Гіпогомоцистеїнемічна дія нового вітамінно-мікроелементного комплексу

31

АКАДЕМІЯ МЕДИЧНИХ НАУК УКРАЇНИ

ДЕРЖАВНА УСТАНОВА

"ІНСТИТУТ ФАРМАКОЛОГІЇ ТА ТОКСИКОЛОГІЇ"

АРТЕМЧУК МИХАЙЛО АНДРІЙОВИЧ

УДК 591.2.001.5:615.03:577.16:612.014.463

ГІПОГОМОЦИСТЕЇНЕМІЧНА ДІЯ НОВОГО ВІТАМІННО-МІКРОЕЛЕМЕНТНОГО КОМПЛЕКСУ

(ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНЕ ДОСЛІДЖЕННЯ)

14.03.05 - фармакологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата медичних наук

Київ - 2008

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Вінницькому національному медичному університеті ім. М.І.Пирогова МОЗ України

Науковий керівник: доктор медичних наук, професор Луцюк Микола

Борисович, Вінницький національний медичний

університет ім. М.І.Пирогова, професор кафедри

загальної та біологічної хімії.

Офіційні опоненти: доктор медичних наук, професор

Французова Стелла Борисівна

Інститут фізіології ім. О.О.Богомольця НАН України, м. Київ, старший науковий співробітник відділу загальної та молекулярної патофізіології;

доктор медичних наук, професор

Посохова Катерина Андріївна

Тернопільський державний медичний університет ім. І.Я.Горбачевського МОЗ України, завідувач кафедри фармакології з курсом клінічної фармакології.

Захист відбудеться "18" червня 2008 р. о 15 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.550.01 в ДУ "Інститут фармакології та токсикології" АМН України (03057, Київ, вул. Ежена Потьє, 14).

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці ДУ "Інститут фармакології та токсикології" АМН України (03057, Київ, вул. Ежена Потьє, 14).

Автореферат розісланий "__" травня 2008 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради

Д 26.550.01

кандидат біологічних наукІ. В. Данова

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність проблеми. Підвищений рівень гомоцистеїну (ГЦ) в плазмі крові, тобто гіпергомоцистеїнемія (ГГЦ), є незалежним фактором ризику прискореного розвитку серцево-судинної патології, у тому числі при атеросклерозі [F.Yang et al., 2005], гіпертонії [І.І. Андрушко та співавт., 2003], цукровому діабеті [S.A.Schafer et al., 2006; O. Essais et al., 2006], псоріазі [B.Vanizor Kural et al., 2003], нирковій недостатності [Н.А.Мухин и соавт., 2002] та інших хворобах і станах. З ГГЦ пов'язують також деякі порушення діяльності ЦНС (депресія, шизофренія, хвороби Альцгеймера та Паркінсона), виникнення дефектів розвитку в онтогенезі, рак прямої кишки [О.О.Пентюк та співавт., 2003; J.Weingaertner et al., 2005; F.G. de Souza et al., 2006]. Негативний вплив ГГЦ на організм реалізується шляхом пригнічення процесів метилювання, хімічної модифікації білків [J.Selhub, 1995], стимуляції оксидативного стресу [K.Sydow et al., 2003; N.Tyagi et al., 2005] та тромбогенезу [P.Hainaut et al., 2002; D. Genser, 2003], впливу на експресію генів [Y.Hu, 2001] та інші процеси. Підтвердженням значної ролі ГГЦ у прогресуванні серцево-судинної патології є і те, що призначення гіпогомоцистеїнемічної терапії призводить не лише до зниження рівня ГЦ в плазмі крові, але і до позитивної динаміки з боку серцево-судинної системи та покращення функції ендотелію [К.П. Постовітенко, 2006; L.M.Title et al., 2000; G. Schnyder et al., 2002]. За даними Z.Ceperkovic (2006), зниження рівня ГЦ в крові на 3 ммоль/л зменшує частоту ішемічної хвороби серця на 16 %, тромбозів на 25 %, серцевих нападів - на 24 %.

Причиною ГГЦ можуть бути явна або прихована недостатність вітамінів В₆, В₉, В_12, порушення на генетичному рівні синтезу ферментів, що беруть участь в метаболізмі цих вітамінів, ниркова недостатність, діабет, псоріаз, інші захворювання, шкідливі звички та деякі лікарські препарати [F. De Bree et al., 2002].

Наведені дані свідчать, що боротьба з ГГЦ є актуальною медичною проблемою. В наш час для зниження рівня ГЦ в крові рекомендують такі заходи, як раціональне харчування, пропаганда здорового способу життя, а також застосування ліків, що мають гіпогомоцистеїнемічну дію (вітамінів В₆, В₉, В₁₂, рибофлавіну, холіну, креатин- та бетаїн-вмісних ліків та інших). Найчастіше використовують високі дози вітамінів В₆, В₉, та В₁₂ - кожного окремо або комплекси, в яких дози вказаних вітамінів значно перевищують фізіологічні, причому не було виявлено токсичну дію великих доз цих вітамінів [P.Durand et al., 2001]. В клінічних умовах найбільшу гіпогомоцистеїнемічну активність виявила певна комбінація вітамінів В₆, В₉, В₁₂ [R.Clark, 1998], тривале застосування якої призвело до вірогідного зниження рівня ГЦ в крові, але не нормалізувало його.

Хоча мікроелементи мають високу біологічну активність, в літературі відсутні дані щодо застосування вітамінно-мікроелементних комплексів як гіпогомоцистеїнемічних засобів. В зв'язку з цим, пошук нових препаратів гіпогомоцистеїнемічної дії, у тому числі серед вітамінно-мікроелементних комплексів, є важливим завданням фармакології.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконана в рамках планової наукової роботи кафедри загальної та біологічної хімії ВНМУ ім. М.І. Пирогова (УДК: 615.22:262, № державної реєстрації 0101U002832), а також згідно договору з Інститутом фармакології та токсикології АМН України „Створення нового лікарського засобу антиатеросклеротичної дії на основі комплексу вітамінів В₆, В₉, В₁₂ та мікроелементів” від 01.11.2001 р. та 02.02.2004 року.

Мета роботи. На основі експериментальних досліджень встановити лікувально-профілактичні властивості нового вітамінно-мікроелементного комплексу при гіпергомоцистеїнемії.

Задачі дослідження.

1. Відтворити на білих щурах-самцях три експериментальні моделі ГГЦ - гостру метіонінову, хронічну метіонінову та гіповітамінозно-метіонінову.

2. На моделях гострої та хронічної метіонінової ГГЦ дослідити профілактичну гіпогомоцистеїнемічну активність нового вітамінно-мікроелементного комплексу та препаратів порівняння.

3. На моделі хронічної метіонінової ГГЦ вивчити лікувальну гіпогомоцистеїнемічну дію вітамінно-мікроелементного комплексу (ВМК), препаратів порівняння та їх антиоксидантну здатність.

4. На моделі комбінованої (гіповітамінозно-метіонінової) ГГЦ дослідити в динаміці вплив ВМК та препаратів порівняння на рівень ГЦ в плазмі крові, вітамінний статус тварин, а також гематологічні зрушення, показники оксидативного стресу та ендотоксикозу, індуковані ГГЦ.

