Рис. 2.18. Механизм образования изопептидных связей

Тепловая денатурация белков является одним из основных физико-химических процессов, лежащих в основе выпечки хлеба, печенья, бисквитов, пирожных, сухарей, сушки макаронных изделий, получения экструдатов и сухих завтраков, варки, жарения овощей, рыбы, мяса, консервирования, пастеризации и стерилизации молока. Данный вид превращений относится к полезным, так как он ускоряет переваривание белков в желудочно-кишечном тракте человека (облегчая доступ к ним протеолитических ферментов) и обуславливает потребительские свойства пищевых продуктов (текстуру, внешний вид, органолептические свойства). В связи с тем, что степень денатурации белков может быть различной (от незначительной до полного изменения расположения пептидных цепей с образованием новых ковалентных -S-S-связей), то и усвояемость полимеров может не только улучшаться, но и ухудшаться. Параллельно могут изменяться физико-химические свойства белков. Для хлопковых семян, подвергнутых влаготепловой обработке, зафиксирован, например, переход растворимого азота из одной формы в другую:

Термическая обработка белоксодержащей пищи при 100- 120°С приводит не к денатурации, а к разрушению (деструкции) макромолекул белка с отщеплением функциональных групп, расщеплением пептидных связей и образованием сероводорода, аммиака, углекислого газа и ряда более сложных соединений небелковой природы. Так, стерилизация молочных, мясных и рыбных продуктов при температуре выше 115°С вызывает разрушение цистеиновых остатков с отщеплением сероводорода, диметилсульфида и цистеиновой кислоты:

H2S	CH3-S-CH3	HO2C-CH(NH2)CH2SO3H

Реакции дезамидирования аспарагиновой и глутаминовой аминокислот и дегидратации глицина могут быть причиной образования новых ковалентных связей в белках, так как образуется пирролидонкарбоновая кислота и 2,5-дикетопиперазин (дикетопиперазина много в обжаренных бобах какао):

Среди продуктов термического распада белков встречаются соединения, придающие им мутагенные свойства. Термически индуцированные мутагены образуются в белоксодержащей пище в процессе ее обжаривания в масле, выпечки, копчения в дыму и сушки. Мутагены содержатся в бульонах, жареной говядине, свинине, домашней птице, жареных яйцах, копченой и вяленой рыбе. Некоторые из них вызывают наследственные изменения в ДНК, и их воздействие на здоровье человека может быть от незначительного до летального.

В экстрактах, выделенных из жареной рыбы и мяса, еще в 70-х гг. найдены продукты пирролиза аминокислот, образующиеся обычно при 500-600°С. Продукты идентифицированы как Трп-П-1 и Трп-П-2 из триптофана, Фен-П-1 из фенилаланина, Глу-П-1 и Глу-П-2 из глутаминовой кислоты, Лиз-П-1 из лизина, Орн-П-1 из орнитина:

Другая группа мутагенных соединений в белковой пище открыта в 80-х гг. в умеренно нагретом мясе (ниже 200°С) и пищевых бульонах:

Токсические свойства белков при термической обработке выше 200°С или при более низких температурах, но в щелочной среде, могут обуславливаться не только процессами деструкции, но и реакциями изомеризации остатков аминокислот из L- в D-форму. Присутствие D-изомеров понижает усвояемость белков. Например, термообработка казеина молока при температуре около 200°С снижает биологическую ценность продукта на 50%.

В сильнощелочных средах, особенно при высоких температурах, некоторые остатки аминокислот претерпевают ряд специфических превращений. Так, аргинин превращается в орнитин, цитруллин, мочевину и аммиак, а цистеин - в дегидроаланин с выделением сероводорода:

Реакционноспособный дегидроаланин конденсируется с остатками лизина, орнитина и цистеина боковых цепей и образует межмолекулярные поперечные связи в белках:

В реакцию конденсации могут вступать остатки аргинина, гистидина, треонина, серина, тирозина и триптофана. Питательная ценность белков с новыми поперечными связями ниже, чем у белков с нативной структурой, поэтому образование их в технологических процессах производства пищевых продуктов нежелательно. К тому же в опытах на крысах показано, что образование, например, лизиноаланина стимулирует нефрокальциноз, диарею и облысение.

Обработка сырья растворами щелочей широко используется при получении изолятов и концентратов белков. Чем ниже значение рН, температура и время обработки, тем выше содержание незаменимых аминокислот в белке. Например, при повышении рН раствора с 8,5 до 12,5 при экстракции белка из пшеничных отрубей количество лизина в нем уменьшается на 40%, треонина - на 26%, а валина - на 24%. Мягкие температурные режимы предохраняют от образования в больших количествах нежелательных аминокислотных фрагментов. В то же время среди специалистов обсуждается вопрос о введении предельно допустимых концентраций лизиноаланина (например, 300 мг на 1 кг) в целях обеспечения безопасности белоксодержащей пищи.

Неблагоприятные погодные условия при созревании зерна, поражение его вредителями и микрофлорой, пониженная или повышенная температура при хранении и переработке сырья и полуфабрикатов, механические, физические и химические факторы (перемешивание, гомогенизация, замес, инфракрасное облучение, ультразвук, действие солей, диоксида углерода, газообразных азота и этилена и т. д.) усиливают структурные перестройки белков, которые могут разрушать природные белково-липидные взаимодействия. Высвобождающиеся липиды, подвергаясь окислительной порче, способны инициировать образование ковалентных меж- и внутримолекулярных связей в белках и новых полимерах:

R - H + LO?22; > R? + L02H;	R? + R? > R-R;
R - R + LO?2 > R - R? + L02H;	R - R? + R? > R-R-R	и т. д.

Остатки тирозина в присутствии гидропероксидов (LO2H) могут превращаться в сульфоксиды и сульфоны, остатки цистеина - в сульфиновые, сульфоновые кислоты, а остатки триптофана - в гидрокси-?-индолилаланин и N-формилкинуренин. Все реакции окисления связаны с потерей незаменимых аминокислот. Окислительная порча белков особенно опасна при переработке масличного и жирового сырья. Торможение реакций можно достигать добавлением оксидантов, ферментных препаратов или повышением активности собственных ферментов сырья в целях вывода липидов из взаимодействия с белками.

