Явление люминесценции

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Контрольная работа

Явление люминесценции

Введение

флуоресценции люминисценция краситель поляризация

Время жизни электронно-возбужденного состояния молекул 10^-8-10^-9 с. После этого молекула возвращается в исходное состояние, израсходовав дополнительную энергию безизлучательным образом на колебательные движения ядер и поступательные движения соседних молекул, т.е. растратив ее в виде тепла. Но эта энергия также может выделиться в виде излученного фотона. Это явление называют люминесценцией. В зависимости от способа возбуждения молекулы - светом, электрической энергией, химическими реакциями, нагреванием, и т.д. - различают фото-, электро-, хемо-, или термолюминесценцию. Нас больше интересует фотолюминесценция, обычно называемая флуоресценцией.

1. Законы флуоресценции

Спектром флуоресценции называют зависимость интенсивности излученного света от энергии фотонов: I_фл = f (h) или F(). Но обычно в видимой и ультрафиолетовой области строят зависимость интенсивности флуоресцентного света от длины волны:

флуоресценция люминисценция краситель поляризация

I_фл = f().

По закону Стокса, спектр флуоресценции смещен в длинноволновую область по сравнению со спектром поглощения. Это смещение называется стоксовским сдвигом. Оно отражает потерю части энергии возбуждения вследствие теплового рассеяния. Но нередко спектры флуоресценции частично перекрываются со спектрами поглощения света (и со спектрами возбуждения флуоресценции). В области перекрытия, называемой антистоксовской (Рис. 1), энергия излученных фотонов больше энергии поглощенных квантов. Дополнительная энергия в данном случае берется за счет колебательной энергии молекул, когда в результате излучения происходит переход на более низкий колебательный подуровень, чем тот, с которого происходило поглощение фотона (Рис. 2).

Рис. 1. Зеркальная симметрия спектров флуоресценции (1) и поглощения (2) раствора родамина 6G. Антистоксова область заштрихована

Правило Каша гласит, что в растворах излучательные переходы происходят, как правило, с нижних колебательных подуровней синглетных или триплетных возбужденных уровней. Это происходит потому, что за время жизни возбужденного состояния 10^-8-10^-9 с успевают осуществиться все колебательно-вращательные переходы (их типичная длительность 10^-13-10^-12 с). Можно сказать, что к моменту испускания фотона молекула «забывает», на какой подуровень она была возбуждена. Поэтому спектр флуоресценции не зависит от длины волны возбуждающего света.

Рис. 2. Схемы переходов между электронно-колебательными при стоксовой (а) и антистоксовой (б) флуоресценции, когда в результате перехода на более низкий колебательный подуровень энергия излученного кванта выше энергии поглощенного кванта

По правилу Лёвшина, спектры флуоресценции, построенные в шкале частот (энергий фотонов, зеркально-симметричны относительно длинноволновой полосе поглощения. Это связано с тем, что расстояния между колебательными подуровнями и вероятности переходов на них у молекул в возбужденном состоянии сходны с таковыми в основном состоянии. Причина этого в том, что за время электронных переходов порядка 10^-15 с положения ядер не успевают измениться, так как типичные периоды их колебаний на два-три порядка дольше - порядка 10^-13-10^-12 с. Поэтому по принципу Франка-Кондона поглощение и испускание фотонов обусловлено одними и теми же колебательными подуровнями.

Квантовым выходом флуоресценции называется отношение числа излученных квантов к числу поглощенных:

= n_фл/n_погл

Величина 0 < < 1, потому что кроме испускания фотонов, есть и другие пути утилизации энергии возбуждения: она может быть передана другим молекулам, расходоваться в химических реакциях или рассеваться в виде тепла.

В соответствии с законом Вавилова, в стоксовой области квантовый выход флуоресценции сложных молекул в растворах не зависит от длины волны возбуждающего света.

Интенсивность флуоресценции разбавленных растворов пропорциональна концентрации флуорохромов. Действительно, в разбавленных растворах с низкой оптической плотностью D = cl < 0,05

I_фл = K I_погл = K I₀ (1-Т) = K I₀ (1-10^-D) 2,3 k I₀ D,

где k - доля флуоресцентного излучения, попадающего в фотоприемник. Это позволяет по флуоресценции определять количество флуорохрома и его изменения при различных воздействиях. Для количественного измерения концентрации флуорохрома используют калибровочную кривую:

c = c_станд (I_фл/I_станд),

где индекс «станд» относится к стандартному калибровочному раствору.

2. Регистрация флуоресценции. Спектрофлуориметры

При регистрации флуоресценции необходимо, чтобы более интенсивный возбуждающий свет не попал в фотоприемник и не мешал измерениям. Для этого располагают фотоприемник по углом 90^о и используют скрещенные светофильтры (Рис. 3). В канале возбуждения флуоресценции помещают светофильтр, хорошо пропускающий возбуждающий свет, но не пропускающий свет в диапазоне, где объект флуоресцирует, а в канале регистрации - светофильтр, не пропускающий коротковолновый свет, используемый для возбуждения флуоресценции, но хорошо пропускающий излучаемый свет. Пара таких взаимоисключающих светофильтров не должна пропускать свет.

