Вірусний гипатит С

10

Вступ

Вірусні гепатити займають одне з перших місць в інфекційній патології людини, після грипу і респіраторних вірусних захворювань.

По своїй величині соціально-економічного збитку та медичній значимості вірусні гепатити займають ведуче місце в інфекційній патології України та інших країн. Щорічно число захворілих гострими вірусними гепатитами досягає більш мільйона чоловік.

Вірусні гепатити В, С и D - найбільш важкі форми гепатитів, що ведуть до хронізації з наступним формуванням цирозу печінки, первинного раку печінки і часто приводять до летальних результатів. Так за даними ВООЗ (1995 рік) хронізація при вірусному гепатиті В складає 10%, при вірусному гепатиті С 70%, при вірусному гепатиті D - 10-15%. Летальність при вірусному гепатиті А складає 0,6%, при вірусному гепатиті В - 1,4%, С - 1-2%, D - 30%.

Близько 3% світового населення (більше 170 млн. чоловік) виявилося інфікованих вірусом гепатиту С (ВГС), з яких у 90% симптоми відсутні взагалі. Фактично, більшість людей, не знали про те, що вони хворіють, доти, поки медичні аналізи не виявляли їх десятки років, протягом яких їхня печінка повільно руйнувалася. Іноді люди могли дізнаватися про те, що хворі гепатитом С, при спробі стати донором крові, тому, що в банках крові заведено перевіряти її на віруси.

У багатьох випадках, ВГС приводить до хронічних захворювань печінки, таким, як цироз, рак печінки чи печінкової недостатності. І займає друге місце в ураженнях печінки, уступаючи лише алкоголізму і є вагомою підставою для пересадження печінки. Хоча проти гепатитів А и В використовуються вакцини, не існує вакцини проти гепатиту С. Вакцина проти вірусу гепатиту С дотепер не розроблена. Основними проблемами на шляху розробки вакцини є наявність гіперваріабельних ділянок у геномі ВГС, висока частота мутацій вірусу і слабка гуморальна відповідь на вакцину.

Якщо раніше, до 1993 - 1994 р.р., причиною поширення парентеральних форм передачі вірусної інфекції були медичні маніпуляції, то останнім часом усе більшу питому вагу в причині їхнього поширення займає наркоманія (парентеральне застосування наркотиків), унаслідок чого в найближчі роки варто очікувати значний підйом захворюваності вірусними гепатитами серед населення України.

Прогрес у діагностиці вірусних гепатитів став можливим завдяки успіхам молекулярної біології і генної інженерії в області вірусології. Нові технології: імуноферментний, радіоімунологічні методи і ланцюгова полімеразна реакція міцно ввійшли в практичну вірусологію. Широке впровадження маркерної діагностики дозволило вирішувати питання як клінічної діагностики, так і багато епідеміологічних аспектів цих інфекцій.

Звичайне лікування для ВГС не є універсально ефективним, так що пошук нових лікарських засобів на сьогоднішній день є актуальним питанням.

Тому, метою даної роботи було вивчення ефективності застосування імуномодуляторів при лікуванні гепатиту С.

До задач дослідження входило:

Вивчення імунних показників при ВГС

Визначення імунних показників при лікуванні хворих на ВГС циклофероном.

Вивчення ефективності застосування аміксина при лікуванні ВГС.

Порівняння ефективності застосування обох препаратів при ВГС.

1. Огляд літератури

1.1 Класифікація вірусу гепатиту С

ВГС єдиний член роду Hepacіvіrus у сімействі Flavіvіrіdae, у яке входять такі віруси, як вірус діареї биків і лихоманки свиней (рід Pestіvіrus) і вірус жовтої лихоманки, вірус денге і GB-віруси: GBV-A, GBV-B і GBV-C/HGV (рід Flavіvіrus).

Під словами "вірус гепатиту С" мається на увазі гетерогенна група вірусів, що містять РНК. Їхня класифікація заснована на генетичній подібності. Найбільш визнана номенклатура [Simor, 1992] розрізняє шістьох основних генетичних груп і ряд виділених підтипів, що мають найбільшу подібність. Типи нумеруються, починаючи з одиниці, а підтипам привласнюють букви a, b і с у відповідності з годом відкриття.

У 1990 році в Х'юстоні було показано, що гепатит С - один із шести найбільше часто ідентифікуючих гепатовірусів - іншими є A, B, D, E, G. Усі випадки запалення печінки приводять до порушення функцій печінки. Гепатит С звичайно розглядається як найбільш небезпечний серед цих вірусів [Кузин, 1999].

1.2 Будова вірусу гепатиту С

Нуклеокапсид містить РНК вірусу гепатиту С. Зверху нуклеокапсид покритий ліпідною оболонкою з утопленими в ній оболонковими білками, кодованими РНК ВГС. Геном вірусу представлений одноланцюговою лінійною молекулою РНК позитивної полярності, довжиною близько 9600 нуклеотидів. Організація геному ВГС подібна іншим флавівірусам. в ньому виділяють дві зони, які кодують структурні і неструктурні (функціональні) білки.

Гени, що кодують структурні білки, розташовані в 5' області геному вірусу, а неструктурні в 3' області. Геном ВГС має одну відкриту рамку зчитування (ВРЗ), єдиний поліпептид (приблизно в 3000 амінокислот), що під дією вірусних і клітинних протеаз нарізується на структурні і неструктурні білки. [Зеваков, 1998]

До структурних білок відносять білки, кодовані Core, El і Е2 (р21) з молекулярною масою - 21 k, усічена (р19) і форма (р16), виявлена в ядерцях інфікованих гепатоцитів. На своїй поверхні С-білок несе різні висококонсервативні В-клітинні епітопи, існування яких надзвичайно важливо для виявлення антитіл до ВГС у процесі лабораторної діагностики гепатиту С [Laverdant, 1989].

Зони РНК ВГС - Е1 і Е2 кодують білки з молекулярною масою 31 і 70 k . Ці білки мають кілька ділянок N-глікозилювання; в Е1 білку визначено до 6 таких ділянок, а в Е2 - 11. У ділянці Е2 укладена інформація про невеликий білок - р7, що у структурі вірусу не виявлений.

Позначення регіонів, розташованих ближче до 3'- кінцю РНК ВГС - як зон, що несуть інформацію про неструктурні білки вірусу, указує на те, що ці білки не є структурними компонентами вірусної частки. У неструктурній зоні РНК ВГС виділяють ділянки, позначені як: NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A і NS5B. Більшість з білків, кодованих неструктурними зонами РНК ВГС, необхідні для реплікації вірусу.

Порівняльний аналіз нуклеотидних послідовностей РНК ізолятів ВГС, отриманих у різних регіонах світу і навіть у процесі захворювання від того самого пацієнта, виявив основну особливість цього вірусу - високу гетерогенність РНК. Положення про значної генетичний варіабельності РНК ВГС стало в основу теорії, що пояснюють: тривале (іноді довічне) носійство вірусу, частий розвиток хронічного захворювання, труднощі в терапії і створенні ефективних вакцинних препаратів. Найбільш значні відмінності послідовностей РНК ВГС зосереджені в N-кінцевій частині регіону Е2, що позначають - "гіперваріабельний регіон" (HVR).