Использование новых и традиционных технологических процессов без глубокого изучения влияния их на молекулярные основы структуры белков, с одной стороны, опасно для здоровья людей, а с другой - неэффективно с точки зрения обеспечения качества пищевых продуктов. Примером может служить научно обоснованное применение аскорбиновой кислоты для улучшения качества хлеба.

По современным представлениям, аскорбиновая кислота, окисляясь кислородом воздуха в дегидроаскорбиновую кислоту, окисляет глютатион (Г-SH), превращая его в окисленную форму (Г-S-S-Г). Это предохраняет глютатион от участия в сульфгидрильно-дисульфидном взаимодействии с белками клейковины во время образования теста. Сульфгидрильные группы пшеничного белка взаимодействуют друг с другом с образованием дисульфидносвязанных белковых цепей и качество изделий улучшается.

Наряду с окислительными процессами в технологических процессах, предусматривающих механические или физические воздействия на белковые вещества сырья (замес, гомогенизация, ультразвук и т.д.), протекают и другие превращения, характер которых зависит от природы, степени и способа этих воздействий. На начальных стадиях замеса хлебного теста и при измельчении семян зерна наблюдается тепловая агрегация белков, при усиленной механической обработке теста возможна деструкция последних с разрывом дисульфидных и даже пептидных связей.

Агрегирующая и комплексообразующая способность белков пшеницы является одним из важных показателей, обеспечивающих им ведущую роль в формировании клейковины в процессе ее отмывания из муки и тестоведения. Параметры агрегации определяют по методу японских исследователей (Т. Arakawa, D. Yonezawa, 1975). Для этого смешивают растворы клейковинных белков в 0,01 н уксусной кислоте и 0,2 М натрий-фосфатного буферного раствора (рН 5,6), содержащего 2 М NaCl. Измеряют оптическую плотность раствора (? = 350 нм) во времени агрегации процесса и рассчитывают коэффициент начального этапа агрегации (К) и показатель агрегации (t10/c), характеризующий степень помутнения раствора в течение 10 мин.

Константу начальной скорости агрегации рассчитывают по уравнениям:

К =

r
c4

и ?3 = 3rt + ?03,

где ? - оптическая плотность раствора при ? = 350 нм; r - постоянная, отражающая изменение ?3 в первые 1-1,5 мин агрегации; t - время агрегации; ?0 - оптическая плотность при t = 0; с - концентрация белка, %.

Параметры агрегации белков сильных пшениц, характеризующиеся более "плотной" пространственной упаковкой структуры, выше по сравнению со слабыми, имеющими более "рыхлую" организацию молекул (рис. 2. 19). Процесс образования белковых агрегатов по ходу технологического процесса приготовления изделий из муки интенсивнее у крепкой клейковины, чем у слабой.

Константы агрегации уксуснорастворимых белков, экстрагированных из предварительно отмытой клейковины и теста, выше, чем белков, выделенных из муки [В. Колпакова, Е. Молчанова, 1991]. Следовательно, при гидратации белков в ходе технологического процесса и, в частности, при замесе теста или отмывании клейковины водой происходят внутри- и(или) межмолекулярные превращения, связанные с изменением структуры молекул, приводящим к снижению агрегирующих свойств последних.

Наиболее высокие показатели агрегации наблюдаются у ?- и ?-компонентов глиадина, наименее - у ?-компонентов. Способность к агрегации возрастает по мере увеличения подвижности полипептидов и уменьшения их молекулярной массы. Очень высокой способностью образовывать надмолекулярные ассоциаты обладают быстроподвижные ?-глиадины с молекулярной массой 31 000.

Агрегирующая способность белков взаимосвязана с особенностями аминокислотного состава. Так, суммарный глиадин с более повышенной агрегирующей способностью содержит меньше заряженных групп, а ?-глиадины, обладающие низкой степенью агрегации, богаты пролином, фенилаланином, амидогруппами и полярными аминокислотными остатками. Это определяет высокую способность их к взаимодействию с другими компонентами муки и, прежде всего с липидами и липидоподобными соединениями (дигалактозилдиглицерид). Комплексообразование последнего с ?-глиадинами за счет водородных связей обуславливает газоудерживающую способность теста и объем хлеба. Имеются данные, что структура комплексов белки-липиды имеет сходство со структурой белок-липидных мембран.

В агрегации и взаимодействии молекул клейковинных частиц с другими компонентами муки в технологических процессах производства хлеба, макаронных изделий, печенья и т.д., наряду с водородными связями, принимают участие гидрофобные, ионно-электростатические и дисульфидные связи.

Способность белков к формированию высоко агрегированных и надмолекулярных образований зависит от рН, ионной силы и состава среды (присутствие денатурирующих, солюбилизирующих, восстанавливающих и других агентов).

С повышением рН от 4,0 до 9,1 агрегация белков злаковых культур (пшеницы, ржи, ячменя) повышается. Чем больше концентрация нейтральных солей, тем агрегирующая способность белков выше. Отсюда, определенные дозировки поваренной соли способны регулировать образование или разрушение макромолекул клейковинного белка в состоянии пространственно организованной структуры пшеничного теста при производстве, например, хлеба.

Определенное влияние на агрегативное состояние запасных белков оказывают детергенты (ПАВ) различной природы: анионные, катионные, нейтральные. В присутствии анионного детергента в кислой среде, когда молекулы имеют положительный заряд, агрегация белка максимальна. Действие же катионных и нейтральных детергентов в направлении усиления или ослабления агрегации неоднозначно и зависит от рН среды и их концентрации.

В целом же, агрегирующая способность запасных белков различных зерновых культур в ходе технологического процесса может быть представлена в виде интегральной суммы множества взаимодействий, способствующих или препятствующих образованию надмолекулярных структур:

?A = ?Аи +?Аг+?Ав +?Ан +?А? +?Ад + ...,

где ?Аи - агрегация белка за счет ионно-электростатических сил; ?Аг - гидрофобных взаимодействий; ?Ав - водородных связей; ?Ан - набухания (гидратации); ?А? - изменения регулярных структур; ?Ад - содержания дисульфидных связей.

