Аннотация

Изучение свойств бактериальной суспензии и ее применение в подготовительных процессах переработки мехового сырья

Выпускная квалификационная работа (дипломная работа). ФСТД, 2006.

Объектом исследования являются природные жиры - нерпичий, свиной, шерстный; синтетический - Tanning oil G; модифицированный- сульфированный рыбий жир и микроорганизмы, выделенные из жира нерпы и шерстного жира, а также из сточных вод после проведения процесса обезжиривания, образцы меховой овчины, шкурки белки.

Цель работы -- изучение морфолого-культуральных свойств микроорганизмов и исследование их деструктирующей способности.

В результате исследования изучены морфолого-культуральные свойства микроорганизмов и возможность применения микроорганизмов, способных деструктировать жировые вещества для биотехнологического процесса обезжиривания меховой овчины, шкурок белки.

Установлено, что предложенный биотехнологический способ обезжиривания обеспечивает оптимальное удаление жировых веществ с поверхности волосяного покрова и из кожевой ткани.

Разработаны маточные растворы для обезжиривания, позволяющие проводить процесс с меньшим расходом синтетических поверхностно-активных веществ, исключение из рабочего состава формальдегида и карбоната натрия.

Основные технологические показатели: исключение из сточных вод формальдегида, сокращения содержания в сточных водах синтетических поверхностно-активных веществ, сокращение расхода химматериалов.

Область применения - для дальнейшего внедрения в производство.

Экономический эффект достигается за счет сокращения расхода химматериалов и сточных вод.

Введение

В настоящее время экономическое состояние страны ставит перед легкой промышленностью много проблем, среди которых важнейшими являются процессы интенсификации производства и рост его эффективности. Основным источником повышения эффективности мехового производства является проведение исследовательских работ с целью совершенствования технологии с применением новых способов обработки и химических материалов. Интенсификация производства предполагает повышение степени механизации и автоматизации трудоемких работ. Рыночные отношения предъявляют новые требования к предприятиям легкой промышленности. Предприятия должны обеспечить экологическую безопасность окружающей среды от возможных отрицательных последствий, оставаясь кредитоспособными и иметь высокие показатели экономической эффективности производства. Все это ведет к тому, что руководители стремятся внедрять те технологии, которые дают полуфабрикат с высокими показателями качества и параметрами, соответствующими ГОСТам, выработанными с минимальными затратами труда, химматериалов и времени.

Характерной особенностью предприятий кожевенной и меховой промышленности является большое потребление воды и, следовательно, большой объем отработанных жидкостей, так называемых сточных вод, которые относятся к числу наиболее опасных для водоемов.

Содержание загрязнений в сточных водах кожевенно-меховой промышленности столь велико, что в случае поступления последних в водный объект, может вызвать необратимые процессы, включая полное разрушение сложившейся экосистемы. Поэтому проблема экономного использования воды, снижения количества сточных вод, уменьшения их загрязнения в настоящее время является одной из важных проблем.

В связи с этим целью работы являлось изучение деструкции жировых веществ микроорганизмами, выделенных из природных жиров и сточных вод, после процесса обезжиривания и разработка параметров для проведения биотехнологического обезжиривания меховых шкур.

1. Литературный обзор. Применение ферментов в кожевенной и меховой промышленности

Ферментативная обработка сырья одно из наиболее перспективных направлений совершенствования биотехнологических процессов в производстве кожи и меха. Известны работы по использованию ферментов в отмоке, золении, обезволашивании, позволяющие интенсифицировать жидкостные процессы и существенно снизить загрязненность сточных вод.

Основанием для применения ферментов при обработке шкур явились развитие ферментной промышленности и расширение выпуска различных ферментных препаратов, в том числе для меховой промышленности.

Обработка шкур с применением ферментов является более рациональной по сравнению с другими способами, обеспечивает высокое качество кожи -- мягкость, легкость, пластичность, кроме того, способствует повышению производительности труда и увеличению выхода площади полуфабриката, что в целом дает значительный экономический эффект [1].

1.1 Применение ферментов в производстве кожи

В кожевенном производстве процессы с применением ферментов протекают на коллагеновых структурах уже подвергшихся изменениям в той или иной степени в результате консервирования, золения и др. процессов.

Отмока сырья с применением ферментов позволяет значительно ускорить и усовершенствовать обводнение кожевенного сырья, особенно законсервированного высушиванием. Далее, ферментативные процессы при обезволашивании кожевенного сырья, процесс мягчения целиком основан на воздействии протеолитических ферментов на дерму - коллаген. Главным вопросом в механизме ферментативного воздействия является выявление роли протеолитических ферментов на коллагеновые структуры кожного покрова различных видов животных и разных их возрастов. Исследования в этой области очень разноречивы. Например, коллаген молодых животных менее устойчив к воздействию протеолитических ферментов, чем коллаген взрослых животных. Также известно, что нативный коллаген и другие белки устойчивы к действию ферментов, а денатурированный коллаген, подвергшийся термической, механической, кислотной, щелочной, солевой обработке, гидролизуется под воздействием протеолитических ферментов [2].

Обработка свиного голья в растворах ферментов способствует освобождению его от остатков корней волоса, эпидермиса, пигмента и кожного жира, смесь которых в кожевенном производстве называется гнейстом. После мягчения гнейст легко удаляется из ткани опавшего голья при легком нажиме. Очистка голья от гнейста необходима, так как при дальнейших обработках он вызывает пятнистость и грубость лицевой поверхности кожи [3].

Были проведены многочисленные исследования, в которых предпринимались попытки использовать протеолитические ферменты. Известно, что в технологии кожи разрыхление структуры достигается сначала обработкой шкур в щелочных растворах (золение), а затем мягчением измененного коллагена протеолитическими ферментами. Мягчению подвергают уже обезволошенные шкуры, поэтому выбор ферментов не лимитируется их действием на волос или на прочность связи волоса с кожевой тканью.