Рис. 3 Применение скрещенных светофильтров для регистрации флуоресценции (А) и их спектры пропускания света (Б). 1 - светофильтр в канале возбуждения, 2 - светофильтр в канале регистрации флуоресценции



Рис. 4. Схема спектрофлуориметра. 1 - источник света; 2 - собирающий линзы; 3 и 5 - монохроматоры в каналах возбуждения и регистрации флуоресценции; 4 - кювета с образцом; 6 - фотоумножитель; 7 - источник питания фотоумножителя; 8 - усилитель; 9 - компьютер и принтер

В современных спектрофлуориметрах обычно используются два монохроматора, один в канале возбуждения, другой - в канале регистрации флуоресценции (Рис. 4) Это позволяет регистрировать как спектр флуоресценции, так и спектр возбуждения. В последнем случае флуоресценцию регистрируют на определенной длине волны, обычно в максимуме, а если в спектре флуоресценции есть несколько максимумов, то можно для каждого из них зарегистрировать спектр возбуждения и по ним идентифицировать флуорохромы, ответственные за появление этих максимумов.

3. Кинетика люминесценции. FLIM микроскопия

Не все возбужденные молекулы излучают фотоны в одно и то же время. Это вероятностный процесс, поэтому одни молекулы испускают кванты раньше, а другие позже. Поэтому после возбуждения коротким световым импульсом, например, лазерным, флуоресценция постепенно затухает. Переход возбужденной молекулы М* в основное состояние М₀ можно описать с помощью уравнения:

М* М₀ + Q,

где k - вероятность перехода в единицу времени, а Q - квант света (фотон).

Кинетика этого процесса описывается уравнением первого порядка:

d [M*]/dt = - k [M*]

Его решение:

[M*(t)]=[M*(0)] exp (t/),

где = 1/k - среднее время жизни возбужденного состояния. Интенсивность люминесценции также равна:

I(t) = d[Q]/dt = - k [M*]= d [M*]/dt

или:

I(t) = d([M*])/dt = -k [M*]= -[M*(0)] exp (t/) = - I(0) exp (t/),

то есть кинетика люминесценции повторяет кинетику концентрации возбужденных молекул (Рис. 5А, Б). Постоянную времени затухания флуоресценции можно найти из графика кинетики затухания флуоресценции. Для этого удобней воспользоваться линеаризованным графиком (Рис. 5Б):

- ln [I(t)/I(0)] = t/,

на котором = ctg , где - угол наклона прямой.

Практически такие измерения провести трудно, так как время жизни синглетного возбужденного состояния очень мало (обычно 0,5-10 нс). Поэтому часто используют метод однофотонной фотометрии. В нем образец освещают очень коротким лазерным импульсом длительностью менее 1 нс. Он возбуждает некоторое количество молекул, которые высвечивают световые кванты через разные интервалы времени _i. При попадании фотона на фотокатод фотоумножителя генерируется короткий импульс фототока. Гистограмма распределения этих импульсов по величинам _i дает кинетику люминесценции. Для ее построения экспериментатор задает временной интервал ?t порядка нескольких сот пикосекунд, в котором подсчитываются импульсы (это время подачи сигнала на вход усилителя), и общее количество таких интервалов n. Соответственно, общее время регистрации: T = n?t. Функция зависимости числа импульсов в i-м интервале от времени (или от номера канала) как раз представляет кинетику спада флуоресценции после возбуждения. Ее более точно определяют по полученным экспериментальным точкам с помощью метода наименьших квадратов (Рис. 5А).

Нередко в состав изучаемого биологического объекта входит несколько (i) компонент с близкими спектрами флуоресценция, но с разной кинетикой затухания флуоресценции. В этом случае кинетика затухания флуоресценции представляет собой сумму из нескольких экспонент. На линеаризованном графике в этом случае они будут представлены отрезками с разным наклоном:

- ln [I(t)/I(0)] = (t/_i),

по которому можно определить число этих компонент и характерное время затухания флуоресценции _i для каждого из них.

Рис. 5. А. Кинетика спада флуоресценции после возбуждения коротким световым импульсом. Определение времени жизни возбужденного состояния на экспоненциальном (Б) и линеаризованном (В) графиках

Рис. 6. Однофотонный и фазово-модулированный методы измерения постоянной времени затухания флуоресценции: (Адаптировано из http://www.olympusconfocal.com/applications/flimintro.html)

Фазово-модулированный метод основан на измерении фазового сдвига снижения амплитуды флуоресценции при модуляции возбуждающего света с частотой щ ~ 10-20 МГц и коэффициентом глубины модуляции m:

I = I₀ (1+m cos щt)

Модулированный световой поток делится прозрачной пластинкой на два. Один (порядка 8%) идет в измерительный канал, а основная часть света во втором канале возбуждает свечение образца, также изменяющееся по синусоидальному закону (Рис. 6). Детектором света при таких измерениях может служить ФЭУ или CCD. Поскольку флуоресценция задерживается в образце на время , то колебания флуоресцентного сигнала сдвигаются по фазе на величину ? относительно возбуждающего светового потока. При экспоненциальном затухании флуоресценции величина постоянной времени связана с частотой модуляции простой зависимостью:

= щ^-1 tg (?)