Степень участия того или иного фактора в изменении агрегативного состояния белков, а с ним и реологических свойств теста и качества хлеба, зависит от исходных физико-химических свойств и структурных особенностей белков муки, технологических факторов процесса (температура, степень механического воздействия, рН среды и т. д.), химической природы и количества дополнительного сырья, улучшителеи и пищевых добавок.

Огромное значение для изменения свойств и агрегативного состояния белков в ходе технологического процесса приготовления теста имеет дисульфидно-сульфгидрильный обмен:

P1S-SP2 + P3SH > Р1S - SР3 + P2SH

Считают, что лабильность дисульфидных связей обеспечивает образование новых прочных межмолекулярных связей и релаксацию (ослабление) напряжения структур клейковины при замесе теста.

Сильная мука, содержащая крепкую клейковину, требует больше времени замеса, так как она содержит больше дисульфидных связей и меньше SH-групп, чем слабая.

В процессе созревания муки при ее отлежке, а также под влиянием окислителей типа броматов, улучшение реологических свойств клейковины объясняется увеличением содержания S-S-связей и уменьшением, соответственно, SH-групп. В присутствии восстанавливающих агентов (сульфит натрия) реологические свойства клейковины ухудшаются, как это имеет место в прорастающем зерне или в процессе приготовления теста из зерна, пораженного клопом-черепашкой. Во всех случаях показатели качества и реологические характеристики теста взаимосвязаны с изменением в соотношении S-S-связей и SH-групп в белках.

Процессы образования или распада S- S-связей в созревающем и прорастающем зерне пшеницы протекают при участии специфических ферментов тиол-дисульфидного обмена: тиол- кислородоксидоредуктаза (КФ 1.8.3.2) и тиол-протеиндисульфидредуктаза (КФ 1.8.4.2). Предполагают, что направленное регулирование активности указанных выше ферментов в процессе приготовления теста является действенным приемом улучшения технологических свойств муки в целях обеспечения надлежащего качества хлеба [Т. Горпинченко, 1995].

В результате действия протеолитических ферментов в технологическом потоке производства пищевых продуктов белковые вещества так же претерпевают ряд существенных изменений. Так, на стадии солодоращения при производстве пива в эндосперме ячменя наблюдается гидролиз глобулина (эдестин), альбумина (лейкозин), проламина (гордеин) и глютелина с накоплением азотистых соединений с более низкой молекулярной массой (пептиды, аминокислоты). В результате в зерне накапливается растворимая, коагулируемая и аминная формы азота, тогда как в зародышевом листке и ростках зерна, наоборот, увеличивается количество белкового азота за счет процессов синтеза.

Высокомолекулярные фракции белков при прорастании зерна расщепляются под действием ферментов эндопептидаз по схеме:

и экзопептидаз (дипептидаз и полипептидаз). Полипептидазы включают аминопептидазы (а-аминоацилпептидгидролазы, 3.4. 1 ), для действия которых необходимы свободные аминогруппы (- NH2), и карбоксипептидазы (пептидиламинокислотные гидролазы, 3.4.2), требующие для гидролиза свободные карбоксильные группы (- СООН).

Технологические режимы проращивания зерна предусматривают оптимальные условия (рН, температура) действия гидролитических ферментов для обеспечения накопления низкомолекулярных азотистых соединений для питания дрожжей сусла.

В традиционной технологии производства хлеба и мучных кондитерских изделий из муки нормального качества при тестоведении не протекают глубокие реакции гидролиза белков, свидетельствующие об изменении их первичной структуры, тогда как слабые процессы пептизации низкомолекулярных азотистых соединений, являющихся продуктами незавершенного синтеза в зерне, могут иметь место. Изменения структуры белков в процессе тестоприготовления ограничиваются, как правило, дезагрегацией, агрегацией молекул и изменением высших уровней ее организаций (вторичная, третичная, четвертичная структуры).

2.10 КАЧЕСТВЕННОЕ И КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ БЕЛКА

Присутствие белков в пищевых объектах устанавливается с помощью качественных реакций, которые условно разделяют на две группы: а) цветные реакции; б) реакции осаждения.

Среди первой группы различают универсальные реакции (биуретовая на пептидные связи и нингидриновая на ?-аминокислоты) и специфические, обусловленные присутствием в белках остатков определенных аминокислот. Так, ксантопротеиновая реакция свидетельствует о наличии в белках остатков ароматических аминокислот, реакция Паули - гистидина и тирозина, Адамкевича и Вуазене - триптофана, нитропруссидная - цистеина, а реакция Сакагучи - аргинина. По результатам специфических реакций ориентировочно можно судить о пищевой ценности белков.

Во второй группе реакций белки осаждают действием солей, органических растворителей, концентрированных кислот, щелочей, ионов тяжелых металлов, температуры и в изоэлектрической точке. Белки в растворенном состоянии крайне неустойчивы, поэтому при добавлении органических растворителей (спирт, ацетон), концентрированных растворов нейтральных солей щелочных металлов и воздействии физических факторов (нагревание, облучение, ультразвук) гидратная оболочка разрушается и они выпадают в осадок.

Так как белковые вещества сырья (муки, крупы, молока, мяса), включая ферменты, часто являются определяющими в обеспечении качества пищевых изделий, то для изучения физико-химических, биохимических и физиологических свойств этих соединений обязательным условием является получение белков в индивидуальном и, по возможности, неденатурированном состоянии. Белки обычно теряют природные (нативные) свойства (растворимость, гидратацию, ферментативную активность и т.д.), подвергаясь денатурации под влиянием различных факторов. Типичным примером необратимой денатурации белков является выпадение их в осадок под действием ТХУ. Длительный контакт со спиртом также приводит к необратимой денатурации белка. Денатурирующее действие различных факторов на белки можно смягчить, если проводить операции выделения их при температуре не выше +4°С.