В даний час визначено 6 основних генотипів і понад 100 субтипів ВГС. Генотипи 1а, 1у, 2а, 2у, 2з і За складають більш 90% ВГС - ізолятів, отриманих у Північній і Південній Америці, Європі, Росії, Китаї, Японії й Австралії/Нової Зеландії. Генотипи 4, 5а і 6 відповідно реєструються в Центральній і Південній Африці, Південно-Східній Азії. У Росії і країнах СНД зареєстрована перевага генотипу 16 (не менш 68,9%). Вважається, що пацієнти, інфіковані генотипом 1 (особливо 1в), відповідають гірше на лікування в порівнянні з пацієнтами, інфікованими іншими генотипами вірусу [Yuasa, 1991].

У хворого ВГС циркулює як популяція часток вірусу, у яких геноми відрізняються друг від друга на 1-2% (квазіспецифічності) у результаті мутацій, що накопичуються під час інфекції чи, що потрапили в організм пацієнта при зараженні. Ці мутантні форми можуть сприяти більш активної чи реплікації можуть допомагати вірусу ухилятися від імунної відповіді організму і потенційно впливати на результат гострої інфекції, розходження в плині захворювання і відповіді на інтерферонотерапію [Жданов, 1986].

1.3 Життєвий цикл

Життєвий цикл ВГС включає утворення реплікативних (негативних - ) ланцюгів РНК, що служать матрицею для утворення геномних молекул. Частота виявлення реплікативной форми РНК ВГС за даними одних дослідників складає 35% випадків [Абдулмеджидова, 2000], тоді як за даними інші до 100% [Chang, 2000]. Істотна розбіжність даних може порозуміватися труднощями, що виникають при визначенні негативної-РНК, тому що кількість негативних ланцюгів РНК на один [lanford, 1995] - три [Mellor, 1998] порядку нижче, ніж позитивна + РНК. Це порозумівається тим, що одна молекула -РНК може служити матрицею для синтезу декількох геномних молекул [Маслова, 2000].

Серед дослідників немає єдиної думки про тім, наскільки реплікація вірусу зв'язана з процесами ушкодження печінки і виходом вірусних часток у периферичну кров [De Molіner, 1998. Marcus, 1994]. За даними Marcus с соавт. [1998, 1999], що використовували напівкількісний метод ПЛР, немає строгого зв'язку між вірусною реплікацією і рівнем віремії. Згідно отриманим нами даним, реплікація вірусу в печінці супроводжується більшою частотою виявлення РНК ВГС у сироватці крові, однак достовірної кореляції між цими параметрами не виявлено. Невідповідність між кількістю виявлених геномної і репликативної форм РНК ВГС у печінці і рівнем віремії може бути наслідком ряду причин:

1 - елімінації вірусу із сироватки за допомогою специфічних антитіл;

2 - надходження ВГС у периферичну кров не тільки з печінки, але і з інших органів і тканин;

3 - порушення процесу вивільнення вірусу з кліток печінки під дією лікарських чи засобів інших факторів [Marcus, 1994].

Досвіди, проведені в нашій лабораторії, не виявили достовірної кореляції між частотою зустрічаємості негативна-РНК ВГС у печінці і ступенем поразки печіночної тканини [Лакина, 2000]. Це погодиться з припущенням, що вірус може реплицироваться, не викликаючи серйозних ушкоджень у тканині печінки. Однак є дані про можливу участь вірусної реплікації в розвитку цитопатичного ефекту [Chang, 2000, Tsutsumі, 1994]. За допомогою методу гібридизації іn sіtu показано, що клітки, що містять репликативную форму РНК вірусу, локалізовані переважно у вогнищах поразки печінки [Tsutsumі, 1994]. Виявлено достовірну кореляцію між кількістю гепатоцитів.

1.4 Епідеміологія і клініка

Джерелом інфекції є тільки людина. Поширення вірусу відбувається трансфузіонно при переливанні крові і її чи препаратів інструментальним шляхом у результаті занесення зараженої вірусом крові в організм здорових людей, а також вертикально - від матері до плоду. Сприйнятливість населення до ВГС дуже високого. За даними ВООЗ на 1997 рік, на частку гепатиту С в Африці приходиться до 25% усіх випадків вірусного гепатиту. У ряді країн Америки - до 35%. У США - до 90% посттрансфузійного вірусного гепатиту викликається вірусом гепатиту С. Підтримці епідеміологічного процесу сприяє схильність гепатиту С к хронічному плину. Вірус виділяється від хворих протягом однієї чи декількох тижнів до появи ознак хвороби і до 10 тижнів після початку хвороби. Інкубаційний період у порівнянні з гепатитом B, коротше приблизно на 1 місяць і складає 6-8 тижнів. Нерідке захворювання протікає без жовтяниці; остання спостерігається приблизно в 25% хворих. Незважаючи на відносно сприятливий плин, близько 50% усіх форм інфекції приводять до формування хронічного гепатиту, а близько 20% хронічних поразок печінки закінчуються цирозом і раком [Коротяев, 2000].

Вірус гепатиту С - це найбільш часта причина гострих вірусних гепатитів у людей похилого віку. Серед усіх вірусних гепатитів, що уражали людей похилого віку в США, Ізраїлі і Франції, гепатит у спостерігався в 74%, 72% і 60% випадків, відповідно. Головним фактором ризику зараження гепатитом С у людей похилого віку є проведені раніше гемотрансфузії.

Гепатит C - інфекція, викликана вірусом гепатиту С; у клінічно виражених випадках характеризується симптомами гострої поразки печінки, що найчастіше протікає з помірною інтоксикацією й у більшості випадків закінчується розвитком хронічного гепатиту С можливим переходом у цироз і первинний рак печінки. Раніше Гепатит С позначали терміном "Гепатит НІ-А-НІ-В [Sonnenblick, 1990].

Однієї з основних характеристик гепатиту С є часта хронізация. Вважається, що 60-70% гострого гепатиту С закінчуються розвитком хронічного гепатиту. Перехід гострого гепатиту С в хронічний відбувається поступово. Протягом декількох років наростає активність патологічного процесу і фіброзу печінки. Показники активності сироваткових трансаміназ у межах чи норми незначно підвищені. Показники синтетичної функції печінки (кількість загального білка й альбуміну) у межах норми, аж до розвитку цирозу печінки. До факторів, що визначають розвиток хронічного гепатиту, може бути віднесений вік захворілого гострим гепатитом С [Львов, 1997].

Для хронічного гепатиту С характерно наявність у печінці лімфоїдних інфільтратів; існування пацієнтів із ВГС-віреміей, але з нормальними показниками сироваткових трансаміназ, які реєструються тривалий час. Крім цього, висловлюється припущення, що в поразці печінки може відігравати роль підвищений рівень відкладення заліза в клітках печінки [Шахгильдян, 1999].

