микроорганизмы сразу по нескольким направлениям. Наночастицы серебра «AgБион» предназначены:

1 В качестве дезсредства -- для дезинфекции помещений, предметов обстановки, оборудования и т.д.

2 В качестве модификатора - как биоцидная добавка для создания и производства различных материалов и продукции санитарно - гигиенического назначения с биоцидными (в т.ч. антимикробными, противовирусными, противогрибковыми) свойствами.

На рисунке 4 представлен препарат «AgБион»на основе наночастиц серебра. Наночастицы серебра «AgБион» могут использоваться в качестве дезинфицирующего средства, отвечающего самым высоким современным требованиям. В Институте также разработан ряд технологий, позволяющих модифицировать традиционные материалы наночастицами серебра (НЧС) с целью придания им биоцидных свойств.

Рисунок 4 - Препарат «AgБион» на основе наночастиц серебра

Достоинства препаратов "AgБион":

- обладают высокой антимикробной активностью, в т.ч. способны подавлять наиболее адаптированные к внешним воздействиям микроорганизмы (или их видоизмененные формы);

- имеют полный спектр антимикробного действия (бактерии, вирусы, грибы) и подавления патогенной микрофлоры (споры);

-не оказывают деструктирующего влияния на материалы обрабатываемых изделий;

- не содержат хлорсодержащих компонентов;

- обеспечивают безопасность здоровья персонала и пациентов при рекомендуемых режимах обработки;

- экологически безопасны - не загрязняют окружающую среду вредными химическими соединениями.

На основе наночастиц серебра «AgБион» Концерн «Наноиндустрия» наладил выпуск дезсредств нового поколения. Эта продукция предназначена для защиты здоровья людей и животных.

1.2.2 Терапия в медицине с наночастицами серебра

В области терапии наиболее существенным результатом применения наночастиц серебра является решение проблем доставки препаратов и регенерации тканей. Наночастицы серебра позволят врачам:

- доставлять лекарство точно к месту болезни, увеличивая эффективность и сводя к минимуму побочные эффекты;

- обеспечить возможности для контролируемого вывода терапевтических веществ и их метаболитов (продуктов превращения лекарств в ходе естественных процессов обмена веществ в организме);

- могут использоваться для стимулирования врожденных механизмов иммунитета и регенерации (основное внимание здесь сосредоточено на искусственной активации и управлении взрослыми стволовыми клетками).

Aктивно проводятся работы по созданию нанокапсул и наносфер для целенаправленной доставки лекарственных препаратов в организме человека (онкологическая, противогепатитная и анти - ВИЧ - терапия). Лекарства, содержащиеся внутри наночастиц серебра, размер которых в 70 раз меньше, чем красные кровяные тельца, переносятся с током крови к определенному органу, где происходит пролонгированное (постепенное) выделение препарата. Для достижения эффективности лекарства необходимо, чтобы его молекулы попали к нужным клеткам: антидепрессанты - в мозг, противовоспалительные средства - в места воспалений, противоопухолевые препараты - в опухоль и т.д. Способность молекул вещества поступать в теле пациента туда, где они необходимы, называется биологической усвояемостью. Биологическая усвояемость - камень преткновения всей современной фармацевтики.

Сегодня ведутся активные работы по адресной доставке лекарств, которые будут точно попадать в цель, не повреждая других органов. Для доставки лекарственных веществ непосредственно в больные органы и ткани могут быть использованы полимерные наноразмерные капсулы. В настоящее время получены нанокапсулы со средним диаметром от 10 до 5000 нм, включающие матрицу из воска или текстильного волокна и активного вещества.

Указанная структура позволяет обеспечить стабильное выделение лекарства в течение длительного периода и, если в дендримеры будут встроены миниатюрные датчики, постоянный контроль состояния пациента, позволяющий регулировать поступление лекарства.

Обычная бактерия обладает естественной способностью проникать в живые клетки и может работать в качестве «транспортного средства» по доставке лекарств, что открывает новые возможности в области генной терапии. Наночастицы размером от 40 до 200 нм прикрепляют на поверхность бактерии специальными молекулами - линкерами. На одной бактерии можно разместить до нескольких сотен наночастиц, расширив таким образом количество и «типы» грузов, которые нужно доставить.

Одним из направлений развития нанохимии [33] является криохимия. Криохимические методы открывают новые возможности для получения и производства лекарственных препаратов. Биофармацевтическая и терапевтическая активность лекарств зависит от их полиморфной модификации, молекулярной организации, структурной упорядоченности, размера и формы частиц. В настоящее время нанохимия занимается получением структурно -модифицированных (видоизмененных) лекарственных средств. При исследовании различных органических соединений установлено, что в низкотемпературных конденсатах формируются особые неравновесные состояния, на основе которых предложены новые способы производства лекарственных препаратов. Низкие температуры (криомодификация лекарств) позволяют обойтись без использования растворителей и исключают загрязнение окружающей среды.

