?-Амилаза (Н.Ф.3.2.1.2). ?-Амилаза отщепляет мальтозу от нередуцирующего конца цепи, разрывая гликозидные связи через одну. Название "|3-амилаза" было выбрано для того, чтобы показать, что мальтоза образуется в ?-аномерной форме. Это не означает, что в молекуле крахмала присутствуют ?- связи, а указывает скорее на то, что происходит инверсия конфигурации, которая может иметь место в процессе ферментативного превращения вещества, содержащего асимметрический атом углерода. Такая инверсия была открыта П. Вальденом в 1893 г. и поэтому названа вальденовской инверсией. На представленной ниже схеме действие ?-Амилазы на амилозу и амилопектин показано стрелками.

Таким образом, действуя упорядочение, ?-Амилаза последовательно отщепляет остатки мальтозы с нередуцирующего конца до тех пор, пока не встретится точка ветвления со связью ?-1,6. При этом амилоза под действием ?-Амилазы расщепляется до мальтозы на 100%, а при действии ?-Амилазы на амилопектин помимо образующейся мальтозы остается нетронутой крупная, сильно разветвленная сердцевина, так называемый "конечный декстрин", т. к. фермент прекращает свое действие за 2 -- 3 остатка глюкозы от точек ветвления.

?-Амилазы -- это ферменты в основном растительного происхождения. Хорошо известными источниками являются зерно пшеницы, а также пшеничный и ячменный солод, соевые бобы, клубни картофеля.

В отличие от ?-амилазы, ?-Амилаза менее термостабильна, но проявляет большую устойчивость к кислым значениям рН, сохраняя свою активность при рН 3,3. Это нашло свое отражение в способе разделения ?-и ?-Амилаз солода, где оба фермента присутствуют одновременно.

Глюкоамилаза (Н.Ф.3.2.1.3). Глюкоамилаза (у-амилаза) продуцируется различными видами плесневых грибов рода Aspergillus: A. oryzae, A. niger, A. awamory и некоторыми другими, например, Rhizopusdelamarn Rhizopus niveus. Эти ферменты расщепляют как амилозу, так и амилопектин до глюкозы, последовательно действуя с нередуцирующего конца цепи крахмала. Они способны гидролизовать ?-1,4 и ?-1,6 гликозидные связи.

Различные глюкоамилазы отличаются друг от друга скоростью гидролиза крахмала, отношением к температуре и рН, и некоторыми другими показателями. На использовании препаратов грибной глюкоамилазы разработан ферментативный метод получения глюкозы, который получил широкое распространение в Японии.

Поллуланаза(Н.Ф. 3.2.1.41). Ранее этот фермент был известен под другими названиями -- R-фермент, предельная декстриназа, дебранчинг-фермент.

Поллуланаза является эндогенным ферментом, она способна хаотично гидролизовать ?-1,6-гликозидные связи в пуллулане, амилопектине, гликогене и предельных декстринах, которые получаются при совместном воздействии на крахмал и гликоген ?- и ?-Амилаз. Наиболее частым отцепляемым фрагментом является мальтотриоза..

Продуцетами пуллуланазы являются Aerobacter aerogenes, Bacillus cereus, Bacillus polimyxa, Bacillus sp. и Streptomyces. Ферменты, полученные из различных источников, обладают разной молекулярной массой

(от 48 000 до 143 000 Да) и по разному относятся к температуре и рН, действию ингибиторов и активаторов.

Инулаза (Н.Ф. 3.2.1.7). Фермент осуществляет гидродиз инулина и других полифруктозанов по (3-1,2-фруктозидной связи, начиная с ?-фруктозидного конца полимера. В результате образуется фруктоза и единственная молекула глюкозы на одну молекулу инулина. При полном гидролизе инулина получается 95% фруктозы и 5% глюкозы.

Фермент гидролизует главным образом инулин; сахароза, рафиноза также гидролизуются, но с незначительной скоростью. Инулаза содержится в тех же растениях (топинамбур, цикорий), в которых присутствует инулин. Активная инулаза продуцируется Aspergillus awamori BKM-808 при глубинном культивировании. Препарат обладает высокой стабильностью к Н+-ионам и температуре. Оптимум рН действия 4,5; оптимум температуры -- 65°С.

Полученные из инулина фруктозные сиропы могут быть широко использованы в кондитерской промышленности и диетическом питании.

?-Фруктофуранозидаза (Н.Ф.3.2.1.26). Другие названия этого фермента -- инвертаза или сахараза.

Для промышленного производства имеют значения только ферменты из S. cerevisiae и S. carlsbergensis. ?-Фруктофуранозидазу выделяют из дрожжей путем автолиза.

В результате действия фермента на сахарозу получается смесь эквимолярных количеств ?-глюкозы и ?-фруктозы, получившая название "инвертного сахара". Термин "инверсия" обозначает изменения, происходящие в способности сахара вращать плоскость поляризованного света. Это можно выразить следующей схемой:

Сахароза + Н2О > D (+)-глюкоза + D ( -- )-фруктоза

[?]D=+66,5° [ ?]D = +52,5° [?]D = -92,4°

Оптимум рН дрожжевой инвертазы находится в достаточно широкой зоне от 4,0 до 5,5. Фермент ингибируется ионами металлов. Полное ингибирование происходит под действием ртути и свинца; частичное ингибирование вызывают ионы серебра, цинка, меди. ?-Фруктофуранозидаза гидролизует также рафинозу и метил-?-О-фруктофуранозид, причем, если относительную скорость гидролиза сахарозы принять за 100, то соответствующие скорости расщепления этих субстратов будут равны 47 и 77.

Инвертаза находит широкое применение в пищевой промышленности. Гидролиз концентрированных растворов сахарозы приводит к образованию более сладких сиропов. Точка кипения инвертированных сиропов выше, а точка замерзания ниже, т. к. при инверсии повышается осмотическое давление. Образовавшиеся при действии инвертазы моносахариды более растворимы, не так легко выкристаллизовываются из высококонцентрированных сиропов. Практическое использование инвертазы в кондитерской промышленности будет рассмотрено в разделе 8.3.