5. Дослідити дозозалежну гіпогомоцистеїнемічну дію ВМК в умовах гіповітамінозно-метіонінової ГГЦ.

6. Дослідити зміни мікроскопічної будови внутрішніх органів щурів (серце, легені, нирки, печінка, шлунок, кишківник, сім'яники, сітківка ока та головний мозок) за гіповітамінозно-метіонінової ГГЦ та здатність ВМК в цих умовах відновлювати порушену структуру органів.

Об'єкт дослідження: гіпергомоцистеїнемія.

Предмет дослідження: лікувально-профілактична дія нового вітамінно-мікроелементного комплексу на моделях гіпергомоцистеїнемії.

Методи дослідження: фармакологічні, біохімічні, гематологічні, мікробіологічні, морфологічні та статистичні.

Наукова новизна дослідження. Достеменно підтверджено, що гіповітамінозно-метіонінова ГГЦ супроводжується пошкодженням судинного русла внутрішніх органів, у т.ч. серця, легень, нирок та печінки. Досліджено основні сторони фармакологічної дії ВМК та встановлено переваги його активності на досліджених моделях гіпергомоцистеїнемії у щурів: нормалізації відхилень, індукованих ГГЦ у порівнянні з певною комбінацією вітамінів В₆, В₉, В₁₂ [R.Clark, 1998] та препаратом “Декамевіт”. Вперше показано, що композиція мікроелементів на основі координаційних сполук цинку та хрому з N-2,3-диметилфенілантраніловою кислотою та ванадатом амонію підсилює специфічну гіпогомоцистеїнемічну дію вітамінів В₆, В₉ та В₁₂. Вперше запропонована класифікація гіпогомоцистеїнемічних лікарських засобів, заснована на аналізі механізму їх дії.

Практичне значення одержаних результатів. Проведені експериментальні дослідження показали доцільність застосування ВМК, що містить вітаміни В₆, В₉, В₁₂ та мікроелементи Zn, Cr, V, з профілактично-лікувальною метою при ГГЦ. На основі літературних та власних даних у співавторстві розроблені методичні рекомендації “Доклінічні дослідження гіпогомоцистеїнемічної дії потенційних лікарських засобів”.

Впровадження результатів дослідження в практику. За результатами дослідження отримано 1 патент України на винахід. Основні положення дисертації використовуються в навчальному процесі на кафедрах Вінницького національного медичного університету ім. М.І.Пирогова (кафедри фармакології, патологічної анатомії), Тернопільського державного медичного університету ім. І.Я.Горбачевського (кафедра медичної хімії), Буковинського державного медичного університету (кафедри фармації та медичної хімії), Ужгородського національного університету (кафедра біохімії і фармакології).

Особистий внесок здобувача. Автором особисто проведено патентно-інформаційний пошук, аналіз даних літератури за темою дисертації, опрацьовано моделі, згідно з якими особисто виконано експериментальні дослідження. Дисертант самостійно провів статистичну обробку та аналіз первинного матеріалу, написав всі розділи дисертації, сформулював висновки та практичні рекомендації. Мікробіологічні дослідження проведені на кафедрі мікробіології, вірусології та імунології ВНМУ ім. М.І. Пирогова (зав. каф. - проф. Г.К. Палій), гістологічні - на кафедрі гістології та ембріології ВНМУ ім. М.І. Пирогова (зав. каф. - проф. М.С. Пушкар), гістохімічні у відділі морфології ІФТ АМН України (зав. відділом - ст.н.с. О.В. Сергієнко), за що дисертант їм щиро вдячний.

Апробація результатів дослідження. Результати роботи були оприлюднені на науково-практичних конференціях “Біопсихосоціальні аспекти здоров'я: здоров'я здорових” (Вінниця, 2004), "Сучасний стан і проблеми експериментальної та клінічної медицини" (Тернопіль, 2004), “Новітні технології у медицині” (Вінниця, 2005), на ІХ з'їзді Всеукраїнського Лікарського Товариства (Вінниця, 2007).

Публікації. За матеріалами досліджень опубліковано 10 наукових праць: 5 статей у виданнях, рекомендованих ВАК України, 4 тез в матеріалах наукових конференцій і з'їздів, 1 методичні рекомендації.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація викладена на 174 сторінках машинопису та містить 30 таблиць, 32 рисунки (з них 27 мікрофотографій). Дисертація складається із вступу, огляду літератури, розділу «Матеріали і методи дослідження, моделювання гіпергомоцистеїнемії», 3-х розділів власних досліджень, аналізу та узагальнення результатів дослідження, висновків, практичних рекомендацій та списку використаних джерел, який включає 270 джерелo, у тому числі 211 зарубіжних авторів.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали та методи дослідження. Предметом експериментального дослідження був новий вітамінно-мікроелементний комплекс, розроблений сумісно співробітниками Інституту фармакології та токсикології АМН України та ВНМУ ім. М.І. Пирогова, який містить суміш координаційних сполук цинку, хрому з N-2,3-диметилфенілантраніловою кислотою (HL), ванадат амонію та специфічні для лікування гіпергомоцистеїнемії вітаміни: В₆ - піридоксин, В₉ - фолієва кислота , В₁₂ - ціанокобаламін. Один грам суміші містить: ZnL₂·2H₂O - 127 мг (Zn²⁺ - 14 мг), CrL₃·2H₂O - 1,64 мг (Cr³⁺ - 105 мкг), (NH₄)₃ VO₃ - 38 мкг (V ⁵⁺ - 13 мкг), В₆ - 10 мг, В₉ - 2 мг, В₁₂ - 0,2 мг та допоміжні речовини.

Вибір цих мікроелементів зумовлений тим, що ферменти метилювання гомоцистеїну (метіонінсинтетаза та бетаїнгомоцистеїнтрансфераза) є Zn-залежними металоензимами [C.W.Goulding et al., 1997; N.S.Millian et al., 1998; J.L.Ferrer et al., 2004; S.Ratnam et al., 2006], а більшість мікроелементів, у тому числі ванадій та хром, є незалежними чинниками нормального функціонування серцево-судинної системи [А.В.Кудрин, О.А.Громова, 2006]. Вважають, що вітамінно-мінеральні комплекси виявляють високу біологічну та лікувальну активність, при включені до них легкозасвоюваних форм мінеральних солей [Г.С. Григор'єва та співавт., 2004]. В зв'язку з цим, до складу ВМК включені сполуки цих мікроелементів. Для порівняння використані два препарати, близькі до ВМК по вітамінному складу. Першим препаратом порівняння (ПП-1) слугувала композиція, описана в роботі R.Clark (1998), яка в клінічних умовах у порівнянні з 19 іншими комбінаціями вітамінів В₆, В₉, В₁₂ виявляє найвищий гіпогомоцистеїнемічний ефект. Ця композиція включає високі добові дози вітамінів В₆, В₉, В₁₂ - 10,0; 1,0; 0,4 мг, відповідно, і забезпечує зниження рівня ГЦ в крові пацієнтів з ГГЦ майже на 60%. В якості іншого препарату порівняння (ПП-2) використано відомий в Україні полівітамінний комплекс “Декамевіт” - єдиний з полівітамінних препаратів, що містить в одній таблетці високі дози вітамінів В₆, В₉, В₁₂ - 20,0; 2,0; 0,1 мг, відповідно.