Патоморфологічно гепатит С характеризується загальними проявами запалення і некрозу. Разом з тим, на відміну від гепатиту В чи А, а також гепатитів невірусної етіології, для гепатиту С, характерні такі гістологічні ознаки як: наявність у портальних трактах щільних лімфоцитарних агрегатів і фолікулів; интраваскулярні синусоїдальні інфільтрати чи лімфоцитів гиперплазірованних Купфферовскіх клітин при відсутності вираженого некрозу гепатоцитов у безпосереднім оточенні; змінений епітелій жовчних проток; жирова дистрофія. Разом з тим, необхідно враховувати, що спектр ушкодження печіночних клітин при гепатиті С може бути надзвичайно широкий [Кузин, 1999].

У більшості хворих хронічним гепатитом С в плин тривалого періоду часу захворювання має безсимптомний перебіг. У 55-60% випадках реєструються печіночні прояви захворювання. До них відносять: незначне збільшення печінки, підвищення активності сироваткових трансаміназ (у 2-3 рази), що змінюються періодами їхньої нормалізації. У період клінічно виражених симптомів захворювання хворий відзначає стомлюваність, млявість, нездужання, зниження працездатності, поганий сон, почуття ваги в правому підребер'ї. У 40-45% випадків реєструють внепечіночну прояву захворювання. Вважають доведеним, що змішана кріоглобулінемия асоційовано з хронічним гепатитом С. Вона реєструється в 42-96% випадків, а в 10-42% має клінічні прояви: слабість, артралгія пурпуру, синдром Рейно, артеріальна гіпертонія, поразка бруньок. До складу кріопреципітата можуть входити РНК ВГС, антитіла до білок кодованих структурною і неструктурною частиною геному ВГС. У якості інших внепечіночних проявів хронічної ВГС-инфекции розглядають: ендокринні (гіпертиреоз, гипотиреоз, тиреоидит Хашимото); гематологічні (ідеопатична тромбоцитопенія, неходжкінская В-лимфома, апластична анемія та ін.); поразка слинних залоз і око (лімфоцитарний сіалоаденит, виразки роговиці, увеіт); шкірні (пізня шкірна Порфирія, червоний плоский лишай, вузлувата еритема та ін.); нейромишечні і суглобні (міопатичний синдром, синдром Гійена-Барре й ін.); ниркові (гломерулонефрит); автоімунні (вузликовий періартерііт). У більшості випадків внепечінкові прояви реєструються в пацієнтів, схильних до аутоімунних реакцій. В даний час також прийнято вважати інфікування вірусом гепатиту С причиною розвитку гепатоклітиної карциноми [Львов, 1997].

Рідким ускладненням гострого гепатиту С є фульмінантний гепатит при ретроспективних дослідженнях знайшли, що в хворих фульмінантним гепатитом у вік вище 50 років є незалежним прогностичним фактором [Hoofnagle, 1995].

Вірусний Гепатит С часто приводить до хронічного захворювання печінки, і принаймні в 50% хворих розвивається хронічний гепатит. У тих, у кого виникає хронічний гепатит, у 20 - 60% (дані залежать від тривалості спостереження) розвивається цироз печінки [Покровский, 1993].

У хворих хронічним гепатитом С похилого віку титр РНК HCV значно вище такого в молодих пацієнтів. Вірусом гепатиту С часто заражаються в старшому віці, тому в багатьох літніх людей спостерігається активна реплікація вірусу, при тім що цироз печінки ще не встигає розвитися. Для порівняння: вірусом гепатиту В часто заражаються в дитинстві і юності, тому в людей похилого віку не спостерігається активної реплікації вірусу, а цироз до цього часу вже розвивається. Знижена здатність імунної системи літніх справитися з вірусом гепатиту С пояснює більш високу в порівнянні з молодими хворими віремію. Іншим можливим поясненням може служити той факт, що люди похилого віку, як правило, уражаються ВГС типу 1Б, а в заражених вірусом такого типу спостерігається підвищений, у порівнянні з іншими типами вірусу, рівень РНК ВГС у сироватці. Ще одне можливе пояснення полягає в тім, що в обстежуваних хворих вірусним гепатитом С похилого віку виявляється більш важке в порівнянні з молодими захворювання печінки. А титр РНК ВГС збільшується з вагою хвороби печінки [Кузин С.Н., 1999].

1.5 Лабораторна діагностика

При постановці діагнозу "гепатит С" необхідно враховувати наступні найбільш важливі фактори:

показники активності печінкових ферментів;

наявність чи відсутність маркерів інфікування вірусом гепатиту С (ВГС) і іншими гепатотропними вірусами;

дані епідеміологічного анамнезу;

результати клінічного обстежання пацієнта.

Тільки комплексний облік даних факторів дозволяє з високим ступенем надійності діагностувати це захворювання (Laverdant, 1989).

Це дає можливість:

виявити осіб з наявністю ВГС для зниження рівня посттрансфузіонного гепатиту С;

постановка діагнозу і розмежування гострого і хронічного гепатиту С;

прогноз захворювання;

призначення, оцінка і прогноз ефективності проведеної терапії;

вивчення широти поширення ВГС у популяції і різних групах населення.

Основою лабораторної діагностики гепатиту С є знання про ВГС, його реплікації, інформація про динамік появи і зникнення маркерів інфікування, а також сучасні імунохімічні і молекулярно-біологічні методи детекції антигенів, антитіл і нуклеїнових кислот. (Yuasa, 1991)

ВИЗНАЧЕННЯ АНТИ-ВГС. У 1989 році група дослідників фірми "Chіron Corporatіon" під керівництвом Q-L.Choo здійснила клонування РНК ВГС і одержала імунореактивні олігопептиди, що вступають у реакцію з антитілами, що циркулюють у крові хворих хронічним гепатитом "ні А, ні В". Ці олігопептиди стали основою діагностичних препаратів для виявлення антитіл до ВГС (Лакина, 2000)

КОНФОРМАЦІЙНІ ТЕСТИ. Для розмежування ложнопозитивних зразків і зразків, дійсно утримуючі антитіла до ВГС, розроблені додаткові (Supplemental) тести. Найбільше часто в цих тестах використовується принцип імуноблота, коли на нітроцеллюлозной мембрані адсорбуються у виді окремих смуг антигени, кодовані різними зонами РНК ВГС. Анти-ВГС взаємодіють з адсорбованими антигенами за допомогою мічених ферментом антитіл проти Іg людини з наступної їх детекціею за допомогою субстратного комплексу (Prince, 1996).

ВИЗНАЧЕННЯ Іg АНТИ- ВГС. В даний час створені і промислово випускаються діагностичні набори для виявлення Іg анти-ВГС На етапі конструювання діагностичних наборів були створені набори для ИФА, основою яких були пептиди, кодовані різними регіонами РНК ВГС . Вибір був зупинений на пептиді, кодованому Core регіоном РНК ВГС і виявленні антитіл до нього класу Іg (Исаева, 2001)

ВИЗНАЧЕННЯ АНТИГЕНІВ ВГС. Можливість визначення антигенів ВГС привертала увагу дослідників відразу ж після відкриття вірусу. Принципова можливість їхнього тестування була продемонстрована К. Krawczynskі зі співавторами, що імуногістохімічно знайшли в печіночній тканині антигени ВГС, довівши специфічність імунофлюоресцентного випромінювання. Застосування поли- і моноклональних антитіл до різних антигенів ВГС установило наявність ВГС core Ag, антигенів, кодованих NS3 і NS4 зонами РНК ВГС, у ядрі і цитоплазмі гепатоцитів, у 60-90% хворих хронічним ВГС.Однак подальші дослідження продемонстрували, що антигени ВГС удається знайти менш чим у 5% печіночних клітин (Букринская, 1996).

