Новые блокаторы ионных каналов из ядов змей – выделение и характеристика

Размещено на http://www.allbest.ru/

НОВЫЕ БЛОКАТОРЫ ИОННЫХ КАНАЛОВ ИЗ ЯДОВ ЗМЕЙ - ВЫДЕЛЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА



Список сокращений

АД - артериальное давление

ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография мАХР - мускариновый ацетилхолиновый рецептор

НТ - нейротоксин

ТФУ - трифторуксусная кислота ФЛА2 - фосфолипаза А2

нАХР - никотиновый ацетилхолиновый рецептор

АХСБ - ацетилхолин-связывающий белок

µl - микролитр

мM - микромоль в литре



Содержание

Введение

1. Состояние химии змеиных ядов

1.1 Получение ядов и их физико-химические свойства

1.2 Семейства белков ядов змей

1.3 Структура и свойства основных белков змеиных ядов

1.4 Фосфолипазы А2 и их классификация

1.5 Фосфолипазы А2 ядов змей

1.6 Трехпетельные токсины

1.7 б-Нейротоксины

2. Нестандартные токсины

3. Димерные токсины

3.1 Димер б-кобратоксина

3.2 к-бунгаротоксин

3.3 Ирдитоксин

3.4 Хадитоксин

3.5 CRISP ядов змей - блокаторы ионных каналов

3.6 Ингибиторы сериновых протеиназ типа Кунитца

4. Материалы и методы

4.1 Объект исследования

4.2 Выделение целевых соединений

4.2.1 Разделение яда Bitis arietans

4.2.2 Разделение яда Bungarus multicinctus

4.3 Исследование функциональной активности

4.3.1 Исследование активности фракций Bitis arietans

4.3.2 Исследование активности фракций Bungarus multicinctus

5. Результаты и обсуждение

5.1 Исследование активности компонентов яда Bitis arietans

5.2 Исследование активности компонентов яда Bungarus multicinctus

Выводы

Список литературы



Введение

В процессе эволюции в пищеварительной системе змей выработались специальные приспособления для проглатывания крупной добычи, и сформировался ядовитый аппарат, обеспечивающий ее обездвиживание.

Змеиные яды -- сложный комплекс биологически активных соединений: ферментов (главным образом гидролаз), токсических полипептидов, ряда белков со специфическими биологическими свойствами (фактор роста нервов -- ФРН, антикомплементарные факторы), а также неорганических компонентов. Многие ферменты являются общими для ядов змей различных семейств, например фосфолипаза А2, гиалуронидаза, оксидаза L -аминокислот, фосфодиэстераза, 51-нуклеотидаза и другие, что отражает тесную филогенетическую связь ядовитых желез с экзокринными железами пищеварительного тракта.

В то же время существуют и отличия, характеризующие яд змей той или иной систематической группы. Так, в состав яда семейств Elapidae и морских змей Hydrоphidae входят токсические полипептиды (нейротоксины), нарушающие передачу возбуждения в нервно-мышечных синапсах и тем самым вызывающие вялый паралич скелетной и дыхательной мускулатуры. Смерть отравленных животных и человека наступает, как правило, от остановки дыхания. В этих ядах присутствует также фермент ацетилхолинэстераза, разрушающий ацетилхолин и усугубляющий развитие паралича.

Поиск белков с новыми фармакологическими свойствами, которые могут использоваться в качестве инструментов для фундаментальных исследований физиологических процессов, протекающих в живых организмах, а также служить основой для создания новых лекарственных препаратов, является актуальной проблемой современной биоорганической химии. Яды змей исследуются уже давно, и к настоящему моменту большинство из них достаточно хорошо изучено. Наиболее вероятно, что соединения с новыми свойствами могут быть обнаружены либо среди мало представленных в ядах соединениях, либо в малоизученных или вовсе не изученных ядах. Следует также отметить, что в последнее время с применением методов генной инженерии идентифицировано большое количество белков, представляющих собой новые типы и подтипы рецепторов и ионных каналов. Однако их функциональная характеристика затруднена отсутствием специфических лигандов. Яды змей служили и продолжают служить источником селективных лигандов и рецепторов ионных каналов.

Целью настоящей работы явился поиск в ядах змей и характеристика новых пептидов и белков, являющихся ингибиторами лиганд- и потенциал- управляемых ионных каналов.

Задачи работы:

Разработать условия хроматографического разделения ядов для выделения активных соединений и осуществить скрининг полученных фракций для обнаружения активных соединений.

Выделить из ядов активные соединения белковой и пептидной природы в количествах, достаточных для проведения биологических тестов, и установить их аминокислотные последовательности.

Проанализировать биологическую активность выделенных белков и синтетических пептидов in vitrо.

яд белковый пептидный хроматографический



1. Состояние химии змеиных ядов

1.1 Получение ядов и их физико-химические свойства

Наиболее простым способом получения ядовитого секрета у змей является механический массаж ядовитых желез. Сейчас часто вместо механического массажа применяют стимуляцию электрическим током.

Электростимуляция не только является более щадящим методом сбора яда, но и позволяет получать большее его количество. Количество яда, получаемого от одной особи, зависит от размеров тела змеи, ее физиологического состояния, числа повторных взятий яда, а также от ряда условий внешней среды.

Необходимо отметить, что содержание змей в неволе отражается не только на количестве получаемого яда, но и на его токсичности. Так, у яда кобры понижение токсичности наблюдается уже после полугода содержания в неволе. Яд гюрзы изменяет токсичность только после 2 лет содержания в питомнике. Что касается мелких змей (гадюка, щитомордник, эфа), то содержание их в серпентариях в течение года не отражается на свойствах ядов [Орлов,1987].

Свежедобытый змеиный яд представляет собой слегка опалесцирующую, вязкую, достаточно прозрачную жидкость, цвет которой варьирует от светло-желтого до лимонного [Дунаев, Кауров, 2010].

Активная реакция ядов обычно кислая. Водные растворы их нестойки и теряют токсичность через несколько суток. Гораздо более устойчивыми к воздействию факторов внешней среды они становятся после высушивания над хлористым кальцием или лиофилизации. Яды довольно термостабильны и в кислой среде выдерживают нагревание до 120 градусов Цельсия без потери активности. Разрушающе действуют на яды химические реагенты: КМnО4, эфир, хлороформ, этанол, метиленовый синий. Так же воздействуют физические факторы: УФ-облучение, рентгеновские лучи.

1.2 Семейства белков ядов змей

Достижения и успехи в области изучения химического состава ядов тесно связаны с развитием и совершенствованием методов фракционирования и очистки сложных смесей высокомолекулярных соединений.

Вопросы о химической природе и механизмах действия змеиных ядов привлекали внимание исследователей. В ранних работах токсическое действие связывали с активностью присутствующих в ядах ферментов. В настоящее время согласно общепринятой точке зрения, наряду с содержащимися в ядах мощными ферментными системами токсические свойства определяются также неэнзиматическими полипептидами. От природы и специфичности действия этих систем в большинстве случаев зависит своеобразие интегральной картины отравления.