Методы выделения и очистки белков. Общая схема операций по выделению белков сводится к измельчению биологического материала (гомогенизации), экстрагированию и собственно выделению, то есть очистке и получению белка в индивидуальном состоянии. При изучении метаболических процессов в живых организмах (в созревшем зерне, плодах, овощах) морфологическая и биохимическая целостность клеток и тканей сохраняется в максимальной степени, тогда как при исследовании состава сырья и готовых пищевых продуктов потеря целостности структуры несущественна. Гомогенизацию объектов следует рассматривать как начальную стадию выделения белков, но способ ее определяется постановкой задачи. Например, анализ ферментов из растительных материалов часто затруднен тем, что при гомогенизации экстрагируется большое количество фенолов, которые взаимодействуют с карбонильными группами пептидных групп при помощи водородных связей и вызывают денатурацию белка и потерю ферментами своей активности. Добавление в экстракт поливинилпирролидона, образующего с фенолами нерастворимые комплексы, предотвращает инактивацию ферментов.

Разрушение клеточной структуры осуществляется тщательным измельчением материала в гомогенизаторах, мельницах, попеременным замораживанием и оттаиванием, применением ультразвуковых высокочастотных колебаний, пресс-методов с использованием высоких давлений и метода "азотной бомбы". В последнем случае клетки насыщаются азотом под давлением, которое затем сбрасывается и клетки разрушаются. Эффективность гомогенизации зависит не только от способа разрушения клеточных структур, но и от вида анализируемого материала. Животные клетки разрушаются относительно легко, особенно в отсутствие сосудистой и соединительной ткани, тогда как растительные и микробные - из-за присутствия клеточных стенок - трудно. В таком случае применяют методы растирания материала с твердыми веществами (песок, абразивный порошок) или обработку клеточных стенок лизоцимом или ферментными препаратами, содержащими целлюлазу, хитиназу и липазу. Гомогенизацию рекомендуется проводить в холодных комнатах или с использованием льда.

Экстракция белков может быть совмещена с гомогенизацией клеток и тканей либо проведена отдельно, если продукт заранее измельчен. Для определения ферментативной активности белка достаточно одноразовой экстракции, тогда как для количественного определения белковых фракций зерна - трех- или пятикратной. Условия экстрагирования белков (время, гидромодуль, температура и т.д.) подбираются эмпирически, основываясь на методиках ведущих научных школ.

Большинство белков животных тканей хорошо растворимы в 5-10% растворах солей, тогда как для перевода в раствор белков зерновых культур применяют более широкий набор растворителей. Для этого используются буферные системы со значениями рН от кислых до слабощелочных (фосфатные, боратные, цитратные, трис-HCl), органические растворители и неионные детергенты, разрывающие белок-липидные или белок-белковые связи:

Растворители подбираются с учетом разрыва в белках определенных типов связей. Так, уксусная кислота ослабляет ионные связи, сообщая молекулам одноименные положительные заряды, мочевина - водородные и гидрофобные, салицилат натрия и ДДС-Na - гидрофобные и ионные, а водные растворы спиртов - водородные и гидрофобные взаимодействия. Органические растворители разрывают белок-липидные связи.

При изучении физико-химических свойств белков и их превращений в пищевых системах широко используют методы фракционирования и очистки от небелковых соединений. Они основаны на различиях таких свойств белков, как размер молекул, растворимость, заряд и сродство к специфическим химическим группам.

Осаждение белков из раствора под действием солей щелочных и щелочноземельных металлов называют высаливанием. Для высаливания чаще применяется сульфат аммония, под влиянием которого белки, как правило, сохраняют растворимость и ферментативную активность. Главную роль при высаливании играет не природа солей, а валентность ионов, действие которых оценивается по ионной силе (?):

? = ? ?CV2,

где С - концентрация каждого вида иона; V - валентность ионов.

Глобулины выпадают в осадок при 50% насыщении, альбумины - при 100% насыщении растворов солей, а при ступенчатом фракционировании (20-100% насыщения) выпадают белки и других классов (проламины, глютелины).

В практике выделения и очистки белков используются различные типы хроматографии: адсорбционная, распределительная, ионообменная и хроматография по сродству. Адсорбционная хроматография основана на различиях в полярности белков. В колонке вместе с буферным раствором упаковывают адсорбент, на который в небольшом объеме растворителя наносят исследуемый образец. Компоненты разделяемой смеси адсорбируются, затем элюируются с помощью буферного раствора с увеличивающейся концентрацией или полярностью. Фракции белка собирают с помощью автоматического коллектора фракций.

В распределительной хроматографии, в отличие от адсорбционной, в качестве неподвижной фазы выступает водный слой, удерживаемый твердой фазой (силикагель, бумага). Разделяемые вещества многократно распределяются между водным слоем и движущейся фазой растворителя и с разной скоростью перемещаются подлине колонки или бумаге. Распределительную хроматографию на бумаге часто используют для анализа пептидов и аминокислот. Адсорбентом служат нити целлюлозы, а растворителем - смесь органических растворителей, например: бутиловый спирт-уксусная кислота-вода. Хроматограмму проявляют, высушивают и анализируют местонахождение разделяемых компонентов тем или иным способом.

Методом ионообменной хроматографии белки или аминокислоты разделяют на основе различий в общем заряде молекул. Если белок в нейтральной среде (рН 7) имеет положительный заряд, то он связывается на колонке с ионообменником, содержащим фенольные, сульфо- и карбоксильные группы (катионообменник), если отрицательный, то - на колонке с ионообменником, представленным аминами или органическими основаниями (анионообменник). Чаще всего для фракционирования белков используют производные полистирола и целлюлозы:

Положительно заряженный белок снимается с колонки с помощью раствора хлористого натрия или изменением рН элюирующего буфера. При этом ионы натрия конкурируют с положительно заряженными группами белков. Белки с меньшим положительным зарядом вымываются с колонки первыми, с большим зарядом - последними.

Хроматография по сродству (аффинная хроматография,) основана на принципе избирательного связывания белков со специфическими веществами (лигандами), прикрепленными к носителю. Лиганд (глюкозу) ковалентно присоединяют к носителю (проводят иммобилизацию) и наносят на колонку исследуемую белковую смесь. Несвязавшиеся белки удаляют соответствующим буфером, а нужный белок элюируют раствором, содержащим лиганд в очень высокой концентрации. При этом присоединенные к колонке остатки глюкозы в молекуле белка замещаются на глюкозу, находящуюся в растворе (рис. 2.20).

