Магнитные наночастицы, как средство влияния на релаксационные свойства водородосодержащих биологических сред

Размещено на http://www.allbest.ru/

министерство здравоохранения российской федерации

ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ

ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ

«РОССИЙСКИЙ НАЦИОНАЛЬНЫЙ ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМЕНИ Н.И.ПИРОГОВА»

министерствА здравоохранения российской федерации

Медико-биологический факультет

Кафедра биохимии

ДИПЛОМНАЯ РАБОТА

Чистотиной Елены Анатольевны

«Магнитные наночастицы, как средство влияния на релаксационные свойства водородосодержащих биологических сред»

Специальность-060112 «Медицинская биохимия»

Допущена к защите : " " ____ 2013 г. Работа выполнена:

Кафедра молекулярной Заведующий кафедрой фармакологии и радиобиологии им П.В.Сергеева

биохимии, академик РАМН, МБФ РНИМУ им.Н.И.Пирогова

профессор А.И. Арчаков ___________

Куратор: Научный руководитель:

Вареница А.И. , доцент_ Семейкин А.В. , к.м.н., доцент_

Москва 2013



Оглавление

1. Введение

2. Обзор литературы

2.1 Наночастицы магнетита, их свойства и возможности использования в фармакологии и медицине

2.1.1 Наночастицы магнетита, основные свойства

2.1.2 Магнитные свойства НЧОЖ. Суперпарамагнетизм и ферримагнетизм

2.2 Протонная релаксометрия

2.3 Применение наночастиц магнетита в качестве основы для контрастного средства при МРТ диагностике

2.3.1 Метод МРТ-диагностики

2.3.2 Клиническое применение МРТ

2.3.3 Показаниями для проведения МРТ с контрастным средством

2.3.4 Противопоказания к МРТ

2.4 Классификация магнитно-резонансных контрастных средств

2.5 Взаимодействие наночастиц оксида железа с клетками. Роль стабилизации

3. Материалы и методы

3.1 Методика экспериментального исследования

3.2 Исследуемые соединения и реактивы

3.3 Методика получения суперпарамагнитных и ферримагнитных наночастиц сложного оксида железа

3.4 Просвечивающая электронная микроскопия

3.5 Измерения протонно-релаксационных свойств НЧОЖ

3.6 Клеточная культура фибробластов крысы

3.7 МТТ-тест

3.8 Методы статистической обработки данных

4. Результаты и их обсуждение

4.1 Синтез растворов на основе наночастиц

4.2 Анализ кривых спада времен релаксации

4.3 Оценка влияния соединений железа на жизнеспособность фибробластов МТТ-тестом

Выводы

Список литературы



Список сокращений

SPIO - суперпарамагнитный оксид железа

НЧОЖ - наночастицы оксида железа

ЯМР- ядерно-магнитный резонанс

МРТ - магнитно-резонансная томография

МРВ - магнитно-резонансная визуализация

МРКС - магнитно-резонансные контрастные средства

РЭС - ретикуло-эндотелиальная система

ГЭБ - гемато-энцефалический барьер

РЧИ - радиочастотный импульс

RV- резовист



1. Введение

наночастица магнетит резонансный контрастный

На сегодняшний день невозможно представить современную медицину без лучевой диагностики, включающую в себя протонно-эмиссионную томографию, рентгеновскую и магнитно- резонансную томографию (МРТ). Внедрение в клиническую практику метода МРТ позволило вывести диагностические возможности медицины на качественно новый уровень. За свои работы по изучению магнитно-резонансной визуализации (МРВ) Пол С. Латербур и Питер Менсфилд получили Нобелевскую премию в 2003 году[44].

Оптимизация результатов диагностической картины достигается использованием магнитно-резонансных контрастных средств (МРКС). Визуализация с применением контрастного средства позволяет значительно увеличить объем диагностической информации, позволяя оценивать динамику патологических процессов с необходимыми временными и пространственными разрешениями, повысить разрешение и контрастность при анализе малых объектов, достоверно отличить очаги патологий от здоровых тканей[57]. Основными областями применения контрастных средств являются диагностика и идентификация онкологических образований, в том числе метастазирования, а также заболеваний сердечно-сосудистой системы.

На настоящий момент используются парамагнитные контрастные средства, содержащие гадолиний, имеющие ряд недостатков: токсичность и визуализация объектов только по одному основному параметру Т1(время спин-решеточной релаксации)[26]. В связи с чем, актуальным является разработка нового контрастного средства для МРТ - диагностики, превосходящего по функциональным свойствам уже существующие препараты.

Альтернативным контрастным средством может служить препарат, синтезированный с применением современных нанотехнологий, на основе суперпарамагнитных частиц сложного оксида железа - магнетита. Наночастицы магнитных материалов, с размером частиц соизмеримым с размером магнитного домена, при внесении их во внешнее магнитное поле, выстраиваются в нем без энергетических потерь на междоменное взаимодействие, что позволяет значительно повлиять на характерные времена протонной релаксации исследуемых сред и ключевые параметры для магнитно-резонансной визуализации. Требованием, предъявляемым к новому контрастному средству, кроме достижения необходимых релаксационных свойств, является биологическая совместимость используемых наночастиц с основными тканями организма, а также длительная стабильность водного раствора на их основе[43]. Анализ литературных данных показал, что основные свойства наночастиц, а также растворов на их основе, определяются их размером, который контролируется выбором метода и режимов их синтеза[3]. Необходимо учитывать, что практическое применение принципиально нового контрастного средства может потребовать корректировку существующих МРТ - методик анализа очагов патологий[31].

В связи с выше изложенным, целью данной работы является получение коллоидных растворов, содержащих наночастицы оксида железа различных размеров, и исследование их протонно-релаксационных свойств.

Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

1) Определить режимы метода химического синтеза наночастиц сложного оксида железа с учётом требований к их функциональным свойствам.

2) Определить релаксирующую способность полученных растворов наночастиц оксида железа.

3) Определение цитотоксичности раствора наночастиц сложного оксида железа с помощью МТТ- теста.