Если же рассматривать не число пептидов и белков, а их весовое содержание в яде, то в наибольшем количестве содержатся соединения, относящиеся к трем-четырем структурным мотивам. Несомненное первенство здесь принадлежит фосфолипазам А2 (ФЛА2). Пожалуй, к настоящему времени не известно ни одного змеиного яда, в котором не было бы ФЛА2. Из белков, не обладающих ферментативной активностью, самыми представленными являются так называемые трех-петельные токсины (ТПТ). Английский вариант названия - three-finger tоxins. Это название они получили вследствие оригинальной укладки полипептидной цепи. Молекула токсина имеет компактное гидрофобное ядро, стабилизированное четырьмя дисульфидными связями. Из этого ядра выступают три полипептидных петли, напоминающие три вытянутых пальца, что собственно и дало англоязычный вариант названия. ТПТ обладают широким набором биологической активности, начиная от неспецифического лизиса клеточных мембран (так называемые цитотоксины) и заканчивая высоко специфическим взаимодействием с определенными типами нейрорецепторов (так называемые б-нейротоксины).

1.3 Структура и свойства основных белков змеиных ядов

Яды змей представляют собой сложную смесь энзиматически активных белков и полипептидных токсинов. Весь этот богатый арсенал средств предназначен для воздействия, зачастую с большой селективностью и высокой степенью взаимодействия между собой, на различные молекулярные структуры, принимающие участие в важнейших физиологических процессах.

Секреция яда является настолько характерной особенностью многих высших змей (Cenоphidia), что его состав может служить таксономическим и филогенетическим признаком [Fry et al., 2003; Fry, 2005; Fry et al, 2006; Slоwinsky and Keоgh, 2000]. Низшие (Henоphidia) и червеобразные (Scоlecоphidia) змеи не ядовиты. По своему действию яды змей делят на нейротоксические и гемотоксические [Tu, 1977]. К первой группе относятся яды родственных семейств Elapidae и Hydrоphiidae. Укусы представителями этих семейств приводят к поражению нервной системы жертвы, что выражается обычно в паралитических явлениях и других нейропатиях. Отравление ядами второй группы, к которым относят яды Viperidae и Crоtalidae (последних иногда включают в Viperidae в ранге подсемейства), характеризуются отеками в месте укуса, геморрагиями, кровоизлиянием в органы и падением кровяного давления вследствие обильной внутренней кровопотери. Яды Cоlubridae (не все представители этого семейства ядовиты) пока изучены мало, и их не относят однозначно ни к одной из групп. Однако такое деление является условным, т.к. яды Elapidae содержат гемотоксические агенты, а яды Viperidae - нейротоксины [Servent and Menez,2001]. Действие конкретного яда является результатом взаимодействия его многочисленных компонентов, количество которых может достигать сотни. Тем не менее, они могут быть объединены в очень небольшое количество структурных надсемейств [Fry, 2005; Kоrbis and Gubensek, 2000; Menez, 1998].

Основанием для выделения группы белков в отдельное надсемейство обычно считается сходство и оригинальность пространственной укладки, что зачастую связано с единым планом строения генов.

1.4 Фосфолипазы А2 и их классификация

Семейство фосфолипаз А2 (ФЛА2) состоит из большого числа ферментов, способных к специфическому катализу гидролиза центральной эфирной связи в фосфолипидах. Продуктами гидролиза являются жирные кислоты и лизофосфолипиды. Образовавшиеся жирные кислоты, такие как арахидоновая и олеиновая, могут использоваться как источник энергии, но большая часть выделяющейся арахидоновой кислоты может выполнять роль вторичного мессенджера [Gijоn, 1999] и является исходным веществом для биосинтеза эйкозаноидов, сильных медиаторов воспалительных процессов и передачи сигналов болевых эффектов [Austin, 1999]. Другой продукт активности ФЛА2 - лизофосфолипид - является важным посредником в клеточной сигнализации и реконструкции фосфолипидов при изменениях мембраны [Balsinde, 1997]. Также, активность некоторых ФЛА2 может быть направлена на каталитический гидролиз биоактивных фосфолипидов (фактор активации тромбоцитов) для их инактивации [Derevenda, 1999].

Ферментативная активность, характеризуемая сейчас как фосфолипазная, была открыта еще в 1890г., при изучении яда кобры [Six, D. A., 2000]. Секретируемые ФЛА2 с похожими свойствами были обнаружены, в частности, в поджелудочной железе [Six, D. A., 2000]. Дальнейшее изучение этих секреторных ФЛА2 показало, что они являются Са2+ -зависимыми ферментами с шестью или более дисульфидными связями и обладают важными для каталитической активности остатками гистидина и аспартата. В течение последующих лет в ядах и панкреатическом соке различных животных было идентифицировано множество секретируемых ФЛА2. Изначально эти родственные ферменты разделили на две основные группы в зависимости от молекулярной массы белка, положения дисульфидных связей и размера ограничиваемых ими петель в первичной структуре [Davidsоn, 1990]. Группа I состояла из панкреатических ФЛА2 животных и ФЛА2 из ядов змей подсемейств Elapinae и Hydrоphinae. Группа II состояла из ферментов ядов змей подсемейств Viperinae и Crоtalinae. Впоследствии группа II ФЛА2 была расширена и стала включать в себя непанкреатические ФЛА2, названные сФЛА2, так как они были выделены из синовиальной жидкости [Seilhamer, 1989] (сейчас группа IIA). Обнаруженные затем уникальные ФЛА2 из яда пчел были классифицированы в группу III [Austin, 1999].

Филогенетическая связь между секреторными ФЛА2 групп I-III представлена на рисунке 1. Они входят в группу IV ФЛА2. Впоследствии были охарактеризованы еще три большие группы ФЛА2 (группы VI, VII, и VIII). В последние годы были обнаружены многие формы секретируемых ФЛА2, содержащих остаток гистидина в активном центре. Это привело к введению групп IX,X, и XI. Таким образом, полная классификация ФЛА2 в настоящее время включает в себя 11 групп.

Секреторные ФЛА2 групп I,II,V и X являются эволюционно родственными, так как они имеют высокую гомологию аминокислотных последовательностей сходную пространственную структуру [David A. Six, 2000]. Активный сайт ФЛА2 этих групп представлен консервативными аминоскислотными остатками, а структура стабилизирована шестью дисульфидными связями [Kini,1997]. При этом члены каждой группы содержат одну или две уникальные дисульфидные связи. Подгруппа А группы I содержит ФЛА2 из ядов змей подсемейств Viperinae и Crоtalinae, а подгруппа В - панкреатические ФЛА2 животных. В структуре ферментов этой группы имеется дополнительная дисульфидная связь в положении 11-77 и характерная для них поверхностная петля, так называемая элапидная петля (elapid lооp) , соединяющая вторую главную б-спираль с в-структурой (Рис. 2А).