Гель-фильтрация, или метод молекулярных сит заключается в пропускании белков через колонку с гелем сефадекса или других типов (агарозных, полистирольных). Применяются также пористые стеклянные шарики и пористый кварц (порасил). Наибольшее распространение получили декстрановые гели (сефадекс), являющиеся продуктом поперечного сшивания полисахаридных цепочек декстрана. Зерна сефадексов разных номеров содержат поры разных размеров, в которые могут проникать белки с определенной молекулярной массой. Низкомолекулярные белки распределяются в растворенном виде как внутри частиц полимера, так и между ними, а высокомолекулярные - только между частицами, поэтому вторые быстрее проходят через колонку и первыми вытекают из нее (рис. 2.21). В итоге белки распределяются по молекулярной массе и могут быть собраны в виде отдельных хроматографических фракций (рис. 2.22).

Принцип методов электрофоретического разделения заключается в способности молекул пептидов и аминокислот, находясь в заряженной форме в виде катионов (+) или анионов (-), передвигаться в электрическом поле с определенной скоростью. Кроме того, молекулы с близкими зарядами, но разными размерами, отличаются отношением заряда к массе. Все эти различия и обуславливают высокую разрешающую способность электрофоретических методов. Скорость миграции белков в электрическом поле (V) зависит от напряжения электрического поля(?), заряда белков (z) и сопротивления трения (О-Сопротивление трения определяется размерами, формой белка, значениями рН и концентрацией буфера. Указанные величины связаны между собой соотношением: V = ? · z / f.

Впервые метод электрофореза был разработан Тизелиусом с применением бумаги в качестве носителя и специальных оптических устройств, регистрирующих передвижение границы раздела раствора белка и растворителя по показателям преломления (фронтальный электрофорез). В настоящее время распространены методы зонального электрофореза, предусматривающие использование крахмальных и полиакриламидных гелей (ПААГ). Наиболее распространенным методом фракционирования белков является диск-электрофорез (от англ, discontinuous - прерывистый) в ПААГ, при котором используется пара буферных растворов с различными значениями рН в присутствии ДДС-Na и гели различной пористости (концентрирующие и разделяющие) (Laemmli, 1970). Для обнаружения белков гели обрабатывают красителями: амидовым черным 10В, кумасси синим R-250. Интенсивность окраски, а по ней количественное содержание белковых фракций, определяют сканированием на денситометре.

Для электрофоретического разделения белков и пептидов успешно применяется двумерный электрофорез в ПААГ. В соответствии с этим методом смесь компонентов разделяют сначала в столбиках геля электрофорезом в горизонтальном направлении, затем в гелевых пластинах - в вертикальном (рис. 2.23). При разделении белков, например гороха, этим методом удалось получить более 150 различных компонентов.

Очень высокую разрешающую способность имеет метод изоэлектрического фокусирования белков, в основе которого лежит фронтальный электрофорез, проводимый на колонке одновременно в градиенте рН и напряжения. Колонку предварительно заполняют носителями с синтетическими смесями полиаминополикарбоновых кислот (амфолитами), затем сверху в нее подают раствор сильной кислоты, снизу - сильнощелочной раствор для того, чтобы установить градиент рН с крайними значениями, соответствующими рН кислого и щелочного растворов. Амфолиты прекращают движение по колонке, когда их суммарный заряд становится равным нулю, и тем самым стабилизируют исходный градиент рН. В подготовленную колонку вносят образец исследуемой смеси, компоненты которой распределяются по зонам со значениями рН, характерными их изоэлектрическим точкам.

В химии пищевого белка применяют и другие разновидности электрофоретическогоразделения(иммуноэлектрофорез, изотахофорез), а также метод пептидных карт и ультрацентрифугирование. Метод пептидных карт (отпечатков пальцев) относится к методам двумерного разделения и наиболее часто используется для анализа пептидов. Пептиды получают избирательным гидролизом белков, затем на бумаге их разделяют в горизонтальном направлении электрофорезом, в вертикальном - распределительной хроматографией. Пептиды окрашивают нингидрином, элюируют и определяют аминокислотный состав.

В методе ультрафильтрации белки в градиенте плотности распределяются на разных уровнях центрифужной пробирки в процессе седиментации (осаждения) в виде отдельных зон. Для создания градиента используют соли тяжелых металлов и растворы сахарозы. Метод широко применяется для определения молекулярных масс белков по константе седиментации (S), которая зависит от массы и формы белковых частиц:

S = v/(w2 · r),

где v - скорость перемещения границы растворитель-белок, см/с; w- угловая скорость ротора, рад/с; г - расстояние от центра ротора до середины ячейки с раствором белка.

Величина S, равная 1 · 10-13 с, принята за единицу и названа сведбергом (S) в честь Т. Сведберга, впервые сконструировавшего ультрацентрифугу.

Очистка белков от низкомолекулярных соединений (солей, сахаров, аминокислот) осуществляется методами диализа, гель-фильтрации на сефадексе G-25, кристаллизации, ультрафильтрации и с помощью полых волокон. При диализе используют полупроницаемые мембраны (целлофан, коллодийная пленка), через которые белки не диффундируют и остаются внутри диализного мешочка. Более мелкие молекулы проходят через поры диализной мембраны и выходят в диализат. В методе ультрафильтрации, который применяется, например, в производстве сывороточных белков молока, соевых белковых изолятов, по обе стороны мембраны создается разность давлений за счет продавливания фильтруемого белкового раствора. В качестве мембран используются целлюлозные пленки и нецеллюлозные полиэлектролитные комплексы. Аналогично мембранам по принципу молекулярного сита действуют и полые волокна. Белковый раствор помещается с внешней стороны волокон, и создается разность давления за счет повышения его в растворе или понижения внутри их.

Гомогенность белка определяется на последнем этапе выделения и очистки с применением по меньшей мере двух методов, оценивающих то или иное физико-химическое свойство. Наиболее достоверными являются ультрацентрифугирование в градиенте плотности, диск-электрофорез в ПААГ, иммунохимические методы и растворимость. Если белок при электрофорезе представлен только одной полосой и обладает при этом максимальной биологической активностью, то он считается гомогенным. Для гомогенного белка на кривой растворимости (зависимости растворенного белка от общего его количества в постоянном объеме растворителя) имеется только один перегиб, тогда как для гетерогенного - столько, сколько в нем индивидуальных компонентов.