Ряд исследователей считают, что свежий, незолоеный и необработанный нейтральными солями коллаген разрушается панкреатином. Так, кусок шкуры был обработан панкреатином при температуре 40⁰С (панкреатин менялся в течение обработки много раз). Потери азота составили 27 %. Исследования проведенные на изолированных коллагеновых волокнах под контролем микроскопа в камере с подогревом, показали, что 5% раствор панкреатина при 40⁰С в течение 5 часов вызывает растворение коллагеновых волокон. Нативные волокна коллагена сначала распадаются на элементарные волокна, вследствие растворения промежуточного вещества, а затем на отдельные отрезки, которые переходят в раствор [4].

В кожевенном производстве ферментные препараты применяются как мягчения голья, так и для обезволашивания овчины. Наибольшее преимущество ферментов проявляется при использовании их для обезволашивания. При этом устраняется широко применяемый в производстве хромовых кож намазной известково-сульфидный способ обезволашивания. Это позволяет исключить применение вредных химических материалов, повысить культуру производства и производительность труда, упростить очистку сточных вод. Кроме того, ферментная обработка повышает качество снимаемой шерсти. Основной причиной недостаточного применения ферментного метода обезволашивания является высокая стоимость выпускаемых ферментных препаратов [5].

Введение ферментной обработки для свиного сырья способствует:

- более легкому удалению щетины;

- раскрытию коллагеновых пучков и разрыхлению плотной структуры;

- дополнительному обезжириванию сырья.

Указанные факторы обуславливают получение съема щетины стандартного голья, что имеет немаловажное значение для выполнения последующих процессов и операций, особенно золения, придают мягкость и эластичность готовой коже, повышают качество и выход щетины.

Принципы построения методики обезволашивания свиного сырья ферментами такие же, как и для других видов сырья. После промывки, отмоки и обезжиривания следует ферментная обработка при повышенной температуре в присутствии антисептиков ванным, намазным или комбинированным способами [6].

Шкуры овец являются основным видом кожевенного сырья, обезволашивание которого с помощью ферментов находит все большее применение. Одна из главных причин этого сохранение высокого качества шерсти - ценного сырья для текстильной промышленности. Шерсть, снятая бактериологическим (швицеванием или после обработки ферментами) способом, равноценна стриженной шерсти. Для получения шерсти высокого качества за рубежом взамен электростирижки широко применяется ферментный метод обезволашивания для шкур овец тонкорунных, полутонкорунных и других пород. При этом выход шерсти увеличивается на 10-20 % в сравнении с выходом при электростирижке. Повышенный выход шерсти объясняется большей ее длиной из-зи отсутствия разрушения корня и нижней части волоса, которые происходят при известково-сульфидном обезволашивании или остатков волоса при электрострижке. Длина шерсти, снятой ферментным способом, примерно на 10-30 % больше, чем длина шерсти, снятой указанными выше методами.

Преимущества по качеству и общему выходу шерсти сохраняются и при ферментном обезволашивании овчины в кожевенном производстве.

Ферментная обработка овчины с целью последующего удаления шерсти способствует получению высококачественных с большей мягкостью и эластичностью перчаточных и одежных кож, а так же кож для анилиновой отделки вследствие большей чистоты и гладкости лицевой поверхности [7].

Кроме того, в последние годы повысились санитарно-гигиенические требования к очистке сточных вод на кожевенных заводах.

В настоящее время в большинстве стран для обезжиривания кожевенного сырья преимущественно используются бактериальные протезы с разной степенью очистки. Большой интерес для кожевенной промышленности представляют препараты протеолитических ферментов, полученные методом распылительного высушивания. Перспективным является получение препаратов методом многоступенчатого вымораживания.

Испытания проводили на кожевенном заводе при центральном научно-исследовательском институте Кожобувной промышленности. Результаты исследования показали, что препараты обладают хорошей обезволашивающей способностью при обработке различных видов кожевенного сырья. При обработке свиного сырья наблюдалось сильное ослабление связи щетины с дермой за 18-20 часов. В этом случае так же отмечалось хорошее обезжиривание сырья. При ферментативной обработке свиного сырья содержание жира уменьшилось более чем в 4 раза. Для сравнительной оценке обезжиривающей способности препарата были поставлены контрольные опыты, где вместо ферменного препарата использовали специальные обезжиривающие вещества, применяемые в кожевенной промышленности. Исследования показали что, применение ферментных препаратов из культуры Bac. Mesentericus шт. 11-11 позволяет для этого вида сырья исключить последующий процесс обезжиривания полуфабриката [8].

В работе Чурсина В.И., Шапкарина Н.П. исследовано влияние различных ферментов и их комбинаций на свойства дермы. Эксперименты проводили на образцах сырья из яловки легкой развесом 18-24 кг мокросоленого консервирования. В данной работе использованы следующие ферментные препараты: щелочная протеаза с активностью 51300 ед/г(ТУ 64-13-19-89), коллагеназа с активностью 118 ед/г (по данным производителя - ЗАО«Биопрогресс»), протосубтилин Г-Зх с активностью 70 ед/г (ГОСТ 23636-90).

Обработку ферментами проводили при ж.к. 1,5, температуре 30єС в присутствии 3% карбамида и при рН =9,5. Расход ферментных препаратов устанавливали исходя из их активности, а именно, для коллагеназы-0,1%, для щелочной протеазы-0,5%, для протосубтилина-1% от массы сырья. Обработку проводили в течение 4 ч.Некоторое ослабление волоса было отмечено для образцов, обрабатывавшихся в присутствии коллагеназы. После промывки образцы направляли на золение, которое осуществляли при расходе гидроксида натрия 2% и сульфида натрия 0,6%. Полное удаление шерсти наблюдалось при ферментативной обработке коллагеназой и протосубтилином Г-Зх.Для обезволашивания образцов, которые подвергались обработке щелочной протеазой, расход сульфида натрия увеличивали до1,2%от массы сырья.

