Математическое моделирование лизиса фибринового сгустка плазмином

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Введение

Фибриновые сгустки образуются в результате работы системы свертывания в ответ на нарушение целостности стенки кровеносного сосуда и предотвращают потерю крови организмом. После репарации повреждения, когда необходимость в сгустке исчезает, важно его разрушить и удалить, чтобы восстановить нормальный поток крови. Эту задачу выполняет система фибринолиза, обеспечивающая превращение циркулирующего в крови профермента плазминогена в активный фермент плазмин и последующий лизис сгустка этим ферментом.

Одной из наиболее распространенных и опасных патологий систем свертывания и фибринолиза является образование тромбов в кровеносных сосудах. Тромбозы являются одной из основных причин смертности и инвалидности. Основным способом борьбы с образующимися тромбами является использование тромболитических препаратов, стимулирующих систему фибринолиза. Однако применение таких препаратов всегда граничит с риском тяжелейших кровотечений вследствие повышающейся активности фибринолиза. Поэтому крайне важно знать особенности регуляции этой системы для более эффективного и разумного использования таких препаратов и разработки новых.

Более полно понять механизмы регуляции фибринолиза может помочь создание и исследование математических моделей этого процесса. Математическое моделирование фибринолиза могло бы способствовать обобщению и структурированию эмпирически выведенных закономерностей, а также указанию дальнейшего направления экспериментальных исследований этого процесса. В существующей литературе известно несколько математических моделей фибринолиза, однако каждая из них направлена на решение определенного класса задач, которые зачастую слабо пересекаются друг с другом. Только малая часть из существующих моделей принимает во внимание особенности внутренней структуры отдельного волокна фибринового сгустка, что в определенных случаях может иметь решающее значение. Кроме того, ни одна из существующих моделей не способна описать некоторые наблюдаемые в экспериментах принципиальные явления при лизисе сгустка, такие как образование поперечных разрезов фибринового волокна и увеличение скорости лизиса сгустка, при увеличении радиуса составляющих его фибрилл, но с использованием одинакового количестве общего фибрина.

Целью данной работы было исследование лизиса фибринового сгустка плазмином с помощью математического моделирования.

В работе были поставлены следующие задачи:

§ разработать математическую модель реакции лизиса фибринового сгустка плазмином с учетом структуры отдельного фибринового волокна;

§ на основании сравнения модели с существующими в литературе экспериментальными данными определить лимитирующую стадию этой реакции, оценить ее кинетические константы, сравнить их со значениями, известными в литературе;

§ исследовать и объяснить причину появления поперечных разрезов фибринового волокна в процессе его лизиса.

1. Обзор литературы

фибрин плазмин разрез тромбин

Фибринолиз - процесс, необходимый для нормальной работы организма человека. Его суть заключается в растворении сгустков крови, образующихся в результате действия системы свертывания. Процесс свертывания крови запускается организмом как ответ на повреждение стенки кровеносного сосуда и препятствует потери крови организмом [1]. Фибринолиз же восстанавливает циркуляцию крови по сосуду, после репарации его повреждений, устраняя ставшие ненужными сгустки. На рис. 1-1 приведена фотография фибринового сгустка в отсутствие клеток крови.

Рис. 1-1. Фотография фибринового сгустка, полученная с помощью сканирующего электронного микроскопа [2].

Прежде чем переходить к обзору системы фибринолиза, рассмотрим сначала, как образуется сам фибрин.

1.1 Процесс полимеризации фибрина

Предшественником фибрина является белок фибриноген. Он циркулирует в крови человека в концентрации около 8,8 мкМ. Молекулярная масса фибриногена 340 кДа, размеры - 45х9х9 нм [3]. На рис. 1-2 показан схематичный вид его молекулы [4]. Фибриноген состоит из трех пар полипептидных цепочек (Аб-66,5 кДа, Bв-52 кДа и г-46,5 кДа), связанных между собой дисульфидными мостиками. В его структуре выделяют несколько доменов: два D-домена, центральный E-домен и два бС домена. В Е-домене находятся N-концы всех трех пар полипептидных цепей. В D-домене - С-концы Вв и г цепей. гС-домен представляет собой С-конец Аб полипептидной цепи. бС-домены в фибриногене замкнуты друг на друга. На рис. 1-3 показана модель молекулы фибриногена цыпленка, основанная на его кристаллической структуре [5]. N-концы Аб и Вв цепей, а также бС-домены на модели молекулы не показаны.

Рис. 1-2. Схематичный вид молекулы фибриногена [4].

Рис. 1-3. Модель молекулы фибриногена цыпленка [5]

Полимеризация фибрина происходит в три этапа:

1) Удаление тромбином фибринопептидов А и В молекулы фибриногена.

Белок тромбин - результат работы «каскада» реакций системы свертывания [1] - отрезает от N-концов Аб и Вв цепей фибриногена фибринопептиды А и В, превращая при этом фибриноген в фибрин-мономер (рис. 1-4). N-концы Аб и Вв цепей становятся реакционными областями (a-knob и b-knob), комплементарными определенным областям в D-доменах фибрин-мономера (a-hole и b-hole). После этого начинается второй этап полимеризации.

2) Образование протофибриллы.

Фибрин-мономеры агрегируют друг с другом через комплементарные knob-hole взаимодействия и образуют двухцепочечную нить - протофибриллу (рис. 1-4). Нити протофибриллы сдвинуты одна относительно другой на половину молекулы фибрина. В длину протофибрилла растет примерно до 15 мономеров [6]. Далее следует третий этап полимеризации, приводящий к агрегации протофибрилл друг с другом и образованию фибриллы.

Рис. 1-4. Первые два этапа полимеризации фибрина

3) Латеральная агрегация протофибрилл. Образование фибриллы.

До сих пор ученые пытаются выяснить, как же точно происходит латеральная агрегация протофибрилл, какие взаимодействия приводят к такой агрегации и какова же упаковка протофибрилл в фибриновом волокне. За неимением достаточной информации по этим вопросам обычно ограничивались представлением о фибриновом волокне в виде длинной нити, состоящей из более мелких нитей - протофибрилл - заполняющих волокно так, чтобы обеспечить определенную его пористость, наблюдаемую в экспериментах (20% фибрина / 80% водной фазы в объеме волокна) [7]. Наглядным примером таких представлений является модель структуры фибриллы из работы [8], используемая при математическом моделировании фибринолиза (рис. 1-5). В той работе отдельная фибрилла представлялась в виде длинного цилиндра определенного радиуса, равномерно заполненного более мелкими длинными цилиндрами (протофибриллами), оси которых параллельны оси фибриллы. Определенная плотность упаковки протофибрилл давала необходимую пористость всей фибриллы.