?-Галактозидаза (Н.Ф.3.2.1.23). Фермент, который часто называют лактазой, катализирует реакцию гидролитического отщепления нередуцирующих остатков ?-D-галактозы в ?-галактозидах, в частности, в молочном сахаре -- дисахариде лактозы:

Ферментные препараты лактазы, применяемые в пищевой промышленности, получают с помощью различных продуцентов: микроскопических грибов (A. oryzae, A. niger), бактерий (Е. coli, Lactobacillus), дрожжей (S. fragilis, S. psedotropicalis). Все они имеют различные температурные оптимумы, которые, однако, лежат в пределах 37 -- 50°С. Оптимумы рН этих ферментов также заметно отличаются: для бактериальных -- около 7,0; для грибных -- около 5,0; для дрожжевой лактазы -- около 6,0.

При гидролизе лактозы в цельном молоке, обезжиренном молоке или в концентратах молока оптимальную активность (при нейтральном рН этих субстратов) проявляет дрожжевой фермент; для сыворотки и его концентратов -- грибной. Причем в обезжиренном молоке или сыворотке лактоза гидролизуется легче, чем в цельном, а пастеризованные субстраты гидролизуются легче, чем непастеризованные.

?-Галактозидаза из E.coli была получена в кристаллическом состоянии, ее молекулярная масса 850 000 Да. Она ингибируется некоторыми металлами (Си, Zn). Восстанавливающие агенты (цистеин, сульфид Na, сульфит Na и др.) активируют фермент и способны преодолевать влияние ингибиторов-металлов.

У некоторых групп населения (исключение составляют жители Северной Европы и некоторых районов Африки) ярко выражена непереносимость (интолерантность) лактозы, связанная с полным или частичным исчезновением у взрослых людей лактазной активности в клетках кишечного эпителия. У грудных младенцев активность этого фермента очень высока.

Эндополигалактуроназа (Н.Ф.3.2.1.15) и экзополигалактуроназа (Н.Ф.3.2.1.67). Эти два фермента участвуют в превращениях пектиновых веществ наряду с другими пектолитическими ферментами растительного и микробного происхождения (см. также гл. 3).

Эндополигалактуроназа -- фермент, который гидролизует ?-1,4-связи в молекуле растворимого пектина (метоксилированной полигалактуроновой кислоты), неупорядоченным, произвольным образом. С возрастанием степени этерификации полигалактуроновой кислоты степень и скорость гидролиза падают, т. к. для проявления каталитической активности фермента требуются свободные карбоксильные группы. Большинство изученных эндополигалактуроназ микроскопических грибов имеют молекулярную массу от 30 000 до 40 000 Да. Оптимальные значения рН колеблются в диапозоне 3,8 -- 5,5.

В гидролизе этого типа связи принимает участие и другой фермент -- экзополигалактуроназа, который последовательно отщепляет молекулу галактуроновой кислоты, начиная с нередуцирующего конца. Эндополигалактуроназа синтезируется как грибами, так и некоторыми видами бактерий. Они отличаются по своей специфичности к пектинам из различных источников, конечными продуктами реакции, оптимуму рН и другим свойствам.

Для промышленного производства ферментных препаратов пек-толитических ферментов, которые являются комплексными, в качестве продуцентов используют в основном микроскопические (плесневые) грибы, в частности, грибы рода Aspergillus: A. niger, A. wentii, A. oryzae. Бактериальные ферменты в промышленных масштабах не производятся.

Растительные полигалактуроназы, по-видимому, похожи на грибные прлигалактуроназы. Они обнаружены в широком спектре плодов и овощей: помидорах, авокадо, редисе, огурцах, яблоках, грушах, цитрусовых и др. Все они проявляют активность при естественных рН плодов.

Применение препаратов пектолитических ферментов в промышленности достаточно обширно. Они используются при производстве фруктовых соковых концентратов и экстрактов, при осветлении соков и вин, при производстве фруктовых и овощных пюре и нектаров.

Целлюлолитические ферменты. Ферментативное разрушение целлюлозы и родственных ей полисахаридов (гемицеллюлозы, лигнина) -- сложный процесс, требующий участия комплекса ферментов. Продуцентами такого комплекса целлюлолитических ферментов являются грибы рода Trichoderma, Phanerochaete (Sporotrichum) и Fusarium, a также бактерии рода Clostridium, Cellulomonas и некоторые другие.

Три основных типа целлюлолитических ферментов, продуцируемых микроскопическими грибами, образуют комплекс ферментов, способных осуществить полный гидролиз целлюлозы:

-- Эндо-1,4-?-глюконаза или целлюлаза (Н.Ф.3.2.1.4) беспорядочно гидролизует ?- 1,4-гликозидные связи. Она не расщепляет целлобиозу, но гидролизует целлодекстрины и производные целлюлозы с высокой степенью замещения, т. к. специфичность этого фермента не высока.

-- Экзо-1,4-?-глюконаза или целлобиогидролаза (Н.Ф.3.2.1.91) действует на целлюлозу, отщепляя целлобиозные звенья с нередуцирующего конца цепи. Этот фермент не действует на замещенные производные целлюлозы, что указывает на более высокую субстратную специфичность, чем у эндоглюконазы. Целлобиогидролаза гидролизует целлодекстрины, но не действует на целлобиозу.

-- ?-Глюкозидаза (Н.Ф.3.2.1.21) расщепляет целлобиозу и целлоолигосахариды до глюкозы. Фермент не действует на целлюлозу и высшие олигосахариды.

Целлюлазная система бактерий существенно проще, чем у грибов, т. к. бактерии образуют только эндоглюконазу и ?-глюкозидазу.

Все ферменты целлюлолитического комплекса достаточно хорошо изучены: практически все они являются гликопротеидами, определены их молекулярные массы, изоэлектрические точки, для многих показано наличие множественных форм.

Доказано, что различные ферменты, гидролизующие высокоупорядоченную целлюлозу, действуют в синергизме (рис. 8.10).

Эндоглюконаза атакует аморфные участки целлюлозных фибрилл. В результате образуются новые целлюлозные цепочки, на которые действует целлобиогидролаза, отщепляя целлобиозные звенья с нередуцирующего конца. Синергизм между двумя этими ферментами проявляется в том, что в результате действия эндоглюконазы появляется новый субстрат (более короткие цепочки), на который действует уже целлобиогидролаза. ?-Глюкозидаза усиливает гидролиз, расщепляя целлобиозу -- конечный продукт и ингибитор этих ферментов.