Таблица 1- Кинетика процессов и состояния голья на отдельных стадиях обработки

Расход фермента	Состояни е голья после золения	Степень пропикеле ванности через 4ч,%	Прокрас соединениями хрома,%	Температура сваривания,С
			1ч	3ч	5ч
Коллагеназа -0,1%	Сильный нажор, повреждение лицевой мембраны	100	50	60	90	79
Протосубтилин Г-Зх-1%	Сильный нажор, повреждение лицевой мембраны	80	20	60	80	91
Щелочная протеаза-0,5%	Незначительный нажор,остатки шерсти	100	80	100		86

Как следует из таблицы 1, представленные результаты не позволяют дать однозначную интерпретацию действия ферментов на ослабление связи волоса с дермой и протекание последующих процессов, но объясняют многие важные моменты ферментативного обезволашивания. В то же время использование коллагеназы в данной концентрации приводит к повреждению лицевой поверхности и, принимая во внимание незначительную температуру сваривания, вызывает существенную деструкцию коллагеновых фибрилл.

Протосубтилин, относящийся к протеазам общего действия, в большей степени разрушает эпидермис, в состав которого входят глобулярные гликопротеиды, протеогликаны и «мягкие» коллагеновые белки. Это, в свою очередь, вызывает повреждение лицевого слоя голья.

Щелочная протеаза активно гидролизует неколлагеновые белки, способствуя полному освобождению от них волокнистой структуры дермы. Как результат для этих образцов отмечаются высокие значения пропикелеванности и продубленности.

Следует подчеркнуть, что степень поврежденности лицевой поверхности голья в результате ферментной обработки находится в тесной зависимости с содержанием общих белков в отработанных растворах после золения.

Представлялось интересным по той же схеме оценить действие бинарных смесей ферментных препаратов, которое может быть более интенсивным за счет синергетического эффекта и расширения спектра гидролизуемых связей.

На основании полученных результатов выяснилось, что комбинация ферментных препаратов позволяет улучшить как процесс обезволашивания- золения, так и процесс дубления. Хороший эффект обезволашивания достигается при совместной обработке коллагеназой и протосубтилином Г-Зх. Это объясняется более высокой способностью протосубтилина Г-Зх разрушать эпидермальные слои шкуры, облегчая тем самым доступ коллагеназы к коллагеновым белкам, выстилающих волосяные сумки. Однако, отсутствие эффективного воздействия на глобулярные белки неколлагенового характера не позволяет добиться полного извлечения их из структуры дермы, что несколько снижает скорость проникания дубящих солей к активным центрам коллагеновой молекулы.

Наиболее эффективен с этой точки зрения состав, включающий протосубтилин Г-Зх и щелочную протеазу, позволяющий практически полностью очистить дерму от неколлагеновых белков и обеспечить хорошую степень обезволашивания в процессе золения.

Сравнительная оценка действия ферментов показала различия в их влияния на те или иные характеристики голья и полуфабриката. Более эффективными в целях обезволашивания являются диады соответствующих ферментных препаратов, обеспечивающих к тому же более высокие технологические преимущества при проведении преддубильно-дубильных процессов [9].

Шкуры угря по сравнению со шкурами других видов рыб имеют наиболее сложное гистологическое строение, что определяет необходимость специфической их обработки с целью получения кож [10].

В работе Харчуткиной Е.М., Болдовской Е.П., Дормидонтовой О.В. и др. для разработки методики отмоки-обезжиривания шкур угря были выбраны препараты липаза флюозим ГЗх, обеспечивающая достижение хорошего обезжиривающего и отмачивающего эффекта, и протеаза Прок, способствующая обводнению шкур.

При изыскании эффективного способа отмоки обезжиривания шкур угря, позволяющего сохранить рисунок лицевой поверхности, было сделано предположение о возможности совместного использования липазы и протеазы. В связи с этим изучалось влияние последовательности введения ферментных препаратов в обрабатывающую жидкость на активность системы.

Таблица 2- Влияние последовательности введения ферментных препаратов в обрабатывающую жидкость на активность системы

Вариант	Ферментный препарат	рН	Протеолитическая активность по методу Ансона, ед/г	Липолитическая активность по методу Ота-Ямада, ед/г
1	Протеаза	7	75,4	10000
2	Протеаза	10	36,9	5000
3	Липаза	7	55,4	100000
4	Липаза	10	33,8	95000
5	Протеаза + субстрат; липаза	7	73,8	80000
6	Протеаза + субстрат; липаза	10	50,8	70000
7	Липаза + субстрат; протеаза	7	29,2	140000
8	Липаза + субстрат; протеаза	10	9,2	133000
9	Протеаза + липаза	7	23,1	35000
10	Протеаза + липаза	10	10,8	30000

Из данных таблицы 2 видно, что при одновременном дозировании ферментных препаратов активность системы меньше суммарной активности отдельно взятых препаратов.

Рассматривая данное явление, можно предположить, что снижение протеолитической и липолитической активности является результатом изменения структурных особенностей обоих ферментных препаратов (гидролиз связей в цепях молекул ферментов, блокировка функциональных групп активного центра и т.д.), и, как следствие этого, их инактивированием.

Анализируя варианты введения ферментных препаратов в раствор, можно сделать вывод о том, что совместное использование липазы флюозим ГЗх и протеазы Прок возможно лишь при условии их поочередного введения. Данные таблицы 2 показывают также, что введение в субстрат липазы флюозим ГЗх, а затем протеазы Прок приводит к значительному снижению протеолитической активности полиферментной системы, что может объяснятся особенностями механизма каталитической реакции, при которой флюозим ГЗх, воздействуя на субстрат, затрудняет каталитическое действие протеазы Прок.

Результаты эксперимента показали, что применение композиции ферментных препаратов при одновременном их дозировании приводит к снижению протеолитической и липолитической активностей; в случае предварительного введения в обрабатывающую жидкость липазы увеличивается липолитическая активность системы и уменьшается протеолитическая, а в случае предварительного введения в обрабатывающую жидкость протеазы увеличивается протелитическая активность системы и уменьшается липолитическая.