Рис. 1-5. Модель цилиндрической структуры фибриллы

Только в 2000 г. в работе [9] авторы, основываясь на данных кристаллической структуры фибриногена и фрагментов фибрина в комплексе с синтетическими субстратами, предложили более конкретную модель структуры фибринового волокна. Основным вопросом исследования авторов была стадия латеральной агрегации протофибрилл. Описанный ими механизм латеральной агрегации на сегодняшний день представляется довольно убедительным, однако их окончательная модель трехмерной структуры фибриллы еще не была подтверждена необходимыми экспериментами и пока является только гипотетической.

Рассмотрим процесс латеральной агрегации протофибрилл, описанный в той работе.

После того, как с помощью knob-hole взаимодействий образовалась протофибрилла (ее три вида проекции показаны на рис. 1-6а), на каждом D-домене открываются по два сайта латеральной агрегации протофибрилл: один - в вС участках D-доменов, другой - в гС. Сама такая агрегация идет через взамодействия вС-вС и гС-гС D-доменов разных протофибрилл. Латеральные взаимодействия происходят в плоскостях, лежащих под углами примерно 30-45є по отношению к плоскости взаимодействия двух нитей в протофибрилле. На рис. 1-6б представлена агрегация двух протофибрилл в трех ракурсах. При этом нити двух протофибрилл, связанные латеральными взаимодействиями, в отличие от нитей одной протофибриллы, не являются сдвинутыми относительно друг друга. На рис. 1-6в показана агрегация трех протофибрилл. Для наглядности от каждой протофибриллы показана только одна из двух цепей.

(а)

(б)

(в)

Рис. 1-6. (а) - три вида проекции протофибриллы; (б) - три вида проекции латеральной агрегации двух протофибрилл; (в) - латеральная агрегация трех протофибрилл, от каждой протофибриллы представлена только одна из цепей; в правом нижнем углу показан вид агрегации трех протофибрилл в поперечном сечении, закрашеннами кругами изображены цепи протофибрилл, отсутствующие на предыдущих изображениях. [9].

С помощью таких латеральных взаимодействий протофибриллы собираются вместе и образуют фибриллу. На рис. 1-7 изображен один из вариантов структуры фибриллы, предложенный авторами. Причем, по их предположению, при латеральной агрегации трех протофибрилл через разные цепи какой-либо из них и по одну сторону от нее обязательно необходим их сдвиг относительно друг друга, вследствие запрещающего объемного эффекта (рис. 1-7а, б). Благодаря такому сдвигу структура фибриллы оказывается в значительной мере пористой (примерно 80% жидкой фазы в фибрилле), что согласуется с экспериментальными измерениями [7].



Рис. 1-7. Структура фибриллы, предложенная в работе [9]. (а) Разрешенная агрегация трех протофибрилл (индексами 1 и 2 обозначены цепи протофибрилл) (б) Запрещенный вариант агрегации трех протофибрилл. (в) Структура фибриллы в поперечном сечении. (г) боковой вид структуры фибриллы. [9].

Схематичный трехмерный вид такой агрегации протофибрилл показан на рис. 1-8, на котором, в отличие от рис. 1-7, для наглядности одним блоком изображена не одна цепь протофибриллы, а сама протофибрилла. Как видно, такая фибрилла имеет слоистую структуру.

Рис. 1-8. Трехмерный вид структуры фибриллы, соответсвующий структуре, изображенной на рис. 1-7.

Такая «блочная» структура фибриллы (один «блок» - это одна протофибрилла длиной примерно в 15 мономеров фибрина) пока не подтверждена убедительными экспериментами и не считается общепринятой.

Помимо описанных выше взаимодействий вС - вС и гС - гС при латеральной агрегации происходит переключение взаимодействий бС - бС с внутримолекулярных (внутри одной молекулы) на межмолекулярные (между разными молекулами), что дополнительно укрепляет связи протофибрилл друг с другом [4], [10].

Известно, что фибриллы при полимеризации могут ветвиться [11]. Степень ветвления (количество точек ветвления), а также диаметр образующихся фибрилл зависят от условий полимеризации: концентрации фибриногена, концентрации тромбина, ионной силы раствора и др [7], [12]. Повышенная концентрация фибриногена, пониженная концентрация тромбина, низкая ионная сила раствора - эти факторы приводят к образованию сгустка, состоящего из более толстых фибрилл. При физиологических условиях диаметр образующейся фибриллы составляет 50-100 нм [11], [13].

1.2 Обзор системы фибринолиза

Ключевой компонент системы фибринолиза - плазмин (Пм). Этот белок, являющийся сериновой протеазой, способен напрямую осуществлять гидролиз фибрина. Плазмин циркулирует в крови в виде своего неактивного предшественника - плазминогена (Пг). Плазминоген активируется до плазмина одним из двух белков-активаторов: тканевым активатором плазминогена (тПА) или урокиназным активатором плазминогена (уПА). На рис. 1-9 показана схема основных реакций системы фибринолиза. Рассмотрим отдельные компоненты этой системы, а потом перейдем к механизмам ее регуляции.



