Морфофункціональні та біохімічні особливості системи еритрону за умов цукрового діабету 1-го типу

31

Національна академія наук України

Інститут біології клітини

Люта Мар'яна Ярославівна

УДК 616.379-008.64:612.111:[577.152.1.+577.112.4+547.477]

Морфофункціональні та біохімічні особливості системи еритрону за умов цукрового діабету 1-го типу

03.00.11 - цитологія, клітинна біологія, гістологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Львів - 2008

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана на кафедрі біохімії біологічного факультету

Львівського національного університету імені Івана Франка

Міністерство освіти і науки України

Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор

Сибірна Наталія Олександрівна,

Львівський національний університет

імені Івана Франка,

завідувач кафедри біохімії

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор

Великий Микола Миколайович,

Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України

пров. наук. співр. відділу біохімії коферментів

- доктор біологічних наук, професор

Янович Вадим Георгійович,

Інститут біології тварин УААН,

гол. наук. співр.

Захист відбудеться “ 20 ”лютого 2008 р. о 14 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 35.246.01 в Інституті біології клітини НАН України за адресою: 79005, м. Львів, вул. Драгоманова, 14/16.

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Інституту біології клітини НАН України за адресою: 79005, м. Львів, вул. Драгоманова, 14/16.

Автореферат розісланий “18” січня 2008 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

кандидат біологічних наук В.М. Убийвовк

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Цукровий діабет є однією з найголовніших медико-соціальних проблем і займає третє місце серед захворювань, які найчастіше є причиною ранньої інвалідності і летальності серед населення практично у всіх країнах світу [Gale, 2002]. Кількість хворих на ЦД у світі перевищила100 млн. осіб. У медичних закладах України на обліку їх біля 1 млн. Щорічно число хворих збільшується на 5-7%, а кожні 15 років - подвоюється [Томашевський, 1996].

ЦД 1-го типу є автоімунним захворюванням з деструкцією в-клітин острівців підшлункової залози, що розвивається під дією факторів зовнішнього середовища та при наявності генетичних передумов. Дана патологія супроводжується порушеннями вуглеводного, ліпідного та білкового обмінів, що призводить до формування ряду ускладнень. Незважаючи на велику кількість досліджень у цілому світі патогенез ЦД з'ясований не до кінця [Кураева и др., 2003]. У останній час головні завдання дослідників - перехід від діагностики діабету до його передбачення, від лікування до попередження.

Метаболічні порушення, які розвиваються внаслідок інсулінової недостатності при ЦД, значно ускладнюють функціонування систем підтримки гомеостазу, важливою ланкою якого є еритроцити периферичної крові. При ЦД суттєво змінюються фізичні, біохімічні, морфофункціональні властивості еритроцитів. За умов гіперглікемії глікозилювання гемоглобіну - основного білка червоних кров'яних клітин викликає зміну його спорідненості до кисню, посилення гіпоксії периферичних тканин у хворих на ЦД 1-го типу. Крім того, метаболічні процеси, індуковані глюкозою, проявляються активацією перекисного окислення ліпідів (ПОЛ), що впливає на стабільність клітинної мембрани, адсорбцію на ній токсичних речовин, Це веде до порушень у обміні речовин, і, як наслідок, знижує життєздатність цих клітин [Бондарь и др., 2003]. В цілому зміни еритроцитарної ланки в комплексі метаболічних порушень у хворих ЦД вивчені недостатньо. Розуміння цих змін дозволить проводити адекватну фармакологічну корекцію при цьому захворюванні.

Відомо, що система L-аргінін/NO може брати участь у формуванні кисеньтранспортної системи крові, тобто впливати на основну функцію клітин еритрону через внутрішньоеритроцитарні механізми регуляції, кисеньзалежний характер утворення NO, підтримку судинного тонусу, дію пероксинітриту [Зинчук, 2003]. Вивчення її впливу на морфологічні та біохімічні показники еритроцитів за умов ЦД 1-го типу є надзвичайно актуальним, оскільки для цієї патології характерне посилення гіпоксії тканин пропорційно до розвитку діабетичних ускладнень.

Характер рівноваги між інтенсивністю вільнорадикальних процесів та функціонуванням системи антиоксидантного захисту значною мірою залежить від рівня продукування NO та депонування оксиду азоту в еритроцитах. Тому виникає потреба пошуку нових фармакологічних агентів, здатних коригувати розвиток цукрового діабету шляхом послаблення токсичної дії вільних радикалів кисню і азоту за умов даної патології. В цьому плані надзвичайно перспективним є застосування інгібіторів NO-синтаз селективної дії, які пригнічують, передусім, індуцибельну ізоформу фермента, що проявляє свої функції, в основному, за критичних умов.

З'ясування особливостей функціонування системи антиоксидантного захисту (АОЗ), ферментів біосинтезу NO, механізмів депонування NO за допомогою гемоглобіну, та їх роль у регуляції морфофункціонального стану еритроцитів дозволить розширити наші уявлення про патогенез ЦД 1-го типу та механізми розвитку ускладнень за даної патології.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконувалась на кафедрі біохімії біологічного факультету Львівського національного університету імені Івана Франка згідно плану науково-дослідної роботи кафедри за темами: “Діагностика та розробка засобів корекції метаболічних порушень при цукровому діабеті” (№ держреєстрації 0193U024092) і “Структурно-функціональні та біохімічні особливості клітин системи крові за умов цукрового діабету 1-го типу” (№ держреєстрації 0103U001909).

Мета та завдання досліджень. Метою даної роботи було з'ясування біохімічних механізмів впливу системи L-аргінін/NO на морфологічний та функціональний стан еритрону за умов цукрового діабету 1-го типу та пошук шляхів корекції метаболічних порушень, які виникають при даній патології.

Для досягнення поставленої мети необхідно було вирішити наступні завдання:

1. Оцінити інтенсивність еритропоезу у щурів з експериментальним стрептозотоциновим діабетом.

2. Дослідити активність NO-синтази в еритроцитах щурів у нормі і за умов ЦД 1-го типу на фоні введення щурам per os субстрату даного ферменту (L-аргініну) та його інгібіторів (L-NAME (N^щ-nitro-L-arginine methyl ester) і аміногуанідину (AG)).