Таким образом, для получения кож из шкур угря рекомендуется технология, предусматривающая отмоку-обезжиривание в водном растворе липазы флюозим ГЗх и протеазы Прок при их последовательном введении. Это позволит получить кожевенный полуфабрикат с сохранением специфического рисунка лицевой поверхности, хорошими прочностными и упруго-пластическими свойствами [11].

В работе С.П. Кочетовой и других использован фермент протакрин, представляющий собой комплексную щелочную протеазу. Для работы использовалось сырье КРС массой 25-30 кг.

Воздействие ферментов на сосочковый и сетчатый слои дермы зависит от глубины и скорости проникания в толщу дермы, поэтому представляют интерес методы, дающие возможность проследить за движением и локализацией ферментов в дерме.

Для исследования изменений, происходящих в дерме под действием ферментов был использован метод количественного анализа структуры по РЭМ- изображению.

Образцы КРС исследовали после отмоки, щелочной подготовки и ферментативного обезволашивания. Для каждого образца проводили послойный анализ изменений, происходящий в сосочковом, пограничном и в сетчатом слое.

На сосочковом слое дермы после отмоки были видны отдельные пучки волокон в плотной упаковке, после щелочной подготовки наблюдалось разделение отдельных пучков на волокна, после ферментативной обработки достигалось разделение отдельных пучков на волокна, становились видны отдельные тонкие волоконца, связующие пучки волокон. В пограничной области дермы между сетчатым и сосочковыми слоями после отмоки были видны плотно упакованные пучки волокон, после щелочной подготовки отдельные пучки в большей степени разделены на волокна, после ферментативной обработки видна система тонких волоконец, связывающих между собой отдельные пучки и более крупные волокна. Разделение же самих пучков на волокна в сетчатом слое практически не наблюдается, но следует отметить, что после ферментативной обработки образуется система тонких волоконец, связующих отдельные пучки.

Анализируя полученные результаты, можно сделать следующие предположения: в сосочковом слое после щелочной подготовки происходит разделение структуры, дополнительное освобождение от глобулярных белков и жировых образований. В пограничном слое (между сосочковым и сетчатым) в сырье после отмоки и после щелочной обработки наблюдается тенденция к увеличению количества мелких пор. Это происходит, видимо, за счет удаления неколлагеновых белков.

Сетчатый слой после щелочной подготовки сырья также характеризуется увеличением мелких пор, в то время как после ферментативной обработки возрастает число крупных пор. Это может быть связано с разделением структуры, образованием больших межпучковых пространств

На основании этого можно сделать вывод, что ферментный препарат проникает в толщу дермы и способствует частичному разделению структуры, выводу глобулярных белков. Изменений самой макроструктуры не происходит [12].

Г.А. Нестеровой и Л.П. Истрановым были проведены исследования закономерностей обезволашивания кожевенного, сырья. Обезволашивающего эффекта можно достигнуть, разрушая корень; волоса путем разрыва в щелочной среде прочных дисульфидных связей, а также разрушением веществ, выстилающих волосяную сумку, что способствует свободному выходу из нее волоса. Одной из составных частей ферментативного обезволашивания является воздействие ферментов на компоненты сложных белков, выстилающих волосяную сумку и белково-углеводистые комплексы.

Более поздние исследования подтвердили важную роль протеаз в разрушении белково-углеводистых комплексов. Для достижения эффекта обезволашивания целесообразно применение ферментов, действующих на различные классы соединений, присутствующих в дерме, белки, углеводы, жировые вещества, причем ведущее место принадлежит протеазам.

Все данные по изучению ферментативного обезволашивания показывают, что длительность процесса определяется скоростью проникания фермента к месту реакции -- волосяной сумке.

Основной фактор ускорения процесса - изменение структуры, дермы, способствующее увеличению ее проницаемости и пористости.

Подготовка сырья к действию ферментных препаратов, включающая удаление консервирующих веществ, механические операции удаления подкожно-жировой клетчатки способствуют наилучшему доступу ферментов к структурным элементам дермы и повышению проницаемости ее для больших молекул ферментов. Рекомендуется также обработка щелочами, кислотами, солями. В связи с этим ферментативному обезволашиванию, как правило, предшествует щелочная или ферментативная отмока [13].

Работа С.П. Кочетовой и других посвящена исследованию протеолитической активности собственных ферментов шкур крупного рогатого скота (КРС).

Активность протеолитических ферментов в процессе автолиза в шкуре КРС исследовали независимыми методами: по воздействию экстрактов из шкуры на гидролиз сывороточного альбумина человека и по увеличению аминного азота при расщеплении белков шкуры в процессе естественного автолиза.

Протеолитические ферменты катализируют расщепление белковых веществ до пептидов и дальнейший гидролиз этих пептидов до аминокислот. В связи с этим определение активности протеолитических ферментов шкуры КРС в процессе автолиза можно учитывать по количеству освобождающихся аминных или карбоксильных групп в пробе материала за определенный отрезок времени. Исходя из этого активность определяется по накоплению аминного азота.

Установлено, что в экстрактах при рН 3,6 и 5,6 содержатся ионы магния и цинка в значительном количестве. Ионы кобальта, марганца и меди присутствуют в виде следов. Полученные данные позволяют предположить, что экстракты шкур КРС содержат протеолитические металло-ферменты.

Полученные результаты позволяют предположить, что экстрагируемые из шкуры КРС ферменты можно отнести к классу металлосодержащих тиоловых и карбоксиамидгидролаз [14,15].

Целью работы Г.В. Плешанова, С.В. Янушевской, В.С. Мальцева и В.С. Духанина являлось изучение влияния ферментативной обработки на свойства связующих и пигментных концентратов в качестве связующего используют казеин низших сортов, который по данным, имеет повышенную кислотность, содержит посторонние примеси белкового происхождения, ухудшающие оптические характеристики казеиновых клеев [ 16].

Фигуриным Ю. В. предложен метод обезжиривания свиных шкур с помощью действия комплекса липолитических и протеолитических ферментных препаратов. Установлено, что при ферментативном воздействии комплекса липолитических и протеолитических ферментных препаратов на шкуру происходит ее обезжиривание, уменьшение содержания в ней углеводных компонентов и как следствие этого - хорошее разделение структуры дермы, удаление значительной части неколлагеновых белков. Все это способствует получению кож высокого качества из свиного сырья.