Рис. 7. FLIM. изображение клеток, флуорохромированных двумя красителями: Hoechst 33342, окрашивающим ДНК, и Alexa 488, выявляющим микротрубочки. А. Монохромное флуоресцентное изображение клетки (счет по всем каналам). Б. Изображение клетки в псевдоцветах, соответствующих разному времени затухания флуоресценции ф (Г): 2000 пс (красный), 2400 пс (желтый), 2800 пс (зеленый) и 3200 пс (голубой). В. Определение постоянной времени затухания флуоресценции ф в разных пикселях клеточного изображения. Общее время регистрации 60 с с шагом 150 пс. По этим данным строились окрашенные в псевдоцвета изображения клетки, соответствующие разным ф, и совмещенные на (Б)

Различие кинетики затухания флуоресценции разных молекулярных компонент клетки позволило разработать новый метод микроскопической визуализации клеточных компонент, которые имеют перекрывающиеся спектры флуоресценции, но разное время жизни - FLIM (Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy). Он позволяет одновременно регистрировать кинетику затухания флуоресценции в каждом пикселе микроскопического изображения клетки и координаты этого пикселя, а затем построить карту пространственного распределения в клетке флуорофоров с различной кинетикой затухании флуоресценции. Для визуализации этого распределения обычно с помощью компьютерных методов строят изображение клетки в псевдоцветах, распределение которых соответствует распределению среднего времени затухания флуоресценции в различных точках. Как показывает пример, приведенный на Рис. 7, в клетке хорошо выявляется распределение хроматина и микротрубочек, окрашенных разными флуоресцентными красителями, у которых время затухания флуоресценции отличается всего на 0,4 нс.

Этот метод позволяет, также оценивать распределение рН, полярности среды, концентрации разных ионов, или напряжения кислорода в живой клетке и оценивать их изменения во времени, происходящие уже не в наносекундном временном масштабе, характерном для флуоресценции, а в более медленной, физиологически значимой секундной или минутной шкале.

4. Поляризация флуоресценции

В электромагнитной волне колебания электрического вектора перпендикулярны направлению ее распространения. Молекулы с наибольшей вероятностью поглощают излучение с электрическим вектором, колеблющимся в плоскости, параллельной дипольному моменту электронного перехода. Но в растворах молекулы имеют произвольную ориентацию. Поэтому при облучении раствора плоско поляризованным светом, прошедшим через поляризатор или излученный лазером, возбуждаться будет только та часть молекул, у которых вектор дипольного момента перехода лежит или имеет составляющую в плоскости поляризации света. В этом случае флуоресцентное излучение частично поляризовано. Наибольшая поляризация наблюдается под углом 90^о к к направлению распространения света (Рис. 8). Другое условие максимальной поляризации - высокая вязкость среды, препятствующая изменению ориентации молекулы за время возбуждения. Степень поляризации характеризуется долей поляризованного света в общем световом потоке:

P =I_p/(I_p+I_n),

где I_n и I_p - интенсивность неполяризованной и поляризованной компонент.

Рис. 8. При возбуждении молекул в растворе плоско поляризованным светом флуоресценция становится частично поляризованной

Эту величину можно найти через экспериментально определяемые компоненты света с электрическим вектором, параллельным или перпендикулярным оси Z: I и I_, соответственно. Как известно, поляризатор с идеальным пропусканием полностью пропускает свет с вектором колебаний электрической волны, параллельным его плоскости поляризации, и совсем не пропускает перпендикулярно поляризованный свет. Интенсивность неполяризованного света он уменьшает вдвое. Поэтому:

I = I_p + I_n/2; I = I_n/2

P = (I - I) / (I + I)

Если принять, что в плоскости (xy) молекула одинаково излучает в направлениях x и y, то общая интенсивность флуоресценции составляет:

I = I_x + I_y + I_z = I+ I + I = 2I + I.

Анизотропия флуоресценции определяется из соотношения:

А = (I - I) / (2I + I)

Легко видеть, что А = 2Р /(3 - Р) и Р = 3А/(2+А).

Для очень вязких растворов, где за время жизни возбужденного состояния молекул направление векторов дипольных моментов электронных переходов практически не меняется, справедлива формула Перрена-Яблонского:

P = (3 cos² -1)/(cos²+3),

При возбуждении флуоресценции неполяризованным светом:

P = (3 cos² -1)/(7 - cos²).

Определенная выше величина Р - это характеристика предельной поляризации, свойственной неподвижным молекулам. В реальности она снижается из-за вращательной диффузии молекул, которая приводит к деполяризации флуоресценции. Коэффициент вращательной диффузии равен:

D_r= RT/ =2,

где - коэффициент трения в среде, а - время вращательной релаксации.

Изучая деполяризацию флуоресценции, можно определить вязкость среды, а если говорить о сравнительно небольших молекулах флуоресцентных зондов, точнее, ее микровязкость в ближайшем микроокружении флуоресцирующей молекулы:

= A RT/(A₀-A) V₁,

где А - анизотропия флуоресценции, А₀ - предельная анизотропия, измеренная в очень вязком растворе, - среднее время жизни возбужденного состояния, V₁ - объем одного моля молекул

Деполяризация флуоресценции большинства красителей практически не проявляется в водных растворах, где их молекулы хаотично ориентированы. Но она значительно выражена в таких вязких средах, как липидный бислой биологических мембран, или микроокружение флуоресцирующих молекул внутри белковой глобулы.

Измерение деполяризации флуоресценции позволило, например, определить величину вязкости липидного слоя внутри биомембран: 100-1000 Пас. С помощью этого метода изучают комплексы флуоресцирующих веществ, например, лекарственных препаратов, с белками, а также структурные перестройки белков и биомембран при различных воздействиях, функциональных перестройках и патологических состояниях.

5. Спектры возбуждения люминесценции

Спектр возбуждения флуоресценции - зависимость интенсивности флуоресценции от длины волны возбуждающего света. Но поскольку интенсивность флуоресценции также зависит от интенсивности возбуждающего света I₀, то часто производят нормировку на I₀, определяя спектр возбуждения как:

f_в () = I_фл/I₀.