2. Обзор литературы

2.1 Наночастицы магнетита, их свойства и возможности использования в фармакологии и медицине

2.1.1 Наночастицы магнетита, основные свойства

Сложный оксид железа - магнетит Fe3O4 (FeO х Fe2O3) относится к классу веществ называемых ферритами, в структуре которого ионы кислорода образуют кубическую гранецентрированную решетку, где на один двухвалентный ион железа приходятся два трехвалентных иона железа[34].В результате образуются две магнитных подрешетки - одна из которых состоит из половины трехвалентных ионов железа, а вторую составляют оставшаяся половина его трехвалентных и двухвалентных ионов( рис.1).

Магнитные моменты подрешеток направлены антипараллельно, поэтому магнитные моменты трехвалентных ионов компенсируются, а моменты двухвалентных образуют спонтанную намагниченность. Материалы с некомпенсированным антиферромагнетизмом относят к классу ферримагнетиков. Магнитный домен магнетита обычно составляет 8 молекул оксида железа, суммарный магнитный момент которого близок к суммарному моменту отдельных ионов. Магнетит характеризуется достаточно высокой температурой Кюри (температура плавления)- 850 К, а при температуре 123 К, в результате изменения кристаллической структуры, магнетит испытывает переход Вервея (переход металл-изолятор)[36].



Рис 1. Строение кристаллической решетки Fe3O4.

-А. Красные шары - O2-, фиолетовый шар - Fe2+.

-Б. Красные шары -O2-, зеленые шары - Fe3+.

-В. Четыре узла А и четыре узла Б формируют элементарную ячейку кристалла магнетита.Г. Взаимная ориентация векторов магнитных спинов ионов Fe3+ и Fe2+. Зеленые шары - Fe3+. Фиолетовый шар - Fe2+.

Четыре узла А и четыре узла Б формируют элементарную ячейку кристалла магнетита.

Согласно законам термодинамики формирование упорядоченной системы требует затрат энергии и связано с уменьшением энтропии, а значит требует воздействий на систему внешних сил и не должно протекать самопроизвольно. Кристаллическая структура магнетита такова, что в результате сложных взаимодействий электрической и магнитной природы, между атомными носителями магнетизма возникает положительная обменная энергия, и становится выгодным параллельное расположение магнитных моментов. В результате возникает некий вектор намагниченности у каждого отдельного домена. При размере наночастиц, сопоставимым с размером домена 5-20 нм, получаем однородно намагниченную однодоменную частицу, обладающую оптимальными магнитными свойствами, вследствии отсутствия междоменного взаимодействия при внесении частицы во внешнее магнитное поле[34]. В случае массивного материала из-за разнонаправленности отдельных доменов их вектора компенсируются и при отсутствии внешнего магнитного поля суммарная намагниченность материала равна нулю. Системы малых частиц магнетита, находящихся в немагнитной матрице, обладают парамагнитными свойствами, а в случае однодоменного состояния -суперпарамагнитными. [6].

Поведение суперпарамагнитных веществ во внешнем магнитном поле существенно отличается от обычных парамагнетиков и ферромагнетиков. При воздействии внешнего поля каждый отдельный магнитный домен принимает тоже направление, что и внешнее поле [37]. В таких системах потери при поглощении и испускании исследуемой средой энергии внешнего магнитного поля сводиться к минимуму, что делает их идеальной основой для магнитно - резонансного контрастного средства при МРТ- исследованиях. Намагниченность суперпарамагнетиков, связанная с поведением спинов отдельных атомов и отсутствия влияния междоменных стенок, в некоторых случаях, во много раз больше намагниченности обычных парамагнетиков. В случае наночастиц магнетита, со средним размером, около 30-50 нм, они обладают ярко выраженными ферримагнитными свойствами, при этом, при попадание во внешнее магнитное поле определенной частоты они, накапливая энергию, нагреваются до пороговой температуры, соответствующей переходу из ферримагнитного состояния в немагнитное. Это свойство ферримагнитных наночастиц магнетита возможно использовать при лечение онкологических заболеваний.

Исследования показали, что поведение наночастиц, при введение их в организм через кровоток, также существенно зависят от размера объекта. Частицы со средним размером 30-50 нм активно поглощаются клетками ретикулоэндотелиальной системы (РЭС) и достаточно быстро накапливаются в печени и лимфатических узлах. В отдельных случаях, с целью увеличения времени циркуляции наночастиц их поверхность специально модифицируют, например полиэтиленгликолем. Однако, наночастицы с размером 5-10 нм, как свидетельствуют публикации, длительно циркулируют в кровотоке и поглощаются в очаге онкологических заболеваний[51]. Обнаружено, что наночастицы размером 5-10 нм обладают возможностью проникновения через ГЭБ, что открывает большие возможности для применения их при диагностики и лечения патологий головного мозга.

Практический интерес представляют суперпарамагнитные и ферримагнитные наночастицы оксида железа. Возможности применения наночастиц магнетита, а также наносистем на его основе, непосредственно опираются на его физические и фармакологические свойства[52].

наночастица магнетит резонансный контрастный

2.1.2 Магнитные свойства НЧОЖ. Суперпарамагнетизм и ферримагнетизм

Суперпарамагнетизм - квазипарамагнитное поведение веществ во внешнем магнитном поле, состоящих из очень малых ферро- или ферримагнитных частиц, слабо взаимодействующих друг с другом, и ведущих себя во внешнем магнитном поле как отдельные атомы[35]. Гистерезис в таких структурах отсутствует. Внешнее поле ориентирует магнитные моменты частиц по полю без изменения направления самих частиц, в то время как, например, у парамагнитных газов магнитные моменты переориентируются вместе с их носителями. Необходимым условием существования суперпарамагнетизма является соизмеримость геометрического размера частицы с размером магнитного домена (3-10 нм), так как при этом удается избежать влияния междоменных стенок (стенок Блоха). Этот эффект возможен только в системах на основе наночастиц. При воздействии внешнего магнитного поля каждый отдельный магнитный домен принимает тоже направление, что и внешнее поле. Отсутствие магнитного гистерезиса приводит к тому, что потери при поглощении и испускании, исследуемой средой энергии внешнего магнитного поля, сводиться к минимуму[55]. Относительное увеличение размера наночастиц таких материалов до 30-50 нм, приводит к наличию у них ярко выраженных ферримагнитных свойств, причем в некоторых случаях наблюдается рост намагниченности таких наночастиц по сравнению с массивным аналогом. Рассматривается возможность использовать такие частицы для осуществления адресной доставки лекарственных средств в очаги заболевания, путем локализации магнитных наночастиц с помощью внешнего магнитного поля, а также для профилактики и лечения онкологических заболеваний[54]. Особый интерес представляет применение ферримагнитных наночастиц в терапевтических методах лечения, связанных с применением стволовых клеток при лечении ими различных заболеваний. С помощью таких наночастиц можно обеспечить доставку клеток в очаги заболеваний, контроль миграции при введение в организм и предварительную сепарацию[51].