Высокое содержание природного жира в свиных шкурах затрудняет выработку из них высококачественных кож, поэтому при производстве свиных кож необходимо максимальное удаление природного жира, а также хорошее разделение структуры дермы. Для выполнения данных условий наиболее целесообразным является использование комплекса липолитических и протеолитических ферментных препаратов.

Предварительное исследование, проведенные автором, показали, что при совместном использовании комплекса этих ферментных препаратов в подготовительных процессах производства свиных кож в первую очередь необходимо использование щелочной липазы.

В ходе эксперимента ферментные препараты использовались в процессах отмоки и мягчения. Концентрацию щелочных липаз в рабочих жидкостях при исследовании действия комплекса липолитических и протеолитических ферментных препаратов на природный жир свиных шкур определяли количество жира в сырье, сырье после отмоки, голье, полуфабрикате, отработанных жидкостях и в щетине. Полученные результаты, показывают, что используемые ферментные препараты хорошо обезжиривают свиные шкуры и щетину. Хорошее обезжиривающее действие щелочных липаз подтверждается высоким содержанием липидов в отработанных жидкостях в процессе отмоки и мягчения.

В результате проведенной работы установлено, что при ферментативном воздействии комплекса липолитических и протеолитических ферментых препаратов на шкуру происходит ее обезжиривание, уменьшение содержания в ней углеводных компонентов и, как следствие этого, хорошее разделение структуры дермы, удаление значительной части неколлагеновых белков. Все это способствует получению высокого кож качества из свиного сырья [17].

Применение ферментных препаратов при обработке кожевенного сырья является одним из перспективных методов совершенствования технологических процессов.

Целью работы Е.А. Пуртова, Т.Ф. Миронова и Л.М.Лупова являлось изучение возможности применения нейтральной протеазы протосубтилина Г10Х (штамм Bac. Subtilis) в производстве кожи для верха обуви из шкур крупного рогатого скота.

Оптимум действия нейтральной протеазы протосубтилина Г10Х находится в пределах рН 7-7,5, протеолитическая активность по казеину составляет 40 ед./г.

Исследования проводили на полукожнике средней (12 кг) массы мокросоленого способа консервирования.

Для выяснения характера и степени воздействия нейтральной протеазы на структуру дермы полукожника эксперимент осуществляли не препаратах дермы полукожника, приготовленных из отмоченного сырья и голья щелочно-солевой обработки и подвергнутых спирто-эфирной сушке.

Изменение структуры коллагена дермы, происходящие в процессе ферментативной обработки дермы в зависимости от ее продолжительности, концентрации ферментного препарата, предварительной обработки дермы, изучали путем исследования влияния продуктов распада и продуктов выплавления на содержание оксипролина.

В ходе эксперимента было установлено, что действие фермента на структуру коллагена дермы усиливается в случае предварительной щелочной обработки. Незначительное содержание оксипролина в продуктах распада при действие на препараты дермы (до 2,3% в зависимости от характера предварительной обработки и интенсивности ферментативной обработки) свидетельствует о том, что обработка нейтральной протеазой не приводит к распаду коллагена дермы. В продуктах выплавления препаратов дермы, подвергшихся ферментативному воздействию, наблюдается значительное содержание оксипролина, что указывает на появление в структуре дермы под действием ферментов фрагментов структурных элементов коллагена, которые могут перейти в раствор только при гидротермическом воздействии.

Таким образом исследуемая нейтральная протеаза способствует разделению структурных элементов дермы, не вызывая при этом распада коллагена.

Данные разведывательного эксперимента позволяют сделать вывод о возможности использования нейтральной протеазы протосубтилина Г10Х в процессах кожевенного производства.

Исходя из результатов разведывательного эксперимента, были разработаны варианты обработки полукожника, предусматривающие применение нейтральной протеазы протосубтилина Г10Х в процессе подготовки шкур к обезволашиванию и в процессе мягчения. В качестве контрольного варианта использовали типовую методику производства хромовых кож для верха обуви из опойка, выростка и полукожника, предусматирвающую применение в процессе мягчения панкреатина.

При проведении эксперимента в лабораторных условиях исследовали изменение основных структурных элементов шкуры под действием ферментативных обработок по содержанию в отработанных жидкостях оксипролина и общего азота, которое выражалось в процентах от содержания данных компонентов в абсолютно сухой, обезжиренной и обеззоленной шкуре.

Результаты проведенного эксперимента показали, что применение нейтральной протеазы протосубтилина Г10Х в процессе отмоки и мягчения способствует хорошему разделению структурных элементов дермы. Введение обработок данным ферментным препаратом позволяет сократить продолжительность отмоки, уменьшить загрязненность сточных вод благодаря снижению количества сульфида натрия, применяемого в процессе мягчение ферментного препарата животного происхождения панкреатина [18].

1.2 Применение ферментов в производстве меха

В технологии меха ферменты могут применяться и в других процессах, например, при обезжиривании, крашении, отбеливании.

Процесс обезжиривания необходим при обработке многих видов мехового сырья. Так, при обработке меховых и шубных овчин, шкур морского зверя, ондатры, сурка, обезжиривают как волосяной покров, так и кожевую ткань. Учитывая различие в составе жира, находящегося на волосе или в кожевой ткани, используют различные способы обезжиривания. По существующей технологии волосяной покров обезжиривают в водно-щелочных растворах поверхностно-активных веществ, кожевую ткань - в жирорастворителях. Оба эти способа довольно продолжительны и трудоемки, требуют большого расхода воды (первый способ) или специального оборудования (второй способ). Применение липолитических ферментов будет способствовать рационализации процесса, снижению трудоемкости, уменьшению производственного цикла и может быть экономически выгодно, особенно при повторном использовании растворов [19].