I_фл = K I₀ (1-Т) = K I₀ (),

где () - коэффициент поглощения света, то:

f_в () = K (),

а поскольку по закону Вавилова квантовый выход флуоресценции не зависит от длины волны, то спектр возбуждения совпадает по форме со спектром поглощения света. Это позволяет по спектрам возбуждения флуоресценции идентифицировать флуоресцирующие вещества и, как указывалось выше, определять их концентрацию в разбавленных растворах, у которых оптическая плотность не превышает 0,2.

6. Фотообесцвечивание красителей

В результате действия света молекулы флуорофоров могут трансформироваться. В зависимости от световой дозы диапазон этих изменений может быть очень широким - от небольших изменений структуры молекулы, связанных с нарушением слабых взаимодействий - водородных или гидрофобных связей - до ее разрушения, деградации в результате разрыва ковалентных связей. Физико-химические и, в частности, спектральные свойства образующихся фотопродуктов отличаются от свойств исходного вещества, что позволяет их обнаружить.

Рассмотрим для примера спектральное исследование процесса фотообесцвечивания гиперицина (Рис. 9) - растительного пигмента, выделенного из травы зверобой. Гиперицин - эффективный фотосенсибилизатор, применяющийся в фотодинамической терапии и диагностике опухолей. Он гидрофобен и агрегирует в водных растворах, но в фосфатном буфере, содержащем человеческий сывороточный альбумин (ЧСА), агрегация не происходит.

Рис. 9. Структура гиперицина

Спектр поглощения гиперицина содержит полосы около 280 (белковая полоса), 330, 560 и 600 нм, а также широкое плато в области 400-500 нм. Под действием оранжевого света с максимумом в полосе поглощения (л_макс = 600 нм; 100 мВт/см²) оптическая плотность раствора гиперицина снижается во всем спектре, т.е. происходит фотообесцвечивание (Рис. 10).

Рис. 10. Снижение оптической плотности раствора гиперицина после 35-95-минутного облучения оранжевым светом (л_max = 600 нм)

Спектр флуоресценции гиперицина в растворе ЧСА содержит две полосы при 608 и 648 нм (Рис. 11). Освещение снижает оба пика. При этом в области 470-580 нм появляется широкая полоса с максимумом около 520 нм, соответствующая продуктов фототрансформации гиперицина. Она лучше видна на Рис. 11Б, где все спектры нормированы на величину основного пика при 600 нм.

Рис. 11. Спектры флуоресценции гиперицина в растворе ЧСА до (сплошные линии) и после (прерывистые линии) освещения. Справа - те же спектры, нормированные на амплитуду пика при 600 нм

Рис. 12. Спектры возбуждения флуоресценции гиперицина в растворе ЧСА до (сплошные линии) и после (прерывистые линии) облучения оранжевым светом. А: л_фл = 650 нм; В: л_фл=560 нм

Изучение спектров возбуждения флуоресценции дает информацию о появлении продуктов фототрансформации красителя. В спектре возбуждения гиперицина, зарегистрированном при флуоресценции с длиной волны 650 нм (Рис. 12), наблюдаются те же основные полосы, что и в спектре поглощения света (Рис. 10), хотя соотношение их амплитуд отличается. На месте плато 400-500 нм вырисовываются две широкие полосы с максимумами при 390 и 480 нм. Облучение оранжевым светом снижает все полосы возбуждения (Рис. 12А), что соответствует убыли основной массы гиперицина в результате фотообесцвечивания. Но ситуация становится противоположной при регистрации спектров возбуждения на длине волны 560 нм, соответствующей спектру флуоресценции фотопродукта. В необлученном препарате флуоресценция практически не регистрируется, но после воздействия оранжевого света появляется спектр с максимумами около 340, 390 и 480 нм (Рис. 12Б). Положение этих максимумов близко к положению максимума 330 нм и полосы 400-500 нм в спектре поглощения света. Видимо, накапливающиеся продукты фототрансформации не сильно отличаются от гиперицина. Их химическая структура пока не установлена.

7. Восстановление флуоресценции красителей после обесцвечивания (FRAP)

Эффект фотообесцвечивания красителей может применяться при изучении процессов диффузии в клеточных мембранах и отдельных клеточных компартментах. Суть этого метода, называемого восстановлением флуоресценции после фотообесцвечивания (FRAP - fluorescence recovery after photobleaching), заключается в следующем. С помощью интенсивного лазерного луча, сфокусированного в пятно микронных размеров, локально обесцвечивают краситель, окрашивающий мембрану или определенный участок клетки. Затем вследствие диффузии красителя из соседних необлученных областей флуоресценция постепенно восстанавливается. Кинетика восстановления флуоресценции обычно экспоненциальная (Рис. 13), По ней можно вычислить коэффициент латеральной диффузии флуоресцентно меченых молекул в клетке:

D = 0,22 r² / _1/2,

где r - радиус обесцвеченной области, а _1/2 - время полувосстановления флуоресценции, определяемое по схеме, приведенной на рис. 1

Рис. 13 Восстановление флуоресценции после локального фотообесцвечивания красителя в клетке. Внизу схема измерения параметров восстановления флуоресценции

8. Миграция энергии

Электронное возбуждение молекулы может происходить не только при поглощении кванта энергии, но и при переносе энергии от другой возбужденной молекулы:

D* + A > D + A*,

где D и A - донор и акцептор энергии, а * обозначает возбужденное состояние.

Безизлучательный перенос или миграция энергии могут происходить по одному из трех механизмов: индуктивно-резонансному механизму Ферстера, экситонному или обменно-резонансному.