2.2 Протонная релаксометрия

При описании ядерной магнитной релаксации пользуются моделью, в которой магнитные моменты, или спины, отдельных ядер составляют в своей совокупности спиновую систему данного вещества. Спиновая система имеет температуру, в общем случае отличающуюся от температуры ее окружения («решетки») или температуры данного вещества. Такая модель позволяет рассматривать два не зависящих друг от друга процесса: обмен энергией внутри спиновой системы (спин-спиновая релаксация) и обмен энергией между спиновой системой и решеткой (спин-решеточная релаксация)[32]. Первый процесс обеспечивает восстановление нарушенного каким-либо образом термодинамического равновесия внутри спиновой системы, тогда как второй процесс -- восстановление термодинамического равновесия между спиновой системой и решеткой. Каждый из этих процессов протекает во времени с некоторой определенной скоростью и характеризуется своей постоянной -- временем спин-спиновой релаксации Т2 и временем спин-решеточной релаксации Т1. Обратные величины этих времен являются мерой скорости соответствующей релаксации, причем всегда [30].

Термодинамическое равновесие в простейшей спиновой системе, состоящей из ядер одного сорта со спинами I=1/2, характеризуется больцмановским распределением населенностей этих ядер по двум спиновым уровням с магнитными квантовыми числами m1=+1/2 и m1=-1/2. Энергии этих спиновых уровней отличаются друг от друга только в том случае, когда спиновая система находится в постоянном магнитном поле. В отсутствие такого поля спиновые уровни вырождены и их энергии имеют одинаковую величину.

Очевидно, что в тот момент, когда вещество помещают в магнитное поле, вырождение снимается, и происходит нарушение больцмановского распределения населенностей уровней и, следовательно, термодинамического равновесия в спиновой системе, поскольку такое распределение не устанавливается мгновенно, а происходит с постоянной времени, равной времени ядерной магнитной релаксации.

Для экспериментального наблюдения ядерной магнитной релаксации применяют методы ядерного магнитного резонанса (ЯМР). В этих методах для нарушения термодинамического равновесия как внутри спиновой системы, так и между спиновой системой и решеткой вещество помещают во внешнее постоянное магнитное поле Но (используя эффект Зеемана энергитичнеский уровень расщепляется). Спустя некоторое время после установления больцмановского распределения населенностей уровней спиновой системы это вещество облучают достаточно мощным импульсом переменного электромагнитного поля, частота которого хо равна частоте ларморовской прецессии ядер :

(1.1)

где -- гиромагнитное отношение ядер, составляющих спиновую систему вещества.

Под действием частоты в спиновой системе происходят энергетические переходы между ядерными уровнями, в результате которых нарушается больцмановское распределение населенностей этих уровней. После прекращения действия импульса, заполненного частотой , спиновая система самопроизвольно возвращается к больцмановскому распределению населенностей уровней или к термодинамическому равновесию за счет процесса ядерной магнитной релаксации. При этом в приемной катушке импульсного спектрометра ЯМР индуцируется электрический сигнал, пропорциональный ядерной намагниченности. Этот сигнал наблюдается с помощью регистрирующих устройств в течение времени сохранения фазовой когерентности между отдельными ядерными магнитными моментами, сравнимого со временем спин-спиновой релаксации.

Собственно процесс релаксации происходит за счет взаимодействий каждого ядерного магнитного момента в спиновой системе с локальным магнитным полем hl (t), которое создается соседними с данным ядром ядерными и электронными магнитными моментами и токами. Величина локального магнитного поля постоянно модулируется (флуктуирует) под влиянием случайного теплового движения молекул и атомов, составляющих решетку данного вещества[47].

Флуктуации локального магнитного поля содержат компоненты многих частот, но процесс ядерной магнитной релаксации вызывает только та компонента, частота которой равна .

Практически все современные методы магнитно-резонансной визуализации (МРВ) или магнитно-резонансной томографии (МРТ) основываются на получении сигнала от ядер водорода живых систем (гиромагнитное отношение протонов 1H=42,58 МГц/Тл). Они широко представлены в любом биологическом объекте в высокой концентрации (относительная распространенность изотопа 99,98%) .

Когда атомные ядра помещаются в магнитное поле, они могут поглощать радиоволны соответствующих частот, зависящих от типа ядер, величины магнитного поля, физического и магнитного окружения ядер, что является основой явления магнитного резонанса, используемого для получения МР-визуализации[56].

Для протонов в магнитном поле существуют два движения прецессии или конуса прецессии, сориентированные вдоль направления силовых линий магнитного поля. Первый - для ядер в состоянии с низкой энергией (стабильное состояние), и другой - в противоположном направлении - для ядер в состоянии высокой энергии (нестабильное состояние).Частота движения прецессии определяется из следующего уравнения, называемого уравнением Лармора[39]:

f = г * Bо

где f - частота Лармора (единица измерения МГц), г - гиромагнитное отношение (единица измерения МГц/Тесла), которое в соответствии с названием является механическим магнитным свойством ядра и зависит от типа ядра, Во - вектор индукции магнитного поля. Реальная живая ткань содержит большое число ядер. Таким образом, мы наблюдаем суммарный эффект от всех микроскопических событий, который эквивалентен одному большому магнитному моменту Мо, величина которого равна сумме величин от индивидуальных ядер, направленных вдоль внешнего магнитного поля Во. Направление и величина этого магнитного момента не изменяются во времени, если на ткань не действует радиочастотный импульс (РЧИ).

После облучения РЧИ соответствующей частоты, суммарная намагниченность протонсодержащего объекта, (М0) отклоняется от своего равновесного положения. Для возбуждения спиновой системы более эффективно воздействие радиоволнами большой интенсивности в короткий промежуток времени (импульсный магнитный резонанс). Частота радиоволн должна быть равна или близка частоте Лармора. Импульс, отклоняющий М0 на 900 в плоскость XY, называется 90-градусным импульсом (1800-РЧИ). При облучении импульсом, как правило, удвоенной длительности, называемым 180-градусным импульсом (1800-РЧИ), намагниченность изменяет свое направление на противоположное, т. е. инвертируется.