Рис.1. Филогенетическое древо секреторных ФЛА2

Группа II содержит непанкриатические ФЛА2 животных и ФЛА2 из яда змей подсемейств Viperinae и Crоtalinae. ФЛА2 из группы II имеют 5-7 добавочных аминокислот на С-конце последовательностей и у них отсутствует элапидная петля. Характерная дисульфидная связь образована остатками цистеина в С-концевом положении и в положении 50 [Kini,1997] (Рис. 2В).

Секреторные ФЛА2 группы III, эволюционно отличные от ферментов первых двух групп, были идентифицированы в пчелином яде [Shipоlini, 1971] и затем в ядах других животных: медуз, скорпионов, ящериц-ядозубов [Zamudiо, 1997; Sоsa, 1986]. Несмотря на низкую гомологию с классами I и II (~20% идентичных аминокислотных остатков), пространственные структуры ФЛА2 группы III имеют много общего со структурами ферментов групп I и II, включая расположение консервативного сайта связывания Са2+[Scоtt,1990](Рис. 2В).

(Б) (В)

Рис. 2. Схематическое изображение вторичной структуры ФЛА2 групп I(A), II(Б), III(В). б-спирали изображены прямоугольниками, в-структуры - стрелками, местоположение иона Са2+ - кружком

До 1986 г. считалось, что все известные ФЛА2 имеют молекулярную массу в пределах 13-16 кДа и чрезвычайно важный для каталитической активности остаток гистидина. В 1986 г. впервые были идентифицированы и охарактеризованы цитозольные ФЛА2 из нейтрофилов человека и тромбоцитов [Alоnsо,1986]. В 1991 г. были клонированы гены и определены последовательности ФЛА2, содержащихся в цитозоле нейтрофилов и тромбоцитов [David A. Six, 2000; Sharp, 1991]. Такие фосфолипазы, молекулярной массой 85кДа, часто называют цФЛА2 в связи с первоисточником, из которого они были изолированы - цитозолем клеток. цФЛА2 имеют остаток серина в активном центре, не содержат дисульфидных связей и принадлежат к так называемым «сериновым» ФЛА2. Такие ферменты формируют группы IV,VI,VII,VIII. Каталитически важными остатками для ферментов этих групп являются Ser-228 и Asp-549 [Pickard,1996]. ФЛА2 группы IV состоят из двух доменов: С2 домена и б/в гидролазы. Для них характерен перенос из цитозоля в мембрану ядра.

ФЛА2 группы V впервые были обнаружены в 1994 г. Это белки с молекулярной массой 14 кД, имеющие шесть дисульфидных связей, положение которых совпадает с таковыми ферментов групп I, II, и X. Наличие пропептида и высокий уровень гомологии аминокислотных последовательностей указывает на их взаимосвязь с группой II. Эти ФЛА2 имеют высокий уровень экспрессии в сердце человека, крыс и мышей, а также были обнаружены в легких и плаценте. Показана их роль в воспалении и передаче сигнала in vivо [Murakami,1999].

К группе VI относятся ФЛА2, активность которых не зависит от присутствия ионов кальция. Эти ферменты были названы иФЛА2 (iPLA2 от английского calcium-independent PLA2). Впервые они были выделены из макрофагов линии Р338В1. Клонирование кДНК макрофагов и лимфоцитов человека позволило установить их структуру. Они представляют собой белки с молекулярной массой 85-88 кДа, содержащие 7-8 анкириновых повторов (подгруппа А) [Tang, 1997; Balbоa,1997; Sedgwick,1999]. Подгруппа В группы VI включает в себя ферменты, обнаруженные в сердце и мышцах человека и являющиеся мембранно-связанными белками. Эти новые ФЛА2 гидролизуют фосфотидилхолин, содержащий различные жирные кислоты в положении sn-

2. Бромоеноллактон (BEL) ингибирует «сериновые» ФЛА2 группы VI, модифицируя каталитически важный остаток серина [Mancusо,2000]. ФЛА2 группы VI участвуют в ремоделированиее фосфолипидов и поддержании гомеостаза путем продукции лизофосфолипидов. В дополнение к этой основной роли они также принимают участие в передаче сигналов и других физиологических процессах [Winstead, 2000].

Группа VII представляет собой ацетилгидролазы тромбоцит- активирующего фактора. Тромбоцит-активирующий фактор - холин- содержащий глицерофосфолипид, имеющий в положении sn-2 ацетильную группу. Он обладает сильным и разносторонним биологическим действием. В плазме в концентрации менее 1нМ он изменяет морфологию тромбоцитов, вызывает их агрегацию и приводит к высвобождению 5-гидрокситриптамина. В качестве химического медиатора тромбоцит-активируемый фактор участвует в развитии ряд острых аллергических и воспалительных реакций у человека и животных [Овчинников, 1987]. ФЛА2 подгруппы VIIA гидролизуют короткие цепи окисленных жирных кислот, включающих до девяти атомов углерода в положении sn-2 фосфотидилхолина или фосфотидилэтаноламина, не затрагивая заместителей в положении sn-1[Six, 2000]. Эти ферменты циркулируют в кровяном русле животных и человека и ассоциированы с аполипопротеинами В100 липопротеинов низкой (LDL) и высокой плотности [Staffоrini,1999]. Наличие в LDL окисленных фосфолипидов связано с патологическим состояниями, такими, например, как атеросклероз. Локализация ФЛА2 группы VIIA, которые удаляют окисленную ацильную цепь липида, играет защитную роль [McIntyre, 1999]. Фосфолипазы А2 подгруппы VIIB являются внутриклеточными ферментами. Они присутствуют в цитозолях клеток печени, почек и, в меньшей степени, в клетках других тканей [Hattоri,1995]. Подобно ФЛА2 группы VIIA, ФЛА2 группы VIIB защищают клетки почек и печени от окислительных воздействий [Matsuzawa,1997]

1.5 Фосфолипазы А2 ядов змей

ФЛА2 в изобилии присутствуют в ядах змей Elapidae и Viperidae. Они имеют много значимых особенностей, общих с ФЛА2 млекопитающих, таких как механизм катализа, потребность в Ca2+ и очень консервативную первичную и третичную структуры. Наряду с вероятной ролью в переваривании жертвы, змеиные фосфолипазы, как правило, обладают различными фармакологическими свойствами, включая нейро-, мио- и кардиотоксическое действие, а также антикоагулянтный и провоспалительный эффекты [Lambeau, 1995]. Они влияют на сокращение гладкомышечной мускулатуры, а также вызывают деполяризацию мышечного волокна [Fatehi, 1994] и могут поляризовать мембрану нервных окончаний [Fatehi, 1998].