3. З метою дослідження процесів депонування NO вивчити динаміку вмісту лігандних форм гемоглобіну (Hb) в еритроцитах, кисень-зв'язуючу функцію основного пігмента крові, нітритредуктазну активність дезокси-Hb та процес нітрозування Hb in vitro в нормі, за умов експериментального ЦД та на фоні введення AG.

4. Проаналізувати електронні спектри нітрозил-Hb (NOHb) у нормі, за умов стрептозотоцинового діабету та на фоні введення AG для оцінки можливості моделювання коригуючого впливу на процеси депонування NO.

5. За допомогою скануючої електронної мікроскопії дослідити поверхневу архітектоніку та поліморфізм еритроцитів щурів при введенні L-аргініну, L-NAME та AG in vivo у нормі та за умов експериментального ЦД 1-го типу.

6. З'ясувати вплив L-аргініну, L-NAME та аміногуанідину на стан системи антиоксидантного захисту та рівень перекисного окислення ліпідів в еритроцитах контрольних тварин і на моделі експериментального стрептозотоцинового діабету.

Об'єкт дослiдження: біохімічні механізми, що опосередковують морфологічні та функціональні зміни в еритроцитах контрольних щурiв та тварин із експериментальним цукровим діабетом.

Предмет дослiдження: цитологічні та фізико-хімічні показники клітин еритроїдного ряду периферичної крові та кісткового мозку, ізоформи NOS (ендотеліальна конститутивна та індуцибельна NO-синтаза), лігандні форми гемоглобіну, NO-похідні гемоглобіну (нітрозо- та нітрозилгемоглобін), нітритредуктазна активність дезоксигемоглобіну, ферментативна система антиоксидантного захисту (СОД, каталаза, ГПО, ГР), рівень продукції перекисного окислення ліпідів (ТБК-позитивні продукти).

Методи дослiдження: біохімічні, методи абсорбційної спектроскопії, скануючої електронної мікроскопії, цитологічні, статистичні.

Наукова новизна отриманих результатів. Отримані дані по вмісту фетального гемоглобіну, кількості еритроцитів у периферичній крові та добовій продукції і швидкості дозрівання ретикулоцитів у поєднанні з аналізом препаратів кісткового мозку ілюструють механізм розвитку анемії у хворих на ЦД 1-го типу на клітинному рівні.

Показано, що за умов експериментального ЦД значно зростає активність іNOS у еритроцитах.

Проведено аналіз лігандних форм гемоглобіну еритроцитів щурів у нормі та при ЦД 1-го типу на фоні введення аміногуанідину - інгібітора індуцибельної ізоформи NOS та процесів неферментативного глікозилювання. Показано, що за умов ЦД інтенсифікується процес S-нітрозилювання гемоглобіну.

Вперше показано коригуючий вплив аміногуанідину на кисеньтранспортну систему, активність ферментів антиоксидантного захисту, інтенсивність процесів перекисного окислення ліпідів та морфофункціональний стан еритроцитів щурів із експериментальним стрептозотоциновим діабетом.

Практичне значення одержаних результатів. Отримані дані по коригуючому впливу аміногуанідину на морфофункціональний стан еритроцитів (поліморфізм червоних кров'яних клітин, вміст глюкози та глікозильованого гемоглобіну, кисеньтранспортну функцію, активність ферментів системи антиоксидантного захисту, депонування NO шляхом нормалізації процесу S-нітрозилювання гемоглобіну) за умов ЦД 1-го типу вказують на доцільність його застосування в комплексній терапії та корекції ускладнень, що виникають при досліджуваній патології і на його основі вести пошук та розробку нових фармакологічних препаратів для лікування даного захворювання. Результати досліджень нітритредуктазної активності, процесів нітрозилювання та нітрозування дезоксигемоглобіну in vitro та аналіз електронних спектрів нітрозилгемоглобіну дозволяють охарактеризувати механізми депонування NO за участю гемоглобіну та роль системи L-аргінін/NO у процесах формування адаптаційного захисту при ЦД.

Отримані у дисертаційній роботі дані використовуються у навчальному процесі під час викладання спецкурсів, які читаються на кафедрі біохімії біологічного факультету ЛНУ імені Івана Франка.

Особистий внесок здобувача. У всіх серіях досліджень дисертант безпосередньо брала участь у створенні моделі стрептозотоцинового діабету, виконала весь обсяг експериментальних досліджень, статистичну обробку отриманих результатів, здійснила пошук та аналіз джерел наукової літератури згідно з темою кандидатської дисертації. Автор особисто брала участь у підготовці публікацій до друку. Дослідження поверхневої архітектоніки еритроцитів методом скануючої електронної мікроскопії виконано спільно із к.б.н., ст.н.сп., Кулачковським О.Р. Планування експериментальної роботи, аналіз та обговорення результатів, формулювання основних положень і висновків проведено спільно з науковим керівником, д.б.н., завідувачем кафедри біохімії, проф. Сибірною Н.О. Співучасть співробітників кафедри біохімії у виконанні роботи відмічена у спільних публікаціях.

Апробація результатів досліджень. Основні положення дисертації були представлені на IV Національному конгресі патофізіологів України (Чернівці, 2004); І з'їзді фізіологів СНД (Сочі, 2005); Міжнародній науково-практичній конференції „Біологічне окиснення в нормі і патології” (Тернопіль, 2006); ІХ З'їзді Укр. біохім. тов. (Харків, 2006); третій Міжнародній науковій конференції студентів і аспірантів „Молодь та поступ біології”(Львів, 2007); 2-му З`їзді Українського Товариства Клітинної Біології (Київ, 2007).

Публікації. За темою дисертації опубліковано 10 робіт, які включають 6 статей у фахових наукових журналах та 4 тез доповідей на міжнародних та вітчизняних наукових конференціях, з'їздах, конгресах.