Применение целлюлолитических ферментов представляет большой интерес, т. к. ферментативный гидролиз целлюлозосодержащих материалов (древесина, торф, сельскохозяйственные и городские отходы) может обеспечить получение различных биотехнологических продуктов (глюкозы, этанола, ацетона, микробной биомассы). В настоящее время исследования ферментативного расщепления целлюлозы достигли такого уровня, когда имеются все необходимые условия для разработки промышленного процесса и лишь по экономическим причинам он не реализуется на практике.

Протеолитические ферменты (Н.Ф.3.4). Основной реакцией, катализируемой протеолитическими ферментами, является гидролиз пептидной связи в молекулах белков и пептидов.

Согласно первоначальной классификации протеолитических ферментов их делили на две группы: протеиназы и пептидазы. При этом считали, что протеиназы действуют на белки, расщепляя их до полипептидов; полипептиды же гидролизуются пептидазами до аминокислот. Более поздняя классификация, до сих пор сохранившая свое значение, основана на схеме, предложенной М. Бергманом и Д. Фрутоном (1937). Согласно этой схеме протеазы разделяются на эндо- и экзопептидазы. Ферменты первой группы (эндопептидазы) могут гидролизовать глубинные пептидные связи и расщеплять молекулу белка на более мелкие фрагменты; ферменты второй группы (экзопептидазы) не могут гидролизовать пептидные связи, находящиеся в середине цепи, и действуют либо с карбоксильного, либо с аминного конца цепи, отщепляя последовательно одну задругой концевые аминокислоты. В связи с этим экзопептидазы подразделяют на аминопептидазы, карбоксипептидазы и дипептидазы.

Аминопептидазы (Н.Ф.3.4.11) катализируют отщепление N-концевых аминокислот.

Карбоксипептидазы (Н. Ф. 3.4.12) катализируют отщепление С-концевых аминокислот.

Дипептидазы (Н.Ф.3.4.13) проявляют специфичность к дипептидным субстратам.

Вместе с тем эндопептидазы (протеиназы) разделены на подгруппы, начиная с подподкласса 3.4.21, в первую очередь на основании каталитического механизма (строения активного центра); особенности специфичности используются при этом только для идентификации индивидуальных ферментов в пределах подподкласса:

-- сериновые протеиназы (Н.Ф.3.4.21), в активном центре которых функционирует остаток серина и гистидина;

-- тиоловые (цистеиновые) протеиназы (Н.Ф.3.4.22), содержат в активном центре SH-группу остатка цистеина;

-- кислые (карбоксильные) протеиназы (Н.Ф.3.4.23), в активном центре содержат СООН-группу остатка аспарагиновой кислоты;

-- металлопротеиназы (Н.Ф.3.4.24), содержат в активном центре металл, необходимый для проявления их каталитической активности.

Группа протеиназ, о механизме действия которых ничего неизвестно, отнесена к подподклассу 3.4.99.

Субстратная специфичность протеиназ будет определяться следующими факторами: природой аминокислоты, образующей гидролизуемую пептидную связь; радикалами аминокислот, удаленными от гидролизуемой пептидной связи; общей пространственной конформацией молекулы белка, делающей определенные пептидные связи доступными для действия фермента.

Исследование протеолитических ферментов ведется весьма интенсивно. Это происходит вследствие того, что они являются чрезвычайно удобным объектом для изучения структуры белков, активных центров ферментов, механизмов регуляции ферментативной активности и других важных вопросов энзимологии; кроме того, протеазы широко применяются в различных отраслях промышленности: пищевой, сельском хозяйстве, медицине.

Промышленное применение препаратов протеаз будет описано в разделе 8.3. Здесь же мы остановимся на рассмотрении отдельных свойств протеаз, имеющих технологическое значение, предварительно разделив их по типу происхождения на растительные, животные и микробные.

Растительные протеазы. Споры о приоритетности тех или иных ферментных препаратов, полученных из названных источников, ведутся уже достаточно долго. Однако, в связи с ограниченностью животного сырья (внутренние органы крупного рогатого скота и свиней), а также возможной токсичностью микробных препаратов (все они требуют высокой степени очистки, хотя и это не может служить абсолютной гарантией их безопасности), большой интерес представляют растительные протеазы, лишенные указанных недостатков.

Папаин (Н.Ф.3.4.22.2) и химопапаин (Н.Ф.3.4.22.6). Папаин является наиболее применяемым в производстве протеолитическим ферментом. Ферменты папаин и химопапаин -- истинные ферменты латекса плодов дынного дерева (Carica papaya).

Эти ферменты относятся к группе тиоловых протеиназ, характерной особенностью которых является то, что они активируются сульфгидрильными соединениями -- восстановленным глутатионом, цистеином.

Папаин и химопапаин получены в кристаллическом состоянии; их молекулярная масса 20 700 и 36 000 Да, соответственно, а изоэлектрические точки равны 8,75 для папаина и 10,1 для химопапаина.

Оптимальная зона рН для действия папаина зависит от природы гидролизуемого белка и может быть слабокислой, нейтральной или слабощелочной.

Химопапаин имеет большое сходство с папаином, однако можно выделить и некоторые интересные отличия. Например, активность химопапаина при гидролизе гемоглобина и казеина в два раза ниже, чем у папаина; он более термоустойчив, чем папаин, и проявляет хорошую стабильность в кислой среде (рН 2,0).

Папаин обладает довольно широкой специфичностью. Он преимущественно гидролизует вторую пептидную связь, лежащую за карбоксильной группой фенилаланина.

Различные фирмы, как зарубежные, так и отечественные, выпускают ферментные препараты на основе папаина с различной степенью очистки. Возможности их использования обширны: кожевенная промышленность (при обезволашивании и мягчении шкур); кинопроизводство (для растворения желатинового слоя на пленках при их регенерации); парфюмерия (при создании добавок в кремы, лосьоны, зубные пасты); производство синтетических моющих средств (для удаления загрязнений белковой природы); медицина (при лечении воспалительных процессов, ожогов, тромбозов и др.); пищевая промышленность (виноделие, пивоварение, производство спирта, хлебопечение, сыроделие и др.).

Фицин (Н. Ф. 3.4.22.3) и бромелаин (Н. Ф. 3.4.22.5). Фицин выделяют из млечного сока фикусовых растений, например, инжира (Ficus carica). Так же, как и папаин, он относится к тиоловым протеиназам. Еще один тиоловый фермент -- бромелаин -- получают из свежего сока ананаса (Bromeliacea).