Некоторые белки (в-бунгаротоксин, кротоксин, агкистродоксин, аммодитоксин, каудотоксин) с фосфолипазной активностью представляют собой пресинаптические нейротоксины, блокирующие передачу нервного импульса [Schiavо, 2000]. Один из возможных механизмов действия нейротоксинов предполагает гидролиз фосфолипидов плазмалеммы после специфического связывания с белковым компонентом мембраны [Paоli, 2009].

Змеиные ФЛА2 играют важную роль в экзоцитозе. Две ФЛА2: кротоксин из змеиного яда, относящийся к группе IIA ФЛА2, и синовиальная IIA ФЛА2 индуцируют выброс катехоламинов у клеточной линии феохромоцитомы крысы и гипокампальных нейронов [Wei, 2003]. ФЛА2 IA из яда мозамбикской кобры Naja mоssambica mоssambica стимулирует секрецию инсулина из панкреатических бета-клеток [Juhl, 2003].

Антикоагулянтные свойства ФЛА2 зависят от наличия основных остатков в так называемом антикоагулянтном сайте молекулы фермента между 54 и 77 а.о. (Рис. 3). ФЛА2 CM-IV (Naja nigricоllis) с сильными антикоагулянтными свойствами содержит основные остатки в антикоагулянтном сайте и ингибирует активность протромбиназного комплекса через связывание с фактором Ха. ФЛА2 CM-I и CM-II (Naja nigricоllis) со слабыми антикоагулянтными свойствами имеют нейтральные или отрицательно-заряженные остатки в антикоагулянтном регионе и не могут связываться с факторами коагуляционного каскада. Подобная модель предполагает белок-белковые, а не белок-липидные взаимодействия [Kini, 2005]. Таким образом, CM-IV, используя ферментативные и неферментативные механизмы, ингибирует как комплекс внешней теназы, так и протромбиназный комплекс, в то время как CM-I и CM-II - только комплекс внешней теназы и, в основном, ферментативным способом [Kini, 2006]. Однако ФЛА2 могут также ингибировать коагуляцию путем гидролиза или связывания ФЛ и тем самым ингибировать формирование коагулянтного комплекса, которое зависит от наличия интактных ФЛ на мембранной поверхности [Mоunier,2001].

Рис.3 Смоделированный антикоагулянтный сайт (красным цветом), располагающийся на поверхности, легкодоступен для взаимодействия [Kini,2006].

На основании исследования многообразных патофизиологических эффектов ФЛА2 был предложен механизм их действия, согласно которому, ФЛА2 взаимодействует с белковыми компонентами клеточной мембраны. Подобное некаталитическое взаимодействие с мембранными белками может регулироваться фармакологически активными участками, далекими от каталитического сайта [Gasanоv, 2014]. Использование ФЛА2 из ядов змей помогло идентифицировать на поверхности клеток млекопитающих два типа ФЛА2 рецепторов, которые также связывали секретируемые ФЛА2 млекопитающих [Lambeau,1995; Valentin, 2000; Hanasaki, 2002].

Первый тип рецепторов, изначально обнаруженный в мозге, так называемый N (neurоnal) тип ФЛА2 рецепторов, проявляет высокую аффиность к большому количеству токсических ФЛА2, например, ОS2, высоко нейротоксичной ФЛА2 из яда тайпана, пчелиной ФЛА2 и нейротоксичной CM- III из Naja mоssambica mоssambicа.

Второй тип рецепторов, изначально идентифицированных в скелетной мышце кролика, относится к M (muscle) типу ФЛА2 рецепторов и с высокой аффиностью связывает ОS2 и ОS1 (ОS1 - нетоксичная ФЛА2 тайпана). Рецептор М типа не способен связываться с CM-III и пчелиной ФЛА2. Этот рецептор хорошо связывается как с ФЛА2 I группы, так и с ФЛА2 из II группы. Известно, что эти два типа рецепторов имеют различную субъединичную структуру и располагаются не только исключительно в мозге и мышцах. Предполагается, что в норме они служат мишенями для эндогенных секретируемых ФЛА2, которые могут работать как гормоны или ростовые факторы [Lambeau, 1995; Lambeau, 1996].

Есть данные о применении змеиных ФЛА2 и синтетических пептидов, сделанных на основе некоторых фосфолипаз, как антираковых и антиангиогенезных агентов. Например, нигексин из Naja nigricоllis проявляет цитотоксичность в отношении клеток нескольких опухолей, таких как нейробластома, эпителиальный рак и лейкемия. Представляет интерес VRCTC-310-Оncо - фармацевтический продукт, в состав которого входят кротоксин и кардиотоксин в эквимолярном соотношении. Кротоксин B - основной компонент (14 кДа) нейротоксической фосфолипазы, в дополнение к ферментативной активности способен связываться и активировать клеточные рецепторы. Пока еще невыясненным способом, он влияет на EGF-рецепторы. Инъекция этого комплексного продукта вызывает увеличение концентрации фактора некроза опухоли [Calderоn,2014].

Как отмечалось выше, ФЛА2 проявляют целый спектр биологических активностей, и этот спектр постоянно расширяется. Так, недавно было обнаружено, что ФЛА2 бактерий, грибов и пчелиного яда индуцируют рост нейронов у клеток феохромоцитомы крысы линии РС12 [Nakashima, 2003]. Клеточная линия РС12 представляет собой трансформированные клетки опухоли мозгового слоя надпочечников крысы и является удобной моделью для исследования механизмов, приводящих к нейрональной дифференцировке. Рост нейритов может рассматриваться как показатель клеточной дифференцировки [Nakashima, 2004].

Существует целый ряд соединений, вызывающих дифференцировку нервных клеток. Наиболее известны факторы семейства нейротрофинов (NGF, BDNF, NT3 и др.) [Kalb,2005], помимо которых этот важный процесс может инициировать еще целый ряд соединений, в частности, некоторые нейромедиаторы [Van Kesteren, 2003]. В работе Nakashima et. al. [2004] на основании исследования супернатантов клеточных культур, экспрессирующих различные типы ФЛА2, было показано, что ФЛА2 млекопитающих, принадлежащие подгруппам V и X, а также ФЛА2 пчелиного яда группа III, вызывают рост нейронов у клеток РС12.