Структура та обсяг роботи. Дисертація містить наступні розділи: вступ, аналітичний огляд літератури, матеріали та методи досліджень, результати досліджень, аналіз та узагальнення результатів досліджень, висновки та список використаних джерел. Дисертацію викладено на 124 сторінках друкованого тексту і проілюстровано 12 рисунками та 13 таблицями. Список літератури включає 177 найменувань.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Огляд літератури. В огляді літератури проаналізовано сучасні дані стосовно етіології ЦД 1-го типу та його ускладнень, а також експериментального стрептозотоцинового діабету. Охарактеризовано морфофункціональний стан системи еритрону, киснево-транспортну функцію крові та біологічну систему L-аргінін/NO у нормі і за умов досліджуваної патології.

Матеріали і методи досліджень. Експериментальний цукровий діабет (ЕЦД) у щурів викликали введенням стрептозотоцину (“Sigma”, США) з розрахунку 7 мг на 100 г маси тіла дочеревинно. Розвиток діабету контролювали за вмістом глюкози в крові, яку визначали глюкозооксидазним методом з використанням набору реактивів “Lachema” (Чехія) [Tringer, 1969]. У експериментах in vivo з моменту індукції діабету тваринам per os вводилися досліджувані речовини з питною водою: L-аргінін у концентрації 1,25 г/л протягом 14 днів; L-NAME у концентрації 70 мг/л протягом 14 днів ; AG у концентрації 1 г/л протягом 30 днів. Дослідження проводили в таких групах: 1. Контроль (К); 2. К + L-аргінін; 3. К + L-NAME; 4. К + AG; 5. Діабет (Д); 6. Д + L-аргінін; 7. Д + L-NAME; 8. Д + AG.

Кількість еритроцитів та ретикулоцитів визначали згідно методик [Сибірна та ін., 1997]. Визначення швидкості дозрівання та добової продукції ретикулоцитів визначали за методикою, описаною [Ілюхін и др., 1982 ]. Для отримання цитологічних препаратів клітин кісткового мозку застосовували комбіноване фарбування за Папенгеймом.

Активність NO-синтази визначали як описано в роботах [Онуфриев, 1995, Сумбаев, 2000] у нашій модифікації або опосередковано контролювали за вмістом кінцевих продуктів метаболізму NO: нітритів за методом Гріса [Мокроносов, 1989], нітратів за методом [Cawse, 1967].

Лігандні форми Hb визначали методом абсорбційної спектроскопії [Білий та ін., 1998]. Нітритредуктазну активність дезоксигемоглобіну визначали у гемолізатах, отриманих з використанням 33 мМ К⁺/Na⁺-фосфатного буферу (рН 7,36). Процес дезоксигенації гемоглобіну здійснювали у вакуумі [Иванов, 1975] і контролювали спектрофотомерично. Концентрацію гемоглобіну у гемолізатах визначали за методикою [Van Kampen, 1961]. Реакцію відновлення NO₂^-аніонів за участю дезоксигемоглобіну ініціювали додаванням до гемолізату розчину NaNO₂ та реєстрували зростання оптичної густини розчину при 480 нм [Gross, 1999]. Електронні адсорбційні спектри досліджували за допомогою спектрофотометра UV-VIS “Specord M-40” (Німеччина). Нітрозування проводили у спеціальному сатураторі. При цьому через відновлений дитіонітом натрію гемолізат пропускали оксид азоту, який одержували шляхом відновлення нітроксильного іону при поєднанні розчинів та аскорбінової кислоти [Gross, 1999].

Дослідження поверхневої архітектоніки еритроцитів здійснювали методом скануючої електронної мікроскопії. Виділення, відмивання та фіксацію еритроцитів для електронної мікроскопії проводили за методикою [Сидоров и др., 2001, Новицкий и др., 2001]. Готові зразки вивчали в скануючому електронному мікроскопі JEOL JSM-T 220 A Scanning microscope (Японія) Для отримання кількісної характеристики морфологічних форм еритроцитів у кожному препараті статистично підраховували 500 клітин, використовуючи класифікацію [Боднарь и др., 2003, Погорелов и др., 2005].

Супероксиддисмутазну активність (СОД, КФ 1.15.1.11) визначали методом, який ґрунтується на відновленні нітросинього тетразолію супероксидними радикалами [Чевари и др., 1991]. Каталазну активність (КФ 1.11.1.6) визначали за інтенсивністю забарвлення комплексу Н₂О₂ з молібдатом амонію [Королюк и др., 1988]. Глутатіонпероксидазну активність (ГПО, КФ 1.11.1.9) визначали за допомогою методу, в основі якого лежить розвиток кольорової реакції внаслідок взаємодії SH-груп з реактивом Еллмана [Моин, 1986]. Активність глутатіонредуктази [ГР, КФ 1.6.4.2] оцінювали за зменшенням вмісту NADPH [Панченко и др., 1975]. Вміст сполук, що реагують з тіобарбітуровою кислотою (ТБК-позитивні продукти), визначали за методикою [Тимирбулатов и др., 1981]. Глікозильований гемоглобін визначали колориметричним методом [Van Kampen, 1983].

Результати досліджень обробляли статистично з використанням коефіцієнта Ст'юдента.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Цитологічні та фізико-хімічні показники периферичної крові та кісткового мозку щурів у нормі та за умов експериментального ЦД 1-го типу. Показано, що за умов експериментального цукрового діабету (ЕЦД) відбувається збільшення вмісту ретикулоцитів периферичної крові у 1,4 разів, їх добової продукції у 1,3 разів, а швидкості дозрівання у півтора рази порівняно до норми. Розвиток стрептозотоцинового діабету веде до підвищення вмісту лужностійкого та глікозильованого гемоглобіну (Hb). Збільшення кількості фетального гемоглобіну є компенсаторною реакцією системи еритрону на гіпоксичний стан, який розвивається за умов ЦД. При аналізі цитологічних препаратів кісткового мозку виявлено зниження процентного вмісту поліхроматофільних (у 1,3 разів) та оксифільних (у 1,7 разів ) нормоцитів при стрептозотоциновому діабеті, яке можна пояснити їх сповільненим дозріванням та швидкими темпами елімінації ретикулоцитів у русло крові. Отримані нами результати ілюструють механізм розвитку анемії у хворих на ЦД 1-го типу на клітинному рівні.