Рис. 1-9. Схема основных реакций системы фибринолиза. Волнистой линией обозначен фибрин. Волнистая линия под названиями белков означает, что те белки находятся в связанном с фибрином состоянии. «Лиз» под волнистой линией обозначает фибрин с С-концевыми лизиновыми аминокислотными остатками

Основные компоненты системы фибринолиза

Плазминоген и плазмин

Плазминоген является одноцепочечным гликопротеином с молекулярной массой 92 кДа. Синтезируется плазминоген в печени и циркулирует в крови в виде своей Глу-формы (ГлуПг) в концентрации примерно 2 мкМ. Глу-плазминоген имеет на своем N-конце аминокислоту глутамин. В его структуре выделяют семь доменов: преактивационный пептид, пять крингл-доменов (К1-К5) и протеазный домен [16] (перечислены, начиная с N-конца). Удаление плазмином преактивационного пептида приводит к переходу Глу-формы плазминогена в его Лиз-форму (ЛизПг). Лиз-плазминоген имеет более открытую конформацию, лучше связывается с фибрином и лучше активируется активаторами по сравнению с Глу-плазминогеном [17], [18], [19], [20]. Крингл-домены обеспечивают узнавание плазминогеном лизиновых аминокислотных остатков, входящих в сайты связывания на фибрине, ингибиторах и клеточных рецепторах [19], [21], [22], [23], [24]. На молекуле фибрина обнаружено два низкоафинных сайта связывания плазминогена (плазмина), находящихся между D и E доменами молекулы и включающих в себя аминокислотные остатки Аб148-160, и по одному высокоафинному сайту на каждом бС домене, представленному остатками Аб392-610 [4]. Однако роль высокоафинных сайтов остается неопределенной, т.к. они, по-видимому, не являются доступными плазминогену (плазмину) на фибрине, организованном в фибриновое волокно (в экспериментах с фибриновыми сгустками наблюдаются только низкоафинные сайты связывания) [19], [25].

Если же говорить о размерах плазминогена, то его Глу-форма представляет собой глобулу диаметром 9 нм, лизиновая же форма является более открытой и имеет форму, напоминающую «дверную ручку» длиной порядка 14 нм [17]. Плазминоген, связанный своими кринглами с лигандом, принимает еще более открытую конформацию. Его длина в этом случае достигает примерно 24 нм [26]. При разрезании активаторами (тПА или уПА) связи Арг561-Вал562 в молекуле плазминогена, начинает функционировать его протеазный домен, и плазминоген превращается в активную протеазу плазмин. Плазмин состоит из двух полипептидных цепей, связанных дисульфидными связями. Тяжелая А-цепь плазмина содержит все пять кринглов, а в состав легкой В-цепи входит характерный для трипсиновых протеаз каталитический сайт, состоящий из остатков Гис602, Асп645 и Сер740. Плазмин способен осуществлять гидролиз многих связей в молекуле фибрина [27]. Гидролиз определенных связей приводит к разрушению всей молекулы и образованию продуктов деградации фибрина (ПДФ), разных размеров [28], [29], [30]. Разрезание же плазмином некоторых других связей около лизиновых аминокислотных остатков обеспечивает эффект наблюдаемого в экспериментах улучшения связывания плазминогена (плазмина) [21], [22], [31], [32]. Такой эффект положительной обратной связи обеспечивают появляющиеся С-концевые лизины, однако связан ли эффект с появлением новых дополнительных сайтов связывания или улучшением афинности старых остается не вполне понятным.

Активаторы плазминогена

Тканевый активатор плазминогена

Тканевый активатор плазминогена (о-тПА) является одноцепочечным гликопротеином с молекулярной массой 68 кДа. Синтезируется он эндотельальными клетками и в норме циркулирует в крови в концентрации 60 пН [33], хотя только 20% от этого количества находится в свободной форме, другая же часть циркулирует в комплексе со своим ингибитором ПАИ. N-концевая часть о-тПА состоит из finger-домена, домена эпидермального фактора роста и двух крингл-доменов. С-концевая часть молекулы содержит каталитический домен, характерный для трипсиновых протеаз. Finger и второй крингл-домен способны взаимодействовать с фибрином [34]. Во взаимодействии о-тПА с ингибитором ПАИ участвуют его второй крингл-домен, каталитический домен (активный сайт) и аминокислотные остатки 296-304 [35]. Хотя о-тПА и является ферментом, его активность по отношению к своему субстрату-плазминогену довольно мала в отсутствии фибрина, тогда как в присутствии последнего активность повышается примерно в 1000 раз, благодаря формированию тройного комплекса активатор-плазминоген-фибрин [36], [20]. Плазмин может превращать одноцепочечный активатор (о-тПА) в двухцепочечный (д-тПА) путем разрезания связи Арг275-Иле276. Однако значение такого превращения о-тПА в д-тПА для ускорения процесса активации остается спорным вопросом. По данным одних ученых д-тПА связывается с фибрином лучше, чем о-тПА [37], т.е. появление д-тПА является положительной обратной связью, по данным же других - хуже [38], что предполагает отрицательную обратную связь.

Урокиназный активатор плазминогена

Урокиназный активатор плазминогена (о-уПА) является одноцепочечным гликопротеином с молекулярной массой 55 кДа. Синтезируется он многими клетками (соединительнотканными, эпителиальными, макрофагами, эндотелиальными клетками) и в норме циркулирует в крови в концентрации 70 пМ [39]. О-уПА состоит из домена эпидермального фактора роста (необходимого для связывания с клеточными рецепторами), крингл-домена (не имеющего афинности к лизину) и каталитического домена (гомологичного трипсиновым протеазам). Разрезание плазмином связи Лиз158-Иле159 приводит к превращению одноцепочечного урокиназного активатора (о-уПА) в двухцепочечный (д-уПА), являющийся гораздо более эффективным [40], [41]. Урокиназный активатор имеет очень низкое сродство к фибрину, однако присутствие фибрина все же повышает активацию плазминогена с помощью о-уПА (но не д-уПА) [42]. Интересно, что основной ингибитор активаторов плазминогена ПАИ способен ингибировать только д-уПА, но не о-уПА [43].

Ингибиторы

Антиплазмин

Антиплазмин (АП) является очень быстрым ингибитором плазмина [44]. Этот белок принадлежит к семейству серпинов и является гликопротеином с молекулярной массой 70 кДа. Синтезируется антиплазмин в печени и циркулирует в крови в концентрации 1 мкМ. Антиплазмин взаимодействует с лизин-связывающими кринглами и активным сайтом плазмина. Плазмин, находящийся в связанном с фибрином состоянии, гораздо меньше подвержен ингибированию антиплазмином: эффективность его инактивации уменьшается в 430 раз и его время жизни составляет около 7 минут (тогда как время жизни свободного плазмина примерно 1 с) [45].

Макроглобулин

Макроглобулин (МГ) - ингибитор большого числа протеиназ, его молекулярная масса 725 кДа. В системе фибринолиза наиболее заметное действие оказывает на плазмин, хотя эффективность ингибирования плазмина макроглобулином составляет примерно 10% от эффективности ингибирования антиплазмином [46].