Установлені:

можливість визначення Core Ag ВГС у сироватці та плазмі крові;

специфічність виявлення Core Ag ВГС;

наявність осіб з циркулюючим антигеном у крові серонегативних по анти-ВГС;

часте (90,3%) виявлення Core Ag ВГС у сироватках крові з наявністю анти-ВГС і РНК ВГС;

пряма кореляція між концентрацією РНК ВГС і виявленням Core Ag ВГС;

Визначено, що Core Ag ВГС удається виявляти в 83% випадків (n=24) наступного дня після першого виявлення РНК ВГС і задовго (у середньому 26 днів) до появи анти-ВГС.

МЕТОДИ ВИЯВЛЕННЯ РНК ВГС. Сучасний етап лабораторної діагностики гепатиту С можна охарактеризувати як етап початку широкого застосування молекулярно - біологічних методів виявлення РНК ВГС. Переважна більшість методів виявлення нуклеїнових кислот було апробовано для виявлення РНК ВГС. Принципам конструювання діагностичних препаратів і їхньому застосуванню для детекції вірусних ДНК чи РНК присвячене значна кількість літературних оглядів, опублікованих як у вітчизняних, так і закордонних виданнях. Усі ці методи можна розділити на двох груп, в основі яких лежить застосування принципів гібридизації без ампліфікації обраної ділянки нуклеїнової кислоти та з їх ампліфікацією, що дозволяє значно підвищити здатність методу.

МЕТОД ГІБРИДИЗАЦІЇ заснований на з'єднанні мічених гібрідізаціонних зондів (генноінженерні чи синтетичні молекулярні структури, що містять у собі нуклеотидні послідовності, комплементарні обраним ділянкам РНК). Облік результатів здійснюють по інтенсивності сигналу, що надходить від мітки в складі комплексу, що утворився.

При гепатиті С цей метод виявлення РНК ВГС насамперед знайшов застосування для її ідентифікації безпосередньо в гепатоцитах, у тестах що позначаються - іn sіtu hіbіdіzatіon. Можливість безпосередньої детекції РНК ВГС у тканині дозволила знайти її в мононуклеарних клітках крові, клітках слинних залоз і інших тканин організму хворого гепатитом С (Моминалиев, 2000).

МЕТОД ГІБРІДІЗАЦІЇ, ЯКИЙ ЗАСТОСОВУВАЛИ ДЛЯ ДЕТЕКЦІЇ РНК ВГС, дозволяє продемонструвати наявність негативних (реплікативних) ланцюгів РНК ВГС, що свідчить про активну реплікацію вірусу.

Метод полімеразної ланцюгової реакції - у даний час найбільш широко застосовуваний методичний прийом, що лежить в основі практично всіх молекулярно-біологічних методів детекції РНК ВГС. Причому, визначення РНК ВГС можливе як у якісному, так і кількісному варіанті, що особливо важливо для призначення, моніторингу й оцінки ефективності застосовуваної терапії.

Як основні варіанти методу можна виділити:

полімеразну ланцюгову реакцію (ПЛР);

лігазну ланцюгову реакцію;

NASBA;

ТМА (Реакція транскрипційно-опосередкованої ампліфікації, Transcrіptіon-medіated amplіfіcatіon). У його основі лежить багатоцикловий процес, що нагадує природну реплікацію нуклеїнової кислоти, причому кожен цикл складається з послідовних етапів.

З досліджуваного матеріалу (сироватка, плазма крові, печінковий біоптат) виділяється РНК ВГС. З огляду на те, що нуклеїнова кислота ВГС представлена РНК, а для ампліфікації необхідна молекула кДНК, за допомогою ферменту - зворотної транскриптази, відбувається утворення одноланцюгових молекул кДНК ВГС. На наступному етапі до визначеної ділянки кожного з ланцюгів кДНК ВГС приєднуються т. з. праймери - короткі олігонуклеотиди, комплементарні відомим нуклеотидним послідовностям. Порівняння первинної структури 5'UTR області геному різних ізолятів ВГС виявило їхню незначну мінливість (між генотипами, гомологія нуклеотидів - 92-98%, а у середині генотипу 98-99%).

Далі, за допомогою ферменту ДНК-залежної ДНК полімерази відбувається синтез нових ділянок ДНК. В даний час як джерело цього ферменту найчастіше використовують бактерії Thermophіlus termus (Tth-полімераза) чи Thermophіlus aquatіcus (Taq-полімераза). Володіючи термостабільністю в присутності іонів марганцю і магнію, цей фермент може бути одночасно використаний для синтезу комплементарних одноланцюгових молекул кДНК ВГС і ампліфікації обраних ділянок кДНК. На завершальному етапі одного циклу реакції, за допомогою ДНК полімерази відбувається синтез нових ланцюгів комплементарних кДНК ВГС. Багаторазове повторення циклів реакції призводить до накопичення фрагментів кДНК ВГС, що можливо зареєструвати за допомогою електрофорезу в поліакриламідному гелі з наступною візуальною детекцією чи із застосуванням гібридизації з олігонуклеотидними зондами, що збільшує чутливість і специфічність застосовуваних діагностичних препаратів. Застосування праймерів, мічених ферментами, дозволяє проводити облік результатів ПЛР за допомогою імуноферментного аналізу.

ЛІГАЗНА ЛАНЦЮГОВА РЕАКЦІЯ виявлення РНК BГ.(LCR).

Метод заснований на здатності ферменту "ДНК- залежної ДНК-лігази" зшивати (лігувати) розриви фосфодіефірного зв'язку в ДНК у присутності АТФ і іонів Mg2+. Так само як і при проведенні "класичної" ПЛР для виявлення РНК ВГС, перший етап LCR - зворотна транскрипція з одержанням кДНК ВГС. Далі ДНК-лігаза здійснює зв'язування двох пар праймерів (комплементарних 5' некодованій зоні РНК ВГС), що надалі ампліфікуються. Детекція продуктів ампліфікації LCR здійснюється за допомогою обліку реакції антитіло-антиген-антитіло. Кожний із двох праймерів мітиться різним гаптеном. Перший з них захоплюється антитілами, адсорбованими на мікрочастинках. Після процедури промивання за допомогою другої пари антитіл, мічених флуоресцентною міткою, відбувається їхня виборча взаємодія з гаптеном в ампліфікаційному продукті з наступним проведенням субстратної реакції й обліком на флюориметрі.

Чутливість цього методу складає близько 200 копій РНК ВГС у мл, що дозволяє його використовувати для рішення різних клініко-діагностичних задач.