Ферменты могут быть также использованы при оксидационном крашении и отбеливании. В обоих случаях необходимо применение окислителей. Известно, что пергидроль - наиболее употребляемый окислитель - резко снижает прочность волоса и кожевой ткани шкур. При использовании оксидаз, которые могут направленно действовать на требуемый агент, прочность волоса не должна снижаться.

Использовать ферменты можно также и для предотвращения пожелтения волоса шкур морских животных. Шкуры морских животных быстро желтеют, что является следствием окисления кислородом воздуха непредельных жиров морских животных. Для защиты шкур от пожелтения их либо упаковывают в герметичные мешки, либо покрывают смазкой, в которую добавлены антиокислители [ 20].

При выделке меховых шкур нельзя применять сильные щелочные воздействия, так как это резко снижает качество волоса. Использование же протеолитических ферментов без предварительной щелоченной обработки малоэффективно, хотя и несколько улучшает качество кожевой ткани. Основным препятствием для использования протеолитических ферментов является их обезволашивающее действие [21].

Наиболее распространен технический панкреатин из поджелудочной железы. В состав этой вытяжки входят следующие ферменты: протеиназа (трипсин), протаминаза (карбоксилпептидаза В), пролиназа, аминопептидаза, карбоксилпептидаза А и дипептидаза, также липаза и амилаза. При обезволашивании и мягчении применяют препараты, получаемые путем выращивания микроорганизмов на питательной среде, например протосубтилин Г3х, липогаетрин Г3х и др., а так же их смеси. Для мягчения в меховом производстве используют препараты микробного происхождения - мальтававморин Г10х, оболадающий гликозидазной активностью. Квашение - сложный процесс, где основную роль играют ферменты, как амилаза, расщепляющая крахмал мальтаза и протеолитические. Таким образом, в кожевенном и меховом производстве важной значение имеют гидролазы: протеазы, эстеразы и эфиразы [2].

Ферментативная обработка меховых шкур является более рациональным способом по сравнению с квашением, обеспечивает высокое качество кожевой ткани - мягкость, легкость, пластичность и, кроме того, способствует повышению производительности труда и увеличению выхода площади мехового полуфабриката. [22].

Казалось бы, не может быть и речи об использовании протеолитических ферментов для обработки меховых шкур вследствие их обезволашивающего действия. Несмотря на это, во многих исследованиях по технологии меха испытывали протеолитические препараты. Так, А. В. Раевский, Н. В. Сергеев, И. П. Стефанович показали, что мягчение меховых и шубных овчин трипсином при предварительной известковой обработке дает весьма высокий технологический эффект: происходит разрыхление кожевой ткани, что придает ей мягкость и пластичность. Но при такой обработке уменьшается прочность волоса, нарушается фиксация его в кожевой ткани. Поэтому данный метод не нашел практического применения.

При обработке меховых шкурок пепсином -- ферментом, способным воздействовать на белки кожевой ткани в кислой среде, происходит резкая потеря кожевого вещества в результате перехода его в растворимое состояние и снижается прочность шкуры. Пластические свойства кожевой ткани при этом существенно не изменяются [23].

Постоянно растущий спрос на высококачественную шерсть, а также санитарные требования к сточным водам было стимулом того, что в последние годы многие кожевенные заводы Франции, а также предприятия, занимающееся съемкой шерсти с овчин не пригодных для кожевенного и мехового производства, стали применять ферментные препараты, изготовленные фирмой Рапидаз.

На фирме Рапидаз, находящейся в г. Секлен (Societe Rapidase, Seklin Nord France) ферментные препараты для кожевенного производства изготавливают на базе бактериальной протезы, получаемой путем глубинного выращивания бактериальной культуры на жидкой питательной среде, в состав которой входит картофельный крахмал.

Препараты, изготовленные из бактериальной протезы, довольно стойки при хранении, только после 10-12 месячного хранения заметно незначительное уменьшение активности [24].

Способы выполнения ферментной обработки зависит от имеющегося оборудования, производственных площадей и перерабатываемого сырья. Возможно как приспособление используемого оборудования, так и создание высокомеханизированных проходных линий ферментной обработки, особенно сырья овчины [25].

Сынкова А.В., Миронова Т.Ф., Талянского О.В. исследовали влияние температуры и рН обрабатывающей жидкости, а так же механических воздействий на каталитическую способность нейтральной протеазы в процессе обезволашивания овчины.

Отмоку овчины пресно-сухого консервирования осуществляли по известной технологии в течение 24 часов при температуре 18-20⁰С в присутствие сульфита натрия (5 г/л), гексафторсиликата натрия (3 г/л) и ПАВ (1 г/л).

Последующее обезволашивание проводили при различных значениях температуры (18-20 ⁰С; 30-32 ⁰С; 38-40 ⁰С) и рН обрабатывающей жидкости (6; 7; 8; 9) с использованием механических воздействий и в состоянии покоя.

Анализ полученных результатов позволил сделать выводы: при всех вариантах температурного режима и режима механического воздействия эффект полного обезволашивания наиболее быстро достигается при рН 7, таким образом зависимость от рН обезволашивающей способности ферментного препарата коррелирует с данными зависимостями протеолитической активности протеазы Прок.

Наибольшее количество ионогенных групп в дерме наблюдается в случае обезволашивания при рН 7, при данном рН среды протеаза Прок обеспечивает состояние дермы, близкое к изоэлектрическому, в котором набухание коллагена минимально, что облегчает удаление волоса с волосяной сумки.

При температуре обезволашивающей жидкости 30-32⁰С обезволашивание различных топографических участков протекает более равномерно, в течение более длительного периода времени, чем мездреной, что указывает на диффузию протеазы прок в дерму с бахтармяной стороны, наличие мездры на которой препятствует протеканию этого процесса и замедляет достижение обезволашивающего эффекта.

Увеличение температуры обрабатывающей жидкости от 30-32⁰С до 38-40⁰С приводит лишь к незначительному сокращению продолжительности обезволашивания.

Процесс ферментативного обезволашивания протекает медленнее в случае отсутствия механических воздействий [26].