ВМК та препарати порівняння в тривалих дослідах (10-20 діб) вводили тваринам з дієтою, в короткочасних дослідах - за допомогою зонду в шлунок. Добове дозування ВМК та препаратів порівняння: тваринам на 1 кг маси тіла вводили дози, що в 5 разів перевищують передбачені для людини. Так, у випадку ВМК щури в якості добової дози вітамінів В₆, В₉, В₁₂ отримували 715; 143; 14,3 мкг/кг маси тіла, та мікроелементів: Zn²⁺ - 1 мг/кг, Cr³⁺ - 7,5 мкг/кг, V⁵⁺ - 0,93 мкг/кг, в той час як для людини пропонована добова доза цих компонентів в складі ВМК - 143; 28,6; 2,86 мкг/кг та 0,2 мг/кг; 1,5 мкг/кг; 0,186 мкг/кг, відповідно.

Тварини та дієти. Експериментальні дослідження проведені на 377 статевозрілих білих щурах-самцях з масою тіла 200±30 г. Тварин утримували на напівсинтетичній крохмально-казеїновій дієті з контрольованим вмістом всіх нутрієнтів, яку модифікували в залежності від мети експерименту.

Моделі ГГЦ. Використані три моделі гіпергомоцистеїнемії - гостра метіонінова, хронічна метіонінова та комбінована гіповітамінозно-метіонінова (ГМГ). Вказані моделі дозволяли підвищити рівень ГЦ в плазмі крові експериментальних тварин: за гострої ГГЦ ~ в 5 разів, за хронічної ГГЦ - в 1,5-2 рази, за ГМГ - в 11-13 разів.

Біохімічні, мікробіологічні та гематологічні дослідження. Досліджували кров, плазму або сироватку крові, гомогенати печінки та нирок. Вміст ГЦ в плазмі крові визначали на апараті Hewlett Packard (США) з використанням колонки Hypersil BDS C-18 методом високоефективної рідинної хроматографії в модифікації [О.О. Пентюк та співавт., 2001]. Рівень білка визначали уніфікованим біуретовим методом [В.В. Меньшиков, 1987], середні молекули (СМ), як показник ендотоксикозу, методом [Н.И. Габриэлян, В.И. Липатова, 1984], малоновий діальдегід (МДА) - за допомогою тіобарбітурової кислоти [В.Н. Орехович, 1977], гідроперекиси (ГП) методом [В.Б. Гаврилов, М.И. Мишкорудная, 1983], карбонільні групи (КГ) білків реакцією з фенілгідразином [H. Refsgaard, 2000]. Визначали забезпеченість тварин, що перебували на гіповітамінозно-метіоніновій дієті, вітамінами - фолієвою кислотою (прямим методом) та вітамінами В₆ і В₁₂ (непрямими методами). Вміст фолату в плазмі крові визначали мікробіологічним методом за допомогою фолатдефіцитного штаму Lactobacillus casei АТСС 7469 [Ю.М. Островский, 1979], статус вітаміну В₆ - по активності в печінці ферментів АСТ та АЛТ [В.В. Меньшиков, 1987], вітаміну В₁₂ - по екскреції з сечею метилмалонової кислоти [Л.В.Снегирева, 1972]. Вміст гемоглобіну визначали за допомогою геміглобінціанідного методу, кількість еритроцитів та лейкоцитів - в камері Горяєва. Ці дослідження виконані в акредитованій для біохімічних досліджень науково-дослідній клініко-діагностичній лабораторії ВНМУ ім.М.І.Пирогова (завідувач лабораторією професор О.О. Пентюк).

Морфологічні дослідження. Протягом експерименту визначали мікроскопічну будову внутрішніх органів шляхом зафарблення зрізів тканин гематоксиліном та еозином і гістохімічними методами [Н.З. Слінченко, 1964], Picro-Mallory V [Д.Д.Зербино, Л.Л. Лукасевич, 1989] для виявлення наявності в судинах фібрину та його “віку”.

Статистичні методи. Отримані цифрові дані підлягали обробці за допомогою методів варіаційного аналізу з використанням пакету прикладних програм Statistica 6.0 for Windows 98. Підраховували середні значення критеріїв, а також середньоквадратичні відхилення (М±m). Використовували також універсальні статистичні пакети до персонального комп'ютера “Exсel”. Для визначення зв'язків між показниками використовували кореляційний аналіз (з вираховуванням r) по Пірсону [Е.В.Гублер, 1978]. Достовірною вважалась різниця за Р?0,05.

Результати досліджень та їх обговорення. Виявлено, що протягом експериментів, проведених на трьох моделях ГГЦ, у тому числі на гіповітамінозно-метіоніновій, використані дієти забезпечують нормальний приріст маси тіла тварин всіх груп, крім того щури візуально мають звичайний вигляд та поведінку. Відсутність негативного впливу на масу тварин гіповітамінозно-метіонінової дієти пояснюється тим, що в дослід були взяті дорослі, а не молоді тварини та відносно невеликою (14 діб) тривалістю дослідів. Характерно, що ВМК та препарати порівняння не справляли помітної негативної дії на загальний стан тварин, а також не виявили здатності гальмувати чи стимулювати їх ріст.

1. Дослідження на моделі гострої метіонінової ГГЦ

На цій моделі вивчена профілактична гіпогомоцистеїнемічна дія ВМК та препаратів порівняння. Суть моделі полягає в тому, що тваринам одноразово, зондом в шлунок вводять велику кількість L-метіоніну - по 1 мл 5 % розчину на 100 г маси тіла. При цьому через 2 години рівень ГЦ в плазмі крові досягає максимуму. Профілактика полягала в попередньому протягом 10 діб введенні щурам через рот за допомогою зонду ВМК або препаратів порівняння, утриманні на дієті збагаченій ВМК. Отримані дані наведені в табл. 1.

Таблиця 1

Порівняльна профілактична гіпогомоцистеїнемічна дія ВМК та препаратів порівняння (ПП-1 та ПП-2) на моделі гострої метіонінової ГГЦ (М±m)

№ груп	Умови досліду	n	Рівень ГЦ, мкг/мл	Зниження у порівнянні з групою 2, %
1	Інтактний контроль	10	1,630,28	-
2	Гостра метіонінова ГГЦ (контроль ГГЦ)	10	8,261,53*	-
3	ГГЦ + попереднє введення ВМК	11	2,860,26*	- 65,4 %
4	ГГЦ +попереднє введення ПП-1	9	3,500,59*	- 57,6 %
5	ГГЦ +попереднє введення ПП-2	10	3,880,32*#	- 53,0 %
6	ГГЦ + попереднє утримання на дієті, збагаченій ВМК	10	2,750,22	- 66,7 %

Примітки:

1. * - Р?0,05 у порівнянні з інтактним контролем;

2. # - Р?0,05 у порівнянні з дією ВМК (група 3).

Виявлено, що попереднє введення тваринам ВМК та препаратів порівняння достовірно знизило гіпергомоцистеїнемічну дію L-метіоніну. Ефективність ВМК та ПП-1 була рівною і вищою, у порівнянні з ПП-2. Характерно, що введення ВМК за допомогою зонду або з дієтою в умовах гострої ГГЦ було однаково ефективним (зниження рівня ГЦ на 65,4 та 66,7 %, відповідно).