В первом случае, часто называемом FRET (fluorescence resonanse energy transfer), резонансное диполь-дипольное взаимодействие между электромагнитным полем электронного осциллятора возбужденной молекулы (донора энергии) и невозбужденным осциллятором молекулы акцептора индуцирует в последнем вынужденные колебания. При этом донор переходит в основное невозбужденное состояние, а акцептор приобретает способность излучать фотоны (Рис. 14). Эффективность переноса энергии достигает 100%, т.е. донор практически полностью передает свою энергию акцептору.

Условия индуктивно-резонансного переноса энергии:

- донор должен флуоресцировать;

- спектр флуоресценции донора должен перекрываться со спектром поглощения акцептора, т.е. у акцептора должен быть такой же уровень энергии, как у донора. Вероятность миграции энергии пропорциональна площади перекрытия спектров;

- Расстояние, на которое может переноситься энергия, не должно превышать некоторую критическую величину R₀, при которой донор с одинаковой вероятностью флуоресцирует и передает энергию другой молекуле. Вероятность миграции энергии пропорциональна 1/R⁶ (Рис. 14):

Для разных пар веществ R₀ составляет от 1 до 10 нм, чаще 3-5 нм.

Рис. 14. Ферстеровский индуктивно-резонансный способ миграции энергии. На графике изображена зависимость эффективности переноса энергии от расстояния между молекулами

Индуктивно-резонансная миграция энергии может происходить между энергетическими уровнями с разной мультиплетностью:

o Синглет-синглетная: D* + A A* + D

o Синглет-триплетная: D* + A A^т + D

o Триплет-синглетная: D^т + A A*+ D.

Типичное время индуктивно-резонансного переноса энергии 10^-9-10^-10 с. Ферстеровский резонанс сокращает время жизни возбужденного состояния и длительность флуоресценции донора энергии. Также снижается вероятность обесцвечивания донора. Ферстеровскую миграцию энергии можно обнаружить по появлению в спектре возбуждения флуоресценции акцептора полосы поглощения донора или по исчезновению полосы флуоресценции донора энергии в присутствии акцептора энергии.

Явление FRET широко применяется в последнее время для изучения белок-белковых взаимодействий. Для этого к изучаемым белкам присоединяют флуоресцирующие молекулы (Рис. 15). Одна служит донором энергии, воспринимающим возбуждающий свет (в данном примере это зеленый флуоресцирующий белок, GFP), а другая - акцептором. только, Когда изучаемые белки взаимодействуют и акцептор сближается с донором, донор перестает флуоресцировать и появляется флуоресценция акцептора, у которой спектр возбуждения соответствует спектру поглощения донора энергии.

Рис. 15. Применение FRET для исследования белок-белковых взаимодействий

Обменно-резонансное взаимодействие возникает при перекрывании электронных орбит молекул донора и акцептора. Такое взаимодействие возможно при существенно меньших межмолекулярных расстояниях по сравнению с индуктивно-резонансным переносом (<2 нм). В отличие от индуктивно-резонансного механизма, где происходит миграция энергии между синглетными уровнями, в обменно-резонансном механизме разрешен перенос энергии электронного возбуждения от триплетной молекулы донора на триплетный уровень акцептора.

Экситонный механизм миграции энергии также, как и индуктивно-резонансный, основан на электрических диполь-дипольных взаимодействиях между молекулами в случае тесного межмолекулярного взаимодействия при плотной квазикристаллической упаковке молекул. При этом происходит экситонное расщепление уровней энергии, энергетические уровни молекул распределяются по сравнительно большому объему, и локализация возбужденного электрона становится неопределенной. В этом случае вероятность переноса энергии между соседними молекулами резко возрастает. Требуемое для этого время составляет всего 10^-14 - 10^-12 с, что на несколько порядков меньше, чем при индуктивном резонансе. Характерные расстояния переноса энергии - до 2 нм.

9. Тушение флуоресценции

Квантовый выход флуоресценции всегда меньше единицы, потому что часть энергии электронного возбуждения теряется внутри самой молекулы на тепловые процессы или передается соседним молекулам. К внутримолекулярным энергетическим тратам относятся безизлучательные переходы между колебательно-вращательными подуровнями, между электронными уровнями с одинаковой мультиплетностью (S₁ > S₀ или T₁ > T₀) или интеркомбинационная конверсия (S₁ > T₁ или T₁ > S₀). Энергия возбуждения может также растрачиваться на фотохимическую реакцию, например, на разрыв собственных химических связей. К межмолекулярным тратам относятся безизлучательный перенос энергии на соседние молекулы с увеличением их кинетической энергии (тепловые потери), на электронное возбуждение соседней молекулы с возвратом первой молекулы на основной уровень (миграция энергии). Безизлучательная дезактивация возбужденных состояний называется тушением флуоресценции.

Вещества-акцепторы при межмолекулярном переносе энергии называются резонансными тушителями, а те, которые влияют на константу скорости внутримолекулярной конверсии - нерезонансными тушителями. При нерезонансном тушении флуоресценции обязательно столкновение возбужденных молекул флуорофора с молекулой тушителя, в результате которого происходит возмущение электронных уровней и повышение вероятности безизлучательных переходов. При резонансном тушении перенос, или миграция энергии, не требует межмолекулярного контакта.

Наиболее активными тушителями флуоресценции являются тяжелые ионы, такие как Cu²⁺, Cs⁺, I^-, Br^-; парамагнитные ионы и молекулы: нитроксильные радикалы, O₂ или Mn²⁺; молекулы растворителя, особенно воды, акцепторы энергии электронного возбуждения.