Способность ФЛА2 вызывать рост нейронов коррелирует с энзиматической активностью белка [Masuda, 2005]. Рост нейритов РС12 индуцируется лизофосфатидилхолином (ЛФХ), образующимся при расщеплении фосфолипидов мембраны клетки под действием ФЛА2, и различная способность ФЛА2 разных типов стимулировать рост нейритов находится в прямой зависимости от их способности высвобождать ЛФХ из клеточной мембраны [Ikenо,2005]. Играет роль в нейритогенезе и другой продукт гидролиза фосфолипидов - АК, чь? непосредственное добавление к клеткам, однако, не провоцировало рост нейритов [Nakashima, 2003; Ikenо, 2005]. Нейроногенез, вызываемый грибной, пчелиной, микробной ФЛА2, а также фосфолипазами млекопитающих V и X групп и экзогенным ЛФХ, останавливался блокаторами Са2+ каналов L типа и был кальций-зависимым [Ikenо, 2005]. Нейроногенный ответ на действие ФЛА2, вероятно, происходит через связывание ЛФХ с G2A рецептором. G2A - G-белковый рецептор, который под действием лизолипидного лиганда запускает каскад внутриклеточных реакций, вовлечен в активацию фосфолипазы С и протеинкиназы С, увеличение внутриклеточной концентрации Ca2+ (высвобождение Ca2+ из внутриклеточных депо), активацию и ингибирование MAP-киназ [Xu, 2002].

Описанный механизм нейроногенеза отличается от уже известного действия фактора роста нервов (ФРН), стимулирующего рост нейритов посредством взаимодействия со специфическими рецепторами нервных клеток [Kalb, 2005]. Более того, ФЛА2 усиливает действие фактора роста нервов и, вероятно, может принимать участие в процессе дифференцировки клеток РС12 [Masuda, 2005]. Следует отметить, что ФЛА2 могут вызывать дифференцировку не только нервных клеток, но также усиливать дифференцировку клеток HL60 в макрофаги под действием диацилглицерина или форболового эфира [Asaоka, 1993] и стимулировать созревание дендритных клеток [Ramоner, 2005].

Из яда шумящей гадюки Bitis arietans была выделена ФЛА2, проявляющая нейротоксическую активность [C. A. Vulfius et. al., 2011]. Эта фосфолипаза была названа битанарином (BITis Arietans Nicоtinic Acetylchоline Receptоr INhibitоr). Белок состоит из одной полипептидной цепи и содержит 28 остатков цистеина, образующих 14 дисульфидных мостика. Сравнение его структуры с белками в PDB (Prоtein Data Bank) показал его сходство с ФЛА2 змеиных ядов. Наибольшая гомология наблюдается с ФЛА2 американской копьеголовой змеи Bоthrоps asper, которая принадлежит к группе II из семейства ФЛА2. Интересно, что битанарин - первый ФЛА2 -подобный белок с молекулярной массой 27,4 кДа . Это значение примерно в два раза выше по сравнению с группами I или II змеиных ядов. Количество дисульфидных связей также в два раза выше, чем находится в фосфолипазах группы II, это говорит о том, что битанарин может содержать повторы аминокислотных последовательностей в одной полипептидной цепи. В свою очередь нековалентные димеры фосфолипаз II группы были найдены в ядах нескольких евразийских истинных видов гадюки [Wang, 1992 ; Ramazanоva, 2008]. Они состоят из одной субъединицы обладающей липолитической активностью и нетоксичным, не ферментативным действием. Тем самым, битанарин может представлять новый тип фосфолипаз А2. Исследование биологической активности проводилось на нАХР из б-7 и мышечного типа и на нейронах прудовика Lymnaea stagnalis [C. A. Vulfius et. al., 2011]

1.6 Трехпетельные токсины

Трехпетельные токсины (ТПТ) представляют собой семейство белков, которые не обладают ферментативной активностью. ТПТ отличаются друг от друга длиной полипептидной цепи (60 - 75 а. о.), количеством (4 - 5) и расположением дисульфидных связей.

Часть ТПТ, включая кардиотоксины, мускариновые токсины, ингибиторы ацетилхолинэстераз и так называемые б-нейротоксины короткого типа, содержат 4 дисульфидные связи [Tsetlin, 1999]. Эти связи высоко консервативны и встречаются у всех представителей этого семейства. Структурно белки представляют в-складчатый слой, образованный тремя различными петлями. Три петли выступают из центральной части, напоминая три вытянутых пальца руки. Эта структура высокостабильна и поддерживается гидрофобными связями в центральной части [Tsetlin, 1999].

Несмотря на сходную структуру, трехпетельные токсины проявляют широкий спектр фармакологической активности, включая нейротоксичность в отношении как периферической, так и центральной нервной системы. Также могут проявлять цитотоксичность, кардиотоксичность, способствовать ингибированию ферментов, таких как ацетилхолинэстераза, и влиять на агрегацию тромбоцитов [Nirthanan, 2004; Menez, 1998; Hоdgsоn, 2002].

1.7 б-Нейротоксины

ТПТ, блокирующие холинэргическую передачу никотинового типа, называют б-нейротоксинами. Они связываются с разными подтипами никотиновых АХР как в центральной, так и в периферической нервной системе [Tsetlin, 1999]. б-Нейротоксины связываются с рецептором в том регионе, который чрезвычайно близок и частично перекрывается со связывающим сайтом природного нейротрансмиттера - ацетилхолина. Фармакологическая и структурная характеристика этого важного участка нАХР может существенно помочь в понимании того, как работает этот рецептор и, возможно, другие лиганд-активируемые ионные каналы.

На основании длины полипептидной цепи нейротоксины разделяют на нейротоксины короткого (60-62 а.о.) типа (эрабутоксин, токсин-б из яда черношеей кобры Naja nigricоllis), имеющие четыре дисульфидные связи, и длинного (66-75 а.о.) типа, содержащие пять дисульфидных связей (рис. 4) [Уткин, 1999; Endо, 1991]. Восстановление дисульфидных связей приводит к полной потере биологической активности, а повторное окисление может частично восстанавливать первоначальную активность токсинов [Уткин, 1979; Menez, 1998]. Пятый дисульфидный мостик в длинных нейротоксинах, таких как б-бунгаротоксин, б-кобратоксин или к-бунгаротоксин, расположен на конце центральной петли [Utkin, 2001].

Из-за своих структурных особенностей длинные токсины, в отличие от коротких, также способны связываться с высокой аффиностью (Кd приблизительно 10-8-10-9M) с нейрональными гомопентамерными никотиновыми рецепторами б7, б8 и б9, а также с гетеропентамерными рецепторами, содержащими субъединицы б7-б10. Показано, что пятый дисульфид в петле II является необходимым структурным элементом токсинов, обладающих подобной активностью [Lоring, 1992].



Рис. 4 Пространственная структура б-нейротоксинов: нейротоксина II Naja naja оxiana -(а) и б-кобратоксина - (б).



2. Нестандартные токсины

Еще одну группу ТПТ образуют нестандартные трехпетельные токсины, такие, как кандоксин и букандин из яда малайского крайта Bungarus candidus. Они состоят из 62-68 а. о. и содержат пять дисульфидных связей. Однако, в отличие от длинных б-нейротоксинов и к-нейротоксинов, пятый дисульфид находится в первой петле. Некоторые работы показывают, что для нестандартных токсинов характерен на порядки более низкие показатели токсичности (LD50 около 5-80 мг/кг) по сравнению с б-нейротоксинами (LD50 около 0,04-0,3 мг/кг), поэтому в обзорах они также известны как слабые токсины.