2. Дослідження на моделі хронічної метіонінової ГГЦ

Суть цієї моделі ГГЦ полягає в згодовуванні тваринам протягом 14 діб дієти, збагаченої L-метіоніном (1 % до сухої маси). Профілактика полягала у тому, що тварини певних груп отримували дієту, збагачену не тільки L-метіоніном, але і ВМК або препаратами порівняння. Лікування ГГЦ та ускладнень, індукованих ГГЦ, здійснювали шляхом щодобового введення тваринам з ГГЦ в шлунок зондом протягом 3 діб ВМК або препаратів порівняння. Отримані дані наведені в табл. 2.

Таблиця 2

Порівняльна профілактична та лікувальна дія ВМК, ПП-1 та ПП-2 на динаміку біохімічних показників крові щурів на моделі хронічної метіонінової гіпергомоцистеїнемії (М±m)

№ груп	Умови досліду	Рівень ГЦ в плазмі крові, мкг/мл	Сироватка крові	Середні молекули, екстинція
			білок,г/л	малоновий діальдегід, мкмоль/л	кетогрупи білків, мкг/100мг білка
1	Контроль, інтактні тварини	1,650,21	63,94,1	13,300,72	44,9 2,4	205,010,2
2	Контроль ГГЦ	3,700,30*	66,44,7	17,80 0,95*	60,32,5*	215,012,8
Профілактична дія - харчування метіоніновою дієтою, збагаченою:
3	ВМК	1,870,23#	61,94,2	13,20 0,88#	42,82,0#	211,09,5
4	ПП-1	1,920,25#	65,54,8	15,90 0,74*	55,32,6*	213,013,7
5	ПП-2	2,780,23*	63,74,0	13,10 1,07#	48,82,0#	208,010,9
Лікувальна дія - введення тваринам в шлунок протягом 3-х діб після моделювання ГГЦ:
6	ВМК	1,440,19	67,74,8	14,200,83#	50,52,5#	216,013,6
7	ПП-1	1,540,20	65,84,1	14.601.05#	57,22,4*	214,010,5
8	ПП-2	2,020,21	63,93,9	13,401,08#	50,21,9#	210,08,8

Примітки:

1. * - Р?0,05 у порівнянні з інтактним контролем;

2. # - Р?0,05 у порівнянні з контролем ГГЦ.

Виявлено, що збагачення метіонінової дієти ВМК (група 3), як і ПП-1 (група 4), повністю попереджає гіпергомоцистеїнемічний ефект L-метіоніну, в той час як дія ПП-2 була слабшою (Р<0,05). Лікувальна дія всіх трьох композицій була рівною. Хронічна метіонінова ГГЦ (група 2) активує процеси пероксидації ліпідів та білків (табл. 2). Профілактичне введення в дієту ВМК та ПП-2 (групи 3 та 5) запобігло активації оксидативного стресу, в той час як препарат ПП-1 (група 4) виявився менш ефективним. Більше того, навіть трьохдобове лікування тварин цим препаратом (група 7) не нормалізувало рівень кетогруп білків сироватки крові. Результати досліджень показали, що 14-добова метіонінова ГГЦ не змінює рівень загального білка в сироватці крові та середніх молекул крові як показника ендотоксикозу. Таким чином, на моделі хронічної метіонінової ГГЦ профілактична гіпогомоцистеїнемічна дія ВМК була рівною з препаратом ПП-1 та вищою від ПП-2, а профілактична та лікувальна антиоксидантна дія ВМК була рівною з препаратом ПП-2 та переважала препарат ПП-1.

3. Дослідження на моделі гіповітамінозно- метіонінової ГГЦ

На цій моделі вивчена лікувальна дія ВМК та препаратів порівняння. Суть цієї моделі ГГЦ полягає в згодовуванні тваринам протягом 14 діб основної дієти (ОД), збагаченої L-метіоніном (1% до сухої маси), але позбавленої вітамінів В₆, В₉ та В₁₂. Визначення вітамінного статусу показало, що вітамінна недостатність проявилась у зниженні в печінці активності піридоксальфосфатзалежних ферментів АЛТ з 76,34,6 в контролі до 59,32,7; АСТ - з 37,31,6 в контролі до 25,31,2 ммоль/год/мг білку (Р<0,05), зниженні в плазмі крові фолату на 2,4 нг/мл та підвищеній (у 2,4 рази) екскреції з сечею метилмалонової кислоти. Лікування ГГЦ та індукованих нею порушень здійснювали шляхом введення тваринам ВМК або препаратів порівняння протягом 4; 10 та 20 діб. Крім того, на цій моделі досліджена дозозалежна гіпогомоцистеїнемічна дія ВМК, для чого тваринам з ГМГ вводили дозу ВМК, яка в 2 рази перевищує добову (2ВМК), або є в два рази меншою за добову (1/2ВМК).

3.1. Гематологічні та біохімічні дослідження

Гематологічні дослідження. У тварин з ГМГ в крові виявлено достовірне зниження рівня гемоглобіну (до 107,03,1 проти 133,04,8 г/л в інтактному контролі) та кількості лейкоцитів (до 10,000,71 проти 12,800,39 тис/мм³ в інтактному контролі), що було наслідком недостатності в дієті вітамінів В₆, В₉ та В₁₂. Після лікування тварин з ГМГ протягом 4 діб за допомогою ВМК рівень гемоглобіну вже не відрізнявся від контролю (120,03,7; Р>0,05), в той час як кількість лейкоцитів утримувалась на зниженому рівні (10,500,68; Р<0,05). Лікування тварин з ГМГ введенням ПП-1, ПП-2, а також харчуванням повноцінною ОД протягом 4 діб не призвело до нормалізації цих показників. Після лікування тварин протягом 10 та 20 діб ВМК, ПП-1, ПП-2 та повноцінною ОД всі гематологічні показники виявилися нормальними. Таким чином, здатність ВМК нормалізувати гематологічні зрушення, індуковані вітамінною недостатністю, виявилася вищою у порівнянні з референс-препаратами та ОД.

Рівень ГЦ. Через 4 доби лікування ВМК концентрація ГЦ знизилася до рівня, нижчого від контролю і залишалась такою до 10 доби досліду. Під впливом препарату ПП-1 концентрація ГЦ нормалізувалася на 4 добу лікування і залишалася на такому рівні до кінця досліду. Разом з тим рівень ГЦ через 4 та 10 діб лікування препаратами ПП-1 та ПП-2 виявився вищим, ніж у тварин, яких лікували ВМК. Гіпогомоцистеїнемічна дія препарату ПП-2 була не тільки нижчою у порівнянні з ВМК, але через 4 доби лікування не досягла рівня інтактного контролю. На 20 добу досліду рівні ГЦ були однаковими при застосуванні всіх трьох комплексів - ВМК, ПП-1 та ПП-2 (див. рис.1). Таким чином, на моделі ГМГ ступінь гіпогомоцистеїнемічної дії ВМК виявився більшим, ніж у препаратів порівняння ПП-1 та ПП-2.

Рис. 1. Гіпогомоцистеїнемічна дія комплексу ВМК та препаратів порівняння (ПП-1 та ПП-2) в процесі лікування тварин з ГМГ.