Активність різних ізоформ NO-синтази еритроцитів у нормі та за умов ЦД 1-го типу. Згідно даних, приведених в табл.1, введення L-аргініну у нормі збільшувало NO-синтазну активність еритроцитів приблизно на 30%. L-NAME - структурний аналог L-аргініну та неспецифічний інгібітор, який конкурентно інгібує всі форми NOS, знижував активність досліджуваного ферменту на 29%, а дія аміногуанідину - селективного інгібітора іNOS, була дуже слабкою. За умов індукованого стрептозотоцином діабету ми спостерігали іншу картину. Введення L-аргініну викликало зниження активності NOS. Це можна пояснити інгібуванням активності ферменту за принципом негативного зворотного зв'язку за умов значного збільшення концентрації NO. При введенні інгібіторів при ЕЦД спостерігалося пригнічення активності NOS в еритроцитах щурів. Цікаво відзначити, що зниження активності цього ферменту при введенні AG за умов ЦД є у три рази стрімкішим по відношенню до вихідного рівня, ніж у нормі. Це свідчить про переважаючий вклад іNOS у сумарну активність синтаз оксиду азоту за умов патології.

Табл. 1

Активність NOS і вміст нітритів та нітратів в еритроцитах периферичної крові за досліджуваних умов ( Мm, n=14)

Показники Умови	Активність NOS, пмольNADPH/хв на 1мг білка	NO3- + NO2-, мкM
Контроль	0,831 ± 0,028	15,732 2,173
Контроль + L-аргінін	1,080 ± 0,098*	22,322 2,078*
Контроль + L-NAME	0,590 0,041*	6,459 0,024*
Контроль + AG	0,673 ± 0,051*	14,654 1,354
ЕЦД	1,288 ± 0,101*	33,623 1,799*
ЕЦД + L-аргінін	0,843 ± 0,070**	26,924 1,852**
ЕЦД + L-NAME	0,360 ± 0,033**	7,164 0,709**
ЕЦД + AG	0,450 ± 0,039**	11,198 1,215**

Примітка. Тут і далі:

* - різниця вірогідна порівняно з контролем, р<0.05

** - різниця вірогідна порівняно із діабетом, р<0.05

При аналізі вмісту стабільних метаболітів NO - нітратів та нітритів ми отримали результати, які підтверджують дані змін активності NOS, визначеної прямим методом (табл.1).

Вплив аміногуанідину на фізико-хімічні властивості гемоглобіну за умов ЦД 1-го типу. Проведено дослідження впливу аміногуанідину на вміст лігандних форм, спектральні характеристики, нітритредуктазну активність гемоглобіну та кисеньтранспортну функцію еритроцитів. З метою виявлення факторів, які могли б впливати на кисневу афінність гемоглобіну і функціонування киснево-транспортної системи організму в цілому був проведений аналіз лігандних форм гемоглобіну крові щурів у нормі та за умов ЕЦД при введенні AG з використанням методу абсорбційної спектроскопії. В результаті проведених експериментів ми зареєстрували достовірне зростання вмісту метгемоглобіну за умов ЦД. Введення in vivo AG - як у нормі так і за умов цукрового діабету викликало зниження метгемоглобіну, що може свідчити про те, що зростає роль нітритредуктазної ланки оксиду азоту. Для того з'ясування механізмів депонування NO за умов модельного ЦД 1-го типу було досліджено процес нітрозування Hb in vitro, а також проаналізовано електронні спектри дезокси-Hb та нітрозил-Hb (NO-Hb) у нормі, за умов стрептозотоцинового діабету та на фоні введення AG. Поступове перетворення дезокси-Hb в NO-Hb спостерігали за характерними змінами поглинання у видимій області спектру (рис.1). Широка асиметрична смуга з максимумом при 555-560 нм замінялася двома смугами із максимумами поглинання 545,8 нм та 572,4 нм, які є характерними для нітрозил-Hb [Van Kampen, 1983]. Час переходу дезокси-Hb у NO-Hb за умов стрептозотоцинового діабету зростав приблизно на 70%. Електронний спектр (рис.2, крива 2) нітрозил-Hb тварин із стрептозотоциновим діабетом в порівнянні з NOFe²⁺Hb контрольних щурів характеризувався гіпсохромним ефектом у межах смуги Соре. Ці зміни у електронному спектрі Hb зумовлені перерозподілом електронної густини у системі спряжених зв'язків протопорфіринового макроциклу і атома заліза. У вихідній дезоксигенованій формі гемоглобіну Fe²⁺ знаходиться у високо-спіновому стані, має координаційне число 5 і міститься за площиною гему на відстані 0,07нм. При взаємодії оксиду азоту з атомом Fe²⁺ у шостому координаційному положенні залізо переходить у низько-спіновий стан, а число лігандів у координаційній сфері збільшується до шести.

Перехід у низькоспіновий стан супроводжується його зміщенням на 0,07 нм у площину гему, що спричиняє поетапний розрив сольових зв'язків між б-субодиницями і зміщенням субодиниць уздовж контактів б1-в2 і б2-в1.

Нітрозування дезокси-Hb щурів із стрептозотоциновим діабетом супроводжувалось гіперхромним ефектом в області поглинання ароматичних амінокислот, що реєструвалося як зміщення максимуму поглинання з 268,3 до 274,9 нм, і появою широкої смуги поглинання при 334 нм порівняно з NO-Hb контрольних тварин. Зміни спектру поглинання в ультрафіолетовій області відбуваються за рахунок взаємодії NO з білковою частиною молекули Hb, адже відомо, що при 320-360 нм поглинають світло S-нітрозотіольні похідні білків [Stamler, 1992]. Очевидно, відбувається утворення SNO-Hb, який є продуктом нітрозилюванням в-93 цистеїну. Спектри нітрозо-Hb контрольних та з ЕЦД типу щурів, які представлені на рис.2, свідчать про те , що введення AG in vivo (крива -3) мало нормалізуючий вплив на фізико-хімічні властивості молекули Hb.