Оба эти фермента имеют сходство с папаином, проявляют наибольшую активность в нейтральной зоне рН, обладают широкой специфичностью, предпочтительно расщепляют пептидные связи, образованные положительно заряженными аминокислотами.

Использование бромелаина и фицина аналогично использованию папаина; в последние годы их производство возросло, и в настоящее время эти ферменты применяют для удаления белковой мути в пиве и для мягчения мяса.

Протеолитические ферменты семян растений. В семенах злаковых и бобовых культур содержится целый комплекс протеолитических ферментов, участвующих в расщеплении запасных белков до аминокислот в процессе прорастания семян. В покоящихся семенах состояние белкового комплекса характеризуется высокой стабильностью и автолиз в водных суспензиях выражен слабо. Поэтому комплекс протеолитических ферментов семян оставался долгое время слабо изученным. Это было связано с методическими трудностями их выделения и очистки. В настоящее время известно, что протеолиз белков в семенах растений осуществляется комплексом ферментов, различающихся по своим функциям, механизму действия и другим показателям. Некоторые из этих ферментов были выделены в виде высокоочищенных препаратов и подробно охарактеризованы. Так, например, из семян пшеницы были выделены несколько типов протеолитических ферментов, различающихся по оптимуму рН: кислые протеиназы с оптимумом рН 3,7 -- 4,0; нейтральные протеиназы с оптимумом рН 6,5 -- 7,0; щелочные протеиназы с оптимумом рН > 8,0.

Из трех групп протеиназ наибольшего внимания технологов заслуживают нейтральные протеиназы. По активности они в несколько раз превосходят кислые и в условиях теста способны эффективно расщеплять белки клейковины. Одна из особенностей нейтральных протеиназ состоит в том, что они не растворяются в водных, солевых и буферных растворах. Они прочно связаны с белками клейковинного комплекса и извлекаются при частичном растворении клейковины в щелочном растворе. Максимальное извлечение нейтральных протеиназ происходит при обработке измельченного зерна, муки или лиофилизированной клейковины 0,35%-м раствором карбоната натрия. При подкислении щелочного раствора нейтральные протеиназы выпадают в осадок, а в надосадочной жидкости остаются их белковые ингибиторы. Таким образом, в созревших семенах пшеницы нейтральные протеиназы и их белковые ингибиторы образуют единый неактивный комплекс, связанный с клейковиной. Соотношение активности протеиназ и их ингибиторов в созревшем зерне определяет стабильность белкового комплекса, его устойчивость в процессе тестоведения.

Нейтральные протеиназы не активируются восстановленным глутатионом или цистеином и поэтому не могут быть отнесены к тиоловым ферментам, в отличие от кислых протеиназ. Нейтральные протеиназы ингибируются хлоридом натрия, фенольными соединениями, ароматическими аминокислотами, продуктами сахаро-аминной реакции (меланоидинами). Хлорид натрия является обязательным компонентом рецептуры и, внесенный в таком количестве, снижает активность нейтральных протеиназ и соответственно интенсивность автолиза на 60 -- 70%. В зависимости от качества муки и состояния ее клейковинного комплекса технолог может варьировать время внесения соли и тем самым регулировать интенсивность протеолиза. При переработке слабой муки необходимо как можно раньше вводить соль, тогда как для муки с чрезмерно крепкой клейковиной желательно активизировать протеолиз, и соль следует вносить на более поздних стадиях.

В связи с этим необходимо еще раз подчеркнуть важность изучения собственных эндогенных ферментных систем биологического сырья, факторов, влияющих на их активность с точки зрения их огромной роли в процессах, происходящих при созревании, хранении и переработке пищевого сырья.

Протеазы животного происхождения. Протеазам животного происхождения принадлежит огромная роль в процессах пищеварения. Они были одними из первых ферментов, которые получены в высокоочищенном кристаллическом состоянии и детально изучены. Именно они стали объектами для расшифровки структуры активного центра и механизма каталитической активности. Кроме того, эти ферменты, благодаря своей высокой специфичности, сами явились инструментами для расшифровки первичной структуры белков, изучения регуляторных функций протеаз в метаболизме клетки.

Трипсин (Н.Ф.3.4.21.4). Трипсин -- сериновая протеиназа, полученная в кристаллической форме. Молекулярная масса около 23 800 Да. Изо-электрическая точка 10,6; оптимум рН действия находится между 7,0 -- 9,0 для белков и синтетических субстратов.

Трипсин проявляет высокую специфичность к определенным пептидным связям. Он осуществляет гидролиз пептидных связей, образованных карбоксильными группами аргинина и лизина. Трипсин секретируется поджелудочной железой в виде зимогена -- трипсиногена, неактивного предшественника, и активируется либо энтерокиназой, либо аутокаталитически активным трипсином по механизму ограниченного протеолиза. Превращение трипсиногена (229 аминокислотных остатка и молекулярная масса около 24 000 Да) в трипсин (223 аминокислотных остатка) можно представить следующим образом: разрыв одной-единственной пептидной связи между Лиз -- Иле, отщепление N-концевого гексапептида Вал -- Асп -- Асп -- Асп -- Асп -- Лиз приводит к образованию активной формы фермента.

Высокоочищенный трипсин применяется для медицинских целей. Это одна из главных протеаз поджелудочной железы, которая в виде неочищенного панкреатина находит некоторое применение в пищевой промышленности для производства гидролизатов.

Химотрипсин (Н.Ф.3.4.21.1). Химотрипсин -- протеолитический фермент, секретируемый поджелудочной железой в тонкий кишечник в виде неактивного предшественника, называемого химотрипсиногеном. Химотрипсиноген (молекулярная масса около 25 000 Да) представляет собой полипептидную цепь, состоящую из 245 аминокислотных остатков и содержащую пять дисульфидных связей. Он активируется в тонком кишечнике под действием трипсина. При этом происходит гидролиз четырех пептидных связей и отщепление двух дипептидов( 14 -- 15 и 147 -- 148). В результате образуется активный химотрипсин, состоящий из трех полипептидных цепей, ковалентно связанных двумя дисульфидными мостиками.

В активном центре химотрипсина содержится остаток гистидина (57), аспарагиновой кислоты (102) и остаток серина (195). Молекулярная масса около 22 500 Да. Изоэлектрическая точка 8,3; оптимум рН в пределах 7,0 -- 9,0, что согласуется с естественными условиями его действия.