Ингибитор активаторов плазминогена

Ингибитор активаторов плазминогена (ПАИ) является основным ингибитором и тканевого и урокиназного активаторов. Этот белок принадлежит к семейству серпинов и является гликопротеином с молекулярной массой 52 кДа. Синтезируется ПАИ эндотелиальными клетками, моноцитами, макрофагами, гепатоцитами и тромбоцитами, в крови человека присутствует в различных концентрациях вплоть до 2 нМ. Основным источником ПАИ считаются тромбоциты [47], что является значительным для предотвращения преждевременного фибринолиза в момент формирования сгустка [48].

Тромбин-активируемый ингибитор фибринолиза

Тромбин-активируемый ингибитор фибринолиза (ТАФИ) является одноцепочечным гликопротеином с молекулярной массой 60 кДа. Он синтезируется в печени и циркулирует в крови в концентрации 220 нМ [49]. ТАФИ является проферментом и нуждается в активации для превращения в активный фермент ТАФИа. Такая активация осуществляется в основном комплексом тромбин-тромбомодулин [50], [51], но также может осуществляться и плазмином [52], [53], трипсином [52] или одним тромбином [50], [52], хотя и гораздо медленнее. ТАФИа является нестабильным при 37°С, время его полужизни при этой температуре 8-9 мин [51]. Ингибирующее действие ТАФИ заключается в удалении С-концевых лизиновых аминокислотных остатков, появляющихся на фибрине в процессе его деградации [54].

Стадии фибринолиза

Весь процесс фибринолиза можно разбить на две стадии:

1) превращение плазминогена в плазмин с помощью активаторов плазминогена;

2) лизис фибринового волокна плазмином.

Причем в первой стадии активное образование плазмина из плазминогена происходит только там, где появляется фибрин, т.е. где образуется сгусток. Это связано с тем, что, во-первых, некоторые реакции фибринолиза идут быстрее на поверхности фибрина, чем в плазме (например, активация плазминогена с помощью тПА ускоряется фибрином примерно в 1000 раз [20], [36]) и, во-вторых, белки, связанные с фибрином, оказываются защищенными от ингибиторов (например, время полужизни плазмина в присутствии фибрина составляет 7 мин, тогда как в плазме оно гораздо меньше - 0,1 с [45]). Таким образом, появление в крови фибрина запускает процесс его же растворения. Образуется фибрин за минуты, растворяется же за часы.

Для первой стадии фибринолиза характерно также наличие множества положительных обратных связей, осуществляемых плазмином и ускоряющих процесс его же образования: появление С-концевых лизинов, превращение Глу-плазминогена, о-тПА, о-уПА в более эффективные Лиз-плазминоген, д-тПА и д-уПА соответственно.

Вторая стадия фибринолиза является не менее сложной, чем первая, хотя в ней участвуют всего два белка: фибрин в качестве субстрата и плазмин в качестве фермента, разрушающего этот субстрат. Данная реакция протекает в две стадии: обратимое связывание плазмина с фибрином и гидролиз фибрина. В литературе не удалось обнаружить прямых экспериментов, направленных на определение кинетических констант этой реакции, вследствие ряда ее особенностей. Во-первых, плазмину не равновероятно доступен весь объем фибрина. До сих пор у ученых нет однозначного мнения по поводу степени проникновения плазмина в фибриновое волокно. Одни считают, что плазмину доступна только внешняя поверхность фибриллы [55]. Другие предполагают, что плазмин может проникать внутрь волокна [56]. Кроме того, для нахождения кинетических констант этой реакции необходимы эксперименты с равномерным распределением плазмина в сгустке для того, чтобы избежать влияния диффузии плазмина. А в таких экспериментах, вероятно, является затруднительным точное наблюдение за концентрацией появившихся продуктов деградации фибрина. Во-вторых, в процессе лизиса на фибрине появляются дополнительные центры связывания плазмина [21], [22], [31], [32], что также затрудняет точное определение констант реакции. В-третьих, известно, что образующиеся продукты деградации способны ингибировать реакцию лизиса фибрина, т.к. содержат сайты связывания плазмина [57].

Долго была общепринятой модель равномерного послойного лизиса фибрина, в которой считалось, что плазмин действует только на поверхности фибриллы. При этом по мере расщепления внешнего слоя фибриллы плазмину становятся доступными внутренние области волокна [8], [55]. Однако исследования фибринолиза с помощью электронной, конфокальной и атомно-силовой микроскопии показали, что отдельная фибрилла вместо того, чтобы утоньшаться, разрезается плазмином в поперечных сечениях, а ее средний радиус увеличивается, вопреки предполагавшемуся его уменьшению [2], [56], [58], [59], [60], [61] (рис. 1-10). В литературе встретилось только одно объяснение появлению таких поперечных разрезов: плазмин, благодаря наличию в его структуре нескольких фибрин-связывающих крингл-доменов, возможно, способен проникать внутрь фибриллы, связываясь поочередно то одним, то другим крингл-доменом с соседними протофибриллами, «перешагивая» от одной протофибриллы к другой. Таким образом, проникнув внутрь, он мог бы разрезать последовательно все протофибриллы, находящиеся в поперечном сечении и образовать поперечный разрез фибриллы [56]. Однако экспериментального подтверждения такого механизма пока нет. Увеличение среднего радиуса фибриллы, по-видимому, связано с тем, что высвободившиеся из фибриллы кусочки фибрина способны связываться с другими ее участками и увеличение среднего радиуса фибриллы компенсируется уменьшением ее длины.



Рис. 1-10. Фотографии фибринового сгустка в процессе его лизиса плазмином, полученные с помощью сканирующего электронного микроскопа [56]. (А) Контрольный сгусток, в отсутствии плазмина. Сгусток при 30 мин (В), 1 ч (С) и 3,5 ч (D) лизиса плазмином (0,2 U/ml)

Известно, что радиус фибринового волокна влияет на скорость его лизиса. Причем, интересно, что, хотя отдельная более тонкая фибрилла лизируется быстрее более толстой, однако весь сгусток, состоящий из тонких фибрилл лизируется медленнее сгустка, состоящего из толстых фибрилл, при одинаковом количестве полного фибрина [55], [58]. Одно из объяснений этого феномена такое: т.к. лизис фибриллы преимущественно идет ее поперечными разрезаниями, то в сгустке, состоящем из толстых фибрилл большее количество белка сосредоточено в одной фибрилле, а количество фибрилл меньше, и, поэтому, задержка, связанная с переходом плазмина от одних фибрилл к другим меньше, чем в случае сгустка, состоящего из тонких фибрилл [58].