Содержание белка в пищевых объектах обычно определяют по количеству азота с использованием метода Кьельдаля. С целью упрощения и сокращения длительности анализа этот метод с момента его разработки (1983) неоднократно модифицировался с применением различных катализаторов и условий минерализации. На основе модифицированных методов созданы высокопроизводительные автоматические анализаторы типа "Кьельфос", стоимость определения содержания белка на которых и сегодня остается высокой. Существует и некоторая условность в методе Кьельдаля при расчете количества белка, заключающаяся в использовании переводного коэффициента. Однако, несмотря на недостатки, метод Кьельдаля является унифицированным, он включен в ГОСТы на многие пищевые продукты.

Для перевода количества азота в содержание белка используют коэффициент 6,25. Принят он потому, что большинство белков содержит 16% азота (100/6,25 = 16). Однако более правильным является использование коэффициентов, соответствующих фактическому содержанию сырого белка в каждом его виде. Так, для пшеницы получен коэффициент 5,7, так как ее белки содержат 17,5% азота. Для других белковых ресурсов коэффициенты перевода приняты следующими: 5,7 - рожь, ячмень, овес, семена подсолнечника; 5,8 - соя; 6,25 - кукуруза, мясо; 6,38 - молоко.

Имеются и другие методы определения азота, такие как метод Дюма, нейтронно-активационный и с фенолятгипохлоритом на приборе "Техникон". Принцип метода Дюма заключается в разложении органического соединения в атмосфере оксида углерода до газообразного состояния с последующим измерением объема азота (N2). В нейтронно-активационном методе атомы азота образца бомбардируются нейтронами в ядерном реакторе с получением изотопа 13N. Содержание белка рассчитывают по количеству гамма-лучей. Определение азота на приборе "Техникон" осуществляется колориметрическим способом, в котором измеряется интенсивность сине-голубой окраски, образующейся по реакции взаимодействия сульфата аммония, выделяющегося в процессе минерализации образца, с щелочным раствором фенола и гипохлорита. Все описанные здесь методы по точности анализа не уступают методу Кьельдаля, однако они являются достаточно дорогими.

Широкое распространение получил метод инфракрасной спектроскопии, в основе которого лежит поглощение белками света с определенной длиной волны и измерение интенсивности его отражения в приборах-анализаторах. Приборы калибруют по образцам зерна (эталонам) с известным содержанием белка, определяемым по методу Кьельдаля.

Известны методы количественного определения белка, основанные на различной степени помутнения (нефелометрический метод), способности белков адсорбировать красители (кумасси синий R-250, амидочерный и др.) и преломлять лучи света (по показателю преломления). Они характеризуются высокой точностью и простотой определения, хотя имеют ряд ограничений. Наиболее удобными являются методы с кумасси синим, биуретовый и Лоури. В основе биуретового метода лежит биуретовая реакция, в основе метода Лоури - восстановление фосфомолибденовой кислоты тирозином и триптофаном с одновременным протеканием биуретовой реакции. По оптической плотности с использованием калибровочных графиков находят концентрацию белка в растворах.

Контрольные вопросы

1. Какова роль белков в питании человека? Что такое азотистый баланс и какие его виды могут наблюдаться в организме?

2. Каковы рекомендуемые нормы белка в питании и от каких факторов они зависят?

3. Дайте характеристику проблемы дефицита белка и каковы пути ее решения? Какова роль нетрадиционного растительного и животного сырья для пополнения ресурсов пищевого белка?

4. Что такое синдром квашиоркора и каковы его последствия?

5. Что включают в себя понятия пищевая и биологическая ценность белков? Как определяется биологическая ценность белков?

6. Какие свойства характерны для аминокислот?

7. Какова специфическая роль отдельных аминокислот (цистеина, тирозина, фенилаланина, метионина, глутаминовой и аспарагиновой) в организме?

8. Как классифицируются биологически активные пептиды в соответствии с их функциями в организме и в составе пищи? Дайте краткую характеристику представителям групп пептидов.

9. Каковы особенности аминокислотного состава белков злаковых культур по сравнению с белками бобовых и масличных культур?

10. Назовите основные отличия фракционного состава белков злаковых культур (на примере пшеницы) от белков бобовых и масличных культур.

11. Каковы отличия физико-химических свойств и структурных особенностей двух фракций клейковины пшеницы: глиадина и глютенина? Какова их роль в обеспечении реологических свойств теста и качества хлеба?

12. Дайте характеристику фракционного состава и особенностей структуры белков мяса и молока.

13. Что включает в себя понятие "новые формы белковой пищи" и какова их роль в обогащении пищи лимитирующими аминокислотами?

14. Дайте определение функциональным свойствам белков.

15. Перечислите основные функциональные свойства белков. Какова их роль в технологических процессах производства пищевых продуктов?

16. Какие физико-химические и химические превращения претерпевают белки в технологическом потоке производства пищевых продуктов?

17. Какие методы качественного и количественного определения белков вы знаете?

ГЛАВА 3. УГЛЕВОДЫ

Название "углеводы" было дано соединениям этого класса почти 90 лет назад, когда полагали, что все они содержат углерод, водород и кислород в таких соотношениях, как будто представляют собой различные гидраты углерода общей формулы Cn(H2O)m. В дальнейшем оказалось, что ряд соединений, принадлежащих по своим свойствам к классу углеводов, содержат водород и кислород в несколько иной пропорции, чем указано в общей формуле (например, дезоксирибоза - С5Н10О4). Однако название "углеводы" сохранилось, хотя химического смысла оно не имеет.

Углеводы широко распространены в природе, они встречаются в свободной или связанной форме в любой растительной, животной или бактериальной клетке. Углеводы составляют три четверти биологического мира и примерно 60-80% калорийности пищевого рациона.