NUCLEІC ACІDS SEAQUENCENCE AMPLІFІCATІON - NASBA - метод детекції РНК ВГС заснований на одночасній дії трьох ферментів: зворотної транскриптази вірусу мієлобластоми птахів, РНК-ази Н и РНК-полимерази Т7. На відміну від RT PCR на першому етапі не проводиться зворотна транскрипція РНК ВГС. За допомогою використаних ферментів вдається одержати більш 109 копій ділянки кДНК ВГС протягом 90 хвилин. Можливість проведення реакції при невеликих температурах (+41 С) значно спрощує роботу і дозволяє відмовитися від устаткування, що забезпечує циклічні зміни високих температур. Облік результатів реакції здійснюється за допомогою електрохемілюмінісценції. Незважаючи на те, що по своїй чутливості NASBA близька до RT PCR, метод широко не використовується для виявлення РНК ВГС. В даний час проводиться розробка варіанту методу, що сполучить принципи проведення NASBA і "Real-tіme RT PCR".

КІЛЬКІСНЕ ВИЯВЛЕННЯ РНК ВГС. Для оцінки концентрації РНК ВГС застосовують кількісний варіант ПЛР. Спочатку концентрацію РНК ВГС намагалися охарактеризувати порядковими величинами, наприклад "+","++" і т. д., що візуально відбивають інтенсивність смуг, отриманих при електрофорезі продуктів ампліфікації, чи ж методом кінцевих розведень, по наявності позитивного результату в кінцевій крапці титрування. Труднощі стандартизації всіх етапів ПЛР не дозволяють об'єктивно оцінити концентрацію РНК ВГС, що приводить до істотних помилок трактування отриманих результатів [Масалова, 2000].

В даний час результати дослідження виражають у кількісних одиницях: кількість копій РНК ВГС, що містяться в 1 мл, в абсолютному чи логарифмічному вираженні (log 10). Виходячи з того, що концентрація виявленої РНК ВГС відбиває кількість вірусних часток, даний показник позначають як "вірусний еквівалент (eq)", з додаванням приставки k (кілограм, тисяча) чи М (мільйон). Ще одним способом вираження кількості вірусних часток є їхні вагові еквіваленти. Комітет експертів ВООЗ по біологічній стандартизації виготовив "міжнародний стандартний зразок", що містить РНК ВГС (ліофільно висушена сироватка крові, що містить РНК ВГС 1-го генотипу), концентрація якої виражена в міжнародних одиницях (ІU/m).

Спеціальні коефіцієнти дозволяють перераховувати отримані показники концентрації в міжнародні одиниці.

Для визначення концентрації РНК ВГС застосовують практично усі варіанти ПЛР. При цьому до діагностичних препаратів пред'являється ряд специфічних вимог, найважливішим з який є лінійність результатів, тобто збільшення сигналу реєстрованої реакції при збільшенні концентрації РНК ВГС у досліджуваному зразку. Застосування внутрішніх стандартів з різним вмістом РНК ВГС дозволяє уникнути багатьох методичних помилок, що можуть відбитися на кінцевому результаті реакції.

ПЛР У РЕАЛЬНОМУ ЧАСІ ("Real-tіme RT PCR") - один з найбільш перспективних варіантів кількісного методу виявлення РНК ВГС. Принцип методу полягає в здатності гідролізувати послідовності кДНК у напрямку 5'-і-і 3'. У реакції застосовується спеціальний зонд, мічений двома флуоресцентними барвниками, що мають близькі максимуми поглинання і флюоресценції. При наявності продуктів ампліфікації Tag-полімераза розщеплює зонд, що приводить до запобігання переносу енергії від однієї молекули барвника до інший, і тим самим запобігає вихіду кванта світла. Спеціальний прилад здійснює облік реакції і математичне моделювання кінетики флюоресценції на кожнім етапі реакції, що дозволяє одержати інформацію про вихідну концентрацію РНК ВГС.

Відмінною рисою "ПЛР у реальному часі" вважають можливість одержувати інформацію про наявність РНК ВГС безпосередньо в процесі реакції, що дозволяє зменшити час аналізу в сполученні з високою чутливістю і лінійністю одержуваних результатів. [Bukh, 2000].

МЕТОДИ ГЕНОТИПУВАННЯ РНК ВГС. Визначення приналежності ВГС до визначеного генотипу і субтипу знайшло своє застосування для рішення не тільки чисто наукових, але й практичних питань. Наприклад: пошук джерела інфекції під час спалахів гепатиту С чи прогнозування ефективності застосовуваної терапії.

"Золотий стандарт" генотипування ВГС - безпосереднє визначення первинної структури РНК ВГС із його наступним філіпченковим аналізом, що дозволяє чітко охарактеризувати даний ізолят вірусу [Kondo, 1993].

Незважаючи на точність одержуваного результату, метод безпосереднього секвенирування не використовується в практичній охороні здоров'я через технічні складності проведення дослідження і високої вартості робіт. Разом з тим наявність інформації про первинну структуру РНК ВГС є референтним методом генотипування, а наявність приладів для автоматичного секвенирування спрощує одержання результату. В даний час у більшості випадків для генотипування РНК ВГС застосовуються методи, засновані на використанні ПЛР із типоспецифічними праймерами. Гібридизація ампліфікованих продуктів із адсорбованими геноспецифічними зондами (з 5'-нетрансльованої зони РНК ВГС), адсорбованими на нітроцелюлозній мембрані.

Методичний арсенал визначення генотипів ВГС не обмежується перерахованими вище способами і містить у собі різноманітні методи:

генотипування на основі аналізу профілів рестрикції ампліфікованих продуктів. Продукти ампліфікації фрагментів РНК ВГС (NS5 область РНК ВГС) розщеплюються рестриктазами. Фрагменти, що утворилися, розрізняються по довжині в залежності від наявних усередині них сайтів рестрикції, по яких йде розщеплення. Результати електрофорезу і їхнє порівняння дозволяють ідентифікувати генотип ВГС у досліджуваному зразку. Порівняння результатів генотипування з даними секвенирування продемонструвало високий рівень збігу результатів - 95% [Ильина, 2000].

Генотипування на основі методу оцінки конформаційного поліморфізму одноланцюгових фрагментів ДНК. Як об'єкт дослідження обраний 5'-нетрансльований регіон РНК ВГС, що має мінімальний набір нуклеотидних варіацій, що відрізняють генотипи друг від друга. Цей факт визначає можливість застосувати загальні праймери при генотипуванні.

СЕРОТИПУВАННЯ Анти-ВГС стало можливим завдяки дослідженням P. Sіmmonds зі співавторами, який встановив наявність антитіл, спрямованих до генотипспецифічних епітопів, інформація про які кодована NS4 зоною РНК ВГС.