* - Р?0,05 у порівнянні з інтактним контролем;

# - Р?0,05 у порівнянні з групами, що лікувалися ВМК.

Вивчена також дозозалежна гіпогомоцистеїнемічна дія ВМК. Показано, що збільшення добової дози ВМК в два рази не підсилює гіпогомоцистеїнемічну здатність цього комплексу, в той час як зменшення дози в два рази достовірно знижує його специфічну активність.

Процеси оксидативного стресу та ендогенної інтоксикації. Виявлено (табл. 3), що концентрація білків в сироватці крові у всіх тварин була в межах норми, в той час як рівні кетогруп білків, малонового діальдегіду та середніх молекул за ГМГ (група 3) виявились підвищеними (Р<0,05). Гіповітаміноз сам по собі не змінив на достовірну величину ці показники (група 2).

Лікування тварин з ГМГ протягом 4-х діб ВМК (група 4), як і препаратами порівняння (групи 5 та 6), призвело до нормалізації рівня кетогруп білків, чого не спостерігалось при харчуванні тварин тільки повноцінною (основною) дієтою (група 7). Таким чином, здатність ВМК знижувати пероксидацію білків, індуковану ГМГ, виявилась однаковою з препаратами порівняння ПП-1 та ПП-2.

Лікування тварин ВМК, як і препаратом ПП-2 (групи 4 та 6), призвело до зниження рівня малонового діальдегіду у порівнянні з контролем ГМГ (група 3; Р<0,05), а лікування тварин препаратом ПП-1 виявилось менш ефективним. Разом з тим, всі застосовані протягом 4 діб методи лікування тварин (за допомогою ВМК, ПП-1, ПП-2 та ОД) не призвели до нормалізації рівня МДА в сироватці крові (див.табл.3).

Таблиця 3

Вплив 4-х добового введення в організм ВМК, ПП-1, ПП-2, а також харчування основною дієтою (ОД) на динаміку біохімічних показників крові тварин за гіповітамінозно-метіонінової гіпергомоцистеїнемії (Мm)

№ груп	Умови досліду	Сироватка крові	Середні молекули, екстинція
		білок, г/л	кетогрупи білків, мкг/100 мг	малоновий діальдегід, мкмоль/л
1	Інтактні тварини	67,803,05	45,803,20	44,72,4	0,2760,020
2	Гіповітаміноз (контроль)	62,002,81	57,304,30	52,33,3	0,2280,028
3	ГМГ без лікування (контроль ГГЦ)	66,002,30	72,204,07*	73,74.6*	0,4240,016*
Лікування ГМГ протягом 4 діб
4	ГМГ + ВМК	64,603,05	53,703,55#	57,13,3*#	0,2120,021*#
5	ГМГ + ПП-1	68,603,12	55,203,84#	64,83,5*	0,2490,021#
6	ГМГ + ПП-2	66,603,00	54,403,78#	56,54,0*#	0,2560,022#
7	ГМГ + ОД	65,604,20	68,503,70*	70,43,9*	0,3550,020*

Примітки:

1. * - Р?0,05 у порівнянні з інтактним контролем;

2. # - Р?0,05 у порівнянні з контролем ГГЦ.

Наші дослідження показали, що лише лікування протягом 10 діб за допомогою ВМК і препаратів порівняння (але не ОД) здатне нормалізувати рівень МДА в сироватці крові тварин з ГМГ. Така ж ситуація спостерігалась відносно стану ендотоксикозу, який знизився під впливом ВМК та препаратів порівняння (але не ОД) практично до одного рівня. При дослідженні гомогенатів печінки виявлено залежне від ГМГ підвищення концентрації КГ білків, МДА та ГП при нормальній концентрації білка та активності супероксиддисмутази (СОД). Під впливом лікування протягом 4 діб ВМК показав рівну з ПП-1 та ПП-2 активність щодо нормалізації рівня ГП та майже однакову з ПП-2 здатність до зниження концентрацій МДА та КГ білків, причому антиоксидантна дія препарату ПП-1 виявилась нижчою у порівнянні з ВМК та ПП-2. Всі досліджені в печінці показники оксидативного стресу вже не відрізнялися від інтактного контрою через 10 діб лікування ВМК та препаратами порівняння.

Дещо інша картина виявлена при дослідженні гомогенатів нирки. Як і у випадку з гомогенатом печінки, ГМГ викликала в нирках активацію процесів оксидативного стресу при відсутності впливу на концентрацію загального білка та активність СОД. Вже після 4 діб лікування тварин з ГМГ за допомогою ВМК, ПП-1 та ПП-2 концентрації ГП та МДА не відрізнялися від інтактного контролю. Всі три препарати знизили утворення КГ білків, хоча їх рівень залишався статистично вищим, у порівнянні з інтактним контролем. Проте проведені дослідження показали, що збільшення до 10 діб терміну лікування тварин з ГМГ введенням ПП-1 не призвело до нормалізації рівня КГ, це сталося лише після 20-ти добового лікування. Натомість, під впливом ВМК, як і ПП-2, застосованих упродовж 10 діб, рівень КГ досяг показників інтактного контролю.

Дані, отримані на гомогенатах печінки та нирок, свідчать про те, що в умовах ГМГ досліджуваний ВМК має рівну з ПП-2 та вищу від ПП-1 здатність протидіяти прооксидантним властивостям ГЦ.

3.2. Морфологічні дослідження (патанатомічні, гістологічні, гістохімічні)

При зовнішньому огляді, патологоанатомічному розтині, визначенні абсолютної та відносної маси органів щурів з ГМГ ніяких змін відносно контролю не було виявлено.

Проведено гістологічне та гістохімічне дослідження органів тварин - серця, легенів, печінки, нирок, шлунку та кишківнику, сім'яників, передміхурової залози, сітківки ока та головного мозку. Більш детально вивчена мікроскопічна структура серця, легенів, нирок та печінки. Вибір саме цих органів зумовлений їх активною участю в функціонуванні серцево-судинної системи та (для печінки і нирок) - в обміні ГЦ. Дослідження тварин з ГМГ виявило наявність суттєвих ушкоджень судинного русла, ознак гемоциркуляторних розладів та альтеративних змін паренхіми окремих органів, вірогідно гіпоксичного та метаболічного генезу.

В міокарді тварин з ГМГ просвіт інтрамуральних судин розширений, заповнений кров'ю, в частині артерій середнього та малого калібру і вен відмічаються ознаки ушкодження стінки у вигляді набряку ендотеліоцитів та плазматичного просочення медії, стази та тромбози, які, за даними гістохімічного дослідження, відповідають давнині утворення 18-24 години та більше. В окремих місцях кардіоміоцити мають ознаки вогнищевих, переважно зворотних, сегментарних та субсегментарних контрактурних змін I - III ступеня (рис.2).

У тварин, яких лікували ВМК та ПП-1, вже через 10 діб відмічались позитивні зрушення структури міокарду, головне - не знайдені артеріальні та венозні тромбози. Разом з тим залишкові зміни були більш вираженими за лікування ПП-1. 20-ти добове лікування в обох випадках практично повністю нормалізувало структуру міокарду. При 10-добовому лікуванні тварин з ГМГ за допомогою ОД гістопатологічні зміни не зменшились, навіть відбулось їх наростання, а через 20 діб у таких тварин в міокарді спостерігались вже незворотні зміни (рис 3). Ці дані свідчать про те, що повноцінна дієта (ОД) є недостатнім фактором для лікування синдрому ГГЦ.