Специфичность химотрипсина заключается в том, что он предпочтительнее гидролизует пептидные связи, образованные ароматическими аминокислотами: тирозином, триптофаном, фенилаланином.

Этот фермент не применяется в пищевой промышленности как таковой, но является составной частью комплексных препаратов панкреатина.

Пепсин (Н.Ф.3.4.23.1). Пепсин вырабатывается слизистой желудка в виде пепсиногена (молекулярная масса около 42 000 Да). Пепсиноген превращается в активный пепсин под действием НС1 или аутокаталитически путем расщепления одной пептидной связи. Фермент получен в кристаллическом виде, его молекулярная масса 35 000 Да, оптимум рН действия 1,8.

Пепсин является кислой (карбоксильной) протеиназой. Его специфичность выражается в преимущественном гидролизе пептидных связей, образованных аминными группами фенилаланина и тирозина.

Пепсин имеет огромное значение как пищеварительный фермент, он входит в состав лекарственных ферментных препаратов, тонизирующих средств, жевательной резинки. В пищевой промышленности пепсин используют для свертывания казеина молока и для растворения белковой мути в пиве.

Реннин (Н.Ф.3.4.23.4). Этот фермент, имеющий много сходства с пепсином, содержится в соке четвертого отдела желудка телят. Реннин образуется из предшественника -- прореннина. Его молекулярная масса около 40 000 Да, изоэлектрическая точка около 4,5. Оптимум рН действия фермента 3,7.

Реннин представляет собой мощную протеазу, осуществляющую свертывание молока; он является основным компонентом неочищенных экстрактов и комплексных промышленных препаратов, используемых для этой цели.

Казеин молока (78% всех азотистых веществ молока) является фос-фопротеидом, содержащим около 6-10% углеводов. Он не осаждается ионами Са+2; действие реннина приводит к образованию макроглико-пептида и пар?-х-казеина. Последний осаждается в присутствии ионов Са+2 и способствует осаждению других фракций казеина.

Микробные протеазы. Число микроорганизмов, продуцирующих протеазы, чрезвычайно велико. Специфичность этих ферментов во многих случаях более широкая, чем специфичность хорошо изученных ферментов животного происхождения, что затрудняет их классификацию.

Микробные протеазы (грибные и бактериальные) находят широкое применение в различных отраслях промышленности. Среди них есть ферменты, имеющие оптимумы в нейтральной, кислой и щелочной зонах рН; некоторые из них проявляют трипсиноподобное действие, другие являются пепсиноподобными ферментами, третьи -- тиоловыми, четвертые имеют пептидазную активность и т. д. Многие из них были выделены в виде высокоочищенных препаратов и подробно охарактеризованы.

Наибольшее применение нашли щелочная сериновая протеаза из Bacillus licheniformis, которая используется в моющих средствах; протеаза из Мусог, которая заменила телячьи сычуги в производстве сыра, а также грибная протеаза из A. oryzae (в комплексе с амилазой), используемая в хлебопечении.

Протеазы -- наиболее важные промышленные ферменты. Уровень потребления препаратов микробных протеаз около 40% от всех используемых ферментов (табл. 8.3).

Таблица 8.3. Уровень потребления промышленных препаратов протеаз [Микробные ферменты и биотехнология (под ред. В. М. Фогарти), 1986]

Фермент	Доля проданных на рынке микробных протеаз, %
	Микробные ферменты	Всего ферментов
Бактериальная щелочная протеаза	37	30
Микробный реннин	7	6
Другие микробные протеазы	4	3,5
Животный реннин	--	11
Другие протеазы животного происхождения	--	2,5
Растительные протеазы	--	11
Другие (непротеолитические) микробные ферменты	52	36
Всего	100	100

Субтилизин Карлсберга (Н.Ф.3.4.21.14). Кристаллическая форма этого фермента впервые была получена в 1952 г., и с тех пор субтилизин является наиболее важной промышленно используемой микробной протеазой. Он продуцируется В. subtilis и В. licheniformis.

Этот фермент состоит из одной полипептидной цепочки (214 аминокислотных остатка), среди аминокислот отсутствует цистеин. Молекулярная масса фермента -- 27 277 Да, изоэлектрическая точка 9,4; оптимум рН 8,0 -- 9,0. Фермент отличается высокой рН-стабильностью в диапазоне от 5,0 до 11,0.

Субтилизин Карлсберга является сериновой протеиназой, обладает широкой специфичностью, предпочтительнее гидролизует пептидные связи, образованные ароматическими аминокислотами.

Ренниноподобные кислые протеазы. Наиболее важные с практической точки зрения кислые протеазы, используемые при производстве сыров, образуют культуры Mucor pusillus и Mucor mieher.

Протеазы из Mucor pusillus имеют молекулярную массу 30 000 Да, состоят из одной полипептидной цепочки, оптимум рН действия по казеину 4,5, по гемоглобину 4,0.

Протеазы из Mucor mieher имеют большую молекулярную массу 38 000 Да, содержат около 6% углеводов и проявляют максимальную активность по гемоглобину при рН 4,5.

Нейтральные протеазы аспергилловых грибов. Из культуры A. oryzae были выделены две нейтральные металлопротеиназы. Одна из них имеет оптимум рН 7,0, однако быстро инактивируется при 50°С. Другая обладает более низким оптимумом рН 5,5 -- 6,0, но проявляет высокую термостабильность (10 минут, 90°С -- остаточная активность 10%).

Протеазы из различных штаммов A. oryzae или из одних штаммов, но растущих при разных условиях, неодинаково влияют на процесс хлебопечения даже в том случае, если доза фермента стандартизирована. Это объясняется тем, что промышленные препараты содержат различные количества протеолитических компонентов из A. oryzae, а также влиянием многообразных внешних и внутренних факторов на протеолиз белков муки.

8.3 ПРИМЕНЕНИЕ ФЕРМЕНТОВ В ПИЩЕВЫХ ТЕХНОЛОГИЯХ

Ферментные препараты в отличие от ферментов содержат помимо активного фермента множество балластных веществ, в том числе и других белков. Кроме того, большинство ферментных препаратов являются комплексными, т. е. кроме основного фермента, имеющего наибольшую активность, в его состав входят другие сопутствующие ферменты. Однако существуют препараты и индивидуальных ферментов.