Математическое описание системы фибринолиза

В существующей литературе известно несколько математических моделей фибринолиза. Каждая из них направлена на решение определенного класса задач. Некоторые из этих моделей являются попытками довольно полно описать всю систему фибринолиза, другие же сосредоточены только на какой-либо ее части. В Таблице 1 приведены основные области проблем, исследуемых авторами в своих моделях.

Таблица 1. Существующие математические модели фибринолиза

Год	Авторы	Область проблем, исследуемых авторами	Ссылка
1984	Sobel BE Gross RW Robinson AK	оценка повышения фибринолитической активности крови при введении разного количества тПА	62
1986	Tiefenbrunn AJ Graor RA Robison AK Lucas FV Hotchkiss A Sobel BE		63
1993	Diamond SL Anand S	исследование лизиса фибринового сгустка при наличии потока	8
1996	Anand S Diamond SL		64
1995	Anand S Wu J Diamond SL	сравнение лизиса двух биополимеров: фибрина и коллагена при наличии потока	65
1995	Zidansek A Blinc A Lahajnar G Keber D Blinc R	исследование формы распространяющегося фронта лизиса при использовании урокиназы в качестве активатора плазминогена	66
1997	Kolev K Tenekedjiev K Komorowicz E Machovich R	оценка участия разных доменов плазмина в лизисе фибринового сгустка	67
2002	Pleydell CP David T Smye SW Berridge DC	лизис остаточного после реканализации сгустка в условиях потока	68
2003	Anand M Rajagopal K Rajagopal KR	взаимодействие систем свертывания и фибринолиза	69
2005	Anand M Rajagopal K Rajagopal KR		70
2000	Голомысов И.С.	исследование кинетики лизиса фибринового сгустка а) плазмином, б) с использованием урокиназы в качестве активатора плазминогена	71

Работы [69], [70] являются попытками создать полную математическую модель, описывающую одновременно и процесс свертывания, и фибринолиз. Однако модели являются довольно запутанными и сложными для восприятия кроме того, в работах совершенно отсутствует сравнение моделей с экспериментальными данными, что делает затруднительным проверку их корректности.

Остальные работы направлены на исследование определенных областей фибринолиза. Причем, в моделях с разной степенью подробности описываются параметры сгустка. Только работы [8], ([64], [65]), [71] вводят в рассмотрение отдельное фибриновое волокно. Изучение именно этих работ представляло наибольший интерес при создании математической модели лизиса фибринового сгустка в данной работе.

1.3 Постановка задачи

Анализ литературы показал, что вторая стадия фибринолиза - реакция разрушения фибрина плазмином - является наименее изученной и объясненной областью этой системы.

Каковы кинетические константы данной реакции? От каких параметров они зависят? Справедливы ли их литературные значения? Какова структура фибринового волокна? Может ли плазмин проникать внутрь фибриллы? Почему и как образуются поперечные разрезы фибрилл? Почему, если отдельные тонкие фибриллы лизируются быстрее толстых, весь сгусток, образованный тонкими фибриллами, разрушается медленнее сгустка, образованными толстыми, при одинаковом общем количестве фибрина? Как происходит лизис фибриллы: только ли поперечными разрезаниями или же еще имеет место послойный лизис?

На все эти вопросы точных ответов, однозначно подтвержденных экспериментами, пока нет.

Среди существующих математических моделей фибринолиза только в работах [8], [71] были произведены попытки описать вторую стадию фибринолиза с учетом внутренней структуры фибринового волокна, однако многие процессы, происходящие при его лизисе, теми моделями объяснить не удается.

Поэтому целью данной работы было исследование лизиса фибринового волокна плазмином с помощью мотематической модели этого процесса, которая была бы более приближена к описанию наблюдаемых при лизисе явлений и позволила бы дать ответы на некоторые из поставленных вопросов.

В задачи исследования входили:

§ разработка математической модели реакции с учетом внутренней структуры фибриллы;

§ выявление лимитирующей стадии реакции, оценка ее кинетических констант, сравние их со значениями, известными в литературе;

§ объясните причины появления поперечных разрезов фибриллы в процессе ее лизиса.

2. Методы исследования

2.1 Математическая модель для кинетического исследования лизиса фибринового сгустка плазмином

Для моделирования лизиса фибрина плазмином принималась следующая идеализация фибринового волокна. Фибрилла рассматривалась в виде цилиндра радиуса R. Каждая фибрилла состояла из протофибрилл, которые представлялись в виде цилиндров радиуса r, оси которых параллельны оси фибриллы (рис. 2-1А). В поперечном сечении фибриллы предполагалось равномерное по плотности кольцевое расположение протофибрилл (рис. 2-1Б).

фибрин плазмин разрез тромбин

Рис. 2-1. Модель цилиндрического послойного строения фибринового волокна.

Плазмину был доступен только внешний слой протофибрилл. На каждый мономер фибрина для плазмина приходилось два сайта связывания. По мере лизиса от фибрина отщеплялись продукты деградации, радиус фибриллы уменьшался, и для плазмина оказывались доступными следующие слои протофибрилл.

Схема реакции расщепления фибрина плазмином имела следующий вид:



где ? свободные сайты связывания плазмина на поверхности фибрина;

Пм ? свободный плазмин;

Пм^св ? плазмин, связанный с фибрином;

ПДФ ? продукты деградации фибрина;

k_ас и k_ас - кинетические константы ассоциации и диссоциации плазмина с фибрином соответственно;

k_кат? каталитическая константа расщепления фибрина плазмином.

Кинетика гомогенного лизиса фибрина описывалась системой дифференциальных уравнений, написанных в соответствии с приведенной выше схемой на основании закона действующих масс и с учетом изменения количества сайтов связывания на поверхности фибриллы при изменении её радиуса:

где [i] обозначает объёмную концентрацию i-й переменной.