При прекращении действия поля 1H спиновая система самопроизвольно возвращается к больцмановскому распределению населенностей уровней или к термодинамическому равновесию за счет процессов ядерной магнитной релаксации[45]. Сигнал, получаемый от объекта в однородном магнитном поле после воздействия РЧИ, называется сигналом затухания свободной индукции (ССИ). Процесс перехода из возбужденного состояния в равновесное называется спин-решеточным (продольным) релаксационным процессом. Он характеризуется временем спин-решеточной релаксации T1. Т1 характеризует постоянную времени, с которой спины протонов стремятся вернуться к направлению магнитного поля. Намагниченность в направлении z, начиная с нуля, за время, равное Т1, достигнет 63% своей конечной максимальной величины. После возбуждения РЧ-импульсами спины ведут себя как когерентная система, т.е. все микроскопические составляющие намагниченности прецессируют в одной фазе вокруг направления внешнего магнитного поля. Однако, в результате статистической неоднородности магнитных полей между спинами происходит потеря фазовой когерентности из-за различия в частотах Лармора. Поскольку спины постепенно расфокусируются, сигнал магнитного резонанса с течением времени уменьшается. Этот процесс характеризуется спин-спиновым (поперечным) временем релаксации T2, т.е. время, за которое намагниченность в плоскости XY теряет 69% от своей первоначальной величины.



Рис. 2. Поперечное время релаксации.

Где MXY - Временная константа, описывающая поведение поперечной намагниченности

Т2- время необходимое для уменьшения поперечной намагниченности с коэффициентом е.

2.3 Применение наночастиц магнетита в качестве основы для контрастного средства при МРТ диагностике

2.3.1 Метод МРТ-диагностики

Магнитно-резонансная томография (МРТ) является одним из современных методов лучевой диагностики, позволяющим неинвазивно получать изображения внутренних структур тела человека. Важнейшим преимуществом МРТ по сравнению с другими методами лучевой диагностики является отсутствие ионизирующего излучения и, как следствие, эффектов канцеро- и мутагенеза, с риском возникновения которых сопряжено (хотя и в очень незначительной степени) воздействие рентгеновского излучения[41]. Устаревшее название метода “ядерно-магнитно-резонансная томография” (ЯМРТ) в настоящее время не используется, чтобы избежать неправильных ассоциаций с ионизирующим излучением. МРТ позволяет проводить исследование в любых плоскостях с учетом анатомических особенностей тела пациента, а при необходимости - получать трехмерные изображения для точной оценки взаиморасположения различных структур[16,17]. МРТ обладает высокой мягкотканной контрастностью и позволяет выявлять и характеризовать патологические процессы, развивающиеся в различных органах и тканях тела человека[49]. Более того, МРТ является единственным методом неинвазивной диагностики, обладающим высокой чувствительностью и специфичностью при выявлении отека и инфильтрации костной ткани[42]. Развитие МР-спектроскопии и диффузионной МРТ, а также создание новых органотропных контрастных препаратов является основой развития “молекулярной визуализации” и позволяет проводить гистохимические исследовании in vivo.

2.3.2 Клиническое применение МРТ

Исторически первым применением МРТ было исследование головного мозга, открывшее новые горизонты в диагностике неврологических заболеваний[57]. МРТ оказалась единственным методом, позволяющим визуализировать бляшки рассеянного склероза и определить наличие активной воспалительной демиелинизации[40]. На сегодняшний день МРТ стала основным методом нейровизуализации[38], оттеснив на второй план КТ. Современные методики МР-обследования головного мозга, доступные на высокопольных томографах, позволяют получить информацию о кровотоке на капиллярном уровне, количественно оценить движение молекул воды через мембраны клеток , определить концентрацию метаболитов, таких как N-ацетиласпартат, лактат, холин, мио-инозитол, в веществе мозга или измерить pH ткани мозга визуализировать ход проводящих путей головного мозга, картировать функциональные зоны коры головного мозга. Основным преимуществом МРТ в травматологии и ортопедии по сравнению с рентгенологическим исследованием и КТ является возможность визуализации мягкотканных структур, в том числе внутрисуставных связок, менисков, синовиальных складок. В целом ряде исследований было показано, что МРТ позволяет выявлять инфильтрацию и деструкцию костной ткани, замещение костного мозга задолго до появления рентгенологических (в том числе КТ) признаков. По этой причине МРТ является методом выбора для ранней диагностики аваскулярного некроза головок бедренных костей, стрессовых и рентгенологически скрытых переломов[46].

МРТ органов брюшной полости может проводиться только на высокопольных томографах, причем наилучшее качество томограмм достигается при томографии с задержкой дыхания . МРТ является методом выбора для дифференциальной диагностики образований паренхиматозных органов брюшной полости и забрюшинного пространства.

В настоящее время МРТ является наиболее информативным методом в диагностике и дифференциальной диагностике очаговых поражений печени - метастазов, гемангиом, аденом, фокальной узловой гиперплазии, печеночно-клеточного рака и других опухолей. МРТ позволяет с высокой точностью дифференцировать злокачественные и доброкачественные образования надпочечников с помощью специальных протоколов, высокочувствительных к наличию внутриклеточного жира в аденомах. МРТ хорошо выявляет солидные и кистозные опухоли поджелудочной железы. Применение МРТ в урологии существенно расширило возможности предоперационной дифференциации атипичных кист и кистозных опухолей почек, определения стадии рака почки, выявления инвазии почечной вены опухолью почки[46].

Применение эндокавитарных датчиков (в том числе эндоректальных) впервые позволило визуализировать при МРТ капсулу предстательной железы, целостность которой является одним из основных критериев операбельности пациента с раком предстательной железы.

Возможности МРТ в акушерстве и гинекологии пока еще недооценены в России представителями соответствующих клинических специальностей, в первую очередь в силу высокой информативности и распространенности УЗИ. Вместе с тем уже доказано, что МРТ должна использоваться для определения стадии рака эндометрия и шейки матки (эндоректальные датчики), дифференциации миомы и аденомиоза, предоперационной оценки миом матки, уточнения характера врожденных аномалий матки.