Название ферментного препарата включает название основного фермента и название микроорганизма-продуцента, с окончанием "-ин". Например: амилоризин -- основной фермент -- амилаза, продуцент

Aspergillus oryzae; протосубтилин -- основной фермент -- протеаза, продуцент Bacillus subtilis. Помимо этого, в названии обязательно отражается способ культивирования микроорганизма: Г -- глубинное; П -- поверхностное, а также степень очистки -- X (2Х; ЗХ; 10Х; 15Х; 20Х).

Применение ферментных препаратов в отраслях пищевой промышленности позволяет интенсифицировать технологические процессы, улучшать качество готовой продукции, увеличивать ее выход, а также сэкономить ценное пищевое сырье.

Ферментные препараты должны удовлетворять требованиям, предъявляемым конкретными технологиями не только по типу катализируемой реакции, но и в отношении условий их действия: рН, температуры, стабильности, присутствия активаторов и ингибиторов, т. е. тех факторов, которые обуславливают эффективность действия препарата в данной среде и позволяют правильно определить технологические режимы его применения.

В зависимости от цели применения к ферментным препаратам предъявляются определенные требования не только в отношении состава ферментов и оптимальных условий их действия, но и в отношении степени очистки, применяемых наполнителей, стоимости и ряда других параметров.

Очень важным моментом является оценка безопасности ферментных препаратов, и в первую очередь это касается микробных ферментных препаратов, которые требуют тщательного химического, микробиологического и токсикологического контроля. Особое место занимают ферментные препараты, получаемые из генетически модифицированных микроорганизмов. Основными ферментными препаратами, полученными методами генной инженерии и разрешенными к применению в пищевой промышленности, являются: ?-амилаза из В. stearothermophilys, экспрессированная в В. subtilis; ?-амилаза из В. megaterium, экспрессированная в В. subtilis; химозин А, полученный из штамма Е. coli К-12, содержащего ген телячьего прохимозина А.

В настоящее время в мире производится большое количество ферментных препаратов для разных отраслей пищевой промышленности, применяемых на различных стадиях технологического процесса. Различные фирмы выпускают ферментные препараты под разными коммерческими (торговыми) названиями. Однако работа по поиску новых продуцентов, созданию новых препаратов пролонгированного действия, очистке ферментных препаратов, повышению их стабильности и т. п. ведется весьма интенсивно.

Мукомольное производство и хлебопечение

Качество хлеба определяется особенностями химического состава муки и активностью ее ферментного комплекса. Значительное влияние оказывают также условия брожения и выпечки. Получить хлеб хорошего качества можно только в том случае, когда в процессе тестоведения гармонически сочетаются скорости микробиологических процессов и биохимических превращений. Ферментативный гидролиз высокомолекулярных компонентов сырья -- белков и углеводов -- в определенной степени способствует интенсификации этих превращений и, в конечном счете, положительно сказывается на качестве хлеба.

Если раньше в качестве источника ферментов использовали солод, то в последние годы все большие масштабы приобретает применение ферментных препаратов для регулирования биокаталитических процессов, протекающих при приготовлении теста и выпечки хлеба. Солод используется в основном для приготовления питательных сред (заварок) для жидких дрожжей, для активации прессованных дрожжей, а также при выпечке специальных сортов хлеба, например рижского.

Эффективность использования тех или иных ферментных препаратов в хлебопечении в значительной степени зависит от качества муки. Хлебопекарные свойства муки, в особенности качество клейковины и активность собственных ферментов, определяют требования к ферментным препаратам.

Основным препаратом, широко внедренным в хлебопекарную промышленность, является амилоризин П10Х. Препарат получают из поверхностной культуры A. oryzae осаждением этанолом. Он обладает амилолитической и протеолитической активностью. В соответствии с ГОСТом препарат должен удовлетворять следующим требованиям: амилолитическая способность -- 2000 ед/г препарата; осахаривающая способность -- 150 ед/г препарата; протеолитическая активность -- 7 ед/г препарата. Кроме того, особо важное значение для хлебопекарной промышленности имеет степень обсемененности препарата спорами Вас. mesentericus (картофельная палочка) и Вас. subtilis (сенная палочка). Существенный признак поражения хлеба картофельной палочкой -- тягучий мякиш и появление специфического неприятного запаха и вкуса. Поэтому на хлебозаводах при выработке хлеба с использованием препарата амилоризина П10Х каждую партию препарата проверяют на обсемененность спорами Вас. mesentericus (она не должна превышать величину 105). Одним из требований, обуславливающих стабильность ферментных препаратов, является их строгая стандартизация. За рубежом для этой цели используют различные наполнители -- сахар, крахмал, декстрины и т. п. В нашей стране наряду с этими наполнителями применяют сернокислый аммоний, именно он включен в ГОСТ на амилоризин П10Х.

Получить хлеб с надлежащей пористостью, объемом и окраской корки можно только в том случае, если на всех стадиях технологического процесса достаточно Сахаров, обеспечивающих интенсивность газообразования. Несмотря на присутствие в муке собственных Сахаров, хлеб, полученный за счет сбраживания только собственных Сахаров муки, не будет отвечать требованиям стандарта. При газообразовании только за счет собственных Сахаров муки максимум выделения диоксида углерода приходится на первые 1 -- 2 часа брожения. Между тем в процессе хлебопечения газообразование в тесте должно оставаться достаточно высоким и на последней стадии (расстойка и первые 10 -- 15 минут выпечки). При наличии в муке активной ?-Амилазы газообразование в процессе брожения теста идет по возрастающей и максимум приходится на 4 часа брожения. В противном случае для получения дополнительного количества сбраживаемых Сахаров и интенсификации процесса брожения необходимо применение амилолитических ферментных препаратов.

Однако значение Сахаров, безусловно, не ограничивается только процессом брожения. Огромную роль сахара играют в образовании красящих и ароматических веществ хлеба, участвуя в реакции меланоидино-образования.

Исключительно важны для хлебопечения и те изменения, которые претерпевает при тестоведении и расстойке белковый комплекс муки. Именно белковый комплекс и его ферментативные изменения определяют собой физические свойства теста. От белкового комплекса зависит как поведение теста при его замесе и расстойке (в частности, формоудержание), так и качество готового хлеба, его объем, пористость, структура мякиша.

Говоря о протеолитических ферментах, воздействующих на белковый комплекс муки, необходимо еще раз отметить эндогенные протеазы зерна пшеницы, среди которых наибольшее значение имеют нейтральные протеиназы, превосходящие по своей активности кислые протеазы в несколько раз и способные в условиях теста эффективно расщеплять белки клейковины.