При дослідженні нітритредуктазної ланки утворення NO за участю дезоксигемоглобіну за умов цукрового діабету виявлено що дезоксигемоглобін щурів із ЕЦД виявляє відносно більшу нітритредуктазну активність порівняно з дезокси-Hb контрольних щурів. Введення AG практично не змінювало досліджуваних нами показників у контрольних тварин. Проте, у тварин з ЕЦД показано зниження нітритредуктазної здатності дезокси-Hb за введення AG, про що свідчить зниження інтенсивності процесів нітрозилювання дезокси-Hb.

При аналізі кривих дисоціації оксигемоглобіну (КДО) отримано чітко виражений зсув кривої дисоціації вліво і зниження Р₅₀ у щурів з ЕЦД (рис. 3). Виявлено також достовірне зростання вмісту глікозильованого гемоглобіну, що є одним з факторів, що викликає ці зміни (табл. 2). Введення AG контрольним щурам викликає зсув КДО вправо порівняно з контролем, що свідчить про зменшення спорідненості гемоглобіну до кисню (Р₅₀=29,31±1,39). При дії AG за умов ЕЦД нормалізуються киснево-транспортні функції гемоглобіну, тобто відбувається зсув КДО вправо порівняно з діабетом і наближення до контролю (рис. 3), вміст глікозильованого гемоглобіну при цьому достовірно зменшується (табл. 2). При введенні аміногуанідину за умов ЕЦД зсув КДО вправо вказує на перерозподіл у співвідношенні : MetHb / HbFe²⁺NO / SNO-Hb в сторону утворення HbFe²⁺NO.

Табл. 2.

Напівнасичення гемоглобіну киснем та вміст глікозильованого гемоглобіну

(М±m, n=8-10)

Варіант досліду	Р 50, мм рт. ст..	Вміст Hb A?c, %
Контроль	26,61±2,11	4.53 ± 0.05
Діабет	19,20±1,60*	8.81 ± 0.41*
Контроль + AG	29,31±1,38	4.49 ± 0.07
Діабет + AG	23,31±1,08**	6.03 ± 0.28**

Тобто відбувалось зниження спорідненості гемоглобіну до кисню та полегшення дисоціації оксигемоглобіну і гіпоксичного стану, що виникає при даній патології.

Поліморфізм еритроцитів периферичної крові у нормі та за умов цукрового діабету 1-го типу на фоні впливу L-аргініну та інгібіторів NO-синтази

Результати досліджень поверхневої архітектоніки еритроцитів щурів в нормі та за умов ЕЦД на фоні впливу основного субстрату та інгібіторів NO-синтази представлені на рис. 4, 5. Отримано достовірні дані про кількість дискоцитів, стоматоцитів (клітини, які мають форму округлого диску з вираженою увігнутістю з одного боку), ехіноцитів (еритроцитів з виростами різної форми) і форми еритроцитів, які важко піддаються класифікації (табл. 3).

В нормі еритроцитарний пул представлений в основному двовігнутими дискоцитами (рис. 4) до 97%. Клітинна поверхня дискоцита у скануючому мікроскопі виглядає зглаженою, без рельєфних утворень. Трансформовані форми еритроцитів зустрічаються дуже рідко (3% від усієї кількості клітин). Серед них трапляються дискоцити з виростами, гребенями (ехіноцити), куполоподібні (стоматоцити), дзвоноподібні еритроцити. Це є морфологічним проявом онтогенезу червоних кров'яних клітин. Потрібно відмітити, що у контрольних щурів не виявлено значних змін у поверхневій архітектоніці еритроцитів за умов впливу основного субстрату - L-аргініну та інгібіторів NO-синтази (AG, L-NAME) (рис.4).

Аналізуючи поверхневу архітектоніку еритроцитів щурів при ЕЦД (рис 4, Д, рис. 5), можна побачити, що вони зазнають значних змін. На фоні зменшення чисельності популяції функціонально повноцінних двовігнутих дисків (до 69,72 ±2,18 %) спостерігалось збільшення кількості трансформованих клітин, що знаходяться на різних стадіях дегенерації.

Рис. 5. Окремі дегенеративні форми еритроцитів щурів за умов експериментального ЦД: А, Б, В, Д - еритроцити з гребнями різної форми; Г - дзвоноподібний еритроцит; Е, Є - еритроцити з поодинокими виростами; Ж, З - еритроцити з багатьма виростами.

Це еліпсовидні клітини, клітини у вигляді плоского диску, дискоцити з гребенем, виростами, сферичні, куполоподібні, дзвоноподібні, еритроцити у вигляді спущеного м'яча, дегенеративно-змінені клітини червоної крові, які важко піддаються класифікації. Різноманітність дегенеративних форм еритроцитів, виявлених нами за умов ЕЦД представлена на рис 5. Відмічено достовірне зростання концентрації глюкози та HbA?c (табл.3).

Табл.3.

Рівень глюкози та вміст глікозильованого гемоглобіну при введенні досліджуваних речовин щурам у нормі і за умов експериментального цукрового діабету (Мm, n=14)

Варіант досліду	Вміст HbA?c, %	Рівень глюкози в крові, ммоль/л
К	4.53 ± 0.05	5.6 ± 0.5
К +L-Аргінін	4.47 ± 0.11	5.8 ± 0.6
К + L-NAME	4.60 ± 0.12	6.0 ± 0.7
К + AG	4.49 ± 0.07	5.16 ± 0.9
Д	8.81 ± 0.41*	12.5 ± 0.5*
Д +L-Аргінін	9.92 ± 0.63**	14.2 ± 1.1**
Д + L-NAME	8.01 ± 0.47	12.2 ± 0.4
Д + AG	6.03 ± 0.28**	8.6 ± 0.4**

Введення піддослідним тваринам L-аргініну призводило до збільшення кількості дегенеративних форм еритроцитів (рис.4., Е,), зокрема - дискоцитів з одним та багатьма виростами - ехіноцитів (до 19,71±1,81 %). Цікаво відзначити, що при введенні L-аргініну значно зростав рівень глюкози у крові тварин з ЕЦД та вміст глікозильованого гемоглобіну, тобто посилювався патологічний стан (табл. 3). Інгібітори NO-синтази AG та L-NAME за умов ЕЦД викликали зменшення кількості трансформованих клітин (рис 4., Є, Ж). Крім того введення AG знижувало рівень глюкози в крові і вміст глікозильованого гемоглобіну (див. табл. 3) за рахунок пригнічення неферментативного глікозилювання білків, що, незаперечно, має протекторний вплив на увесь організм за умов даної патології.