Серотипування анти- ВГС у порівнянні з генотипуванням РНК ВГС має такі переваги, як простота проведення реакції і більш низька вартість. Разом з тим, цей метод ні в якому разі не може замінити генотипування. Результати серотипування анти-ВГС свідчать про типову приналежність анти-ВГС при поточній чи раніше перенесеній інфекції. У деяких випадках (найбільше часто в хворих гемофілією) реєструється одночасне виявлення анти-ВГС різних підтипів, що може свідчити про множинне інфікування різними субтипами і генотипами ВГС. Крім того, у пацієнтів з гепатитом С на фоні вираженого імунодефіцитного стану РНК можуть бути єдиним маркером, що унеможливлює проведення серотипування [Мукомолов, 1999].

1.6 Лікування

До недавніх часів кращим засобом проти ВГС вважався інтерферон, ці ліки, що інгибують реплікацію вірусу. Медикаментозний інтерферон, що використовується для лікування гепатитів включає: ІNF?-2b (інтрон-а), ІNF?-2a (роферон-а) і ІNF alfacon-1 (інферген). Але інтерферони працюють тільки в 20% випадків [Саринсон, 1998]. Зараз ін'єкції інтерферону комбінують з пероральним введенням рибавірина (Виразол) - антивірусний агент широкого спектра дії. Лікування звичайно триває від 6 міс. до року, і є успішним приблизно лише для 40% хворих [Goodson, 1992].

Недавні дослідження показали, що інші ліки, пролонгований інтерферон, є в 2 рази більш ефективним, ніж звичайний інтерферон. У січні 2001 року Харчове і Лікарське Керування запропонували використання пролонгованого інтерферону - ?-2В - для лікування гепатиту С [Hoofnagle, 2001].

Відомо, що функції інтерферону (ІFN) в організмі різноманітні, однак найбільш важливої з них є антивірусна, яка здійснюється шляхом стимуляції вироблення антивірусних білків у інтактних клітинах, що забезпечує в них розвиток т. н. антивірусного стану [Григорян, 1990]. Унікальні властивості ІFN з'явилися причиною активної розробки різних технологій його виробництва і клінічного застосування. Незважаючи на успіхи ІFN-терапии і розширення спектра його застосування, існує багато проблем, зв'язаних з цим видом лікування. Частота порушень ІFN статусу, розширення представлень про спектр захворювань, при яких необхідна терапія препаратами ІFN, висока вартість, можливість виникнення ряду ускладнень від їхнього застосування, стимулювали дослідження з вивчення індукторів ІFN.

Побічний ефект від застосування лікарської терапії інтерфероном містить у собі симптоми, схожі з грипом і тимчасове зниження вмісту гемоглобіну в крові (анемія), лейкоцитів і тромбоцитів у крові. Хронічні побічні ефекти - які складають приблизно половину при прийнятому лікуванні інтерфероном-рибавірином - включають сильну втому, занепокоєння, дратівливість і депресію. Невеликий відсоток людей випробує психологічні чи суїцидальні настрої. Вчені розробляють використання інгібіторів протеаз для лікування людей із ВГС. Ці ж медикаменти використовуються для деяких людей, хворих СНІДом. У майбутньому можливе лікування ВГС за допомогою генної терапії. Найкраще лікування для людей на кінцевій стадії печінкової хвороби (печінкова недостатність) є пересадження печінки [Подимова, 1998].

Встановлено, що в ряді випадків застосування індукторів ІFN має переваги перед використанням екзогенних ІFN. Так, індуктори ІFN стимулюють вироблення власних ІFN, що не володіють антигенностью. При цьому їхній синтез знаходиться під контролем ІЛ і білків-репресорів і не досягає рівня, здатного зробити дію, що ушкоджує, організм. Індуктори ІFN розрізняються по хімічній природі, по тому на які клітки-продуценти вони діють, синтез якого виду ІFN вони викликають, а також за часом досягнення максимальної концентрації ІFN у сироватці і тривалості дії препарату [Григорян, 1990].

Аміксин відноситься до класу флуоренів і є низькомолекулярним індуктором ендогенного інтерферону.

Амікcин поліпшує перебіг запального процесу, активує макрофаги, збільшує кількість протизапальних цитокінів, підвищує секрецію лізосомних ферментів, інгибує ферменти, субстратом яких служить ДНК: ДНК-полімераза, топоізомераза, зворотня транскриптаза. Про здатність аміксина брати участь у моделюванні імунної системи можна судити за результатами, що свідчать про активацію NK [Григорян, 1990].

У зв'язку з недостатністю інтерфероногенеза, що спостерігається в хворих вірусними гепатитами [Дидковский, 2000], у комплексному лікуванні гострих і хронічних вірусних гепатитів перспективним є застосування індукторів синтезу інтерферону [Івахів, 2001, Малий 2001]. Одним з індукторів синтезу інтерферону є циклоферон - низькомолекулярний індуктор інтерферону, що відноситься до класу акридонів.

Циклоферон є низькомолекулярним індуктором інтерферону, що визначає широкий спектр його біологічної активності (противірусної, імуномодулюючої, протизапальної, антипроліферативної, протипухлинної та ін.). Препарат індукує синтез раннього a-типу-інтерферону. У тканинах і органах, що містять лімфоїдні елементи, циклоферон індукує високий рівень інтерферону, що зберігається протягом 72 годин. Основними клітинами-продуцентами інтерферону після введення циклоферону є макрофаги, Т- і В-лімфоцити. У залежності від вихідного стану має місце активація тієї чи іншої ланки імунітету. Препарат індукує високі титри альфа-інтерферону в органах і тканинах, що містять лімфоїдні елементи (селезінка, печінка, легені), активує стовбурні клітини кісткового мозку, стимулюючи утворення гранулоцитів. Циклоферон активує Т-лімфоцити і природні кілерні клітини, нормалізує баланс між субпопуляціями Т-хелперів і Т-супресорів [Руденко, 2000, Романцев, 2000].

Циклоферон ефективний у відношенні вірусів кліщового енцефаліту, грипу, гепатиту, герпесу, цитомегаловірусу, вірусу імунодефіциту людини, вірусу папіломи й інших вірусів [Шостакович-Корецкая, 2000].

Імуномодулюючий ефект циклоферона виражається в корекції імунного статусу організму при імунодефіцитних станах різного походження й аутоімунних захворюваннях.

Застосування циклоферона при лікуванні гострого і хронічного вірусного гепатиту С сприяло більш швидкому поліпшенню самопочуття хворих, відновленню апетиту, зникненню жовтяниці. Клінічному поліпшенню відповідала позитивна динаміка біохімічних і імунологічних змін [Ершов , 1999, Солдогуб, 1999].

Аналізуючи данні наведені в огляді літератури слід зазначити, що на даний час використання імуномоделюючих препаратів, таких як аміксин і циклоферон є найбільш вдалим для лікування ВГС. Тому вивчення їх дії при лікуванні гепатиту С є доцільним.

2. Матеріали і методи

Нами проводилося дослідження лікувальної ефективності застосування імуномоделюючих препаратів у хворих на хронічний гепатит С. Дані отримували при вивченні клітинного, гуморального імунітету та біохімічних тестів у хворих, які знаходилися на стаціонарному лікуванні у НІІ очних хвороб і тканинної терапії ім.. В.П. Філатова.