Производство крахмала и крахмалопродуктов

Современная крахмал о-паточная промышленность, используя в основном традиционные источники сырья -- картофель и кукурузу, -- вырабатывает большой ассортимент продукции, включающий десятки наименований, которые используются в различных отраслях промышленности. В первую очередь это отрасли пищевой промышленности (кондитерская, хлебопекарная, молочная, консервная, пищеконцентратная и т.д.), а также другие отрасли (медицинская, текстильная, полиграфическая и др.).

Основными продуктами крахмало-паточного производства являются:

-- сухой крахмал;

-- модифицированные крахмалы: расщепленные крахмалы (окисленные и набухающие); замещенные крахмалы (фосфатные, ацетилированные, сополимеры крахмала);

-- декстрины;

-- различные виды крахмальных паток: карамельная (38 -- 44% РВ), карамельная низкоосахаренная (30 -- 34% РВ), глюкозная высокоосахаренная (44 -- 60% РВ), мальтозная (не менее 60% РВ);

-- глюкоза (техническая, пищевая, кристаллическая);

-- глюкозо-фруктозные сиропы.

В настоящее время в России ведется поиск новых источников крахмала и разработка новых технологических приемов с целью увеличения объема и расширения ассортимента вырабатываемых сахаристых крахмало-продуктов. Одним из т.аких перспективных видов крахмалсодержащего сырья является зерновое сорго, которое может быть использовано наряду с картофелем, кукурузой, рисом и пшеницей. Кроме того, ведется поиск и исследование новых амилолитических ферментных препаратов и способов ферментативного получения сахарных сиропов (гидролизатов) различного углеводного состава с учетом их целевого назначения.

Применение амилаз. Ферментные препараты амилаз нашли широкое применение в технологиях получения различных паток и глюкозы.

Первой технологической операцией производства крахмальных гидролизатов является гидролиз крахмала. Его проводят кислотным, кислотно-ферментативным или ферментативным способом. Во всех случаях процесс гидролиза включает стадии клейстеризации крахмала, разжижения крахмального клейстера и его осахаривания.

Кислотный гидролиз в настоящее время осуществляется в основном, с применением соляной кислоты. При этом можно достичь различной степени гидролиза и получить гидролизаты с различной степенью осахаривания. Однако кислотный гидролиз крахмала, несмотря на дешевизну и быстроту процесса, имеет весьма существенные недостатки: получаемые гидролизаты имеют невысокое качество из-за присутствия в них продуктов деградации белков, а также минеральных примесей, которые образуются при нейтрализации кислоты после гидролиза.

Кислотно-ферментативным методом производят разжижение крахмала сначала кислотой, для этого суспензию крахмала подкисляют соляной кислотой до рН 1,8-2,5, нагревают до 140°С в течение 5 мин. Затем нейтрализуют раствором кальцинированной соды до рН 6,0 -- 6,5 и охлаждают до 85°С, после чего добавляют ферментный препарат ?-амилазы и ведут гидролиз в течение 30 мин.

С целью разжижения на этой стадии используют ферментный препарат амилосубтилин Г10Х. Этот препарат выпускается в виде порошка;

содержит в основном ?-амилазу и ?-глюконазу. Оптимальные условия действия препарата: рН 6,2 -- 6,8, температура -- 85 -- 87°С.

Осахаривание полученного гидролизата также проводят с использованием ферментов. Для этой цели наиболее широко применяют порошкообразный ферментный препарат глюкавомарин Г20Х.

Препарат содержит в основном глюкоамилазу. Оптимальные условия действия препарата глюкоавомарина Г20Х: оптимум рН 4,0 -- 5,5; оптимум температуры 56 -- 58°С.

Ферментативный способ заключается в том, что 30 -- 35%-ю крахмальную суспензию прогревают до 55°С, доводят рН до 6,3 -- 6,5, добавляют раствор ферментного препарата амилосубтилина Г1 ОХ и раствор кальцинированной соды в качестве стабилизатора. Процесс разжижения длится в течение 1 часа при температуре 85 -- 90°С при непрерывном перемешивании. Далее стадия декстринизации и осахаривания проводится с использованием препаратов амилосубтилина ПОХ, амилоризина ПОХ и П10Х. Этот процесс идет 2 -- 3 ч при температуре от 53 до 85°С и рН 4,7 -- 5,5.

Дальнейшее осахаривание ведут при 60°С и оптимальном рН, а продолжительность осахаривания зависит от желаемого результата (требуемой степени осахаривания). Инактивацию фермента и остановку процесса гидролиза производят нагреванием продукта при 80°С в течение 20 мин.

Ферментный препарат амилоризин П10Х и ферментный препарат ами-лоризин ПОХ имеют оптимальные условия действия: рН 4,8 -- 5,3 и температуру 53 -- 55°С.

Применение глюкозоизомеразы. Фермент глюкозоизомераза (Н.Ф. 5.3.1.18) катализирует реакцию изомеризации глюкозы во фруктозу, то есть превращение альдозы в кетоформу за счет внутримолекулярного процесса окисления одной части молекулы и соответствующего восстановления другой части. Фермент обнаружен в растениях и продуцируется различными микроорганизмами. В промышленности преимущественно используются препараты глюкозоизомеразы, продуцируемые микроорганизмами, которые относятся к роду Streptomyces, а также к родам Aerobacter и Lactobacillus.

На реакции ферментативной изомеризации основана технология получения глюкозно-фруктозных сиропов из крахмала. Для получения глюкозно-фруктозных сиропов используют гидролизаты кукурузного крахмала с высоким содержанием крахмала (96 -- 98%), полученные с помощью ферментативного гидролиза. Процесс изомеризации под действием иммобилизованного (закрепленного на носителе) ферментного препарата глюкозоизомеразы длится в течение 20 -- 24 часов (до содержания в гидролизате 42% фруктозы и 52% глюкозы). В ходе процесса необходимо контролировать и поддерживать оптимальные условия для работы фермента: температура 60°С, рН 7,0 -- 8,5. Кроме того, для повышения активности фермента и его стабильности в субстрат добавляют ионы магния и кобальта (в виде растворимых солей), а также бисульфит для предупреждения развития микрофлоры. Ионы кальция ингибируют фермент.