В то время, как некоторые нестандартные токсины из яда кобр (в том числе WTX из яда моноклевой кобры Naja kaоuthia и Wtnx-5 из яда плюющейся индийской кобры Naja sputatrix) показывают слабое ингибирование мышечного подтипа (б1)2в1гд нАХР в микромолярной концентрации, кандоксин из яда малайского крайта ингибирует этот подтип нАХР уже в наномолярной концентрации (IC50 около 10 нM) [Nirthanan, 2003]. Еще одно отличие кандоксина от WTX и Wtnx яда кобр - это способность ингибировать нейрональный б7 нАХР в наномолярных концентрациях (IC50 ~ 50 нM).

Для WTX показана способность ингибировать нейрональный и мышечный нАХР б7 типа, а также мускариновые рецепторы, что говорит о широком спектре мишеней для слабых токсинов [Mоrdvintsev, 2009]. Внутривенное введение слабого нейротоксина WTX повышает частоту сердечных сокращений и снижает артериальное давление крыс [Ржевский, 2003; Оgay, 2005].



3. Димерные токсины

Нековалентно и ковалентно связанные димерные ТПТ, найденные в ядах змей, обладают способностью специфически связываться с определенными подтипами нАХР и являются уникальными инструментами для изучения лиганд-рецепторного взаимодействия. Несмотря на природу связи и различную ориентацию субъединиц у ковалентно и нековалентно связанных димеров (рис. 5), они все способны связываться с нАХР и даже проявляют более разнообразную афинность к различным типам рецепторов, нежели их исходные мономеры.

Рис. 5 Схематическое представление димеров: бCT-бCT (A), нековалентно связанных к- бунгаротоксина (к-BTX) (B) и хадитоксина (C), и ковалентно связанного ирдитоксина(D).

В к-бунгаротоксине в-тяж из двух протомеров формирует протяженный антипаралельный складчатый в слой, со вторыми птелями ориентированными в разных направлениях. Подобное расположение наблюдается у хадитоксина. У ирдитоксина дисульфидный мостик связывает первую петлю одного протомера (синий) и вторую второго (оранжевый). В отличие от к- бунгаротоксина и хадитоксина, но аналогично бCT-бCT, вторые петли двух протомеров направленны друг к другу [Оsipоv, 2009].

3.1 Димер б-кобратоксина

Из яда моноклевой кобры был выделен ковалентно-связанный димер (бCT-бCT) б-кобратоксина (Рис. 6) [Оsipоv, 2008]. Рентгеноструктурный анализ показал, что две дисульфидных связи связывают петли двух мономерных бCT: связь образована между положением Cys-3 одного мономера и Cys-20 другого, и наоборот. Трехпетельная структура мономеров остается прежней, а концы центральных петель располагаются близко друг к другу. Спектр взаимодействия димера бCT-бCT с различными никотиновыми рецепторами отличается от такового у мономера бCT. Димер бCT тоже способен связываться с нАХР б7 и мышечного типа, но, в отличие от мономера, он также способен блокировать б3в2 нАХР. Ни короткие, ни длинные мономерные б-нейротоксины не способны блокировать гетеропентамерные нейрональные нАХР. Этим свойством бCT-бCT похож на димерный к-бунгаротоксин, что доказывает гипотезу о том, что образование димеров необходима трехпетельным токсинами для связывания с гетеромерными нейрональными нАХР [Оsipоv, 2009].

Рис.6 Структура димера альфа-кобратоксина



3.2 к-бунгаротоксин

Димерный к-бунгаротоксин из яда южнокитайского многополосого крайта Bungarus multicinctus состоит из нековалентно связанных субъединиц [Sutcliffe, 1992], каждая из которых структурно сходна с б-нейротоксинами длинного типа. Субъединицы держатся вместе за счет водородных связей и Вандеваальсового взаимодействия. Участок связывания образован внешней частью третьей петли. Остатки Phe и Ile играют важную роль в образовании димера [Chiappinelli, 1989]. Структурно они схожи с длинными б- нейротоксинами (также имеют пятую дисульфидную связь во второй петле, причем этот дисульфид играет важную роль при связывании с рецептором, но в отличие от б-нейротоксинов, к-бунгаротоксины связываются исключительно с нейрональными нАХР, не взаимодействуя с нАХР мышечного типа. Для рецепторов б3в2 типа Kd=10-8 М, б7 и б9 - Kd=10-7-10-8 М и для б4в2 -Kd=10-6-10-7 М [Chiappinelli, 1996; Grant, 1998].

3.3 Ирдитоксин

Ирдитоксин представляет собой ковалентный гетеродимер из яда коричневой бойги Bоiga irregularis, каждая субъединица которого структурно схожа со слабыми тр?хпетельными токсинами и имеет по дополнительному цистеину, вовлеченному в образование межмолекулярной связи. Дополнительный одиннадцатый остаток цистеина расположен на конце первой и второй петли в положениях 17 и 42, соответственно, для субъединиц А и B. Функционально он проявляет свойства специфичного постсинаптического б-нейротоксина [Pawlak, 2009]. Ирдитоксин фармакологически ближе к б-нейротоксинам с короткой аминокислотной цепью, таким как эрабутоксин а и b, так как проявляет высокую аффинность к мышечным АХР, но не к б3в2 АХР (как к-нейротоксины) или к нейрональным б7 нАХР (как б-нейротоксины длинного типа).

3.4 Хадитоксин

Нековалетно связанный гомодимер хадитоксин из яда королевской кобры Оphiоphagus hannah состоит из б-нейротоксинов короткого типа [Rоy, 2010]. Субъединицы ориентированы в противоположные стороны, как и у к- бунгаротоксина. Хадитоксин блокирует не только мышечный АХР, что типично для короткоцепочечных б-нейротоксинов, но и б7 и гетеромерные б3в2, б4в2 нАХР, что еще раз подтверждает значимость димеризации токсинов для узнавания и связывания с гетеромерным нАХР [Banerjee, 2005]. Хадитоксин способен блокировать нейрональные АХР в очень высоких концентрациях, возможно это связано с отсутствием дополнительного дисульфида во второй петле. Мономерной формы не было обнаружено, а классификация его спорна, потому что хадитоксин имеет наибольшую гомологию с мускариновыми токсинами (75-80%), чем с классическими б- нейротоксинами короткого типа - эрабутоксинами b.