Матеріалом для дослідження була кров хворих на гепатит С.

2.1 Визначення показників клітинного імунітету

Визначення вмісту лімфоцитів і лейкоцитів у крові

Зважили пробу, отриману в результаті з'єднання 0,008 мл крові і 0,1 мл 10 % розчину оцтової кислоти в процесі забору крові, ретельно перемішали наконечником піпетки і заповнили нею камеру Горяєва. Підрахували кількість лімфоцитів і лейкоцитів (клітки крові чітко розрізнялися за формою ядра (у 20 великих квадрантах із застосуванням об'єктива х40).

Абсолютний вміст кліток а 1 мкл крові визначали по формулах:

Лей =К*а /1000

де Лей -- вміст лейкоцитів у крові, тис/мкл

а -- кількість лейкоцитів, у 20 великих квадрантах камери

Горяева.

Лі = К*б /1000

де Лі -- вміст лімфоцитів у крові, тис/мкл

б -- кількість лімфоцитів, у 20 великих квадрантах камери Горяєва.

К -- коефіциєнт перерахунку: тут К= 169.

Визначення комплексу показників розеткоутворення і фагоцитозу

Приготування суспензії лейкоцитів

Лейкоцити, що містяться в суспензії, отриманої в результаті лізису еритроцитів у процесі забору крові, осадили центрифугуванням планшета при 200 д протягом 5 хв., надосадкову рідину злили із планшета. До отриманого осаду лейкоцитів долили 0,2 мл середовища 199, і одержали суспензію лейкоцитів, яку використали для постановки комплексу тестів розеткоутворення і фагоцитозу.

Постановка реакції розеткоутворення і фагоцитозу

Реакції розеткоутворення і фагоцитозу ставили у 96-лункових планшетах для імунологічних реакцій однократного застосування, що мали лунки обсягом 0,2 мл із круглим дном. Для герметизації в кришку планшета вкладали поліетиленову прокладку, яка вирізувалася з упакування планшета. Кришку закріплювали на планшеті за допомогою резинки.

Е- розеткоутворення (Т-лімфоцити)

У лунку планшета заливали 0,05 мл отриманої суспензії лейкоцитів. Доливали 0,05 мл 0,1 % суспензії еритроцитів барана. Центрифугували при 200 д протягом 5 хв., потім інкубували при +4°С протягом 30 хв.

М- розеткоутворення (В-лімфоцити)

Тест М- розеткоутворення ставили так само, як тест Е- розеткоутворення, але замість суспензії еритроцитів барана доливали 0,05 мл 0,1 % суспензії еритроцитів миші.

Д-фагоцитоз нейтрофілів

Тест Д-фагоцитоза нейтрофілів ставили також, як тест Е- розеткоутворення, але замість суспензії еритроцитів барана доливали 0,06 мл 0,1 % суспензії кліток пекараських дріжджів, вбитих нагріванням.

Е-розеткоутворення після інкубації кліток з теофіліном

(теофілін-резистентні Е- розеткоутворюючі лімфоцити - субпопуляція, збагачена клітками, що володіють хелперною активністю)

У лунку планшета заливали 0,05 мл отриманої суспензії кліток, доливали 0,05 мл 0,01 М розчину теофіліну в середовищі 199. Інкубували при 37 °С протягом 1 години. Далі доливали 0,05 мл 0,1 % суспензії еритроцитів барана і ставили реакцію Е- розеткоутворення.

Фіксація і приготування мазків

Після інкубації осаду при + 4 +10°С у лунки обережно, так щоб не зашкодити осад, додавали 0,02 мл фіксатора, приготовленого на основі глутарового альдегіду. Витримували при кімнатній температурі протягом 5 хвилин. Після цього надосадкову рідину видаляли одночасно з усіх лунок планшета швидким інтенсивним струшуванням. Потім у кожну лунку негайно додавали по 0,05 мл дистильованої води. Осад ресуспендировали у процесі готування мазків. Мазки готували на ацетатцелюлозній плівці у виді краплі, що займає квадрат розміром 9X9 мм. На поверхні прямокутної плівки розміром 90X130 мм міститься 96 мазків.

Можна використовувати флюорографічну плівку шириною 7 см, і мазки займали квадрати 8x8.

Приготування препаратів

Висушені мазки фіксували у метанолі протягом 10 хвилин (чи абсолютному етанолі протягом 20 хвилин). Потім поміщали у розчин метилового зеленого - піроніна. Через 30 хв. мазки виймали, змивали водою, промокали фільтрувальним папіром і сушать у розправленому стані між аркушами фільтрувального папера під вантажем. На висушену плівку наносять тонким шаром розчин канадського бальзаму в ксилолі і накривали ацетатцелюлозною плівкою такого ж розміру, яку щільно притискали. Отримана плівка з 96 препаратами готова до мікроскопії. При відсутності метилового зеленого - піроніна мазки можна фарбувати азуреозином при РН 5-6 протягом 10 хв.

Підрахунок кількості розеткоутворюючих і фагоцитуючих кліток

У препаратах перераховується число розеткоутворюючих лімфоцитів на 50 лімфоцитів і кількість фагоцитуючих нейтрофілів на 50 нейтрофілів із застосуванням об'єктива Х40, при правильному настроюванні світла в мікроскопі по Келлеру. Можна додатково прораховувати в цих препаратах кількість розеткоутворюючих нейтрофілів. За розеткоутворюючу клітку вважали таку клітку, до якої прикріпилося 3 і більша кількість еритроцитів. За фагоцитуючу вважати клітку-нейтрофіл, що захопив 1 чи більшу кількість дріжджових кліток. Обчислювали % розеткоутворюючих і фагоцитуючих кліток.

Визначення абсолютного вмісту розеткоутворюючих кліток у 1 мкл крові

Е-РУЛ тис/мкл = Лі тис/мкл * Е - РУЛ / 100%

М-РУЛ тис/мкл = Лі тис/мкл * М - РУЛ / 100%

де, Е-РУЛ - Е- розеткоутворюючі лімфоцити, відповідно тис/мкл, %;

М-РУЛ - М- розеткоутворюючі лімфоцити, відповідно тис/мкс, %;

Лі - вміст лімфоцитів у крові тис/мкл.

Визначення кількості теофілін-чутливих Е-РУЛ

ЕТФ-Ч-РУЛ = Е РУЛ - ЕТФ-Р-РУЛ

де, Е-РУЛ - кількість розеткоутворюючих лімфоцитів (спонтанних), %;

ЕТФ-Р-РУЛ - кількість теофілін-резистентних Е-РУЛ;

ЕТФ-Ч-РУЛ - кількість теофілін-чутливих Е-РУЛ, %.

Постановка комплексу тестів розеткоутворення і фагоцитозу

Лейкоцити, отримані в процесі забору крові, осаджували центрифугуванням планшетів. До отриманого осаду лейкоцитів доливали середовище 199, після чого суспензію кліток вносять у лунки чотирьох планшетів за допомогою крапельниць. Після цього в планшети вносять відповідні реактиви, і після постановки реакції готували мазки. Усі реактиви вносять у лунки планшетів за допомогою крапельниць. Мазки залишали до повного висихання. Висушені мазки фіксували у метанолі.

