Лекарственные вещества, поступающие в системный кровоток, подвергаются метаболизму (биотрансформации), или же изменению химических свойств действующих веществ под влиянием ферментов организма [15].

Обычно в результате биотрансформации ЛС снижается его растворимость в жирах (липофильность) и повышается растворимость в воде (гидрофильность), а также изменяется его фармакологическая активность [4]. Соответственно, эффективность и безопасность терапии во многих случаях определяется процессами биотрансформации. Метаболические процессы с участием ферментов обычно классифицируются как реакции Фазы I или Фазы II [15]. В 1-й фазе - преимущественно семействами цитохромов CYP450, во 2-й фазе - ферментами конъюгации, такими как изоформы глутатион-S-трансфераз, глюкуронилтрансфераз, N-ацетилтрансфераз, метилтрансфераз и сульфотрансфераз [1].

Фармакокинетический путь при участии определенных ферментов, находящихся под генетическим контролем, проходят в организме человека и все лекарственные препараты. Учитывая разнородность человеческой популяции, можно предположить, что судьба каждого лекарственного средства на каком-то фармакокинетическом этапе связана с полиморфной системой того или иного фермента или белка. По этой причине различные индивиды неодинаково реагируют на одно и то же лекарственное вещество [16].

Известно, что одной из наиболее важной системой биотрансформации ксенобиотиков является реакция N-ацетилирования. Ацетилирование эволюционно является одним из ранних механизмов адаптации, так как эта реакция необходима для синтеза жирных кислот, стероидов, функционирования цикла Кребса. Система ацетилирования находится под контролем фермента N-ацетилтрансферазы (NAT), требует присутствия в качестве кофактора ацетил-кофермента А (Ац-КоА) и протекает в два последовательных этапа. Сначала ацетильная группа Ац-КоА переносится к цистеиновому остатку внутри активного центра фермента с высвобождением кофермента А (E-SH + КoA-COCH3 > E-S-COCH3 + КoA-SH), а затем перемещается с ацетилированного фермента на аминогруппу субстрата. Данный процесс относится ко II фазе биотрансформации ксенобиотиков. Для сильноосновных аминов скорость N-ацетилирования определяется первым шагом, для слабоосновных - вторым. В определенных случаях N-ацетилтрансферазы могут катализировать и реакцию О-ацетилирования [17, 18].

Сама история изучения ариламин-N-ацетилтрансферазы началась практически сразу после введения в медицинскую практику изониазида в 1952 году для лечения туберкулёза. Было обнаружено, что у 40% лиц, принимавших изониазид в дозе 20 мг/кг в сутки, в течение 3 - 8 недель развивался периферический неврит. Выяснилось, что это осложнение тесно связано с метаболизмом препарата и зависит от степени его ацетилирования. Высокая стабильность типа элиминации свободного изониазида, независимого от характера питания и состояния здоровья, и большой размах межиндивидуальной изменчивости по этому признаку дали основание для предположения, что обмен изониазида в сильной степени определяется наследственными задатками [19]. Авторы номенклатуры предложили корневой символ для генов ариламин N-ацетилтрансфераз писать тремя латинскими заглавными буквами (NAT) [7].

К препаратам, ацетилирование которых генетически детерминировано относятся лекарства, содержащие ароматические аминные или гидразиновые группы (сульфаниламиды (сульфасалазин, сульфаметоксозол, сульфадиазин, сульфацетамид), изониазид, прокаинамид, гидралазин (апрессин), нитразепам, призидилол (прекапиллярный вазодилататор, адреноблокатор), амринон (инотроп), эндралазин, аминоглутетимид (ингибитор синтеза стероидов в надпочечниках и периферической ароматизации надпочечниковых андрогенов), клоназепам и кофеин, широко распространенные загрязнители окружающей среды (бензидин, аминофлюорен, 4-аминобифенил, в-нафтиламин, ароматические амины и др.), канцерогенные вещества, содержащиеся в пище и табачном дыме, а также некоторые эндогенные соединения (серотонин, гистамин, дофамин) метаболизируются в печени с участием изоферментов ариламин-N-ацетилтрансфераз: NAT1 и NAT2 [20, 31].

Однако подвержены этому влиянию не все препараты, которые ацетилируются, поскольку некоторые из них ацетилируются с участием различных ферментов в других органах. Исключениями являются сульфаниламиды, Р-аминобензойная и Р-аминосалициловая кислоты [20].