Наиболее распространенный углевод - целлюлоза, структурный компонент деревьев и других растений. Главный пищевой ингредиент - крахмал. Моносахариды встречаются в свободном виде в природе в небольших количествах; в основном они присутствуют как структурные единицы полисахаридов, входят в дисахариды и олигосахариды.

3.1 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА УГЛЕВОДОВ

Согласно принятой в настоящее время классификации углеводы подразделяются на три основные группы: моносахариды, олигосахариды и полисахариды.

Моносахариды

Моносахариды обычно содержат от 3 до 9 атомов углерода, причем наиболее распространены пентозы и гексозы. По функциональной группе они делятся на альдозы и кетозы.

Моносахариды находятся обычно в таутомерном равновесии со своей циклической формой. Таутомерные циклические формы сахаров представляют собой внутренние полуацетали. В результате циклизации появляется новый асимметрический атом углерода, который называют гликозидным (или аномерным). Изомеры относительно аномерного центра называются ?- и ?-аномерами.

Среди моносахаридов широко известны глюкоза, фруктоза, галактоза, арабиноза, ксилоза и D-рибоза.

Глюкоза (виноградный сахар) в свободном виде содержится в ягодах и фруктах (в винограде до 8%; в сливе, черешне 5-6%; в меде 36%). Из молекул глюкозы построены крахмал, гликоген, мальтоза; глюкоза является составной частью сахарозы, лактозы.

Фруктоза (плодовый сахар) содержится в чистом виде в пчелином меде (до 37%), винограде (7,7%), яблоках (5,5%); является составной частью сахарозы.

Галактоза - составная часть молочного сахара (лактозы), которая содержится в молоке млекопитающих, растительных тканях, семенах.

Арабиноза содержится в хвойных растениях, в свекловичном жоме, входит в пектиновые вещества, слизи, гумми (камеди), гемицеллюлозы.

Ксилоза (древесный сахар) содержится в хлопковой шелухе, кукурузных кочерыжках. Ксилоза входит в состав пентозанов. Соединяясь с фосфором, ксилоза переходит в активные соединения, играющие важную роль во взаимопревращениях сахаров.

В ряду моносахаридов особое место занимает D-рибоза. Почему природа всем сахарам предпочла рибозу - пока не ясно, но именно она служит универсальным компонентом главных биологически активных молекул, ответственных за передачу наследственной информации, - рибонуклеиновой (РНК) и дезоксирибонуклеиновой (ДНК) кислот; входит она и в состав АТФ и АДФ, с помощью которых в любом живом организме запасается и переносится химическая энергия. Замена в АТФ одного из фосфатных остатков на пиридиновый фрагмент приводит к образованию еще одного важного агента НАД - вещества, принимающего непосредственное участие в протекании жизненно важных окислительно-восстановительных процессов. Еще один ключевой агент - рибулозо-1,5-дифосфат. Это соединение участвует в процессах ассимиляции углекислого газа растениями.

Полисахариды

Олигосахариды. Это полисахариды 1-го порядка, молекулы которых содержат от 2 до 10 остатков моносахаридов, соединенных гликозидными связями. В соответствии с этим различают дисахариды, трисахариды и т. д.

Дисахариды - сложные сахара, каждая молекула которых при гидролизе распадается на две молекулы моносахаридов. Дисахариды, наряду с полисахаридами, являются одним из основных источников углеводов в пище человека и животных. По строению дисахариды являются гликозидами, в которых две молекулы моносахаридов соединены гликозидной связью.

Среди дисахаридов особенно широко известны мальтоза, сахароза и лактоза. Мальтоза, являющаяся ?-глюкопиранозил-(1,4)-?-глюкопиранозой, образуется в качестве промежуточного продукта при действии амилаз на крахмал (или гликоген).

Одним из наиболее распространенных дисахаридов является сахароза - обычный пищевой сахар. Молекула сахарозы состоит из одного остатка ?-D-глюкозы и одного остатка ?-D-фруктозы.

В отличие от большинства дисахаридов, сахароза не имеет свободного полуацетального гидроксила и не обладает восстанавливающими свойствами.

Дисахарид лактоза содержится только в молоке и состоит из ?-D-галактозы и D-глюкозы.

Среди природных трисахаридов наиболее известна раффиноза (содержащая остатки фруктозы, глюкозы и галактозы). Она находится в значительных количествах в сахарной свекле и во многих других растениях, в частности в бобовых. В целом олигосахариды, присутствующие в растительных тканях, разнообразнее по своему составу, чем олигосахариды животных тканей.

Полисахариды II-го порядка. Их, с точки зрения общих принципов строения, можно разделить на две группы: гомополисахариды, состоящие из моносахаридных единиц только одного типа, и гетерополисаха-риды, для которых характерно наличие двух или более типов мономерных звеньев.

С точки зрения функционального назначения полисахариды могут быть разделены на структурные и резервные полисахариды. Важным структурным полисахаридом является целлюлоза, а главные резервные полисахариды - гликоген и крахмал (у животных и растений соответственно).

Крахмал представляет собой комплекс двух гомополисахаридов: линейного - амилозы и разветвленного - амилопектина, общая формула которых (С6Н10О5)n. Как правило, содержание амилозы в крахмале составляет 10-30%, амилопектина 70-90%. Полисахариды крахмала построены из остатков глюкозы, соединенных в амилозе и в линейных цепях амилопектина ?-1,4-связями, а в точках ветвления амилопектина - межцепочными ?-1,6-связями.

Крахмал является главной составной частью пищи человека. Хлеб, картофель, крупы, овощи - главный энергетический ресурс его организма.

Гликоген - полисахарид, широко распространенный в тканях животных, близкий по своему строению к амилопектину. Молекула гликогена, как и молекула амилопектина, построена из сильно разветвленных цепочек (разветвление через каждые 3-4 звена) с общим количеством глюкозидных остатков 5-50 тыс (с молекулярной массой 1-10 млн).

Целлюлоза (или клетчатка) является одним из наиболее распространенных растительных гомополисахаридов. Она выполняет роль опорного материала растений, из нее строится жесткий скелет стеблей, листьев. В чистом виде она известна в виде ваты и фильтровальной бумаги (писчая и все другие виды бумаги проклеиваются). Древесина наполовину состоит из клетчатки и, кроме того, содержит связанный с нею лигнин - высокомолекулярное вещество фенольного характера. Целлюлоза представляет собой полимер, содержащий 600-900 остатков глюкозы (средняя молекулярная масса 1-1,5 млн).