Диагностические возможности МР-ангиографии наиболее широко раскрываются при обследовании сосудов виллизиева круга, синусов головного мозга , сонных артерий, грудной и брюшной аорты. МР-ангиография сосудов головы и шеи может проводиться без введения контрастного вещества и является рекомендуемым исследованием перед хирургическим вмешательством на внутренних сонных артериях (рис. 6)[46].

При исследованиях сердца МРТ стала эталонным методом оценки сократительной функции миокарда, объемов камер сердца и массы миокарда. С помощью методики кино-МРТ возможна оценка функции клапанов, а посредством фазово-контрастной МРТ можно проводить количественную оценку кровотока в камерах сердца и сосудах. МРТ конкурирует с радионуклидными методами в изучении перфузии и жизнеспособности миокарда. Перспективной является методика МР-коронарографии.

2.3.3 Показаниями для проведения МРТ с контрастным средством

Основными показания для проведения магнитно-резонансной томографии с контрастом являются[48]:

· Опухоли спинного мозга(глиомы, астроцитомы, глиобластомы)

· Опухоли головного мозга( менингиомы, невриномы)

· Опухоли печени

· Рак молочной железы

· Аденомы гипофиза

· Необходимость определения активности рассеянного склероза

· Инфаркты миокарда (для определения точного размера ишемии)

· Дегенеративные поражения позвоночника

Это далеко не весь перечень показаний для проведения магнитно-резонансной томографии с контрастом. МРТ контрастирование применяется и во многих других случаях, если специальные методики проведения данной процедуры, такие как МР-артрография. Эти методы более сложны в проведении и проводятся только по особым показаниям. На сегодняшний день существует несколько основных способов проведения магнитно-резонансной томографии с контрастом:

· В первом случае препарат вводится однократно внутривенно непосредственно перед началом сканирования из расчета, в зависимости от контраста, в среднем 0.2 мг на 1 кг массы тела пациента.

· Второй способ заключается в введении препарата внутривенно капельно. При этом специальный дозатор синхронизирует дозу вводимого препарата с ходом выполнения сканирования. Такой метод называется болюсное контрастирование и применяется при проведении динамической МРТ с контрастом.

2.3.4 Противопоказания к МРТ

Противопоказания к МРТ связаны с воздействием магнитного поля и радиочастотного (неионизирующего) излучения. К абсолютным противопоказаниям относятся:

- наличие у пациента искусственного водителя ритма (может перейти в асинхронный режим работы под воздействием градиентного магнитного поля)

- наличие внутричерепных ферромагнитных гемостатических клипс (при смещении может произойти повреждение сосуда и кровотечение)

- наличие периорбитальных ферромагнитных инородных тел (при смещении может произойти повреждение глазного яблока)

- выраженная клаустрофобия.

У этих пациентов обследование методом МРТ запрещено. К относительным противопоказаниям относятся первый триместр беременности, застойная сердечная недостаточность. Большинство медицинских устройств является условно совместимыми с МРТ. Это значит, что обследование пациентов с установленными стентами, внутрисосудистыми катушками, фильтрами, протезами сердечных клапанов может проводиться при наличии клинических показаний по согласованию со специалистом по лучевой диагностике на основе информации компании-производителя о характеристиках металла, из которого изготовлено установленное устройство. Имеющийся клинический опыт позволяет утверждать, что в подавляющем большинстве таких случаев МРТ абсолютно безопасна для пациентов.

2.4 Классификация магнитно-резонансных контрастных средств

МРКС- неотъемлемая часть клинической МРТ, позволяющая значительно увеличить объем диагностической информации-оценивать динамику патологических процессов с необходимыми временными и пространственными разрешениями.

Наиболее доступным, безопасным и широко используемым способом изменения контрастности тканей и органов при МРТ остается изменение времен спин-спиновой Т2(1/Т2) и спин-решеточной релаксации Т1(1/Т1) протонов с помощью парамагнитных веществ. Парамагнитные хелатные комплексы, составляющие основу большинства современных МРКС, повышают скорость релаксации как 1/Т1, так и 1/Т2.

По преимущественному влиянию на время релаксации парамагнитные вещества разделяют на преимущественно влияющие на Т2 или Т1. Так, например, магневист целый класс наиболее широко используемых гадолинийсодержащих[19] МРКС влияют на Т1, увеличивая интенсивность магнитно-резонансного сигнала тканей-мишеней, «осветляя» область интереса на Т1-взвешенных изображениях, благодаря укорочению Т1. А супермагнитные и ферромагнитные частицы, обладая большим магнитным моментом, индуцируют локальные неоднородности поля, уменьшая тем самым преимущественно Т2. При этом получают негативное усиление, то есть они делают область накопления препарата более темной, что наиболее ярко проявляется на Т2-взвешенных изображениях[53].

МРКС можно классифицировать в зависимости от особенностей их распределения в тканях и органах. Данные о фармакокинетике МРКС свидетельствуют о целесообразности деления их на внеклеточные (тканенеспецифические) и внутриклеточные, или органотропные (тканеспецифические). Внеклеточные МРКС уже достаточно давно (с 1988 года) широко применяют при проведении МРТ. Тканеспецифические внутриклеточные (резовист, примовист) начали применять лишь в последние 10 лет.

1) Внеклеточные препараты (внутрисосудистое или полостное введение). Имеют небольшую молекулярную массу, распределяются во внеклеточном пространстве[53].

-Т1 (позитивные) вещества -Gd-DTPA и другие хелатные комплексы парамагнитных веществ

-Т2 (негативные) вещества-Dys-DTPA (диэтилтриаминпентаацетат диспрозия), Dys-DTPA-BMA (диэтиламинтрипентаацетат бисметиламид диспрозия) .

1.1. Длительно циркулирующие в крови вещества вследствие обратимого связывания с сывороточными альбуминами.

-Т1 (позитивные) вещества - гадоверсетамид(вазовист)

1.2. Ангиографические макромолекулярные вещества для количественного определения объема и скорости тока крови, маркеры дисфункции капиллярной системы.

-Т1 (позитивные) вещества - комплексы Gd-DTPA( других парамагнитных Т1-позитивных веществ) с декстраном, альбумином или полилизином, инкапсулированные в липосомы.

-Т2 (негативыне) вещества - хелатные комплексы диспрозия, ковалентно связанные с альбумином.

2) Тканенеспецифические препараты, распределение которых связано с взаимодействием с клетками.