Вплив L-аргініну та інгібіторів NO-синтази на стан антиоксидантної системи еритроцитів у нормі та при ЦД 1-го типу. Результати дослідження ферментів антиоксидантного захисту та продуктів ПОЛ представлені в табл. 4. Активність супероксиддисмутази (СОД) при діабеті знижується, що може бути пов'язане із впливом кінцевих продуктів глікозилювання та пероксинітриту. Введення L-аргініну та інгібіторів NO-синтаз як у нормі, так і за умов ЦД мало ефект підвищення активності досліджуваного ферменту. Окремо потрібно відзначити, що введення AG мало за умов ЦД нормалізуючий вплив, тобто значення активності СОД було порівняльним до величини цього показника у нормі.

Каталаза реагувала на запропоновані модельні ситуації подібним чином. Глутатіонпероксидаза (ГПО) - фермент, який виявив найменші амплітуди відповіді, але слід зазначити, що навіть незначне інгібування ГПО за фізіологічних умов спричиняє зростання токсичних ефектів та підвищення концентрації активних форм кисню.

Табл. 4.

Активність ферментів антиоксидантної системи та вміст продуктів перекисного окиснення ліпідів у щурів в досліджуваних умовах

(M±m, n=14)

Показники Умови	СОД, ум.од. на 1 мл крові	Каталаза, нмоль Н2О2 на 1 мг Hb за 1 хв (еритроцити)	ГПО, мкмоль GSH на 1 г Hb за 1 хв (еритроцити)	ГР, нмоль NADPH на 1 мг Hb за 1 хв (еритроцити)	ТБК-позитивні продукти, нмоль на 1 мл плазми
Контроль (К)	0,910,01	215,744,83	700,2311,48	3,070,06	67,668,50
Діабет (Д)	0,760,05*	197,883,23*	665,577,33*	6,770,84 *	124,2911,7*
К + AG	1,050,01*	333,785,34*	678,996,02*	5,570,46*	69,423,07
Д + AG	0,990,02**	311,966,24**	608,325,64**	4,080,32**	102,462,45**
К + L-Аrg	1,450,12*	226,577,86	715,668,43	4,150,96*	77,566,30
Д + L- Аrg	1,100,09**	249,369,17**	687,047,46	3,350,58**	129,999,78
К + L-NAME	1,280,09*	273,5615,62*	710,7823,87	3,540,15*	75,436,38
Д +L-NAME	1,090,13**	232,4912,7**	669,8720,03	3,760,10**	89,647,44**

Глутатіонредуктаза (ГР) - це фермент, який у наших дослідженнях виявився найбільш лабільним. Його активність зросла за умов ЦД на 125%. Вплив L-аргініну та інгібіторів NOS мав різноспрямовану дію у нормі та при патології. У нормі активність ферменту на фоні введення досліджуваних речовин зростала, а за умов стрептозотоцинового діабету нормалізувалася, тобто знижувалася. Також нами продемонстровано зростання на 83% вмісту ТБК-позитивних продуктів за умов ЦД порівняно з контролем у еритроцитах (табл.4.), що є наслідком збільшення вмісту активних кисневих метаболітів за умов інтенсифікації окислювальних процесів у клітинах крові за умов діабету.

Характеризуючи зміни статусу АОC у розглянутій експериментальній моделі, можна зауважити, що за умов ЦД відбувається функціональне перемикання на захисну антиокиснювальну систему глутатіону. Розглядаючи зміни активності ферментів АОС організму в контексті динаміки змін вмісту ТБК-активних продуктів, слід відмітити антиоксидантні властивості інгібіторів NOS, введення яких супроводжувалося нормалізацією співвідношення процесів ПОЛ та інактивації активних форм кисню. Особливо потрібно відзначити позитивний вплив AG.

ВИСНОВКИ

Отримані результати розширюють та доповнюють уявлення про біохімічні механізми, які опосередковують зміни морфологічного та функціонального стану клітин еритроїдного ряду за умов експериментального цукрового діабету та можливі способи корекції цих змін. У даній роботі обґрунтовується роль процесів нітрозування і нітрозилювання гемоглобіну, ферментативної системи антиоксидантного захисту, різних ізоформ NO-синтази у розвитку метаболічних порушень за умов даної патології.

1. Зміни в системі еритрону при експериментальному цукровому діабеті виявляються в посиленні еритропоезу (збільшення вмісту ретикулоцитів периферичної крові в 1,4 разів, їх добової продукції - у 1,3 разів, а швидкості дозрівання - у 1,5 разів), перерозподілі фракційного складу (підвищення вмісту фетального гемоглобіну в 1,6 разів) і лігандних форм гемоглобіну (зростання вмісту метгемоглобіну у 7,8 разів) та наростанні поліморфізму еритроцитарної популяції (наявність в крові трансформованих еритроцитів), що є відображенням порушення структури мембрани і метаболізму червоних кров'яних клітин.

2. Сповільнене дозрівання еритрокаріоцитів у кістковому мозку (зниження вмісту поліхроматофільних нормоцитів у 1,3 разів та оксифільних - у 1,7 разів) та підвищення елімінації ретикулоцитів у русло периферичної крові при стрептозотоциновому діабеті розкриває механізм розвитку анемії на клітинному рівні за патологічних умов.

3. За умов цукрового діабету 1-го типу в еритроцитах відбувається зміна співвідношення активності ендотеліальної та індуцибельної ізоформ NOS. Зниження активності eNOS та зростання активності iNOS на фоні інтенсифікації вільнорадикальних процесів лежить у основі розвитку оксидативного стресу та метаболічної інтоксикації і веде до гальмування фізіологічної регуляторної функції NO та прояву його цитотоксичної дії.