При выполнении ферментативного обезволашивания необходимо строго соблюдать температурный режим обработки не допуская снижения температуры, поскольку резкое изменение температуры обрабатывающей жидкости в сторону уменьшения может привести к инактивации ферментного препарата, в результате требуемый эффект обезволашивания может быть так и недостигнут.

Таким образом, полученные результаты будут способствовать разработке оптимальных параметров процесса ферментативного обезволашивания кожевенного сырья [27].

Целью исследования Г.И Ярецкас, Н.М. Шибаковской, О.Н. Мацевичене, А.К. Струмскене явились разработки технологии применения нового ферментного препарата мальтавоморина Г10Х для обработки шкурок кролика, определение изменений основных структурных элементов кожевой ткани шкурок после обработки ферментом и определение качественных, физико-механических и химических свойств готовых шкурок.

Исследование проводили на шкурках кролика пресно-сухого способа консервирования с толщиной кожевой ткани более 0,7 мм, одинаковых по площади, сортности (2), однородных по плотности. Ферментный препарат мальтавоморин Г10Х использовался для отмоки.

Результаты производственных опытов показали, что применение данного ферментного препарата для отмоки шкурок кролика сокращает процесс на 16-20., улучшает качество готовых шкурок за счет их мягкости и пластичности, почти полностью исключает получение грубых шкурок, снижает количество порванных шкурок и увеличивает выход готовой продукции в среднем на 3,3% по сравнению с типовой методикой выделки [28].

Таким образом, на основании литературного обзора можно сделать вывод, что ферменты для кожевенного и мехового производства имеют огромное значение, так как их применение сокращает длительность процессов, способствует меньшему загрязнению сточных вод, то есть вносит вклад в решение экологических проблем, также обеспечивает увеличение выхода площади готового полуфабриката, позволяет повысить качество готовой продукции, а значит, дает значительный экономический эффект.

2. Объекты и методы исследования

Целью дипломной работы являлось изучение свойств бактериальной суспензии, с последующим применением в подготовительных процессах переработки мехового сырья.

Для выполнения эксперимента был составлен сетевой график, представленный на рисунке 1.

Рисунок 1 - Сетевой график дипломной работы

2.1 Объекты исследования

Объектом исследования в дипломной работе являлись жировые вещества различной химической природы: синтетический - Tanning Oil G; модифицированный - сульфатированный рыбий жир; природные - нерпичий, свиной и шерстный, а также микроорганизмы, выделенные из жира нерпы и шерстного жира (H, Нв, В) и из сточных вод после проведения процесса обезжиривания меховой овчины (3, 7).

TANNING OIL G - эмульгатор модифицированный, непротравляющий неокисляющий жир. Применение в процессе жирования овчин после крашения, рекомендуемая концентрация - 2 г/дм³. Преимущество - очень богат питательными жирами.

СУЛЬФАТИРОВАННЫЙ РЫБИЙ ЖИР - продукт сульфатирования жидкой фракции рыбьего жира, густая жидкость от коричневого до темно- коричневого цвета. Получают обработкой ворвани серной кислотой с последующей промывкой и нейтрализацией. Применяется в качестве основных эмульгирующих жиров при составлении смесей для жирования кож всех видов.

СВИНОЙ ЖИР - мазеобразная масса от белого до темно- коричневого цвета. Получают вытапливанием, центрифугированием или прессованием. Применяют для производства мыла.

НЕРПИЧИЙ ЖИР - жидкость от светло- желтого до темно- коричневого цвета. Получают вытапливанием, экстрагированием, прессованием и сепарированием.

ШЕРСТНЫЙ ЖИР - густая пастообразная масса бурого цвета. Внем содержатся кроме воска свободные жирные кислоты, глицериды, белки, слизи, красящие вещества, минеральные примеси.

2.2 Методы исследования

2.2.1 Методика приготовления питательных сред для культивирования микроорганизмов

Мясопептонный агар (МПА)

При культивировании микроорганизмов большое значение имеет обеспечение их соответствующим питанием. Белковой основой для всех сред является питательный бульон. Основой для приготовления мясопептонного бульона (МПБ) является мясная вода. Ее готовят следующим образом: 15 г сухого бульона растворяют в 1 дм³ дистиллированной воды и кипятят 1-3 мин. Для приготовления плотной питательной среды МПА к 1 дм³ МПБ добавляют 2-2,5% агар-агара от объема среды и расплавляют в автоклаве.

Синтетическая среда Рана

В 1 дм³ дистиллированной воды растворяют соли следующего состава (г/дм³): K₂НPO₄-5,0; CaCl₂-1,0; (NH₄)₃PO₄-5,0; NaCl-следы; FeCl₃*7H₂O-следы; MgSO₄ *7H₂O-1,0. В качестве источника углерода используют жир в количестве 1 г/дм³. Для приготовления плотной синтетической среды добавляют агар-агар в количестве 2-2,5% от объема жидкой среды и расплавляют в автоклаве при давлении 1атм.

2.2.2 Выделение чистой культуры методом разведений

Разведения делают в стерильной водопроводной воде. Готовят определенный объем этого раствора и стерилизуют при 1 атм. В ходе одного опыта пользуются постоянным коэффициентом разведения, т.к. в этом случае уменьшается вероятность ошибки. Чаще всего делают десятичные разведения. Для этого берут пробирку с 10 см³ стерильного раствора и переносят стерильной пипеткой 1 см³ исследуемого материала в данную пробирку. Суспензию этого разведения тщательно перемешивают с помощью новой стерильной пипетки, вбирая в пипетку и выпуская из нее полученную смесь несколько раз. Это обеспечивает перемешивание суспензии и уменьшает адсорбцию клеток на стенках пипетки. Затем этой же пипеткой берут 1 см³ полученного разведения и переносят его во вторую пробирку. Таким образом, готовят и последующие разведения. Степень разведения определяется предполагаемым количеством микроорганизмов в образце и соответственно число разведений тем больше, чем больше микроорганизмов в исходном субстрате.