2.1. Гепатотропные вещества(внутривенное введение), поглощающиеся преимущественно гепатоцитами.

-Т1 (позитивные) вещества - Gd-EOB-DTPA(диэтиламинотрипентаацетат этоксибензил гадолиния, примовист), Gd-BOBTA(гадобенат димеглюмина, мультиханс).

-Т2 (негативные) вещества- суперпарамагнитные частицы оксиды железа.

2.2. Вещества, специфически накапливаемые ретикуло-эндотелиальной системой - в печени, селезенке, лимфатических узлах, костном мозге.

-Т1 (позитивне) вещества-липосомы, содержащие парамагнитные Т1-вещества( в клинику не внедрены).

-Т2 (негативные) вещества- суперпарамагнитные частицы оксида железа, например резовист.

2.3. Вещества, накапливаемые поджелудочной железой.

-Т1 (позитивные) вещества- мангафодипир

2.4. Опухолеспецифические вещества.

-Т1(позитивные) вещества- моноклональные антитела, пептиды(гормоны, медиаторы), соматотропин и другие вещества, связанные с небоьшими комплексами парамагнитных Т1-веществ.

- Т2 (негативные) вещества- те же бионосители, связанные с небольшими комплексами парамагнитных веществ, влияющих на Т2

2.5. Вещества, накапливающиеся в калицификатах.

-Т1(позитивные) вещества- дифосфонат Gd-DTPA.

Ниже представлена классификация основных МРКС, имеющихся в настоящее время (рис. 3).



Рис.3. Классификация контрастных средств



Таблица 1.

МР-контрастные средства, зарегистрированные и разрешенные к клиническому применению в России

Коммерческое название	Химическое название	Производитель
Магневист (Magnevist)	Gd-DTPA-димеглюмин (гадопентат-димеглюмин)	Bayer Schering Pharma AG (Германия)
Гадовист (Gadovist)	гадобутрол	Bayer Schering Pharma AG (Германия)
Дотарем (Dotarem)	Gd-DOTA-меглюмин	Guerbet Франция
Примовист (PRIMOVIST)	Gd-EOB-DTPA (динатрия гадоксетат)	Bayer Schering Pharma AG (Германия)
Омнискан (Omniscan)	Gd-диамид	Nykomed Норвегия
Оптимарк (OptiMARK)	Гадоверсетамид	MALLINCKRODT CHEMICAL, Ltd

2.5 Взаимодействие наночастиц оксида железа с клетками. Роль стабилизации

Низкая токсичность - одно из определяющих свойств лекарственного средства. Способов вызвать токсический эффект у наночастиц, например железа, больше, чем у растворимых веществ. Кроме токсичности, присущей веществам, входящим в состав наночастицы, токсичность может быть связана с размером, формой, свойствами поверхности наночастицы. Наночастицы обладают высокоразвитой активной поверхностью и, как следствие, высокой сорбционной емкостью. Благодаря своим размерам (менее 100 нм), сопоставимым с размерами клеток (10--100 мкм), вирусов (20--450 нм), белков (5--50 нм), ДНК (2 нм шириной, 10--100 нм длиной), наночастицы могут приближаться к биообъекту, взаимодействовать и связываться с ним[29].

Для биомедицинского применения наночастиц необходимо выполнить ряд требований: образовать устойчивую коллоидную систему в водных растворах и других биосовместимых растворителях, иметь возможность вариации параметров раствора (концентрации солей, рН и температуры) в интервалах, которые определяются целью исследования в каждом конкретном случае. Однако ввиду высокой реакционной активности для наночастиц практически не существует инертной среды. Одной из особенностей поведения наночастиц в растворе является их склонность к агрегации, поэтому практическое использование растворов наночастиц сопряжено с их стабилизацией (нанесение покрытия на поверхность магнитного «ядра», добавление стабилизаторов, подбор растворителей и т.д.)[27].

Применяемые покрытия можно разделить на органические (сурфактанты и полимеры) [1,20] и неорганические (кремнезем, углерод, благородные металлы)[8,]. Наиболее распространенными органическими покрытиями наночастиц являются декстран, полиэтиленгликоль (ПЭГ), крахмал, поливинилэтанол, гепарин, высшие карбоновые кислоты, в том числе лимонная кислота[10,11,14,25,26].

Помимо защиты от агрегации, окисления, кислотной и щелочной коррозии покрытие может играть роль спейсера для присоединения фармацевтических агентов или биомолекул к магнитному носителю. Благодаря покрытию можно модифицировать поверхность наночастиц различными функциональными группами -- азидо-, амино-, карбоксильными, сульфгидрильными, гидроксильными, имидными и другими, что позволяет ковалентно связывать наночастицы с биомолекулами или лекарственными средствами[2]. Образование ионной связи наночастиц с противоопухолевыми препаратами может быть достигнуто в результате нанесения на наночастицы (уже покрытые полимером с целью стабилизации коллоидного раствора) второго слоя полимеров, поли-DL-лактид-ко-гликолида (PLGA), полилактида (PLL) или дендримеров[9]. Дополнительной важной функцией покрытия наночастиц является повышение их биосовместимости.

Так, показано, что покрытие декстраном препятствует опсонизации магнитных наночастиц клетками ретикулоэндотелиальной системы при введении их в кровоток[23,13]. Поверхностная модификация ПЭГ снижает поглощение наночастиц макрофагами и благодаря наличию полярных и неполярных группировок способствует эффективному проникновению через мембрану клетки.

Такой стабилизатор как лимонная кислота не обладает сильными поверхностно-активными свойствами, так как мала СН цепочка, но приемлема с биологической точки зрения, так как данная кислота-участник цикла Кребса, что способствует ускорению биохимического метаболизма. Также показано, что лимонная кислота обладает низкими токсическими свойствами.

Важно отметить, что иммобилизация на поверхности наночастицы приводит к стабилизации биомолекул и служит защитой от деградации их под воздействием различных факторов. Показано, что ДНК, иммобилизованная на поверхности наночастицы[28], сохраняет свою стереометрию и устойчива к действию нуклеаз[5,7]. При иммобилизации белков и ферментов на магнитных частицах их стабилизация достигается главным образом за счет стабилизации конформационной структуры и за счет предотвращения ферментативной деградации[8,15]. Благодаря малым размерам соединение с наночаcтицей не приводит к денатурации белковых молекул, что очень важно для сохранения функциональной активности и аффинитета к мишени, например при нацеливании посредством антител[12]. При поиске МРКС исследователи обратили внимание на наночастицы оксида железа, обладающие достаточной контрастирующей способностью. Среди железосодержащих МРКС выделяют: SPIO - суперпарамагнитный оксид железа; USPIO - суперпарамагнитный оксид железа в виде ультрамалых частиц и MIOH - монокристаллический оксид железа.