Время пребывания молекулы в возбужденном состоянии при отсутствии безизлучательной растраты энергии называют естественным временем жизни возбужденного состояния _R. После возбуждения флуоресценция экспоненциально затухает. Скорость ее затухания, т.е. скорость изменения количества флуоресцирующих молекул I=-dn/dt пропорциональна их числу n:

I = - dn/dt = k_fn = k_fn₀ e^-k_f t =I₀ e^-k_f ^t = I₀ e^-t/_R,

где k_f = 1/_R - константа скорости флуоресценции, а n₀ - исходное число молекул.

В реальности, когда часть энергии необратимо рассеивается, время жизни возбужденного состояния _f, и квантовый выход флуоресценции понижаются вследствие расхода энергии возбуждения на другие процессы:

,

где k_d - константа внутренней конверсии, k_ik - константа интеркомбинационной конверсии, Q - концентрация молекул - тушителей флуоресценции. Отсюда: _f = _Rf и k_f = _f /_f.

Если тушителя флуоресценции нет, то квантовый выход флуоресценции составит:

,

Тогда степень тушения флуоресценции тушителем можно записать в виде:

/_f = 1 + K[Q].

Это уравнение Штерна-Фольмера. В нем константа K характеризует эффективность тушения флуоресценции. Так как при тушении флуоресценции на изменяется коэффициент поглощения флуорохрома, то такое же уравнение можно написать и для отношения интенсивностей флуоресценции в отсутствие и присутствии тушителя:

I /I_f = 1 + K[Q].

10. Зависимость флуоресценции от микроокружения молекулы

Спектры и квантовые выходы флуоресценции флуорохромов сильно зависят от полярности и подвижности окружающих их молекул, т.е. от диэлектрической проницаемости и вязкости растворителя. А если флуорохром встроен в белковую макромолекулу или биомембрану - от полярности и подвижности атомных группировок в их ближайшем микроокружении.

Владимиров и Потапенко (2006) рассматривают физику этих эффектов на примере диметиламинохалкона (ДМХ), молекула которого в основном состоянии (1 на Рис. 16) является электрическим диполем с небольшим дипольным моментом (1710^-30 Клм). При растворении в разных растворителях с диэлектрической проницаемостью, возрастающей от 1,9 (гептан), до 2,4 (толуол), 17,7 (бутанол), 32,7 (метанол) и 80 (вода) максимум поглощения и особенно максимум флуоресценции ДМХ прогрессивно смещаются в длинноволновую область от 383 до 427 нм и от 436 до 560 нм.

Авторы связывают этот сдвиг с потерей энергии при реорганизации сольватной оболочки. В основном состоянии молекула окружена сравнительно небольшой сольватной оболочкой. В полярных растворителях это оболочка из дипольных молекул растворителя. Быстрый переход в возбужденное состояние, происходящий за 10^-15 с (состояние 2 на Рис. 16), приводит к повышению дипольного момента до 7710^-30 Клм. Такое повышение дипольного момента характерно и для многих других биологически значимых органических молекул. Оно вызывает поляризацию окружающих молекул растворителя, их переориентацию и дополнительную сольватацию ДМХ в течение последующих 10^-13-10^-8 с. В результате энергетических трат на эти процессы, энергия флуорохрома несколько понижается (состояние 3 на рис. 26). Затем излучается фотон флуоресценции и молекула флуорохрома быстро переходит на один из верхних подуровней основного состояния (состояние 4 на рис. 26). Его энергия выше энергии исходного состояния, т.к. молекула имеет дополнительную сольватную оболочку. В результате последующей десольватации молекула возвращается в исходное состояние. Энергетические траты на сольватацию приводят к снижению энергии излученного фотона, т.е. к длинноволновому сдвигу. Этот сдвиг высок, если возбуждение существенно повышает дипольный момент флуорохрома, если велик дипольный момент окружающих молекул, т.е. высока диэлектрическая проницаемость среды, и если высока подвижность молекул растворителя, т.е. низка его вязкость. Все это облегчает переориентацию молекул растворителя, снижает энергетические потери и вызывает длинноволновой сдвиг полосы поглощения.

Рис. 16. Изменения дипольного момента и сольватной оболочки флуорохрома в результате поглощения и излучения фотона. Дипольный момент обозначен соответствующим расстоянием между зарядами

Но такое свойство, вероятно, справедливо для дипольных молекул, а в случае гидрофобных веществ сдвиг может быть противоположным. Например, при переходе от неполярной среды (мембраны липосом или клеток) к полярной (метанол) полосы поглощения (555 и 596 нм) и флуоресценции (602 и 651 нм) гиперицина смещаются в коротковолновую область спектра до 546 и 589 нм и 595 и 645 нм, соответственно. Возможно, в данном случае более важную роль играла не полярность среды, а подвижность молекул в ближайшем микроокружении хромофора. Красный спектральный сдвиг обычно происходит при повышении вязкости микроокружения хромофора, когда подвижность молекул ограничена и больше энергии расходуется на реорганизацию среды вокруг возбужденной молекулы хромофора. Внутри мембран гиперицин локализуется в вязком липидном микроокружении, где его подвижность ограничена по сравнению с метанолом, в котором наблюдается более коротковолновое поглощение и флуоресценция.

11. Флуоресценция белков

Флуоресценция белков обусловлена флуоресценцией аминокислотных остатков, наиболее интенсивно поглощающих ультрафиолетовое излучение - триптофана, тирозина и фенилаланина. Основные параметры флуоресценции этих аминокислот в водных растворах приведены в таблице У триптофана и тирозина примерно одинаковые квантовые выходы флуоресценции, но поскольку молярный коэффициент поглощения на порядок больше, чем тирозина, то и флуоресцирует он сильнее; флуоресценцией остальных аминокислот можно пренебречь.