4. Процеси депонування NO мали різну динаміку у нормі та за умов експериментального цукрового діабету. Введення селективного інгібітора іNOS - аміногуанідину є фактором напрямленого модулювання швидкості (зменшення часу переходу дезоксигемоглобіну в нітрозоформу у 3,3 разів) та інтенсивності (зміни в електронних спектрах) нітрозування і нітрозилювання гемоглобіну і є перспективним напрямком для подальших досліджень з метою виявлення етіології багатьох патологічних станів та методів їх корекції.

5. Введення аміногуанідину за умов модельного цукрового діабету викликало зсув кривої дисоціації оксигемоглобіну вправо та збільшення показника Р₅₀ на 21,4 %, що свідчить про зниження спорідненості гемоглобіну до кисню, полегшення дисоціації оксигемоглобіну і є позитивним коригуючим фактором за умов гіпоксичного стану, що виникає при даній патології.

6. Для послаблення токсичної дії NO і корекції патологічного стану, пов'язаного з його гіперпродукцією у організмі за умов цукрового діабету 1-го типу, доцільним є використання аміногуанідину як селективного інгібітора iNOS, інгібітора неферментативного глікозилювання, антиоксиданта, а також чинника, здатного попереджати посттрансляційні модифікації білків за участю пероксинітриту.

СПИСОК НАУКОВИХ ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ

ДИСЕРТАЦІЇ

1. Сибірна Н.О., Бурда В.А., Люта М.Я. Активність різних ізоформ NO-синтази еритроцитів за умов цукрового діабету 1 типу // Клін. та експериментал. патологія .- 2004.- Т.3, №2. - С.210-212.

(Дисертанту належить опрацювання робочої схеми експерименту, аналіз літературних і експериментальних даних, участь в отриманні матеріалу та написання і оформлення статті. Дисертант особисто визначала активність ферментів синтезу оксиду азоту).

2. Сибірна Н.О., Вовк О.І., Бурда В.А., Люта М.Я. Вплив L-аргініну та інгібіторів NO-синтази на стан антиоксидантної системи за умов цукрового діабету 1 типу // Лаб. діагност. - 2004, №4. - С .47-51

(Дисертант опрацювала дані літератури та власні результати, їй належить участь в отриманні матеріалу, експериментальній роботі та написанні статті).

3. Сибірна Н.О., Люта М.Я., Бурда В.А., Біронт Н.В., Федорович А.М., Дудок К.П. Вплив системи L-аргінін: NO на динаміку вмісту лігандних форм та спектральні характеристики гемоглобіну за умов цукрового діабету 1 типу //Медична хімія. - 2004. - Т.6, №3. - С.26-29

(Дисертанту належить опрацювання робочої схеми експерименту, аналіз літературних даних і власних результатів, участь у написанні та оформленні статті. Здобувач особисто здійснювала визначення вмісту лігандних форм гемоглобіну).

4. Сибірна Н.О., Люта М.Я., Бурда В.А., Федорович А.М. Вплив аміногуанідину на фізико-хімічні властивості гемоглобіну за умов цукрового діабету 1-го типу // Біологія тварин. - 2005. - Т.7, №1-2. - С.194-199

(Дисертанту належить опрацювання робочої схеми експерименту, аналіз літературних і експериментальних даних, участь в отриманні матеріалу та написання і оформлення статті).

5. Бурда В.А., Люта М.Я., Федорович А.М., Сибірна Н.О. Дослідження нітритредуктазної активності гемоглобіну за умов цукрового діабету 1-го типу // Медична хімія.-2006.-Т.8, №4. - С. 92-94

(Дисертанту належить опрацювання робочої схеми експерименту, аналіз літературних даних і власних результатів, участь у написанні та оформленні статті).

6. Люта М.Я., Кулачковський О.Р., Барська М.Л., Сибірна Н.О. Поверхнева архітектоніка еритроцитів щурів за умов експериментального цукрового діабету при введенні L-аргініну та інгібіторів NO-синтази // Лабораторна діагностика. - 2007. - Т. 2. - С. 63-69

(Дисертант опрацювала дані літератури та власні результати, їй належить участь в отриманні матеріалу, експериментальній роботі та написанні статті).

7. Сибирная Н.О., Бродяк И.В., Лютая М.Я., Буслик Т.В. Молекулярные механизмы изменений структурно-функционального состояния клеток крови при сахарном диабете 1-го типа // Научные труды І Съезда физиологов СНГ. - Сочи (Россия). - 2005. - Т. 2. - С. 16-17

(Дисертант брала участь в опрацюванні та аналізі експериментальних даних, написанні та оформленні тез).

8. Люта М.Я., Буслик Т.В., Федорович А.М., Бурда В.А. Вплив аміногуанідину на нітритредуктазну активність дезоксигемоглобіну за умов експериментального цукрового діабету // Тези доповідей ІХ З'їзду Укр. біохім. тов. Харків.-2006. -Т.2. - С.83-84

(Здобувач брала участь у проведенні досліджень, опрацюванні та аналізі експериментальних даних, написанні та оформленні тез).

9. Люта М.Я., Кандя Л.І., Бурда В.А., Федорович А.М., Сибірна Н.О. Дослідження кисеньтранспортної функції гемоглобіну за умов експериментального цукрового діабету на фоні впливу аміногуанідину// Тези доповідей третьої Міжнародної наукової конференції студентів і аспірантів „Молодь та поступ біології”. Львів. - 2007.

(Дисертанту належить опрацювання робочої схеми експерименту, аналіз літературних даних і власних результатів, участь у написанні та оформленні тез).

10. Люта М.Я., Сибірна Н.О. Скануюча електронна мікроскопія еритроцитів щурів за умов цукрового діабету, індукованого стрептозотоцином. // Тези доповідей 2-го З`їзду Українського Товариства Клітинної Біології. Київ. - 2007.

(Здобувач брала безпосередню участь дослідженні, аналізі експериментальних даних, написанні та оформленні тез).

АНОТАЦІЯ

Люта М.Я. Морфофункціональні та біохімічні особливості системи еритрону за умов цукрового діабету 1-го типу. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.11 - цитологія, клітинна біологія, гістологія. - Інститут біології клітини НАН України, Львів, 2007.