Препараты SPIO (Fe23+O3) имеют кристаллическую структуру и сильно ускоряют протонную релаксацию тканей. Диаметр частиц SPIO меньше эритроцита, что позволяет им проникать через капиллярную сеть. Разработанные препараты SPIO имеют необходимые величины заряда и размера для избирательного поглощения клетками ретикуло-эндотелиальной системы (РЭС). После деградации SPIO и РЭС атомы железа включаются в состав гемоглобина эритроцитов. Количество железа, поступающего в организм в составе SPIO при диагностике, значительно ниже общей величины депо железа.

Препараты SPIO относятся к тканеспецифическим МРКС, имея тропность к РЭС и позволяя контрастировать важные органы человеческого организма( печень, селезенка, костный мозг).



3. Материалы и методы

3.1 Методика экспериментального исследования

Цель работы: является получение и исследование протонно-релаксационных свойств коллоидных растворов наночастиц оксида железа различных размеров.

Задача работы №1 Определить режимы метода химического синтеза наночастиц сложного оксида железа с учётом требований к их функциональным свойствам		Задача работы №2 Исследование влияния полученных растворов наночастиц сложного оксида железа на протонно-релаксационные параметры различных биологических средах.		Задача работы №3 Определение цитотоксичности раствора наночастиц сложного оксида железа

Методы, используемые для решения данной задачи Реакция Элмора (получение раствора НЧОЖ), центрифугирование (отделение крупных частиц от мелких), просвечивающая электронная микроскопия		Методы, используемые для решения данной задачи Протонная релаксометрия		Методы, используемые для решения данной задачи МТТ- тест.

3.2 Исследуемые соединения и реактивы

- МТТ - тиазолий синий тетразолий бромид («ДиаэМ», Германия)

- Раствор ВЕРСЕНА («ПанЭко», Россия)

- Раствор трипсина 0,25% («ПанЭко», Россия)

- Среда DMEM/ cNa2CO3 («ПанЭко», Россия)

- Сыворотка крови эмбриональная телячья («ПанЭко», Россия)

- НЧОЖ (Образец в состав которого входят частицы железа размеров 50-60нм). Частицы получены на кафедре молекулярной фармакологии и радиобиологии им. Академика П.В.Сергеева МБФ

- Резовист(RV)-железосодержащее контрастное средство, предназначенное для диагностики печени со средним размером частиц 30-50 нм.

- Лимонная кислота- C6H8O7

- Цитрат натрия- Na3C6H5O7

- Н2О-дистиллированная вода

- раствор хлорида железа II

- раствор хлорида железа III

- раствор солей Fe (II) и Fe (III)

- аммиак- NH3

3.3 Методика получения суперпарамагнитных и ферримагнитных наночастиц сложного оксида железа

Анализируя последние литературные данные, а также прослеживая прогресс, достигнутый за последние десять-пятнадцать лет, можно сказать, что проведение химических реакций в растворах представляет собой один из наиболее удобных путей для получения магнитных наночастиц. Формирование наночастиц достигается путем подбора определенных условий протекания реакции (тип реакции, растворитель, температура) и использованием лигандов и поверхностно-активных веществ, специфически ведущих себя на возникающей границе раздела фаз и полностью или частично ограничивающих дальнейший рост твердой фазы[33].

Предлагаемый нами в качестве действующего вещества сложный оксид железа - магнетит (Fe3O4) был получен химическим методом при осаждении магнетита щелочью из водного раствора солей двухвалентного железа в строго выбранных условиях таким образом, чтобы размер частиц в коллоидном растворе не превышал 5 - 9 нм. В качестве основной химической реакции, для получения наполнителя магнитной жидкости выбрана реакция Элмора[6], при этом исходные реактивы представляют собой соли трех и двух валентного железа:

2 Fe Cl 3 + FeCl 2.+ 8 NH 4 OH Fe 3 O 4 + 8 NH 4 Cl + 4 H 2 O

FeSO4*4 H2O в количестве 3 г растворяли в 12,5 мл воды и 6 г FeCl3*6H2O в 12,5 мл воды, каждую по отдельности в течении 15 мин. интенсивно перемешивая. Затем оба раствора перемешивали в течение 1 часа с рекомендуемой скоростью 800 об/мин. Аммиак добавляли со средней интенсивностью в количестве 25 мл, в течение 15 мин интенсивно перемешивая. Затем добавляли стабилизатор- цитрат натрия в концентрации 2,4мг/мл.

3.4 Просвечивающая электронная микроскопия

Размер и дисперсный состав наночастиц определялся на микроскопе высокого разрешения JEOL JEM-1011, являющегося наиболее оптимальным для исследования наночастиц такого размера (5-20 нм) с последующей обработкой данных.

3.5 Измерения протонно-релаксационных свойств НЧОЖ

Мы изучали времена спин-спиновой релаксации (Т2) протонов в образцах на ЯМР-релаксометре РС-120 фирмы «Брукер».



Рис. 4. Ямр-релаксометр серии minispec mq фирмы «Брукер».

ЯМР-релаксометр для измерения времён релаксации Т1 и Т2 в биологических жидкостях в составе:

1. Управляющий электронный блок с высокочастотным передатчиком.

Качественные характеристики:

- закрытая, не требующая обслуживания система с воздушным охлаждением, с экранированием от электромагнитных помех, со светодиодной индикацией для диагностики подключения и напряжения на блоке питания

- встроенный центральный процессор с возможностью управления в режиме реального времени, динамическое ОЗУ и флэш-ПЗУ для встроенного ПО

- 10 Мб Ethernet адаптер для соединения с локальным ПК и загрузки встроенного ПО. Полностью удаленный контроль с помощью ПО.