Визначення цитотоксичної активності НК-клітин

Отримували клітини мішеней.

Відмивали у среді і розводили до концентрації 106, 5*105, 105 кл/мл для співвідношення клітина-ефектор - клітина-мішень = 1:10, 1:50, 1:100 відповідно.

Постановка реакції:

Активність НК (цитотоксичність) вимірюють мікроскопічним методом. У пластикові камери з плоским дном, вносять 0,1 мл досліджуємих клітин, по 0,1 мл клітин мишей і культивують при 37оС у вологій камері з 5% СО2 протягом 4-16 годин. В контрольну лунку вносили клітини-мішені і використовували живільне середовище.

Оцінка реакції:

Після культивування підраховували кількість непошкоджених клітин у камері Горєва.

Індекс цитотоксичності визначали по формулі:

ІЦ=100%*а-в/а

Де а - кількість еритроцитів у середовищі без ефекторів,

в - кількість еритроцитів у середовищі з ефекторами

Приготування 10-кратного розчину Хенкса

На 1 л розчину беруть NaCl 80,0 г

КС1 4,0 г

MgS04*7H20 2,0 г

CaCI*6H2O 2,75 г

КН2Р04 0, 6 г

Na2HPO4*2H20 1, 53 г

Глюкоза 10, 0 г.

Розливали у невеликі щільно закриті ємності і зберігали у замороженому стані.

Приготування суспензії еритроцитів барана та мишей

Одержували від барана, перед постановкою реакції еритроцити відмивали у фізрозчині, осаджуючи щораз центрифугуванням при 400 g протягом 10 хв. доти, поки надосадкова рідина не стане безбарвною (звичайно 2 - 3 рази). Для готування суспензії 0,01 мл відмитого залишку еритроцитів змішували з 10 мл середовища 199. Суспензію зберігали при температурі + 4 +10°С не більш трьох годин, перед використанням збовтували.

Кров миші безпородної беруть у пробірку з гепарином, Відмивали і готували так само, як і суспензію еритроцитів барана. Збереження таке ж, як суспензії барана.

Суспензія клітин пекарських дріжджів

Ліофілізовані чи свіжі пекарські дріжджі розводять у фізрозчині (співвідношення 1:5 ) і витримували у киплячій водяній лазні протягом 60 хвилин. Зберігали при температурі О- 4°С до 12 місяців. Перед постановкою реакції дріжджі відмивали розчином Хенкса в тім же режимі, що й еритроцити доти, поки рН надосадкової рідини не буде 7,2-7,4 (тобто поки розчин буде зберігати свій колір). Суспензію кліток дріжджів готували і використовували так само, як суспензію еритроцитів.

2.2 Визначення показників гуморального імунітету

Визначення вмісту імуноглобулінів

Імуноглобуліни класів А, М, G - визначали у плазмі крові методом радіальної імунодифузії в гелі в модифікації методу Манчіні.

Одержання плазми

Планшет-штатив, що містить пластмасові трубочки зі зразками крові, центрифугували при 200° 10 хвилин. Верхню частину трубочки, що містить плазму, зрізували і переносять в інший аналогічний штатив у тім же порядку. Отриману плазму можна тривало зберігати в замороженому стані. Перед постановкою реакції плазму разморажували і переносять у лунки планшета, де розводять фізіологічним розчином у 3 рази (співвідношення плазма - фізрозчин 1:2).

Готування пластин, покритих шаром агару

На кришку 96-лункового планшета, що лежить на нагрівальній підставці (температура 50 °С) у строго горизонтальному положенні, наливали 16 мл розчину агару, що містить моноспецифічну сироватку до імуноглобулінів визначеного класу. Після охолодження на кришці виходить рівний шар гелю. У цьому шарі пробійником вирізували лунки діаметром 2 мм відповідно до розміру лунок стандартного 96-ямкового планшета. Таким чином, на пластині одержували 96 лунок.

Розчин агару, що містить моноспецифічну сироватку, готували таким чином: у першу чергу готували розчин, що містить 1,2 % агару, 2 % поліетиленгліколя (м. в. 6000) і 0,01 % мертіолата, інше - фізіологічний розчин. Нагрівали його до 50 °С при перемішуванні, після чого доливали антісироватку, щоб кінцева концентрація її в розчині відповідала зазначеної на ампулі.

Постановка реакції

У лунки першого ряду пластини, покритої шаром гелю, вносять стандартну сироватку нерозведену й у розведеннях 1:2, 1:4, 1:8 у такій кількості, щоб вона заповнила лунку до рівня агару (орієнтовно 3-4 мкл). Лунки інших рядів заповнювали зразками випробуваної плазми в розведенні 1:2. Далі пластини інкубували при 37 °С у вологій камері для визначення рівня ІgG протягом 4-6 годин, ІgA - протягом 12-24 годин, ІgM - 24- 28 годин. Інкубацію припиняли тоді, коли розміри кілець преципітації стандартних сироваток будуть достатні для упевненого виміру діаметрів. Для створення вологої камери зручно використовувати герметично закритий поліетиленовий пакет, на дно якого кладуть відпрацьований 96-луночний планшет, лунки якого наповнені водою.

Облік результатів

По закінченні інкубації на пластинах заміряли діаметри кілець, преципітації за допомогою окуляра-мікрометра в лупі МБС-9 з підсвітом через увігнуте дзеркало, у центрі якого знаходиться чорне коло, чим створюється ефект "темного поля", що різко збільшує контрастність краю преципітату в агарі.

Побудова калібровочної кривої і визначення змісту імуноглобулінів

Вміст імуноглобулінів у випробуваній плазмі визначали каліброваною кривою, яку будували на напівлогарифмічному папері таким чином: по осі абсцис відкладали діаметри кілець стандартної сироватки. По осі ординат - відома кількість імуноглобулінів, що містяться у відповідному образі стандартної сироватки, помножене на 3. Отримані крапки з'єднували. Таким способом будували калібровані криві окремо для кожного класу імуноглобулінів. Якщо по кожному класу тестується одночасно велика кількість зразків плазми (реально до 960) на одночасно приготовлених пластинах агару, то за умови стандартного часу, що витримується чітко, інкубації всіх пластин для даного класу імуноглобулінів калібрована крива залишається незмінної для усіх видів пластин.

Для визначення рівня імуноглобулінів у випробуваній плазмі на осі абсцис, відкладається діаметр кільця преципітації даної плазми, відновлювали перпендикуляр до пересікання з калібровочною кривою, крапку перетинання проектували на осі ординат і відраховували вміст імуноглобулінів відповідного класу.

Визначення вмісту імуноглобулінів

Пластини, покриті шаром агару з моноспецифічною антисироваткою, готували для аналізу всіх 960 зразків плазми і зберігали у холодильнику при + 8°С в герметично закритому поліетиленовому пакеті зі зволоженням. У день доцільно ставити 480 зразків плазми. Прорахунок результатів проводять з використанням бінокулярної лупи Результати перераховували на каліброваній.