Дисертація присвячена дослідженню біохімічних механізмів, які опосередковують зміни морфологічного та функціонального стану клітин еритроїдного ряду та способам корекції метаболічних процесів, які призводять до виникнення та розвитку ускладнень за умов цукрового діабету (ЦД) 1-го типу.

З'ясовано механізм розвитку анемії при ЦД 1-го типу на клітинному рівні. Виявлені зміни в системі еритрону (посилення еритропоезу, наростання поліморфізму еритроцитарної популяції) відображають порушення структури мембрани і метаболізму червоних кров'яних клітин. Показано, що в основі біохімічних порушень, які зумовлюють зміни структурно-функціонального стану еритроцитів за умов ЦД 1-го типу, лежить значне зростання продукції оксиду азоту (NO), викликане зміною співвідношення активностей конститутивної (eNOS) та індуцибельної (iNOS) ізоформ NO-синтази. Зростання активності iNOS на фоні інтенсифікації вільнорадикальних процесів є однією з причин розвитку оксидативного стресу та метаболічної інтоксикації і веде до гальмування фізіологічної регуляторної функції NO та прояву його цитотоксичної дії. Виявлено, що аміногуанідин як селективний інгібітор іNOS впливає на процес утворення і розпаду депо NO, яке контролюється швидкістю та інтенсивністю нітрозування і нітрозилювання гемоглобіну, а також на кисеньтранспортну функцію крові, полегшуючи дисоціацію оксигемоглобіну, що є позитивним коригуючим фактором за умов гіпоксичного стану, що виникає при даній патології. Запропонованно на основі аміногуанідину вести пошук і розробку нових препаратів для запобігання розвитку ЦД та корекції діабетичних ускладнень.

Ключові слова: цукровий діабет 1-го типу, еритроцити, NO-синтаза, гемоглобін, нітрозилювання, аміногуанідин.

АННОТАЦИЯ

Лютая М.Я. Морфофункциональные и биохимические особенности системы эритрона при сахарном диабете 1-го типа. - Рукопись.

Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.11 - цитология, клеточная биология, гистология. - Институт биологии клетки НАН Украины, Львов, 2007.

Диссертация посвящена исследованию биохимических механизмов, опосредующих изменения морфологического и функционального состояния клеток эритроидного ряда и способам коррекции изменений в метаболических процессах, вызывающих возникновение и развитие осложнений при сахарном диабете 1-го типа.

Выяснено механизм развития анемии при сахарном диабете 1-го типа на клеточном уровне. Обнаруженные изменения в системе эритрона (усиление эритропоэза, нарастание полиморфизма еритроцитарной популяции) отображают нарушения структуры мембраны и метаболизма красных кровяных клеток. Показано, что в основе биохимических нарушений, предопределяющих изменения структурно-функционального состояния эритроцитов при сахарном диабете 1-го типа, лежит значительное возрастание продукции оксида азота, вызванное изменением соотношения активности конститутивной (eNOS) и индуцибельной (iNOS) изоформ NO-синтазы. Повышение активности iNOS на фоне интенсификации свободнорадикальных процессов является одной из причин развития оксидативного стресса и метаболической интоксикации, а также приводит к торможению физиологической регуляторной функции NO и проявлению его цитотоксического действия. Обнаружено, что аминогуанидин как селективный ингибитор iNOS влияет на процесс образования и распадения депо NO, контролируемое скоростью и интенсивностью нитрозилирования гемоглобина, а также на кислородтранспортную функцию крови, тем самым, облегчая диссоциацию оксигемоглобина, что является положительным коррегирующим фактором при гипоксическом состоянии, которое возникает при данной патологии. Предложено на основе аминогуанидина вести поиск и разработку препаратов для предупреждения развития или коррекции диабетических осложнений.

Ключевые слова: сахарный диабет 1-го типа, эритроциты, NO-синтаза, гемоглобин, нитрозилирование, аминогуанидин.

SUMMARY

Lyuta M.Ya. Morphofunctional and biochemical features of erythron system under type 1 diabetes mellitus. - Manuscript.

Thesis for a degree of Doctor of Philosophy (Ph.D) in Biology, speciality 03.00.11 - cytology, cell biology, histology. - Institute of Cell Biology of National Academy of Sciences of Ukraine, Lviv, 2007.

Dissertation is devoted to the investigation of biochemical mechanisms mediated changes in morphologic and functional state of erythroid cells and the approaches to correct metabolic processes responsible for appearing and development of type 1 diabetes mellitus (DM) complications.

Revealed changes in erythron system, such as increase of total quantity and daily production of retyculocytes as well as decrease of percentage of polychromatophilic and oxyphilic normocytes under type 1 DM, illustrate the mechanism of the anemia development at cellular level. Increased fetal hemoglobin is a compensatory reaction of organism on development of tissue hypoxia under DM.

Electronic microscopy of the surficial architectonics of erythrocytes detected augmentation of polymorphism in erythrocyte population and the presence of transformed cells in blood under experimental DM which reflect disorders of membrane structure and erythrocyte metabolism. It was shown that the basis of the biochemical impairments which cause the changes in structural and functional state of erythrocytes under type 1 DM, is the significant increase in nitrogen oxide (NO) production resulting in changes in ratio between NO synthase isozymes due to inhibition of endothelial constitutive form and increase in activity of inducible NO synthase (iNOS). Increased activity of iNOS together with intensification of free radical processes induce development of oxidative stress and metabolic intoxication under type 1 DM and transform NO effects from protective to cytotoxic. It was revealed that aminoguanidine, the iNOS selective inhibitor, can be the factor modulating production and degradation of NO depot, controlling by velocity and intensity of nitrylation and nitrozylation of hemoglobin. Analysis of hemoglobin-dissociation curves under experimental diabetes indicates positive corrective effect of aminoguanidine on oxygen-transport system of erythrocytes and respiratory function of blood in whole. As a result, facilitation of oxyhemoglobin dissociation is occurred what is a positive corrective factor under hypoxia under DM.

Aminoguanidine is proposed to use for a search of new drugs for treatment and prevention of vascular complications under type 1 diabetes mellitus.

Key words: type 1 diabetes mellitus, erythrocytes, NO synthase, hemoglobin, nitrozylation, aminoguanidine.