- прямой цифровой радиочастотный генератор и импульсный программатор, частотный диапазон 2-65 MHz, с шагом 1 Hz. Восемь свободных программируемых вспомогательных импульсных каналов. Генерация 0°, 90°, 180° и 270° импульсов, с фазовым разрешением лучше, чем 0.2°

- возможность внешнего включения/выключения

2. Магнитная закрытая система на базе магнита частотой 20 МГц, 470 мТл, с внутренней воздушной циркуляцией и автоматизированной системой поддержки температуры 35-45 Сє, точность поддержания температуры лучше чем 0.01 Сє

- быстрая смена измерительных датчиков

- автоматическое распознавание измерительных датчиков

- автоматическое распознавание ампулы с образцом

- расстояние между полюсами магнита 33 мм

- возможность работы с измерительными датчиками 1H и 19F

3.Измерительный датчик:

- Измерительный датчик на 1H, для магнитной системы 20 МГц, для относительных измерений, позволяющий работать с пробирками диаметром 10 мм.

-датчик поставляется со специальными проверочными образцами для тестирования их работоспособности и настроек прибора.

4. Лицензионное программное обеспечение.

ПО должно позволять управлять магнитными системами, осуществлять их тестирование, программировать импульсные последовательности, сохранять их, с возможностью использовать в дальнейшем, строить калибровки и зависимости, выводить на экран результаты, создавать и печатать протоколы результатов анализа, контролировать и управлять периферийными устройствами.

Методика измерений - импульсная последовательность КПМГ(90°-(ф-180°-ф)n). Кривые спада измерялись в 10 точках (временной диапазон 0,3-30млсек). Накопление сигнала 4 - кратное. Времена спин-решеточной релаксации измерялись с помощью импульсной последовательности -( 180°-ф-90°), количество точек - 10.



3. .Клеточная культура фибробластов крысы

Для оценки цитотоксичности исследуемых соединений были выбраны фибробласты теменной кости крысы. Фибробласты легко поддаются культивации in vitro и являются стандартным объектом при доклинических испытаниях[21].

Для получения культуры извлекали в асептических условиях ламинарбокса теменную кость новорожденной крысы, измельчали стерильными ножницами на фрагменты 1- 2мм3 . Затем среду с фрагментами ткани наносили на дно плоскодонных культуральных пластиковых флаконов «Costar» Использовали стандартную среду DMEM с добавлением 20% ермоинактивированной эмбриональной телячьей сыворотки, L-глутамина в концентрации 100 мкг/мл и антибиотика - гентамицина сульфата - в концентрации 40 мкг/мл.

Через неделю наблюдали образование на поверхности флакона участков клеточного монослоя, растущего из прикрепленных фрагментов. Клетки для равномерного распределения подвергали обработке трипсином и еще через 1 неделю получали монослойную культуру (рис.9)

Рис.5. Монослойная культура клеток нормальных фибробластов

Культивирование клеток осуществлялось в пластиковых флаконах в стерильных условиях, клетки инкубировались при 37єС в условиях 5% СО2. При культивировании клеток использовали стандартную среду DMEM с добавлением 20% термоинактивированной эмбриональной телячьей сыворотки, L-глутамина в концентрации 100 мкг/мл и антибиотиков - гентамицина сульфата и стрептомицина сульфата - в концентрации 40 мкг/мл.

Работа с клетками производилась в асептических условиях с использованием ламинарного бокса ЛС (Россия). При перенесении клеток из одного флакона в другой, или из флакона в планшет, производились следующие операции: сначала из флакона удалялась среда. Затем, оставшийся монослой клеток промывался 2 раза раствором Версена, и 2 раза 0,25% раствором трипсина, после чего флакон с остатками трипсина на слое клеток помещался в термостат, при температуре 37 С на 3-5 мин. После такой обработки, клетки теряли сцепление с поверхностью флакона, что позволяло смыть их струей среды из шприца, и получить суспензию, которую затем переносили в другой флакон или планшет.

3.7 МТТ-тест

МТТ-тест является стандартным методом проверки цитотоксичности различных соединений. Также, в клинической практике, этот тест применяется для определения лекарственной чувствительности опухолей. При этом тест ставится на культуре клеток, полученных в результате взятия биопсии, либо при хирургическом удалении опухоли. Он технически прост, чувствителен и воспроизводим[50].

Метод МТТ-теста основан на способности бесцветной соли тетразолия (3-[4,5-диметилтиазол-2-ил]-2,5-дифенилтетразолия бромид, МТТ) восстанавливаться до окрашенного формазана в присутствии митохондриальных ферментов живых клеток.



Рис.6. Восстановление 3-(4,5-диметилтиазолил-2)-2,5-дифенилтетразолий бромистого (бледно-желтая соль) до формазана с синей окраской.

В каждую ячейку 96-луночного планшета помещалась суспензия клеток в количестве 200 мкл. Клетки инкубировались в среде DMEM с глютамином, с добавлением сыворотки при температуре 37 С в течение 24х часов. Затем вносились исследуемые вещества - различные разведения стандартного образца. Планшет с внесенным образцом инкубировался в течение заданного времени (от 2х до 72 часов). В каждую ячейку вносилось по 10 мкл раствора МТТ в концентрациии 10 мг/мл (т.е. по 100 мкг МТТ). Инкубация продолжалась 2-4 часа, после чего можно было наблюдать изменение цвета среды в ячейках, и, микроскопически, темно-синие кристаллы формазона в клетках. Затем, из ячеек удалялась среда, при этом слой клеток с кристаллами формазона становится виден в виде синего налета на дне планшета. В каждую ячейку вносилось 200 мкл диметилсульфоксида (ДМСО). В течение 5-10 минут формазан растворялся в ДМСО, после чего по 100 мкл раствора отбиралось в чистый планшет для измерения. Измерялась оптическая плотность раствора формазона, при длине волны 530нм, с помощью планшетного спектрофотометра УНИПЛАН.

3.8 Методы статистической обработки данных

При обсчете результатов МТТ-теста достоверность отличия образцов от контроля и друг от друга оценивалась с помощью непараметрического критерия Манна-Уитни-Вилкоксона. Сначала оценивали достоверность отличия оптической плотности в экспериментальных лунках от лунок контроля, затем рассчитывали долю выживших клеток в каждой ячейке планшета, путем деления значений оптической плотности на среднее арифметическое оптической плотности контроля. В результате образец характеризовался набором значений доли выживших клеток, которые сравнивались между собой с помощью названного критерия. Данный метод обсчета был выбран по причине малого объема выборки.