В легенях тварин з експериментальною ГМГ на 15 добу спостереження відмічаються судинні порушення без ознак ушкодження паренхіми. В міжальвеолярних перетинках судини повнокровні, в частині артеріальних та венозних судин відмічаються стази і тромбози. Стінка окремих артерій потовщена, клітини м'язевої оболонки її набряклі, ендотеліоцити місцями розташовані частоколом, частина з них збільшена в розмірах, набрякла. Певні гістологічні зрушення за ГМГ відбуваються також в структурі бронхіального дерева, міжальвеолярних перетинках, нервових та лімфатичних утвореннях легень (рис.4).

Лікування ВМК та ПП-1 протягом 10 діб виявилось досить ефективним: за введення ВМК структура легень практично не відрізнялась від норми, а після лікування ПП-1 мікроскопічна картина лише незначно відрізнялася від контролю. Лікування тварин ОД було менш ефективним: тільки через 20 діб мікроскопічна структура легенів щурів набула нормального вигляду.

В нирках за ГМГ відмічені такі зміни. Клубочки приблизно однакових розмірів, повнокровні, базальна мембрана їх капілярів тонка, в отворах мікросудин знаходиться значна кількість еритроцитів. Стінка окремих артерій набрякла, потовщена, отвір артеріальних судин розширений, переповнений кров'ю, в деяких артеріальних та венозних судинах виявлено тромби, “вік” яких становить 18-24 години та більше. Епітеліальні клітини проксимальних звивистих канальців мають ознаки розповсюджених виражених дистрофічних змін, відмічаються окремі вогнища некрозу (рис. 5). Вказані відхилення, індуковані в нирках за ГМГ, близькі до тих що описані в

Через 10 діб лікування ВМК мікроскопічна будова нирок практично не відрізнялась від контролю, а у тварин, що лікувалися препаратом ПП-1 - майже нормалізувалася: спостерігались незначний мезангіальний набряк та залишкові дегенеративні процеси у канальцевому епітелії. Через 20 діб лікування тварин з ГМГ введенням ВМК та ПП-1 будова нирок не відрізнялася від контролю. При застосування ОД явні патологічні зміни в нирках відмічалися навіть через 20 діб лікування.

В печінці щурів, крім ознак ушкодження стінки поодиноких судин з периваскулярною вогнищевою лейкоцитарною інфільтрацією, відмічались виражена розповсюджена альтерація гепатоцитів, що мала характер як стеатозу та дистрофічних змін, так і окремих вогнищ переважно моноцелюлярного некрозу. Місцями спостерігалось венозне повнокрів'я печінки, фіброз та склероз міжчасточкових перегородок. Поряд з жировою дистрофією в окремих гепатоцитах відмічались ознаки гіаліновокраплинної дистрофії у вигляді брилуватих та сітчастих еозинофільних включень у цитоплазмі.

Лікування тварин з ГМГ введенням ВМК та ПП-1 виявилось доволі ефективним: вже через 10 діб під дією ВМК структура печінки практично не відрізнялася від такої у тварин з груп інтактного контролю, в той час як після лікування ПП-1 збереглися незначні відхилення. Позитивний лікувальний вплив ВМК був виявлений при дослідженні і інших органів.

ВИСНОВКИ

В дисертаційній роботі експериментально обгрунтовується доцільність застосування нового вітамінно-мікроелементного комплексу для профілактики та лікування гіпергомоцистеїнемії.

1. У білих нелінійних щурів з гострою та хронічною моделлю ГГЦ, викликаною введенням L-метіоніну, так само, як і з гіповітамінозно-метіоніновою моделлю, реєструється значне підвищення рівню гомоцистеїну (в 4,5-5,1; 2,2; 11-13 разів, відповідно) в плазмі крові, виникають явища оксидативного стресу - вміст малонового діальдегіду в крові, печінці та нирках підвищується на 65,8; 57,0; 20%, відповідно, кетогруп білків на 57,6; 84,8; 46,7%, відповідно, гідропероксидів в печінці на 37,8%, в нирках - на 40,8%. За гіповітамінозно-метіонінової ГГЦ формується ендотоксикоз - рівень молекул середньої маси в крові підвищується на 53,6%.

2. На моделі гострої ГГЦ, викликаної L-метіоніном, 10-добове внутрішньошлункове введення щурам ВМК значно зменшувало рівень гомоцистеїну в плазмі крові (2,86±0,26 мкг/мл, в контролі ГГЦ - 8,26±1,53 мкг/мл). За цим показником ВМК вірогідно переважав препарат порівняння ПП-2 (3,86±0,32 мкг/мл) та дорівнював ПП-1.

3. Лікувально-профілактичне введення білим щурам з моделлю хронічної метіонінової ГГЦ вітамінно-мікроелементного комплексу протягом 15 діб практично нормалізувало рівень гомоцистеїну (знизився з 3,70±0,30 мкг/мл до 1,87±0,23 мкг/мл), а також зменшувало вміст малонового діальдегіду в сироватці крові (з 17,80±0,95 до 13,20±0,88 мкмоль/л) і кетогруп білків (з 60,3±2,5 до 42,8±2,0 мкг/100мг білка). За двома останніми ефектами ВМК вірогідно переважав ПП-1 (15,90±0,74 мкмоль/л та 55,3±2,6 мкг/100мг білка, відповідно) і дорівнював ПП-2.

4. В умовах сформованої хронічної метіонінової ГГЦ щодобове внутрішньошлункове введення ВМК протягом 3 діб нормалізувало вміст гомоцистеїну в плазмі крові білих щурів (1,44±0,19 мкг/мл), малонового діальдегіду (14,20±0,83 мкмоль/л) та кетогруп білків (50,5±2,5 мкг/100 мг білка) в сироватці крові. Дія ВМК була тотожною такій ПП-2 та переважала ефект ПП-1 (за рівнем малонового діальдегіду та кетогруп білків).

5. На моделі гіповітамінозно-метіонінової ГГЦ щодобове введення ВМК протягом 4 діб нормалізувало вміст гомоцистеїну в плазмі крові білих щурів (рівень знизився з 19,20±2,60 до 0,86±0,12 ), а після дії ПП-1 - до 1,58±0,21 (при 1,43±0,26 мкг/мл у інтактних тварин). Препарат порівняння ПП-2 нормалізував цей показник лише на 10 добу.

6. Застосування ВМК у білих щурів з гіповітамінозно-метіоніновою ГГЦ на 4 добу нормалізувало вміст молекул середньої маси (рівень зменшився з 0,424±0,016 до 0,276±0,020 од), а на 10 добу - рівень малонового діальдегіду, кетогруп білків, гідроперекисів в сироватці крові, печінці та нирках. За цими показниками ВМК дорівнював ПП-2 та вірогідно перевищував ПП-1.

7. У білих щурів з гіповітамінозно-метіоніновою ГГЦ реєструються морфологічні ознаки ушкодження судинного русла (повнокрів'я, набухання стінки судин, десквамація ендотелію, тромбоз окремих судин різної давнини та інші), паренхіми печінки та нирок гіпоксичного та метаболічного характеру (дистрофія, стеатоз, гломерулосклероз та інші). Лікування ВМК при цій патології відновлює структуру судин та органів на 10 добу, а при використанні ПП-1 на 20 добу.