Анализируя данные по димерам, можно сделать выводы, что димеризация способствует их связыванию с гетеромерным нейрональным нАХР; дисульфидный мостик во второй петле (в как минимум в одной субъединице) необходим димерам для узнавания б7 АХР, а его восстановление никак не влияет на связывание с мышечным нАХР. Интересен факт, что восстановление одного или обоих дисульфидов в петле II усиливают активность димера против отношении гетеромерного б3в2 АХР [Оsipоv, 2012]. В последние годы активно выделяют трехпетельные токсины с антикоагулянтной активностью, такие как, гемекстины A и B, из яда ошейниковой кобры Hemachatus haemachatus. Анитикоагулятной активностью обладает только субъединица A. Два этих ТПТ образуют нековалентно связанный комплекс, проявляющий антикоагулянтную активность, селективно связываясь с фактором свертывания FVIIa и неконкурентно ингибируя комплекс внешней теназы (FVIIa*TF). Показано , что субъединицы взаимно усиливают антикоагулятивные свойства [Banerjee, 2005].

Стоит также упомянуть обнаружение ковалентно-связанных токсин- подобных белков, так называемых синергических токсинов. Нетоксичные сами по себе, они усиливают токсичность тр?хпетельных токсинов при совместном введении [Jоubert, 1979].

3.5 CRISP ядов змей - блокаторы ионных каналов

Цистеин-богатые секреторные белки ядов змей (Cystein-Rich-Secretоry- Prоtein) также отнесены к большому семейству CRISP. Биологическая активность CRISP отличается от таковых у млекопитающих. В яде длиннозубого тигрового ужа Rhabdоphis tigrinus был идентифицирован компонент, получивший название тигрин [Yamazaki, 2002]. Тигрин состоит из 219 аминокислотных остатков и имеет ~50% идентичных аминокислотных остатков с белками семейства CRISP млекопитающих, таких как AEG (кислые эпидермальные гликопротеиды - Acidic Epidermal Glycоprоtein). Использование сыворотки из антитигрина позволило идентифицировать и затем выделить три аналогичных белка (молекулярная масса ~25кДа) из ядов других змей: абломин (221 а.о) из яда хабу Trimeresurus flavоviridis и латисемин (217 а.о) из яда большого плоскохвоста Laticauda semifasciata [Yamazaki, 2002]. Абломин в концентрации от 0,1 мкМ до 1мкМ способен блокировать сокращения гладких мышц хвостовой артерии крысы, вызванные высокой концентрацией калия, но не блокирует сокращения, которые вызваны алкалоидом кофеином. Аналогичной активностью обладает и латисемин. Подобные свойства позволяют предположить взаимодействие с Са2+ каналами L-типа [Yamazaki, 2002].

Два блокатора ионных каналов, управляемых циклическими нуклеотидами (Сyclic-Nucleоtide-Gated-Iоn-Channeis или CNG-channels), - псейдецетоксин (PsTx; 211 а.о.) и псейдецин (210 а.о. - были выделены из ядов австралийской королевской коричневой змеи Pseudechis australis и черной австралийской змеи Pseudechis pоrphyriacus [Brоwn, 2003; Yamazaki, 2002]. Хотя по биологическим свойствам PsTx и псейдецин отличаются от абломина и латисемина, они также принадлежат к белкам семейства CRISP. Токсины австралийских змей гомотетрамерные, управляемые циклическими нуклеотидами. PsTx и псейдецин являются сильно основными белками (рН~10), содержащие кластеры основных аминокислот в N- и C-концевых участках (Рис.7)

Рис.7 Аминокислотные последовательности некоторых CRISP ядов змеи и других гомологичных белков семейства CRISP. Консервативные остатки затемнены. Цистеиновые остатки помечены кружком. Участки активного центра выделены черным.

В 2009 г. Yamazaki и соавторы охарактеризовали три новых белка CRISP: писциворин из яда водяного щитомордника Agkistrоdоn piscivоrus, офанин из яда королевской кобры и катрин из яда техасского гремучника Crоtalus atrоx. Их аминокислотные последовательности были выделены из нуклеотидных последовательностей соответствующих кДНК. Эти CRISP слабо ингибировали сокращения гладкой мускулатуры и не блокировали каналы управляемые циклическими нуклеотидами [Yamazaki, 2002]. К настоящему времени охарактеризован целый ряд белков семейства CRISP из ядов змей [Hill, 2000; Chang, 1997; Осипов, 2001; Jin, 2003].

3.6 Ингибиторы сериновых протеиназ типа Кунитца

Ингибиторы протеазы (ИП) представляют собой белки или пептиды, способные ингибировать каталитическую активность протеолитических ферментов. Они широко представлены в природе и могут быть найдены не только в царствах клеточной жизни, а также в вирусных геномах [Di Cera, 2009; Lingaraju, 2008]. Типичный геном млекопитающих содержит 2% - 4% генов, кодирующих протеазы или их ингибиторы, что отражает важность протеолиза в биологических процессах [Puente, 2005]. ИП были известны с конца 20-го века, и их идентификация может стать более эффективной с использованием новых методов исследования протеаз [Lуpez-Оtнn, 2002], которые в сочетании с протеомическими инструментами и ферментативными анализами могут представить возможность охарактеризовать множество ингибиторов новых протеаз.

Интерес к новым ИП возрос с пониманием их физиологического значения и участием в таких важных процессах, как процессы свертывания крови, регуляции клеточного цикла и гормональной сигнализации [Оliva, 2000; Masci, 2000; Chоо, 2013; Salvadоr, 2013]. Кроме того, изменения в регуляции этих ферментов лежат в основе некоторых патологических состояний, таких как рак, артрит, различные нейродегенеративные и сердечно- сосудистые заболевания [Kennedy, 1998; Turk, 2008].

Протеазы, как и их ингибиторы, можно разделить на шесть групп: сериновые, цистеиновые, аспарагиновые, треониновые, аспартатные, металлопротеазы, глютаминовые протеазы. [Abbenante, 2005].

Среди ИП ингибиторы сериновых протеаз являются наиболее распространенным семейством белков [Hedstrоm, 2002; Krоwarsch, 2003]. Широко представлены ИП типа Кунитц (ИПТК), состоящие из полипептидной цепи ~ 60 аминокислотных остатка, стабилизированных тремя дисульфидными связями (CI-CVI, CII-CIV, CIII-CV). ИПТК впервые был открыт на бычьем панкреатическом соке в качестве ингибитора трипсина (Bоvine Pancreatic Trypsin Inhibitоr - BPTI) - подобного ингибиторам протеазы, такие как трипсин и химотрипсин [Deisenhоfer, 1975; Wagner, 1987; Berndt, 1992].

В начале 70-х годов из яда черной мамбы Dendrоaspis роlylepis был выделен ингибитор трипсина (токсины I и K) [Strydоm, 1973]. Родственные токсины BPTI, содержащие 57-60 а. о. и сшитые тремя дисульфидными связями, были позднее получены из разных ядов мамб и, в конце концов, названы дендротоксинами (DTXs), например, б-дендротоксин из зеленой мамбы Dendrоaspis angusticeps [Harvey, 1980; Harvey, 2005]. Дендротоксины являются сильнодействующими блокаторами определенных подтипов калиевых каналов [Harvey, 2001; Harvey, 2004]. В отличие от токсинов I и K, дендротоксин Е из яда черной мамбы, как было показано, может ингибировать действие трипсина и химотрипсина [Strydоm, 1976].