К настоящему времени известно существование одного гена NAT у прокариот (доядерные - бактерии), у эукариот (формы, имеющие ядро) определено три локуса NAT (NAT1, NAT2, NAT3), нумерация их зависит от исторической последовательности изучения. N-ацетилтрансферазы являются цитозольными ферментами, которые были найдены в печени и во многих других тканях у большинства видов млекопитающих, за исключением лис и собак, которые неспособны к N-ацетилированию ксенобиотиков. У кроликов и мышей экспрессируется две формы N-ацетилтрансферазы, обозначаемых NAT1 и NAT2. У человека две формы фермента NAT1 и NAT2. По последним данным, у человека идентифицировано, кроме этих 2 классов, еще 3 класса ферментов: арилалкин-N-ацетилтрансфераза (AANAT), L1-протеин-регулятор адгезии клеток (L1 CAM) и гомолог Saccharomyces cerevisiae N-ацетилтрансферазы (ARD1) [16, 21].

У человека имеется два функциональных локуса, кодирующих N-ацетилтрансферазы NAT1 и NAT2. Гены, кодирующие N-ацетилирование, локализованы в хромосоме 8p21.3-23.1 [21]. N-ацетилтрансферазы для про - и эукариотов классифицируются в соответствии с международными правилами генетической номенклатуры, где локус обозначается арабскими цифрами, аллели - латинскими буквами, отделенными от локуса гена звездочкой [26]. На сегодняшний день известно 36 аллелей, кодирующих белки с разной степенью ацетилирующей способности [27]. Все исследованные гены NAT состоят из открытых для считывания 870 пар оснований, кодирующих каталитически активные белки со средней молекулярной массой 33,5 кДа [16, 28]. Гены NAT хотя и расположены на одной хромосоме, но регулируются независимо друг от друга. NAT1 экспрессируется в большинстве тканей организма, NAT2 - только в печени и кишечнике. Эти ферменты отличаются по субстратной специфичности. Субстратами, преимущественно метаболизируемыми NAT1, являются парааминосалициловая кислота, парааминобензойная кислота и сульфаметоксазол. К веществам, преимущественно N-ацетилируемым при участии NAT2, относят изониазид, гидралазин, сульфаметазин и дапсон. Некоторые ксенобиотики, например, 2-аминофлуорен одинаково хорошо метаболизируются обоими ферментами [22-24].

Считается, что NAT2 обладает меньшей специфичностью и метаболизирует более широкий круг веществ, поэтому именно NAT2 привлекает большее внимание исследователей. Blum М. с соавт. (1990) доказали, что ген NAT2 полиморфен, его продукты по - разному инактивируют изониазид, а также данный ген отвечает за фенотип ацетилирования [28]. Генетический полиморфизм NAT2 был открыт Vatsis К.Р. с соавт. (1995) [25].

Активность NAT2 в силу своего генетического полиморфизма значительно варьирует у различных индивидов. Были установлены несколько диких и мутантных генотипов фермента NAT2 [29, 30]. Распределение генотипов и фенотипов N-ацетилтрансфераз в различных популяциях на сегодняшний день подвергается активному изучению. Результаты этих исследований позволяют определить не только предрасположенность каждого человека к тому или другому заболеванию, но и его индивидуальную реакцию на то или иное лекарственное средство [28, 31].

Установлено, что по активности N-ацетилтрансферазы 2 (NAT2) человечество делится на группы - "быстрые", "промежуточные" и "медленные" ацетиляторы. Распределение скоростей ацетилирования в популяции бимодальное [20]. Разница между быстрым и медленным N-ацетилированием зависит от количества печеночной NAT2 в большей степени, чем от изменений ее свойств [20]. Известно, что быстрое ацетилирование наследуется по аутосомно-доминантному типу, в то время как медленной ацетилирование - по рецессивному. Интенсивность ацетилирования в организме человека контролируется в2-адренорецепторами, метаболическими резервами (пантотеновая кислота, пиридоксин, тиамин, липоевая кислота), генотипом.