Наночастицы способны повышать качество имплантантов- биосовместимость, механическую прочность, срок службы (например, для искусственных клапанов сердца).

1.2.3 Применение ультразвука в терапии и хирургии

Давно известно, что ультразвук, действуя на ткани, вызывает в них биологические изменения. Интерес к изучению этой проблемы обусловлен, с одной стороны, естественным опасением, связанным с возможным риском применения ультразвуковых диагностических систем для визуализации, а с другой - возможностью вызвать изменения в тканях для достижения терапевтического эффекта.

Терапевтический ультразвук может быть условно разделен на ультразвук низких и высоких интенсивностей. Основная задача применения ультразвука низких интенсивностей - не повреждающей нагрев или какие - либо нетепловые эффекты, а также стимуляция и ускорение нормальных физиологических реакций при лечении повреждений. При более высоких интенсивностях основная цель - вызвать управляемое избирательное разрушение в тканях.

Первое направление включает в себя большинство применений ультразвука в физиотерапии и некоторые виды терапии рака, второе - ультразвуковую хирургию[34].

1.2.4 Применение наначастиц серебра в биологии

Применение в биологии [35] наночастиц серебра, в настоящее время широко изучается и достаточно высока в отношении различных видов микроорганизмов. Одним из направлений практического использования наночастиц серебра является местное применение, в том числе в лечении и профилактике гнойной инфекции. К числу основных возбудителей последней относится Pseudomonasaeruginosa [36], которая имеет особое значение при внутрибольничных инфекциях благодаря широкому распространению в окружающей среде и способности быстро колонизировать ее объекты с формированием биопленок, а также Escherichiacoli. Данные виды относятся к грамотрицательным бактериям, имеющим в клеточной стенке липополисахаридный компонент, затрудняющий проникновение в клетку ряда веществ, в том числе некоторых антибиотиков. К тому же псевдомонады обладают природной устойчивостью ко многим липофильным антибиотикам (тетрациклинам, хлорамфениколу, ряду фторированных хинолонов) и способны образовывать внеклеточную слизь, которая может служить дополнительным механизмом переживания воздействия неблагоприятных факторов, среди которых нельзя исключить и наночастицы серебра. В формировании биопленки как в условиях макроорганизма, так и вне его одним из стартовых механизмов является адгезия, поэтому возможность прерывания или замедления развития этого процесса под воздействием наночастиц серебра имеет теоретическое и практическое значение.

1.3 Этиология гнойно - воспалительных заболеваний

Постоянное взаимодействие организма животного с внешней средой определяет состояние функций его органов и систем. При воздействии неблагоприятных условий внешней среды или чрезмерно сильных раздражителей развивается реакция, нарушающая корреляцию физиологических функций, что характерно для состояния, называемого болезнью. Различные формы хирургической инфекции являются результатом резко выраженных форм взаимодействия организма животного и микроорганизмов. Чем больше доза и выше вирулентность проникших в организм микробов и чем слабее его защитные силы, тем больше вероятность заболевания. Наоборот, чем сильнее организм, его иммунобиологические возможности и меньше доза, вирулентность микрофлоры, тем меньше опасность развития инфекции. Уменьшение количества случаев гнойных хирургических инфекций, в основном, зависит от повышения иммунобиологических сил организма, уменьшения загрязнения покровов и слизистых оболочек микрофлорой, а также от своевременной хирургической обработки повреждений.

Гнойные процессы вызываются разнообразными микробами: стафилококками, стрептококками, кишечной палочкой, пневмококками, гонококками, синегнойной палочкой и др. Нередко возбудителем гнойного воспаления бывает комбинация микроорганизмов.

Многочисленными авторами в современных условиях признается ведущая роль стафилококков в структуре возбудителей гнойных воспалительных заболеваний. Наиболее часто гнойные процессы вызываются различными видами стафилококков (золотистый, белый и др.), которые широко распространены в природе, развиваются в аэробных условиях, но могут существовать и в анаэробных. Большое количество стафилококков находится на окружающих предметах, что создает условия для инфицирования всякой случайной, даже небольшой ранки, царапины и пр. Стафилококки стойки к химическим и термическим воздействиям. Их жизнедеятельность связана с выделением токсинов, разрушающих форменные элементы крови и ферменты, коагулирующие и разрушающие белки. Вирулентность стафилококков в гное резко повышается, чем объясняется особая опасность заражения ран гнойным отделяемым. Стафилококки чаще вызывают местные процессы; при развитии же общей гнойной стафилококковой инфекции она обычно протекает с метастазами.