Таблица 1. Квантовый выход и максимум спектра флуоресценции хромофорных аминокислот

Аминокислота	(max), нм
Триптофан	348	0,20
Тирозин	303	0,21
Фенилаланин	282	0,04

Спектры и квантовые выходы флуоресценции белков не тождественны спектрам и квантовым выходам флуоресценции эквимолярной смеси соответствующих аминокислот и зависят от структурной организации белковых молекул. Они изменяются при нарушении вторичной и третичной структуры белка и даже при более тонких структурных изменения. Вклад тирозиновой компоненты в общую флуоресценцию белка проявляется, когда в белке отсутствует триптофан.

Тирозиновая компонента имеет максимум при 303 нм, как и для свободного тирозина, и не изменяется при денатурации белка. Но квантовый выход флуоресценции тирозина в разных белках сильно варьирует. В составе белков он на порядок ниже, чем в водном растворе и сильно зависит от своего микроокружения. Например, в рибонуклеазе квантовый выход флуоресценции трех наружных тирозиновых остатков, обращенных в водную среду равен примерно 0,03, а трех остальных, находящихся внутри белковой глобулы, - всего 0,00 Возможно, низкий кантовый выход флуоресценции внутренних тирозинов обусловлен ее тушением карбоксильными группами глутаминовой и аспарагиновой аминокислот, дисульфидными мостиками и другими факторами. Хотя изменение квантового выхода не позволяет судить о характере микроокружения тирозина, но все же этот параметр можно использовать как конформационно-чувствительный тест. После денатурации рибонуклеазы квантовый выход флуоресценции ее тирозиновых остатков повышается до 0,055.

Вклад триптофановой компоненты в ультрафиолетовую флуоресценцию доминирует даже в сывороточном альбумине человека, в котором на единственный триптофан приходится 17-18 тирозинов и 33 фенилаланина. Спектры флуоресценции триптофана в разных белках сдвинуты в коротковолновую область по сравнению со свободным триптофаном (348-350 нм) и сильно различаются. Например, у рибонуклеазы максимум спектра флуоресценции приходится на 325 нм, а у сывороточного альбумина человека - на 343 нм. При денатурации белков максимум спектра флуоресценции сдвигается к 350 нм, как у свободного триптофана. По всей вероятности, положение максимума триптофановой флуоресценции зависит от микроокружения этой аминокислоты, которое определяется при укладке полипептидной цепи в глобулу.

Квантовый выход флуоресценции триптофана также сильно зависит от структуры белка и различается у разных белков. Например, у лизоцима он равен 0,08, а у пепсиногена - 0,27. После денатурации он становится равным 0,2, как у водного раствора триптофана. Предполагается несколько причин изменения квантового выхода флуоресценции триптофана при включении его в состав белковой глобулы:

- Утрата заряженных групп - NH₃⁺ и - COO^- в полипептидной цепи и последующее тушение флуоресценции (эффект пептидной связи);

- Взаимодействие с триптофана с дисульфидной группой, остатками гистидина или карбоксильными группами аспарагиновой и глутаминовой аминокислот может усилить внутреннюю конверсию и безизлучательные переходы, что также снижает квантовый выход;

- Повышение квантового выхода может быть обусловлено более гидрофобным микроокружением триптофанила в белке по сравнению с раствором, ограничением его подвижности и, значит, снижением вероятности безизлучательных переходов.

Согласно правилу Каша и закону Вавилова, спектр и квантовый выход флуоресценции не зависит от длины волны возбуждающего света. Но во многих белках, содержащих несколько триптофанилов, это не выполняется благодаря их гетерогенности и, как следствие, вследствие разного поведения. Эта гетерогенность, вероятно, обусловлена их различным микроокружением в белковой глобуле. На основании многочисленных экспериментальных данных была составлена эмпирическая схема зависимости спектров поглощения и флуоресценции триптофанилов от их микроокружения (Рис. 17).

Рис. 17. Сдвиги спектров поглощения и флуоресценции аминокислот в разных областях белков. 1 - красный сдвиг и спектра поглощения, и спектра флуоресценции наблюдается в случае отрицательного заряда вокруг триптофанила. 2 - синий сдвиг обоих спектров наблюдается, если заряд вокруг триптофанилов отрицателен. 3 - сближение полос поглощения света и флуоресценции происходит при повышении гидрофобности (уменьшении полярности) микроокружения триптофанила. 4 - Удаление полос друг от друга происходит при уменьшении гидрофобности (повышении полярности) микроокружения триптофанила

Согласно Фрайфелдеру (1980), эти эмпирические правила следующие:

1. Максимум спектра флуоресценции триптофана (_max) смещается влево, в коротковолновую область, а интенсивность возрастает при уменьшении полярности растворителя. Из этого следует:

- Если белок находится в воде и при этом _max смещена влево относительно положения максимума триптофана в воде, то триптофан должен находиться внутри глобулы в гидрофобном микроокружении.

- Если белок находится в неполярной среде и при этом _max смещена влево относительно положения максимума триптофана в воде, то триптофан должен находиться на поверхности глобулы или попадать туда в результате вызванного растворителем конформационного перехода.

2. Если вещество-тушитель флуоресценции, например, иодид или нитрат, тушит флуоресценцию триптофана или тирозина, то последние должны находиться на поверхности глобулы. Если же тушение не наблюдается, то либо аминокислота находится внутри глобулы, либо она окружена электрическими зарядами, отталкивающими этот тушитель.