В молекуле целлюлозы остатки глюкозы соединены ?-(1,4)-гликозидными связями, что определяет линейную структуру полимера. Целлюлоза не расщепляется обычными ферментами желудочно-кишечного тракта млекопитающих, а при действии фермента целлюлазы, выделяемого из кишечной флоры травоядных, распадается на целлодекстрины (олигоцеллосахариды) и целлобиозу.

Декстраны - гомополисахариды, построенные из остатков D-глюкозы с доминирующим типом гликозидной связи; ?-(1,6)-боковые разветвления присоединяются к центральной цепи в положениях 3 и 4. Декстран образуется из сахарозы под действием специфического фермента декстрансахаразы, вырабатываемого бактериями. В зависимости от применяемого штамма бактерий синтезируются декстраны различной степени разветвленности. Декстраны служат для получения молекулярных сит-сефадексов разных марок.

Пентозаны - целлюлозоподобные полисахариды, построенные из ксилозы, арабинозы и других пентоз. Особенно богаты пентозанами скорлупа орехов, подсолнухов, кукурузные кочерыжки, солома, рожь.

Инулин - высокомолекулярный углевод, растворимый в воде, осаждающийся из водных растворов при добавлении спирта. При гидролизе с помощью кислот образует фруктофуранозу и небольшое количество глюкопиранозы. Содержится в большом количестве в клубнях земляной груши и георгина, в корнях одуванчика, кок-сагыза и цикория, в артишоках, в корнях, листьях и стеблях каучуконосного растения гваюлы (Parthenium argentatum). В этих растениях инулин заменяет крахмал. Количество остатков фруктозы, связанных в молекуле инулина гликозидными связями между 1-ми 2-м углеродными атомами, по-видимому, равно 34. Поэтому строение молекулы инулина можно изобразить следующим образом:

В растениях, плесневых грибах и дрожжах содержится особый фермент - инулаза, который гидролизует инулин с образованием фруктозы.

Слизи и гумми (камеди) - группа коллоидных полисахаридов, к которым принадлежат растворимые в воде углеводы, образующие чрезвычайно вязкие и клейкие растворы. Типичными представителями этой группы являются гумми, выделяемые в виде наплывов вишневыми, сливовыми или миндальными деревьями в местах повреждения ветвей и стволов. Слизи содержатся в большом количестве в льняных семенах и в зерне ржи. Именно их наличием объясняется высокая вязкость употребляемого в медицине отвара из льняных семян или же водной болтушки ржаной муки.

При исследовании состава полисахаридов вишневого клея было найдено, что они состоят из остатков галактозы, маннозы, арабинозы, n-гликуроновой кислоты и незначительного количества ксилозы. Изучение слизей ржаного зерна показало, что они почти на 90% состоят из пентозанов. Эти слизи чрезвычайно сильно набухают в воде и дают весьма вязкие растворы.

Камеди находят широкое применение в производстве, поскольку они обладают такими ценными свойствами, как повышенная вязкость, клейкость, набухаемость и т. д. Камеди (гуммиарабинотрагакант) применяются в качестве связующих веществ и загустителей, служат эмульгаторами, основой для косметических и фармацевтических кремов и паст, стабилизаторами в пищевой промышленности.

Пектиновые вещества, содержащиеся в растительных соках и плодах, представляют собой гетерополисахариды, построенные из остатков галактуроновой кислоты, соединенных ?-(1,4)-гликозидными связями. Карбоксильные группы галактуроновой кислоты в той или иной степени этерифицированы метиловым спиртом. В зависимости от этого существует следующая классификация пектиновых веществ:

· протопектин - нерастворимое в воде соединение сложного химического состава (в протопектине длинная цепь полигалактуроновой кислоты связана с другими веществами: целлюлозой, арабаном, галактаном и другими полиозами, а также с белковыми веществами);

· пектиновые кислоты - это полигалактуроновые кислоты, в малой степени этерифицированные остатками метанола;

· пектин представляет собой почти полностью этерифицированную пектиновую кислоту.

Пектиновые вещества составляют основу фруктовых гелей. Пектины растворимы в воде, образуют коллоидные растворы. Протопектины нерастворимы в воде. Молекулярная масса 20-30 тыс.

К гемицеллюлозам относятся разнообразные по химической структуре гетерополисахариды растений: глюкоманнаны, галактоманнаны и ксиланы, содержащие в боковых цепях арабинозу, глюкозу и т. д. В растениях гемицеллюлозы, как правило, сопутствуют целлюлозе и лигнину, причем ксиланы и глюкоманнаны прочно адсорбируются на поверхности целлюлозы.

Гемицеллюлозы, выделяемые из различных растений, отличаются по структуре. В деревьях и семенах они представлены линейными глюкоманнанами, содержащими остатки ?-D-маннозы и ?-D-глюкозы, соединенных ?-(1,4)-гликозидными связями. В травах и древесине обнаружены гемицеллюлозы, цепи которых построены из остатков ксилопираноз, соединенных |3-(1,4)-гликозидными связями, причем в основной цепи имеются различные разветвления.

Гликозиды - продукты, получающиеся при элиминации воды при реакции:

Только очень малые количества гликозидов встречаются в питании человека. Однако их значение часто зависит не от количества, а связано с физиологической ролью. Ряд природно встречающихся гликозидов являются сильными пенообразователями и стабилизаторами, флавоноидные гликозиды могут придавать горький вкус и (или) определенный аромат и цвет пищевому продукту. S-гликозиды встречаются в природе в семенах горчицы и корнях хрена. Они называются гликозинолаты. Аллил-гликозинолат, наиболее известный из класса S-гликозидов, называется синигрин. Он придает определенный аромат пище, но есть работы, в которых авторы полагают, что S-гликозиды и (или) продукты их распада (см. рис. 3.2) могут быть отнесены к пищевым токсикантам.

О-гликозид образуется из D-глюкозы при пиролизе.