Все переменные модели были отнесены к полному объёму сгустка, тем самым модель была упрощена до случая гомогенного распределения всех компонент. Такое упрощение для переменных Пм и ПДФ оправдано, если учесть, что объём, занимаемый фибриллами в сгустке, составляет <1% от полного объёма всего сгустка при физиологической концентрации фибриногена (8,8 мкМ). Для переменных Пм^св и и упрощение также возможно, вследствие достаточно быстрой диффузии плазмина в поре.

Последний член в правой части уравнения для изменения и со временем описывал изменение концентрации сайтов связывания за счет изменения радиуса фибриллы в процессе лизиса. Он равен

где г ? отношение количества протофибрилл в соседних слоях:

S_R, S_R-2r ? площади слоев с внешними радиусами R и R-2r соответственно и толщиной 2r.

Радиус фибриллы R в момент времени t выражался через [ПДФ] в момент времени t и начальные R₀ и [Фн₀]:

Начальные условия для данной системы дифференциальных уравнений имели следующий вид:

где R₀ ? начальный радиус фибриллы, r ? начальный радиус протофибриллы, [Фн₀] ? объемная начальная концентрация фибрина, [Пм₀] ? объемная начальная концентрация плазмина.

Выражение для [и₀] было получено из тех соображений, что отношение количества мест связывания, содержащихся во внешнем слое фибриллы к их полному количеству внутри фибриллы равно отношению площадей поперечного сечения внешнего слоя и всей фибриллы соответственно:

где N_R, S_R ? количество протофибрилл в слое с внешним радиусом R₀ и толщиной 2r и площадь такого слоя соответственно; N_0, S₀ ? количество протофибрилл в поперечном сечении фибриллы радиуса R₀ и площадь такого поперечного сечения соответственно.

Система дифференциальных уравнений (2) начальными условиями (6) решалась численно с помощью стандартной функции ODE15S математического пакета MATLAB 7.0.

2.2 Математическая модель для проверки гипотезы, объясняющей причину появления поперечных разрезов фибрилл

Для проверки предложенной в работе гипотезы (см. п. 3.2) предыдущая модель (2) была расширена: в нее вводились увеличение афинности плазмина к фибрину в процессе лизиса и возможность фиксировать поперечные разрезы фибрилл. Структура фибриллы предполагалась аналогичной описанной выше (рис. 2-1). Однако при этом фибрилла была условно поделена на секции длиной в один мономер фибрина (рис. 2-2).



Рис. 2-2. Разделение фибриллы на секции

Каждая секция характеризовалась количеством удаленных из нее плазмином протофибрилл длиной также в один мономер. Максимальное количество протофибрилл в секции определялось начальным радиусом фибриллы. При физиологических условиях формирования фибриллы среднее значение ее радиуса равно примерно 40 нм [11], [13], а коэффициент пористости е=0.8 [7]. При этом количество протофибрилл радиуса r=4 нм в фибрилле равно 20. Таким образом, выделялось 20 классов секций. Первый класс характеризовался индексом 0, в него входили секции фибриллы, в которых не было удалено ни одной протофибриллы. Последнему классу приписывался индекс 20, что значило, что в тех секциях были удалены все 20 протофибрилл, и это же значило, что в фибрилле в местах, где находились эти секции, произошли поперечные разрезы. Вся фибрилла представлялась как набор секций, каждая из которых принадлежала определенному классу. До начала лизиса все секции фибриллы характеризовались индексом 0. При воздействии плазмина на фибриллу секции переходили в следующие классы.

Плазмину считались доступными два верхних слоя протофибрилл. Это предположение было сделано исходя из сравнения размеров плазмина с характерными размерами фибринового волокна. Изначально количество протофибрилл в двух верхних слоях было равно 12 (в соответствии с физиологическими значениями R, r и е). Для удобства эти два слоя были объединены в один, и фибрилла рассматривалась состоящей из слоев толщиной в две протофибриллы.

Ниже приведены события, происходящие при лизисе одной секции и принцип, по которому в модели вводилось увеличение афинности плазмина к фибрину:

1. Изначально: секция фибриллы состояла из 20 протофибрилл; 12 протофибрилл находились в верхнем слое и были доступны плазмину; все сайты связывания на протофибриллах условно были названы «нативными»;

2. При гидролизе одной протофибриллы считалось, что плазмин успевал «обрабатывать» в среднем еще одну протофибриллу из этого же слоя, а также открывшуюся протофибриллу из следующего слоя, превращая находящиеся на них «нативные» сайты в «новые». «Новые» сайты имели в два раза большую афинность по сравнению с «нативными». При этом секция переходила в следующий класс;

3. При переходе секции в следующий класс количество «нативных» и «новых» сайтов в поверхностном слое изменилось в соответствии с изменением радиуса этого слоя; при этом при переходе к 11 классу в поверхностном слое оставались только «новые» сайты.

4. При гидролизе всех 20 протофибрилл в одной секции появлялся поперечный разрез фибриллы.

Кинетика появления поперечных разрезов фибриллы описывалась системой дифференциальных уравнений, написанных на основании закона действующих масс:



где символом ()ⁱ обозначаются переменные, относящиеся к i-му классу секций

(i принимает значения от 0 до 19);

- плазмин, связанный только с «нативными» сайтами секции;

- плазмин, связанный только с «новыми» сайтами секции;

- плазмин, связанный и с «нативными» и с «новыми» сайтами секции;

X - секции фибрина, свободные от плазмина;

- эффективный коэффициент ассоциации плазмина со всеми «нативными» сайтами секции, для разных секций выражающийся формулами:

для i=0

для i=1:10

для i=11:19

k_ас - коэффициент ассоциации плазмина с одним «нативным» сайтом;

- эффективный коэффициент диссоциации плазмина, связанного с «нативными» сайтами секции; с связан через равновесную константу диссоциации формулой:

- эффективный коэффициент ассоциации плазмина со всеми «новыми» сайтами секции, для разных секций выражающийся формулами:

для i=0

для i=1:12

для i=13:19

k_ас/нов - коэффициент ассоциации плазмина с одним «новым» сайтом;

- эффективный коэффициент диссоциации плазмина, связанного с «новыми» сайтами секции; в модели он имел такое же значение, как и :

Выражения для эффективных коэффициентов связывания представляют собой формулы типа:

или

где n - количество протофибрилл в поверхностном слое фибриллы толщиной в 2r:

N - количество протофибрилл в фибрилле;

p, q - относительные доли «нативных» и «новых» сайтов в поверхностном слое соответственно;

Начальные условия для системы уравнений (8) имели следующий вид:

Для проверки влияния появления «новых» сайтов связывания плазмина на образование поперечных разрезов фибриллы была написана модель, аналогичная модели (8), но без учета появления «новых» сайтов:



где ; .