Иммобилизованные препараты глюкозоизомеразы характеризуются двумя важными показателями: период полужизни препарата, то есть время, за которое активность фермента снижается наполовину (при оптимальных условиях проведения процесса), и продуктивность, то есть количество килограммов глюкозы (на абсолютное СВ), изомеризованное 1 кг или 1 л ферментного препарата при многократном использовании. Для большинства препаратов период полужизни -- 20 -- 35 сут, продуктивность -- до 2000 кг глюкозы на 1 кг фермента.

Полученные с помощью ферментативной изомеризации глюкозо-фруктозные сиропы обладают более высокой степенью сладости, по своим свойствам они близки к инвертному сахару, благодаря чему широко применяются при производстве детского и диетического питания, хлебобулочных изделий, безалкогольных напитков, кондитерских изделий, мороженого и т. д.

Кондитерское производство

Кондитерские изделия в зависимости от вида сырья и типа технологического процесса подразделяют на две группы: мучные и сахаристые. К мучным изделиям относятся печенье, галеты, крекеры, вафли, пряники, кексы, пирожные, рулеты, торты; к сахаристым -- какао-порошок, шоколад, конфеты, карамель, мармелад, пастила, ирис, драже, халва.

Применение ферментных препаратов в кондитерском производстве обусловлено, с одной стороны, видом и свойствами сырья, с другой -- технологической необходимостью и целесообразностью.

Применение протеаз и амилаз. Комплексные ферментные препараты, содержащие активные протеазы и ?-амилазу (например, амилоризин П10Х), применяют при производстве мучных кондитерских изделий с целью ускорения процесса брожения и корректировки физических свойств клейковины муки, изменения реологических свойств теста, ускорения его "созревания".

При производстве мучных кондитерских изделий с использованием дрожжей, таких как галеты, крекеры, кексы, целесообразно применение комплексных препаратов с преобладанием протеолитического действия, но содержащих в своем составе и ?-амилазу. Совокупное действие этих ферментов обеспечивают дрожжи сбраживаемыми сахарами и низкомолекулярными азотистыми веществами. Часть неиспользованных при брожении сахаров и азотистых веществ вступает в реакцию меланоидинообразования, благодаря чему галеты и крекеры приобретают интенсивную окраску и приятный аромат.

При производстве затяжного печенья с использованием химических разрыхлителей, когда много усилий направляется на расслабление клейковины, на протяжении длительного технологического процесса наряду с механическим воздействием на белки клейковины целесообразно использование протеолитических ферментных препаратов; ?-амилаза, присутствующая в качестве сопутствующего фермента как в грибных, так и бактериальных препаратах, не мешает их использованию.

В случае применения бактериальных протеолитических препаратов (например, протосубтилина ПОХ), содержащих в качестве сопутствующего фермента ?-амилазу, при производстве изделий подобных крекерам, галетам, печенью опасности излишней декстринизации не существует, т. к. фермент быстро инактивируется за счет того, что эти тонкие изделия быстро прогреваются до высокой температуры. При выработке кексов, а также бисквитного полуфабриката, выпекающихся в довольно толстом слое при невысокой температуре, в случае необходимости применения комплексных бактериальных препаратов следует осторожно подходить к их дозировке во избежание порчи мякиша. Необходимо также учитывать, что усиленное механическое воздействие на кондитерское тесто приводит к повышению атакуемости ферментами полимеров муки -- крахмала, белков, других веществ, усиливая тем самым конечный эффект гидролиза.

Для заварных и сырцовых пряников наибольшее значение имеет протеолиз, но наряду с потребностью в регулируемом расслаблении теста важным является и сохранение свежести (мягкости) продукта. Очевидно, что при производстве таких видов изделий целесообразно применение комплексных ферментных препаратов с преобладанием протеолитической активности.

При производстве бисквитного полуфабриката нужны комплексные ферментные препараты с умеренной активностью протеолитических ферментов и невысокой ?-амилазной (декстринирующей) способностью. При таком сочетании обеспечивается умеренное расслабление клейковины, способствующее лучшему подъему теста при выпечке и образованию тонкопористой воздушной структуры готовых изделий. Образование декстринов, в свою очередь, способствует сохранению их свежести.

Комплексные ферментные препараты, содержащие протеазы и ?-амилазу, используются для ускорения и облегчения обработки теста при приготовлении слоеного полуфабриката с целью улучшения его эластичных свойств и предупреждения усадки при выпечке. Кроме того, применение таких ферментных препаратов при производстве вафель позволяет оптимально снизить вязкость вафельного теста, способствует получению тонких хрустящих вафельных листов.

Применение инвертазы. Препараты инвертазы, как уже отмечалось, получают из дрожжей S. cerivisiae или S. carlsbergensis путем автолиза. Они представляют собой суспензию спиртоосажденной инвертазы в 25%-м, 50%-м растворе глицерина или 70%-м растворе сорбита. Оптимум рН действия препарата 4,5 -- 5,5, что вполне приемлемо для его использования в различных технологиях производства сахаристых изделий.

Инвертаза применяется в кондитерской промышленности для производства отливных помадных корпусов конфет, круглых помадных корпусов и жидких фруктовых начинок, таких как вишневый ликер. В каждом случае ее применение обусловлено необходимостью получить полумягкую или жидкую консистенцию при высоких концентрациях сахара (78%), предотвращающих брожение. Ускорение или замедление действия инвертазы достигается путем изменения концентрации вносимого препарата, количества воды и температурного режима. При высокой температуре инвертаза инактивируется, и даже при температуре отливки (65°С) активность инвертазы снижается на 12% в течение 30 мин и на 24% в течение 60 мин. Некоторые сорта конфет, например, конфеты с вишневым ликером, невозможно изготовить без инвертазы. В случае производства помадной массы из кокосовых орехов применение инвертазы обусловлено и повышенной влагоудерживающей способностью фруктозы, образующейся под действием этого фермента.

Применение липазы. Молочные ингредиенты широко применяются при производстве кондитерских изделий, они в значительной мере обуславливают их аромат, вкус и питательную ценность. В усилении аромата молочного шоколада, карамели, ириса, сливочного крема наряду с другими компонентами принимают участие и свободные жирные кислоты, образующиеся под действием липаз. При низких уровнях свободных жирных кислот аромат изделий усиливается, но новые ароматы не образуются; при средних -- появляется аромат масла; при высоких -- аромат сыра. Подобные ароматические вещества могут быть получены путем модификации масел или жиров с применением препаратов липаз различного происхождения (животных, растительных, микробных).