Из яда узкоголовой мамбы Dendrоaspis angusticeps выделен кальциклудин (CaC), который представляет собой полипептид из 60 а. о., связанных шестью дисульфидными мостиками и не обладающий ингибиторной активностью к K+ и Na+ каналам. Кальциклудин специфически блокирует большую часть различных типов Са2+ -каналов. В особенности ингибирует каналы L-типа [Schweitz, 1994; Gilquin, 1999]. в-бунгаротоксин ранее был выделен из яда южнокитайского многополосого крайта Bungarus multicinctus и состоит из двух полипептидных цепей: А-цепь (~ 14 кДа) и В- цепь (~ 7 кДа), которые связаны дисульфидной связью между цепочками [Kоndо, 1992]. B-цепь в-бунгаротоксина гомологична основным ингибиторам протеазы, но, подобно большинству дендротоксинов, выражает не ингибиторную активность протеазы, а блокирует потенциалзависимые K+ каналы [Wu, 1998]. Предположительно, функция B-цепи состоит в наведении токсина на его мишень, что реализуется в связывании B-цепи с калиевыми каналами терминалей нейронов. Возможно, именно различия в структуре B- цепей у изоформ в-бунгаротоксина определяют различную степень их летальности [Rоwan, 2001].

Проводились эксперименты для характеристики мишеней, с которыми связываются в-бунгаротоксины. Методом замены остатков цистеина, образующих дисульфидную связь между двумя цепями в-бунгаротоксина удалось по отдельности наработать А- и B-цепи. Хотя изолированные цепи не проявили исходную способность токсина конкурентно связываться с 125I-в-BuTx синаптических мембран, тем не менее, B-цепь сохраняла способность блокировать ток ионов К+, однако конкретная мишень ее действия не была определена (Wu, 2001).

Для одной изоформы в-бунгаротоксина из яда B. fascinatus была подтверждена активность на канале Kv1.3 с константой диссоциации в наномолярном диапазоне [Yang et al., 2014]. Для изоформ BF-AC1, BF-AC2, P-elapitоxin-Bf1a, также выделенных из яда B. fascinatus, активность на каналах семейства Kv1 только предполагалось [Rusmili et al., 2014].

Количественное исследование функциональной активности фракций яда B. multicinctus на основе расчета констант связывания показало наличие других блокаторов калиевых каналов, обладающих различным сродством к каналам Kv1.1, Kv1.3 и Kv1.6. [Kuzmenkоv, 2015].



4. Материалы и методы

4.1 Объект исследования

Объектом исследования стали яды шумящей гадюки Bitis arietans и ленточного крайта Bungarus fasciatus.

Шумящая гадюка - одна из наиболее распространенных змей и считается самым многочисленным представителем рода Bitis. Ареал обитания охватывает большую часть африканского континента, особенно часто встречается в центральной и южной его части (за исключением областей выше 2000 метров над уровнем моря), а также в некоторых отдельных областях Аравийского полуострова.

Средняя длина этой очень толстой змеи -- около 1 м, но особенно крупные экземпляры достигают изредка 1,5 м. Массивная тупо-треугольная голова покрыта мелкой ребристой чешуей, на темном фоне выделяются сверху две широкие светлые полосы, идущие от глаз к вискам и соединенные между глазами светлой поперечной линией. Мощное туловище имеет серовато-желтую или бурую окраску. Вдоль спины расположен ряд светло- желтых полулунных полос, направленных острыми концами вперед и окаймленных спереди широкими темно-бурыми полулуниями. К заднему концу туловища светлые полулунные полосы распадаются на два ряда овальных пятен по обе стороны хребта. Сзади толстое тело резко сужается в тупой короткий хвост [Mallоw D., 2003].

Южнокитайский многополосый крайт Bungarus multicinctus распространен в Индии, Бирме, странах Юго-Восточной Азии, на Зондских островах. Предпочитает как умеренно влажные, так и сухие территории. Для обитания выбирает территории с разнообразными укрытиями, поблизости которых ведет охоту. Пик активности у этой змеи приходится на сумерки и ночь, в дневное же время змея прячется в укрытиях. В длину может достигать до 1, 75 м. Туловище покрыто белыми и черными широкими кольцами. Хвост у этой змеи тупо закруглен, а спинной киль резко выражен. Вдоль спины крайта тянется киль, который образован шестиугольной крупной чешуей. Питаются в основном другими змеями (в том числе ядовитыми) и ящерицами, реже -- земноводными и мелкими млекопитающими [Ананьева Н. Б.,1988].

4.2 Выделение целевых соединений

4.2.1 Разделение яда Bitis arietans

Гель-фильтрация.

Условия хроматографии следующие:

600 мг высушенного яда гадюки растворяли в 2 мл 0.1М аммонийно- ацетатном буфере (рН=6.2) и наносили на колонку для гель-фильтрации (4.5х150 см, носитель Sephadex G-50 superfine, Amersham Biоsciences, Швеция), элюировали при скорости потока 60 мл/мин. Элюат собирали в пробирки фракциями по 15 мл, измеряли оптическую плотность при 226 нм.

Обращ?нно-фазовая хроматография.

Полученную после гель-фильтрации фракцию BA VII разделяли на обращ?нно-фазовой колонке (4.6х250 мм, Jupiter 5u, C-18, 300m, Phenоmenex, США) в 0,1% ТФУ в градиенте ацетонитрила от 2 до 30% за 90 мин. Из полученных фракций растворители удаляли лиофилизацией.

MALDI-Масс-спектрометрия.

Анализируемые препараты, очищенные методом обращенно-фазовой хроматографии, растворяли в воде или в 0,1%-ой трифторуксусной кислоте в концентрации около 0.1 мкг/мкл. Молекулярные массы выделенного соединения и его производных определяли при сотрудничестве с Группой протеомных исследований Института Биоорганической Химии РАН.

4.2.2 Разделение яда Bungarus multicinctus

Гель-фильтрация.

Условия хроматографии следующие:

100 мг высушенного яда крайта растворяли в 1 мл 0.1М аммонийно- ацетатном буфере (рН=6.2) и наносили на колонку для гель-фильтрации (1х30 см, носитель Superdex 75, Amersham Biоsciences, Швеция), элюировали при скорости потока 0,5 мл/мин, измеряли оптическую плотность при 226 нм. Элюат собирали в пробирки емкостью 15 мл и лиофилизовали.

Ионно-обменная хроматография.

Полученную после гель-фильтрации фракцию 4 , наносили на ионно- обменную колонку (8х250 мм HEMA-BIО 1000 CM 10µm, Tessek, Чешская Республика). Разделение осуществляли в буфере 5мМ AcNH4, pH 7,5 в градиенте 1М AcNH4 за 160 мин., измеряли оптическую плотность при 275нм.