Соотношение между лицами со способностью к быстрому ацетилированию ("быстрые" ацетиляторы) и лицами со способностью к медленному ацетилированию ("медленные" ацетиляторы) у представителей разных рас различное [7]. "Быстрый" аллель является исходной формой и одинаков у всех рас, тогда как "медленные" аллели европеоидов и монголоидов различны. У "медленных" ацетиляторов - гомозигот по "медленным" аллелям - скорость работы ферментов снижена на 20%. Например, у эскимосов и японцев отмечен самый низкий процент медленных ацетиляторов (около 10%) [32, 33]. У китайцев он несколько выше и составляет около 20% [34]. Медленные ацетиляторы меньше распространены среди коренного населения Гонконга, Малайзии и Сингапура. В популяциях европеоидов типично приблизительно равное распределение быстрых и медленных ацетиляторов. Например, одно из исследований среди европеоидов Берлина выявило 62% медленных ацетиляторов [35]. Фенотипирование европеоидов в одном из северных регионов Германии (Гросхансдорф) определило 71% медленных метаболизаторов [36]. В то же время у европеоидов Франции данный показатель колеблется от 53% до 61,3% [37, 38]. По данным D. A. P. Evans, удельный вес медленных ацетиляторов в Великобритании составляет около 62% [39]. В Швеции этот показатель приближается к 68% [40, 41], а в Дании - к 58% [41]. В Испании частота медленных ацетиляторов среди здорового населения колеблется от 53-55% до 65,4% [42, 43]. Среди негроидных популяций частота медленных ацетилятров варьирует от 18 до 80%. Белое население США - 60%, коренное население Северной Америки - 20% медленные ацетиляторы [44]. Частота медленных ацетилятров у индусов - 59% [45, 46]. В Кении выявлено 69,9% медленных ацетиляторов [47]. Фенотип медленного ацетилирования преобладает на Ближнем Востоке (Египет, Марокко) и составляет 70%. Например, в иранской популяции их уровень находится в пределах 78,4%, что соответствует вариациям в арабских странах и превышает таковые у европейцев [48]. В России подобные исследования единичны. По их результатам в среднем соотношение медленных и быстрых ацетиляторов составляет 60% и 40% соответственно [49, 50]. Подобные данные полученные Сатыровой Т.В. с соавторами, в популяции европеоидов Юго-Восточного региона Республики Беларусь составляли медленный тип ацетилирования имел место у 66% населения, а быстрый - у 34% [51].

Индивидуальная активность метаболических процессов имеет важное биологическое (патогенетическое) значение. Установлено, что некоторые заболевания связаны с типом ацетилирования. Показано, что медленный тип N-ацетилирования предрасположен к раку мочевого пузыря (частота рака мочевого пузыря у "медленных" ацетиляторов в 2-3 раза больше, чем у "быстрых" ацетиляторов), особенно если носители к тому же являются курильщиками или подвергаются профессиональному воздействию бициклическими ароматическими аминами (Indulsky, 2000) [93, 94]. Считается, что фенотип медленного ацетилирования предрасполагает к повышению уровня метаболитов токсичных веществ в моче. Взаимодействие между полиморфизмом NAT2, курением табака (активным или пассивным) является важным фактором риска возникновения рака легкого и рака молочной железы [92]. При изучении рабочих асбестового производства было выявлено повышение риска развития рака легкого у индивидуумов, имеющих фенотип медленного ацетилирования в сочетании с нулевым генотипом гена GSTM1 (Hirvoven et al., 1995). Курящие женщины в постменопаузе имеют выраженную предрасположенность к раку молочной железы, если они "медленные" ацетиляторы, тогда как "быстрые" ацетиляторы такой ассоциации не имеют [39]. Медленный тип N-ацетилирования характерен также для ревматоидного артрита (Pawlik A. и др., 2002) [52], вирусного гепатита (Тихонова Н.Н., 1991), системной красной волчанки (Gunnarsson et al., 1997; Kato, Yamazoe, 2000) [53], бронхиальной астмы (Вавилин В.А. и др., 2003), обструктивного бронхита [54, 55], экземы (Аковбян В.А., 1991) [56]. Тогда как, у "быстрых" ацетиляторов повышен риск рака толстой кишки, который снижен у "медленных" ацетиляторов (среди "быстрых" ацетиляторов в 1,8 раз чаще встречается колоноректальный рак). Быстрый тип ацетилирования характерен также для больных сахарным диабетом (Mrozikiewicz P. И др., 1994) [57, 59], витилиго (Дворянкова Е.В., 2006) [62], для пациентов со спаечной болезнью (Чекмазов И.А., 2002) [58], ангиной [60], аллергическим дерматитом (Nacak M., 2006) [61].

Определение типа ацетилирования важно для оптимизации терапии, так как у медленных ацетиляторов могут развиваться осложнения, а у быстрых ацетиляторов фармакотерапия может оказаться неэффективной.

Литературные данные показывают, что процессы метаболизма ксенобиотиков включают огромное число ферментов и химических реакций, контролирующих как детоксикацию, так и активацию ксенобитиков [15]. Изучение гена или фермента в отдельности не является достаточным условием для решения проблемы индивидуальной чувствительности человека (предрасположенности или устойчивости) к воздействию ЛС. Наиболее перспективным для разработки методического подхода к изучению влияния ксенобиотиков на организм человека и формирования как побочных эффектов, так и заболеваний у человека представляется, изучение сочетанного эффекта различных генов биотрансформации, задействованных в процессах детоксикации и активации ксенобиотиков.