Начальные условия для модели (21) имели следующий вид:

Системы дифференциальных уравнений (8), (21) с соответствующими им начальными условиями (20) и (22) решались численно с помощью стандартной функции ODE15S математического пакета MATLAB 7.0.

3. Результаты и обсуждение

3.1 Кинетическое исследование лизиса фибринового сгустка плазмином

Сравнение результатов модели с существующими экспериментальными данными.

На рис. 3-1 представлены результаты эксперимента по кинетике лизиса фибринового сгустка плазмином, полученные в работе [71]. В том эксперименте в лунке формировался фибриновый сгусток объемом 60 мкл и высотой 1,5 мм из биотин-меченого фибриногена концентрации 10 мкМ. Сверху сгустка в ту же лунку добавлялось 60 мкл раствора плазмина высотой 1,5 мм с концентрацией 0,6 мкМ. В процессе инкубации при перемешивании на шейкер-инкубаторе при 37єС через определенные промежутки времени отбирали аликвоты раствора и измеряли концентрацию продуктов деградации фибрина авидин-биотиновым методом. На этом же графике изображено решение гомогенной модели (2) с начальными условиями (6), приближенными к условиям проведения эксперимента, и литературными значениями констант реакции, представленными в Таблице 2 (кривая 1). В качестве начальных условий брались значения [Фн₀]=10 мкМ, [Пм₀]=0,3 мкМ (концентрация плазмина, пересчитанная на начальный объем фибринового сгустка), r=4 нм (при физиологических условиях) [8], R₀=40 нм (при физиологических условиях) [11].

Таблица 2: Литературные значения констант реакции расщепления фибрина плазмином

Константа	Значение	Ссылка
kкат	2,72 мин-1а	[57]
	300 мин-1б	[72]
kас	0,006 мкМ-1мин-1	[8]
	0,03 мкМ-1мин-1	[64]
Kd	0,5 мкМ	[25]
а Рассчитано из значения наблюдаемой kкат=1,36 мин-1 для гидролиза плазмином фибрина [57] и учетом того, что на один мономер фибрина для плазмина приходится два сайта связывания [25]. бРассчитано из kкат=1500 мин-1 для гидролиза плазмином специфических хромогенных субстратов [72] и с учетом того, что для растворения одной молекулы фибрин-мономера плазмин должен расщепить около 10 пептидных связей [8].

При данных начальных условиях и предположенных константах реакции решение модели не соответствует экспериментальным результатам. Было предположено, что такое сильное несоответствие вызвано либо неверным значением начального радиуса фибриллы, используемым в модели, от которого зависит начальное количество доступных для плазмина сайтов связывания, либо неверными значениями кинетических констант реакции. Для проверки первого предположения, в модели (2) все сайты связывания в объеме фибриллы были сделаны доступными плазмину (в модели было убрано слагаемое, характеризующее изменение концентрации сайтов связывания при изменении радиуса фибриллы). Решение такой модели при доступности всех мест связывания изображено кривой 2. Очевидно, что модель по-прежнему довольно сильно отличалась от эксперимента. Далее было исследовано влияние констант реакции на кинетику лизиса фибрина. Изменение константы k_кат на два порядка до значения 300 мин^-1 не дало практически никаких изменений в решении модели (данные не показаны). Изменение же константы k_ас (и, соответственно, k_дис, т.к. они связаны через равновесную константу диссоциации K_d=0,5 мкМ [25]) на один порядок до значения 0,1 мкМ^-1мин^-1 позволило модели хорошо описать результаты эксперимента (кривая 3). Таким образом, было сделано предположение, что, по-видимому, именно скорость связывания плазмина с фибрином (характеризующаяся константой k_ас) определяет скорость всей реакции расщепления фибрина.



Рис. 3-1. Кинетика лизиса биотин-меченого фибринового сгустка плазмином. Символами изображены результаты эксперимента (концентрация фибрина в сгустке - 10 мкМ, концентрация плазмина в верхнем слое - 0,6 мкМ) Кривая 1 - результат решения модели (2) с начальными условиями: [Фн₀]=10 мкМ, [Пм₀]=0,3 мкМ, r=4 нм, R₀=40 нм и значениями констант k_кат=2,72 мин^-1, k_ас=0,006 мкМ^-1 мин^-1, k_дис=0,003 мин^-1. Кривая 2 - результат решения модели (2) (при условии, что плазмину доступны все сайты связывания в объеме фибриллы) с начальными условиями: [Пм₀]=0,3 мкМ, и₀=20 мкМ и значениями констант k_кат=2,72 мин^-1, k_ас=0,006 мкМ^-1мин^-1, k_дис=0,003 мин^-1. Кривая 3 - результат решения модели (2) с начальными условиями: [Фн₀]=10 мкМ, [Пм₀]=0,3 мкМ, r=4 нм, R₀=40 нм и значениями констант k_кат=2,72 мин^-1, k_ас=0,1 мкМ^-1мин^-1, k_дис=0,05 мин^-1.

Модель (2) также была применена для описания эксперимента по кинетике лизиса фибринового сгустка плазмином, проведенного в работе [57] В том эксперименте формировались ¹²⁵I-меченые фибриновые сгустки объемами 0.1, 025 и 0.35 мкл одинаковой концентрации (8,8 мкМ) и погружались каждый в 2 мл раствора плазмина с концентрацией 5-60 нМ. В процессе инкубации при постоянном перемешивании на качалке при 37єС отбирали аликвоты раствора, окружающего сгусток и измеряли радиоактивность растворимых продуктов деградации фибрина. Результаты одного из экспериментов, проведенных таким образом, изображены на рис. 3-2.