Стрептококки также часто служат причиной гнойных процессов. Они широко распространены в природе, не гибнут при высыхании. Большинство стрептококков - аэробы, но есть и анаэробные виды. Вирулентность стрептококков резко повышается в животном организме. Для стрептококков характерна локализация вызванных ими процессов, преимущественно на серозных оболочках, но нередки и другие локализации. Воспаление, развивающееся при внедрении стрептококков, носит серозный характер. Эти бактерии визируют белки и служат причиной как общих, так и местных гнойных процессов. При развитии общей стрептококковой инфекции она редко протекает с метастазами и сопровождается тяжелой гнойной интоксикацией.

1.3.1 Этиология и патогенез абсцессов

Чаще возбудителями инфекции при абсцессах являются стрептококки, стафилококки, кишечная палочка, протей и другие. Возможно наличие смешанной микрофлоры. Из типичных микроорганизмов выявляют анаэробов, клостридий, бактероидов.

В ряде случаев гной, который получен при вскрытии абсцесса, не выявляет наличия микроорганизмов. Часто это говорит об типичном возбудителе, который не растет на обычных питательных средах. Также отсутствие роста возможно на фоне использования антибактериальной терапии.

Пути проникновения микробов и развития абсцессов многочисленны: повреждения кожи (микротравмы), распространение инфекции от первичного очага (инфекционного артрита), нагноение гематомы, кисты, погрешности при введении лекарственных препаратов и выполнении хирургических манипуляций. Например, при введении концентрированных растворов лекарственных препаратов, вакцин и анатоксинов может возникнуть асептический некроз с последующим инфицированием и образованием абсцесса.

При абсцессах любой этиологии пораженные ткани подвергаются гнойному расплавлению с образованием полости. Характерной особенностью абсцесса, отличающей его от других видов воспаления (эмпиемы, флегмоны) является наличие капсулы (пиогенной мембраны) - внутренней стенки гнойной полости, отграничивающей воспаление от здоровых тканей (нормальная защитная реакция организма). Капсула образована грануляционной тканью, она не дает гнойно - некротическому процессу распространяться, и продуцирует экссудат.

Исходом абсцессов может быть их самостоятельное вскрытие. При этом, поверхностно расположенные абсцессы, как правило, открываются на поверхности кожи (при абсцессах в подкожной клетчатке, парапроктите, мастите). Если процесс локализуется глубоко, то он может прорываться в закрытые полости (полость сустава, брюшную, грудную), в просвет полых органов (органы желудочно-кишечного тракта, бронхи, мочевой пузырь и другие). Как правило, после вскрытия абсцесса самочувствие больного несколько улучшается, температура может снижаться, уменьшаются воспалительные изменения в анализах. При хорошем иммунном ответе, инфекционный процесс на этом может завершаться: полость абсцесса уменьшается в размерах, спадается и образуется рубец. Если полость опорожнилась не полностью, то процесс может стать хроническим с образованием свища. Прорыв абсцесса в закрытую полость может вести к образованию нового очага воспаления (перитонит, плеврит, менингит и прочие).

2. ОСНОВНЫЕ МЕТОДЫ ПОЛУЧЕНИЯ НАНОЧАСТИЦ СЕРЕБРА

2.1 Хемилюминесценция

Впервые применение меченых антител в иммуноанализе описали Мiles и Hales в 1968 году. Они показали, что иммунорадиометрические методы, использующие в качестве меток радиоактивные изотопы, должны обеспечить повышение чувствительности и специфичности. Это положило начало интенсивным исследованиям и последующему широкому применению радиоиммуноанализа (РИА) в лабораторной практике. Высокая чувствительность и селективность РИА всем известны, однако, очевидны и его недостатки. Прежде всего - радиоактивность и проблема захоронения отходов. Кроме того, в РИА усложнена стандартизация, так как срок годности наборов зависит от периода полураспада. Это объясняет развитие широкого спектра альтернативных методов, не требующих радиоактивных изотопов и использующих различные физические принципы количественного определения метки.

Хемилюминесценция - это процесс излучения фотонов при переходе электронно- возбужденных продуктов окислительных химических реакций в исходное энергетическое состояние [37]. В таких реакциях выделяется значительное количество энергии и квантовый выход излучаемого света достаточно высок.

Из всех неизотопных методов хемилюминесценция обеспечивает наиболее высокую чувствительность. Для иммунометрических методов чувствительность хемилюминесценции на порядки превосходит чувствительность радиоиммуноанализа.

Математическая модель Экинса (Ekins) позволяет рассмотреть влияние на чувствительность анализа двух переменных: специфической активности меченых антител и неспецифического связывания. При специфической активности, стремящейся к бесконечности, и неспецифическом связывании, стремящемся к нулю, чувствительность метода достигает одной молекулы. Конечно, чувствительность на уровне одной молекулы имеет только теоретический интерес. На практике же важно то, что эта математическая модель определяет основные направления, в которых надо двигаться для достижения максимальной чувствительности: максимальная специфическая активность и минимальное неспецифическое связывание.