Для приготовления каждого разведения обязательно используют отдельную пипетку. Пренебрежение этим правилом может привести к получению ошибочного результата. Ошибка связана с адсорбцией микроорганизмов на стенках пипетки, в результате чего не все клетки удаляются из пипетки при приготовлении соответствующего разведения. Часть клеток, оставшаяся на стенках пипетки, может затем попасть в одно из последующих разведений, что и явится причиной получения завышенного результата.

2.2.3 Посев на агаризованные среды в чашки Петри

В стерильные чашки Петри наливают расплавленную на кипящей водяной бане агаризованную среду, по 20-30 см³ в каждую. Чашки оставляют на горизонтальной поверхности, пока не остынет агар. Для посева отбирают чашки, среда в которых осталась стерильной. Когда используют элективные среды или выделяют и учитывают микроорганизмы, требующие повышенной влажности, посев проводят сразу же или вскоре после застывания агара.

Посев делают из определенных разведений в зависимости от предполагаемого количества микроорганизмов в исследуемом субстрате. Стерильной пипеткой наносят определенный объем (обычно 0,05; 0,1 или 0,2 см³) соответствующего разведения, предварительно тщательно перемешанного, на поверхность агаровой пластинки в чашки Петри. Этот объем распределяют по поверхности среды стерильным шпателем. Затем этим же шпателем проводят по всей поверхности во второй чашке, куда посевной материале вносили. При выявлении микроорганизмов, количество которых в субстрате относительно не велико, посевной материал распределяют по поверхности среды только в одной чашке.

Из каждого исследуемого разведения делают таким образом 2 - 3 параллельных высева. Для параллельных высевов из одного разведения можно пользоваться одной пипеткой и одним шпателем. Для посевов из разных разведений используют другую стерильную пипетку и другой шпатель. Чашки с засеянными средами помещают в термостат, отрегулированный на определенную температуру, благоприятную для развития выявляемых микроорганизмов.

Подсчет выросших колоний проводят через определенное время после посева, которое зависит от скорости роста выявляемых микроорганизмов на используемой в опыте среде и данной температуре.

Подсчитывают количество колоний, выросших при высеве из определенного разведения на двух (одной) чашки Петри. Результаты параллельных высевов суммируют и определяют среднее число колоний, выросших при высеве из этого разведения. Колонии считают, как правило, не открывая чашки. Для удобства отмечают просчитанную колонию точкой на наружной стороне дна чашки, пользуясь стеклографом или чернилами по стеклу. При большом количестве колоний дно чашки делят на секторы, подсчитывают количество колоний в каждом секторе и результаты суммируют или используют полуавтоматические счетчики.

2.2.4 Изучение морфологии бактерий

Морфологические свойства изучают путем микроскопирования окрашенных мазков, приготовленных из исследуемой колонии. При этом отмечаются формы микробных клеток, характер их расположения, наличие спор, капсул, жгутиков тинкториальная способность (окрашивание по методу Грама), определяют чистоту культуры. Кроме просмотра окрашенных мазков, устанавливают наличие жгутиков путем исследования культур на подвижность в препаратах «висячая» или «раздавленная» капля, а также путем посева культуры на полужидкий мясопептонный агар (подвижные бактерии вызывают помутнение агара, а неподвижные растут по уколу).

Из колоний готовят мазки, затем окрашивают по Граму, Трухильо, проводят окраску жгутиков по Леффлеру.

Техника окраски по Граму заключается в следующем:

- На обезжиренном стекле делают мазки микроорганизмов. Мазки высушивают на воздухе и фиксируют под пламенем горелки;

- Мазки окрашивают в течение 1 мин генцианвиолетом;

- Препарат промывают в слабой струе водопроводной воды в течение 2 с.;

- Окрашивают препарат раствором Люголя в течение 1 мин.;

- Промывают препарат слабой струей водопроводной воды;

- Погружают препарат на 30 секунд в 96 %-ный спирт, взбалтывая последний, после чего препарат подсушивают промокательной бумагой;

- Окрашивают мазки раствором фуксина Пфейффера в течение 30 с.;

- Промывают препарат в слабой струе водопроводной воды до исчезновения окраски в стоке, подсушивают промокательной бумагой и микроскопируют.

Грамположительные бактерии окрашиваются в синий или фиолетовый цвет, а грамотрицательные - в красный.

Окраска по Трухильо заключается в следующем:

- Мазок фиксируют жаром;

- Наносят водный раствор малахитовой зелени (2 %) и в течение 3 мин подогревают на спиртовке до отхождения влаги;

- Промывают водой;

- Опускают на 1 мин в 0,25 % - ный водный раствор основного фуксина;

- Промывают водой;

- Высушивают фильтровальной бумагой и микроскопируют.

При таком методе окраски споры окрашиваются в зеленый цвет.

Окраска жгутиков по Леффлеру:

- Мазок заливают на 15-20 минут протравой Леффлера, необходимо следить, чтобы протрава не подсыхала;

- Препарат промывают дистиллированной водой;

- Окрашивают карболовым фуксином Циля в течении 3 минут;

- Высушивают фильтровальной бумагой и микроскопируют.

Клетки и жгутики окрашиваются в красный цвет.

2.2.5 Методика изучения культуральных свойств

Культуральные свойства определяют по характеру роста микробной культуры на плотной и жидкой питательных средах. Характер роста на плотной питательной среде изучают с подробным описанием формы, величины, цвета, поверхности, консистенции, краев и структуры колоний, образованных на синтетической питательной среде.

Микроскопическое изучение колоний проводят под микроскопом. Рассматривая колонии в проходящем свете невооруженным взглядом, описывают следующее: форму колоний; диаметр колоний; цвет, который обуславливается пигментом; рельеф колоний; поверхность; ее блеск, прозрачность; характер краев колоний; структуру колоний, ее консистенцию.

Для определения отношения микроорганизмов к кислороду делают посев уколом на мясопептонный агар (МПА). Посев уколом проводят бактериологической иглой путем прокалывания столбика агара в средней части, следя за тем, чтобы игла нигде не подходила к стенкам пробирки. Не доводя на сантиметр до дна пробирки иглу извлекают и обжигают над пламенем спиртовки.