3. Если вещество, не влияющее на квантовый выход свободного триптофана или тирозина, влияет на флуоресценцию, когда они входят в состав белка, то оно делает это путем конформационной перестройки белка.

4. Квантовый выход флуоресценции триптофанила и тирозинила понижается при протонировании карбоксильной группы.

5. Флуоресценция триптофана может тушиться близлежащими протон-донорными группами.

6. Если связывание какой-то молекулы с белком приводит к тушению флуоресценции триптофана, то либо она индуцирует большую конформационную перестройку белка, либо часть триптофанилов находится вблизи центра связывания этой молекулы.

7. Если связывание молекулы-тушителя флуоресценции с белком снижает флуоресценцию триптофана, то триптофан находится вблизи места связывания этой молекулы.

Таким образом, можно:

- различать «полярные» триптофанилы, находящиеся на поверхности глобулы, у которых _max 350 нм и 0,2 и «неполярные», находящиеся в гидрофобном окружении внутри белка, характеризующиеся _max 330 нм и 0,05.

- Оценивать гетерогенность триптофановых остатков.

- Оценивать полярность их микроокружения.

- Изучать доступность этих остатков к разным веществам, добавляемым в раствор и следить за ней при конформационных превращениях белка.

- Обнаруживать структурные конформационные переходы в белках при разных воздействиях.

- Исследовать кинетику этих переходов.

- Изучать условия их осуществления (температура, рН и т.д.)

- Определять термодинамические параметры таких переходов.

Основные преимущества флуоресцентного метода - практическая безинерционность и исключительно высокая чувствительность, позволяющая работать с очень малыми количествами исследуемых веществ. Если с помощью спектрофотометра можно определить 10^-8-10^-9 М какого-то вещества, то флуоресцентный метод позволяет обнаруживать концентрации 10^-10-10^-12 М. Точность измерения интенсивности флуоресценции ограничена различными причинами: светорассеянием; экранировкой возбуждающего и испускаемого света другими молекулами; реабсорбцией (поглощением фотонов в толще образца) флуоресценции молекулами среды; гетерогенностью биообъектов, миграцией энергии, тушением флуоресценции и т.д.

12. Флуоресценция нуклеиновых кислот

В отличие от белков, нуклеотиды и нуклеиновые кислоты, ДНК и РНК, практически не флуоресцируют вследствие высокой вероятности безизлучательной дезактивации возбужденного состояния. Время жизни их возбужденных состояний порядка 10^-11-10^-10 с. Квантовые выход флуоресценции меньше 0,01.

13. Собственная флуоресценция клеток

Практически все клетки кроме эритроцитов способны флуоресцировать в ближнем ультрафиолетовом и видимом диапазонах. Флуоресценцию клеток можно регистрировать как с помощью спектрофлуориметров в кюветах с клеточной суспензией или гомогенатом, так и в микроскопическом варианте с помощью флуоресцентного микроскопа непосредственно в живой клетке.

Для регистрации ультрафиолетовой флуоресценции микроскоп должен быть оборудован ртутной лампой, излучающей ультрафиолетовый свет, кварцевой оптикой, светофильтром, выделяющим возбуждающий свет с длиной волны от 250 до 300 нм (_max = 280 нм), и запирающим светофильтром, не пропускающим свет с длиной волны короче 300 нм, но пропускающим ультрафиолетовое излучение с длинами волн в области 300-350 нм. Наиболее интенсивная ультрафиолетовая флуоресценция наблюдается в цитоплазме, а ядра практически не флуоресцируют. Наибольший вклад во флуоресценцию клеток вносит свечение митохондрий, в мембраны которых встроено большое количество белков. Спектры флуоресценции клеток совпадают со спектрами белковых триптофанилов (_max 330-335 нм), находящихся в гидрофобном микроокружении либо внутри белковых глобул, либо внутри митохондриальных мембран, в которые встроены эти белки.

В видимой области (сине-зеленый диапазон) также интенсивней всего флуоресцируют митохондрии, в которых сосредоточены флавопротеины и рибонуклеопротеины, содержащие никотинамидадениндинуклеотид (NAD). При возбуждении с длиной волны 340 нм флуоресцирует восстановленная форма пиридиннуклеотида NADH, максимум флуоресценции которого в водной среде 470 нм, а в составе белков - 440 нм. Окисленная форма NAD⁺ не поглощает ультрафиолет и не флуоресцирует. Поэтому по флуоресценции можно судить о степени восстановленности NAD. Флуоресценцию окисленных флавинов, прежде всего флавинаденинмононуклеотида (FMN) и флавинадениндинуклеотида (FAD), удобно возбуждать в синей области спектра при 450 нм, а регистрировать в зеленой области (520 нм). Восстановленные флавины, в отличие от пиридиннуклеотидов, не флуоресцируют. По соотношению флуоресценции при 440-470 и 520 нм можно определить соотношение восстановленных пиридиннуклеотидов и окисленных флавинов в клетке и, соответственно, оценить интенсивность биоэнергетических процессов и ее изменения при различных воздействиях. В качестве примера на рис. 18 приведена микрофотография голубой аутофлуоресценции пиридиннуклеотидов и зеленой флуоресценции флавинов в теле одиночных нервных клеток.



Рис. 18. Аутофлуоресценция механорецепторного нейрона рака. А. Изображение нейрона в проходящем свете. Б. Голубое свечение пиридиннуклеотидов. В. Зеленое свечение флавинов в теле клетки. Масштабный отрезок 20 мкм