Определение ацетиляторного фенотипа основано на изучении метаболизма некоторых лекарственных средств, например, сульфадимидина, изониазида, дапсона или кофеина. Большинство эпидемиологических исследований по выявлению зависимости действия различных лекарственных веществ, биотрансформация которых протекает с участием N-ацетилтрансферазы или опосредованно зависит от этих реакций, было проведено до открытия 2 независимых локусов NAT. Поскольку типирование выполнялось по скорости метаболизма изониазида или сульфаметазина - типичных субстратов NAT2, выявленные различия относят к полиморфизму NAT2 [35, 63, 64].

Как правило, отношение концентрации метаболита к концентрации исходного препарата измеряют в сыворотке, моче или слюне спустя определенное время после его перорального приема. Распределение частоты отношения в группе здоровых людей является, в большинстве случаев, бимодальным. В то же время некоторые исследователи представляют свои данные в виде тримодального распределения [35, 64].

На генетически предопределенную степень активности фермента может влиять ряд физиологических параметров: раса, пол (например, зависимая от пола секреция гормона роста, модифицирующая активность ферментов), возраст, патологические состояния (например, болезни печени, почек, кишечника, нарушения печеночного и почечного кровотока), средовые влияния (например, состояние окружающей среды), профессия; поведенческие особенности (например, характер пищи, пристрастие к табакокурению и алкоголю). По этой причине ацетиляторный фенотип не всегда согласуется с соответствующим генотипом [65, 66]. Однако четкую зависимость активности NAT2 от пола, возраста, массы тела, роста, курения, употребления кофе, алкоголя, способа кулинарной обработки мяса по результатам пока еще не многочисленных исследований установить до сих пор не удалось [35, 40, 67-69].

У здоровых людей достаточно часто отмечается высокое соответствие между ацетиляторным генотипом и фенотипом. Например, при исследовании ацетиляторного статуса среди китайских женщин установлено почти полное совпадение частоты встречаемости фенотипа и генотипа быстрых ацетиляторов (78% и 76% соответственно) [34]. Среди 222 белых американцев распределение медленных ацетиляторов составило 58,1% и 59,5% по фенотипу и генотипу соответственно. Конкордантность генотипа и фенотипа NAT2 составила 97,8% в бимодальной модели [44]. Среди 38 европеоидов Германии изучение фенотипа и генотипа ацетилирования показало их 100% -е соответствие. Распределение медленных и быстрых ацетиляторов составило 27: 11. Генотипирование показало 11 различных комбинаций NAT2, среди которых самыми частыми оказались *5B/*5B, *5B/*6А, *5А/*6С [36]. В России подобные исследования единичны. Например, исследование московской популяционной выборки волонтеров показало, что соотношение быстрых и медленных ацетиляторов, определяемое с использованием 2 подходов, не имело достоверных различий и составляло 47% при фенотипировании и 44% при генотипировании. Абсолютные значения скорости ацетилирования в этом исследовании варьировали в широких пределах, как для "быстрых", так и для "медленных" ацетиляторов. Наиболее распространенными аллелями оказались NAT2*4, NAT2*5 и NAT2*6, генотипами - NAT2*5/*5, NAT2*4/*6 и NAT2*4/*5. Полная конкордантность между фенотипом и генотипом обнаружена только у 62 из 75 индивидуумов (87%) [92].

На результаты исследований по изучению полиморфизма N-ацетилрования могут в ряде случаев влиять методологические особенности фенотипирования. Так, O'Neil с соавторами доказали, что распределение медленных и быстрых ацетиляторов по фенотипу различалось в зависимости от тестового препарата и составляло 70: 30 при использовании кофеина и 53: 47 при применении дапсона. Генотип NAT2 показал соотношение медленных и быстрых ацетиляторов как 45: 55. В группе контроля фенотипирование по кофеину выявило распределение медленных и быстрых ацетиляторов как 67: 33 против 60: 40 при генотипировании [89]. У здоровых добровольцев в Индии исследование фенотипа в зависимости от измерений сульфадимидина в моче и сыворотке показало 58% и 66% медленных ацетиляторов соответственно [45]. Следовательно, генотип фермента NAT2 является более существенной и стационарной характеристикой популяции по изучаемому признаку и имеет большое значение для метаболизма и детоксикации лекарственных средств или иных ксенобиотиков.

Таким образом, изучение частоты встречаемости фенотипа и генотипа N-ацетилирования, а также их соотношения среди здоровых лиц и больных с различной патологией сохраняют свою актуальность, так как многие аспекты этой проблемы еще не до конца изучены, а большинство полученных результатов противоречивы. Решение этой задачи поможет раскрытию механизмов развития и факторов предрасположенности ко многим мультифакторным заболеваниям. Фенотип ацетилятора способствует подбору оптимальной дозы лекарственного препарата пациентам с быстрым типом ацетилирования и выявлению безопасной дозы лекарственного препарата больным с медленным типом ацетилирования.

1.3 Методы определения фенотипа N-ацетилятора