8. Механізм лікувально-профілактичної дії ВМК, ймовірно, обумовлений в першу чергу зниженням в плазмі крові ГЦ за рахунок прискорення його метаболізму під впливом вітамінів та мікроелементів.

ПРАКТИЧНІ РЕКОМЕНДАЦІЇ

1. За механізмом дії сучасні засоби лікування ГГЦ доцільно поділити на 4 групи: а) прямої гіпогомоцистеїнемічної дії (активують обмін ГЦ чи сприяють екскреції його з сечею); б) з опосередкованою гіпогомоцистеїнемічною активністю (знижують потребу в S-аденозилметіоніні або мають нез'ясований механізм впливу); в) засоби, дія яких спрямована на корекцію ускладнень, викликаних ГГЦ; г) комбіновані препарати, що в одній лікарській формі містять речовини з різним механізмом дії.

2. При станах, що супроводжуються підвищеним вмістом гомоцистеїну в плазмі крові, з лікувальною метою слід застосовувати новий вітамінно-мікроелементний комплекс (вітаміни В₆, В₉, В_12, цинк, хром, ванадій).

СПИСОК ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Пентюк О.О., Луцюк М.Б., Постовітенко К.П., Артемчук М.А., Асачова О.С., Призимирська Т.В. Гіпергомоцистеїнемія: моделювання та вплив на стан судинної системи в експерименті // Досягнення біології та медицини. - 2004. - Т.3, №1. - С.35-38. (Здобувач провів експериментальні дослідження на моделі хронічної ГГЦ, статистичну обробку отриманих результатів, написав висновки).

2. Постовітенко К.П., Пентюк О.О., Луцюк М.Б., Призимирська Т.В., Артемчук М.А., Андрушко І.І., Чехун В.Ф., Чорнопищук О.Л. Біохімічні зміни в крові, печінці та нирках при експериментальній гіпергомоцистеїнемії за її лікування вітамінами та вітамінно-мінеральним комплексом // Вісник Вінницького національного медичного університету. - 2005. - Т.9, №2. - С.222-227. (Здобувач провів випробовування ВМК на моделі гіповітамінозно-метіонінової ГГЦ та узагальнив результати).

3. Постовітенко К.П., Пентюк О.О., Луцюк М.Б., Сергієнко О.В., Артемчук М.А., Андрушко І.І., Харковенко Р.В., Чехун В.Ф., Призимирська Т.В. Морфологічні зміни в органах тварин з експериментальною гіпергомоцистеїнемією та можливість їх корекції дієтами, збагаченими вітамінами // Вісник морфології. - 2005. - Т.11, №2. - С.287-291. (Здобувач провів морфологічні дослідження та визначив статус вітамінів В₆, В₉, В₁₂).

4. Артемчук М.А. Профілактично-лікувальна дія вітамінних та вітамінно-мікроелементних препаратів за гострої і хронічної метіонінової гіпергомоцистеїнемії // Biomedical and Biosocial Anthropology. - 2006. - Т.7. - С. 17-20.

5. Артемчук М.А. Синдром гіпергомоцистеїнемії - принципи лікування та підходи до класифікації гіпогомоцистеїнемічних лікарських препаратів, засновані на аналізі механізму їх дії // Biomedical and Biosocial Anthropology. - 2007. - Т.9. - С. 47-51.

6. Постовітенко К.П., Істошин В.М., Тертишна О.В., Артемчук М.А., Харковенко Р.В., Луцюк М.Б. Гіпергомоцистеїнемія як фактор ураження судин / Біопсихосоціальні аспекти здоров'я: здоров'я здорових: Матеріали наук.-практ. конференції. Вінниця, 21-22 жовт. 2004 р. - Вінниця, 2004. - С.94-95.

7. Харковенко Р.В., Артемчук М.А., Постовітенко К.П., Луцюк М.Б., Салдан Й.Р., Сергієнко О.В. Вплив вітамінно-мікроелементного препарату на рівень гомоцистеїну в плазмі крові та патоморфологічні зміни в оці, викликані експериментальною гіпергомоцистеїнемією / Сучасний стан і проблеми експериментальної та клінічної медицини: Міжнар. наук.-практ. конференція. Тернопіль, 11-12 листоп. 2004р. // Медична хімія. - 2004. - Т. 6, №3.- С. 175.

8. Артемчук М.А. Вплив різних доз вітамінів В₆, В₉, В₁₂ та вітамінно-мікроелементного комплексу на швидкість нормалізації біохімічних та морфологічних порушень, що виникають за гіпергомоцистеїнемії / Новітні технології у медицині: Міжнар. наук.-практ. конференція. Вінниця, 14-15 трав. 2005р. - Вінниця, 2005. - С.50-51.

9. Артемчук М.А., Пентюк О.О., Луцюк М.Б., Постовітенко К.П., Йолтуховський М.М., Постовітенко О.П., Андрушко І.І., Мельник А.В. Підходи до класифікації фармзасобів з гіпогомоцистеїнемічною активністю по механізмам їх дії / Тези доповідей ІХ з'їзду Всеукраїнського Лікарського Товариства. Вінниця, 10-12 травня 2007р. // Українські Медичні Вісті. - 2007. - Т.7. - С.250.

10. Патент України №66134 А; Експериментальна модель гіпергомоцистеїнемії. В.Ф.Чехун, М.Б. Луцюк, О.О.Пентюк, Т.В.Призимирська, К.П.Постовітенко, М.А.Артемчук, Й.Р.Салдан, О.С.Асачова. - Опубл. 15.04.2004. - Бюл №4. - 6 с.

11. Доклінічні дослідження гіпогомоцистеїнемічної дії потенційних лікарських засобів. О.О.Пентюк, М.Б.Луцюк, М.А.Артемчук та ін. -К.: ДФЦ МОЗ України, 2007. - 30 с.

АНОТАЦІЯ

Артемчук М.А. Гіпогомоцистеїнемічна дія нового вітамінно-мікроелементного комплексу (експериментальне дослідження). - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук за спеціальністю 14.03.05 - фармакологія. - Державна установа "Інститут фармакології та токсикології" АМН України, Київ, 2008.

На білих нелінійних щурах-самцях (n=377), які утримувались на стандартній напівсинтетичній крохмально-казеїновій дієті, проведені експериментальні дослідження специфічної (гіпогомоцистеїнемічної) активності нового вітамінно-мікроелементного комплексу (ВМК), до складу якого входять вітаміни В₆, В₉, В₁₂, а також мікроелементи цинк, хром та ванадій. Дослідження проведено у порівнянні з специфічною дією двох інших комплексів - препаратом порівняння 1 (ПП-1, склад згідно R.Clark, 1998), та препаратом порівняння 2 (ПП-2, полівітамінний препарат «Декамевіт»). На трьох експериментальних моделях гіпергомоцистеїнемії (гостра метіонінова, хронічна метіонінова та комбінована гіповітамінозно-метіонінова) з використанням біохімічних, гематологічних, морфологічних та гістохімічних методів дослідження показано, що ВМК та препарати порівняння володіють гіпогомоцистеїнемічною активністю та здатністю нормалізувати порушення, індуковані гіпергомоцистеїнемією, але профілактична та лікувальна дія ВМК виявилась у більшості випадків вищою у порівнянні з ПП-1 та ПП-2. Зроблено висновок, що досліджуваний вітамінно-мікроелементний комплекс є конкурентноздатним у порівнянні з сучасними аналогами (ПП-1 та ПП-2) і може бути рекомендований для доклінічних та клінічних випробувань.