Рис. 3-2. Кинетика лизиса ¹²⁵I-меченого фибринового сгустка плазмином

Символами изображены результаты экспериментов. Начальные концентрации фибрина (пересчитанные на полный объем раствора плазмина вместе со сгустком) (мкМ): 0.44 (¦), 1.1 (?), 1.54 (^). Начальная концентрация плазмина 0,06мкМ. Сплошные кривые представляют результаты решений модели (2) с начальными условиями: [Фн₀]=0.44 (1), 1.1 (2), 1.54 (3) мкМ, [Пм₀]=0,06 мкМ, r=4 нм, R₀=40 нм и значениями констант k₁=2,72 мин^-1, k_ас=0,8 мкМ^-1мин^-1, k_дис=0,4 мин^-1.

Для описания этого эксперимента также была применена модель (2) с начальными условиями, соответствующими условиям проведения эксперимента. Результаты анализа и сравнения модели с экспериментом дали аналогичный вывод о лимитирующем действии скорости связывания плазмина с фибрином на скорость расщепления фибрина. Для того, чтобы описать эксперимент, значения k_ас и k_дис потребовалось изменить до значений 0,8 мкМ^-1мин^-1 и 0,4 мин^-1 соответственно (рис. 3-2, кривые 1-3).

Влияние начального радиуса фибриллы и констант реакции на поведение модели.

Для более полного представления о влиянии начального радиуса фибриллы и констант реакции на решение модели приведена Таблица 3. Таблица заполнена значениями параметров и констант, которые давали бы совпадение результатов решения модели с экспериментальными данными. Начальный радиус фибриллы R₀, соответствующая ему начальная концентрация сайтов связывания и₀ и каталитическая константа k_кат фиксировались. А значение k_ас варьировалось до значения, при котором модель описывала эксперимент. Значение k_дис было связано с k_ас через равновесную константу диссоциации K_d=0.5 мкМ [25].

Из таблицы видно, что при всех приведенных значениях радиуса фибриллы и константы k_кат для описания экспериментов моделью приходится довольно сильно (на 1-3 порядка) изменять значение константы k_ас, оцененное в работе [8]. Исходя из этих результатов, можно сделать вывод о том, что из двух стадий реакции лизиса фибрина лимитирующей является стадия связывания плазмина. Стадия же непосредственного гидролиза фибрина плазмином гораздо слабее влияет на кинетику всей реакции. Кроме того, для физиологических значений радиуса фибриллы и из исследования Таблицы 3 можно дать численную оценку значения константы связывания плазмина k_ас (0,05-1,0 мкМ^-1мин^-1).

Таблица 3. Значения варьируемых в модели констант k_ас ^а

Эксперимент из работы [71] ([Фн0]=10 мкM; [Пм0]=0.3 мкM)	Эксперимент из работы [57] ([Фн0]=1.54 мкM; [Пм0]=0.03 мкM)
R0, нм	и0, мкМ	Варьируемая константа kас [мкМ-1мин-1] и соответствующая ей kдис [мин-1]б	R0, нм	и0, мкМ	Варьируемая константа kас [мкМ-1мин-1] и соответствующая ей kдис [мин-1] б
		Для kкат=2,72 мин-1	Для kкат=300 мин-1			Для kкат=2,72 мин-1	Для kкат=300 мин-1
200	1,568	kас=0,6 kдис=0,3	Kас=0,4 Kдис=0,2	200	0,241	kас=5,0 kдис=2,5	kас=3,0 kдис=1,5
100	3,072	kас=0,3 kдис=0,15	kас=0,2 kдис=0,1	100	0,473	kас=2,0 kдис=1,0	kас=1,5 kдис=0,75
50	5,888	kас=0,15 kдис=0,075	kас=0,12 kдис=0,06	50	0,907	kас=1,0 kдис=0,5	kас=0,8 kдис=0,4
40	7,2	kас=0,1 kдис=0,05	kас=0,09 kдис=0,045	40	1,109	kас=0.8 kдис=0,4	kас=0,65 kдис=0,325
20	12,8	kас=0,07 kдис=0,035	kас=0,06 kдис=0,03	20	1,971	kас=0,5 kдис=0,25	kас=0,4 kдис=0,2
Все места связывания доступны плазмину в	20	kас=0,05 kдис=0,025	kас=0,04 kдис=0,02	Все места связывания доступны плазмину в	3,08	kас=0,2 kдис=0,1	kас=0,2 kдис=0,1
а Значения и0 (соответствующие значениям R0) и kкат в модели фиксировались, значения kас варьировались до совпадения модели с экспериментом. б kдис рассчитывалось из kас и константы диссоциации Kd=0,5 мкМ [25]. в Плазмину считались доступными все сайты связывания в объеме фибриллы, модель (2) рассматривалась без последнего слагаемого в правой части уравнения для изменения и.

О значениях констант реакции, известных в литературе.

В литературе не удалось обнаружить прямых экспериментов, направленных на определение констант k_кат и k_ас. Это связано с рядом особенностей, затрудняющих её экспериментальное исследование, о которых говорилось в п. 1.2.2. Однако в литературе все же существует несколько оценок констант этой реакции (Таблица 1). Например, в теоретической работе [8] была произведена оценка для k_ас, равная 0,006 мкМ^-1мин^-1, однако она была довольно условной. В той работе предполагалось, что k_ас для плазмина является такой же, как и для Lys-формы плазминогена в силу схожести их K_d. Оценивая k_f для Lys-плазминогена авторы ссылались на статью [19], где довольно приближенно оценивалось время, в течение которого диспергированный фибрин насыщался плазмином разной концентрации. В еще одной теоретической работе тех же авторов k_ас оценивалась как 0,03 мкМ^-1мин^-1 [64] на основании результатов статьи [73], в которой одновременно наблюдалась кинетика превращения плазминогена в плазмин и кинетика ингибирования плазмина несколькими ингибиторами как в свободной плазме, так и в связанном с фибрином состоянии. Значение же концентрации свободного плазмина, необходимое для оценки k_ас, определялось как разность концентраций других компонент, вычисление которой могло привести к довольно большой ошибке. Таким образом, известные в литературе значения k_ас являются довольно сомнительными. Большой разброс в литературных данных существует и по поводу каталитической константы k_кат (Таблица 2), однако из наших результатов вытекает, что точное значение этой константы не настолько критично для скорости протекания всей реакции расщепления фибрина, как значение k_ас.