Ключові слова: гіпергомоцистеїнемія, моделі гіпергомоцистеїнемії, препарати гіпогомоцистеїнемічної дії.

АННОТАЦИЯ

Артемчук М.А. Гипогомоцистеинемическое действие нового витаминно-микроэлементного комплекса (экспериментальное исследование). - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук по специальности 14.03.05 - фармакология. - Государственное учреждение "Институт фармакологии и токсикологии" АМН Украины, Киев, 2008.

Синдром гипергомоцистеинемии - повышенное содержание в плазме крови аминокислоты гомоцистеина - в последние годы привлекает внимание медиков из-за его тесной связи с сердечно-сосудистой патологией и многими другими заболеваниями и состояниями (сахарный диабет, псориаз, почечная недостаточность, шизофрения, депрессии, болезнь Альцгеймера, дефекты развития в онтогенезе, рак прямой кишки и др.). Негативное влияние гипергомоцистеинемии на организм реализуется путем угнетения процессов метилирования, химической модификации белков, стимуляции оксидативного стресса и тромбогенеза, влияния на экспрессию генов и другие процессы. Подтверждением значительной роли гипергомоцистеинемии в прогрессировании сердечно-сосудистой патологии является тот факт, что назначение гипогомоцистеинемической терапии приводит не только к снижению уровня гомоцистеина в плазме крови, но и к позитивной динамике отклонений со стороны сердечно-сосудистой системы и улучшению функции эндотелия. Имеются данные о том, что снижение концентрации гомоцистеина в плазме крови на 3 ммоль/л снижает частоту ишемической болезни сердца на 16 %, тромбозов на 25 %, сердечных приступов - на 24 %. В связи с этим, поиск средств гипогомоцистеинемического действия является актуальной фармакологической проблемой.

Диссертация посвящена экспериментальным исследованиям гипогомоцистеинемической активности нового витаминно-микроэлементного комплекса (ВМК), созданного в Институте фармакологии и токсикологии АМН Украины совместно с Винницким национальным медицинским университетом им. Н.И. Пирогова. ВМК имеет в своем составе высокие дозы витаминов В₆, В₉ и В₁₂, коферментные формы которых принимают непосредственное участие в метаболизме гомоцистеина, а также микроэлементы цинк, хром и ванадий усиливающие специфическую активность ВМК. Способность витаминно-микроэлементного комплекса снижать уровень гомоцистеина, а также предотвращать и лечить нарушения, индуцируемые гипергомоцистеинемией, сравнивалась с действием двух других препаратов, близких к ВМК по витаминному составу - препаратом сравнения 1 (ПС-1, по R.Clark, 1998) и препаратом сравнения 2 (ПС-2, поливитаминный препарат «Декамевит»).

Эксперименты проведены на взрослых белых крысах-самцах (n=377), которые содержались на стандартной крахмально-казеиновой диете. Использованы 3 модели гипергомоцистеинемии: острая метиониновая, хроническая метиониновая и гиповитаминозно-метиониновая, которые обеспечивали повышение уровня гомоцистеина в плазме крови животных приблизительно в 5, 2 и 13 раз, соответственно. Для кормления животных применялись диеты, обогащенные L-метионином - аминокислотой, которая является единственным источником гомоцистеина в организме, а также другими компонентами в зависимости от условий эксперимента.

В работе использованы такие методы исследования: биохимические (определение концентраций белка, гомоцистеина, средних молекул, малонового диальдегида, гидроперекисей, кетогрупп белков, активности ферментов АЛТ, АСТ, СОД), микробиологические (определение фолата), гематологические (определение количества эритроцитов, лейкоцитов, уровня гемоглобина), микроскопические (исследования всех основных внутренних органов, гистохимическое выявление тромбов и определение их возраста по методу Слинченко), статистические.

Показано, что на моделях острой и хронической гипергомоцистеинемии ВМК, как и препараты сравнения, могут частично предупреждать гипергомоцистеинемическую активность метионина, но эффективность ВМК при этом оказалась более высокой. На модели хронической метиониновой гипергомоцистеинемии все исследуемые комплексы обнаружили приблизительно одинаковую лечебно-профилактическую активность, однако способность нормализовать процессы пероксидации липидов и белков, оказалась одинаковой у ВМК и ПС-2, но более высокой, чем у ПС-1.

На модели гиповитаминозно-метиониновой ГГЦ ежесуточное введение ВМК в течение 4 суток нормализовало содержание гомоцистеина в плазме крови белых крыс, аналогично ПС-1. Препарат сравнения-2 нормализовал этот показатель только на 10 сутки. Антиоксидантное действие ВМК было равным ПC-2 и превосходило ПC-1. Способность ВМК к репарации морфологических изменений, вызванных гипергомоцистеинемией, была более высокой, чем у ПС-1.

Результаты исследований свидетельствуют о том, что новый витаминно-микроэлементный комплекс ВМК имеет высокую специфическую гипогомоцистеинемическую активность и способен ускорять нормализацию изменений, индуцированных гипергомоцистеинемией. Эти данные, на наш взгляд, свидетельствуют о целесообразности дальнейшего углубленного изучения ВМК на предмет создания на его основе нового средства, пригодного для профилактики и лечения гипергомоцистеинемии, конкурентоспособного с современными аналогами (ПС-1 и ПС-2). Кроме того, в результате анализа литературных данных и с учетом собственных исследований автором диссертации предложена современная классификация лекарственных средств с гипогомоцистеинемической активностью, основанная на механизме их действия.

Ключевые слова: гипергомоцистеинемия, модели гипергомоцистеинемии, препараты гипогомоцистеинемического действия

SUMMARY

Artemchuk M.A. Hypohomocystinemic action of new vitamin-microelement complex (experimental studies). - Manuscript.

Dissertation for a degree of candidate of medical science in speciality 14.03.05 of pharmacology. - State organization "The Institute of Pharmacology and Toxicology" AMS of Ukraine, Kyiv, 2008.

We made preclinical investigation on white nonlinear male rats, which were on standart semisenthetic starch-casein diet, of specific activity of new vitamin-microelement complex (VMC), which consists of vitamins В₆, В₉, В₁₂, also microelements such as zinc, chrome and vanadium. Researchers have been done in comparison with specific action of 2 (two) other complexes, close to VMC in vitamin composition, preparation of composition 1 (PP-1, composition according to R.Clark, 1998), and preparation of comparison 2 (PP-2, polyvitamin preparation “Decamevit”). It was shown on 3 (three) experimental models of hyperhomocysteinemia (strong methionine, chronic methionine and combined hypovitamin-methionine) using biochemical, hematological, morphological and hystochemical methods of research are shown, that both VMC and preparations of comparison possess hypohomocysteinemic activity and ability to normalize disorders induced by hyperhomocysteinemia, but prophylactic and therapeutic effect of VMC appeared to be higher in most of cases comparing to PP-1 and PP-2. We made the conclusion that researched vitamin-microelement complex is rivalries in comparison with modern analogs (PP-1 and PP-2) and can be recommended for preclinical and clinical investigations.