Действие экстракта гриба Fusarium на биохимические показатели прорастания семян

Размещено на http://www.allbest.ru/

Введение

гриб fusarium культурный растение

Актуальность работы. Высокая поражённость посевного материала внешней патогенной микрофлорой наряду с большим процентом развития болезни, выявленной на основе фитоанализа семян ячменя, требуют особого внимания при выращивании зерновых культур.

Применение химических протравителей, популярное до недавнего времени, в настоящий момент требует пересмотра по нескольким причинам:

· отрицательное влияние на человека;

· остатки химических препаратов накапливаются в почве, воде, продуктах питания;

· химические препараты способствуют появлению устойчивых возбудителей болезней;

· химические препараты нарушают биологическое равновесие между ризосферой живых организмов.

Современные научные разработки и практический опыт показывают, что применение различных биологических средств, наряду с охраной окружающей среды и здоровья людей, обеспечивают высокую техническую и экономическую эффективность.

Широкую известность в последнее время приобрёл биологический препарат «Флоравит Э», представляющий собой сбалансированный комплекс субстанций, полученных путем ферментации и экстракции биомассы гриба Fusarium sambucinum. В медицине БАД «Флоравит Э» (водный и масляный растворы) применяют для немедикаментозного регулирования и поддержания функций желудочно-кишечного тракта, печени, коррекции иммунитета [37], в комплексной терапии геморроя [2], регуляции репродуктивной функции человека [14]. В звероводстве на норках и песцах с положительным результатом применяется в качестве кормовой добавки [23].

Одним из важнейших условий успешного развития животноводства является обеспеченность хозяйств зерновыми кормами высокого санитарного качества. Загрязненность зернофуража токсинами, которые образуют грибы рода Fusarium, приводит к значительному экономическому ущербу, поскольку в последние годы поражение злаковых культур фузариозом отмечается в нашей стране практически повсеместно. В отдельные периоды, особенно в условиях повышенной влажности и температуры, заболевание способно приобретать характер эпифитотий.

Однако в последние годы во многих странах интенсивно изучается возможность использования непатогенных штаммов Fusarium sp. для защиты растений от фузариозов.

Целью работы является выявление действия экстракта гриба Fusarium sambucinum на биохимические показатели прорастания семян. Для решения намеченной цели были поставлены следующие задачи:

· изучить влияние фузариума на морфометрические показатели прорастания культур;

· изучить влияние штамма Fusarium sambucinum на активность каталазы в проростках ячменя и некоторые показатели перекисного окисления липидов (ТБК-реагирующие соединений);

· изучить воздействие штамма гриба Fusarium sambucinum на содержание фенольных соединений и проантоцианидинов в проростках ячменя;

· определить разведение гриба Fusarium, оказывающее наиболее выраженный эффект на показатели прорастания семян.

Объект исследования: семена злаков - ячмень.

Предмет исследования: морфометрические характеристики (количество и длина корешков, масса семян), активность каталазы, содержание фенольных соединений, проантоцианидинов, ТБК-реагирующих соединений.

Новизна работы: впервые было исследовано воздействие экстракта непатогенного штамма гриба Fusarium на ячмень.

1. Аналитический обзор литературы

1.1 Биологическая характеристика грибов рода Fusarium

Систематическое положение: царство Fungi, отдел Ascomycota, класс Ascomycetes, подкласс Sordariomycetidae, порядок Hypocreales, семейство Nectriaceae [19].

У многих видов этого рода имеются только конидиальные спороношения и отсутствует половая стадия. (У других известны половые совершенные стадии.) Конидиальное спороношение у фузариумов чрезвычайно разнообразно по морфологии и способу образования конидий. Грибы этого рода имеют два типа конидий -- макро- и микроконидии.

Макроконидии образуются в воздушном мицелии на простых или ветвящихся конидиеносцах, или представляют собой скопления массы конидиеносцев в виде спородохиев, или образуют пионоты. Макроконидии большей частью с 3--5 перегородками, реже с 6--9, веретеновидные, веретеновидно-серповидные, серповидные, реже ланцетовидные [24]. У основания конидий имеется четко или слабовыраженная ножка, или конидии лишены ее. Верхняя клетка макроконидий имеет характерную форму: она удлиненная или заостренная, может быть тупая или клювовидная и другой формы. В массе макроконидии светлоокрашенные (белоохряные, охряно-розовые, оранжевые, синие, сине-зеленые). Диагностическое значение имеют размеры макроконидий, характер их изогнутости, форма верхней клетки, наличие ножки у основания, количество перегородок.

Микроконидии образуются обычно в воздушном мицелии на простых или сложных конидиеносцах, в цепочках или собраны в головки, а также часто в виде скоплений между гифами мицелия. Конидии одноклетные, реже с одной и еще реже с 2--3 перегородками, обычно овальные, яйцевидные, эллипсовидные, реже шаровидные, грушевидные и веретеновидные. При диагностике наличие или отсутствие микроконидий может быть использовано только в случае их обильного и относительно постоянного образования [10].

Мицелий хорошо развитый, войлочно-пушистый, паутинистый, бело-розовый, белый, красный, светло-кремовый, соломенно-желтый, серовато-сиренево-лиловый или буроватый.

Кроме того, у отдельных видов рода фузариум в мицелии (а иногда в конидиях) образуются хламидоспоры -- одноклетные части гиф, обособляющиеся от остальных клеток толстой оболочкой. Последние обычно бесцветные, реже окрашены в охряно-коричневые тона. Могут быть единичные или собраны в узлы, иногда в виде цепочек.

В некоторых случаях у этих грибов образуются склероции -- тесное скопление гиф роговидной консистенции беловатого, желтоватого, коричневого или синего цвета. Это покоящаяся стадия. Развиваются они чаще всего в тканях субстрата или в почве и служат у этих грибов, как и хламидоспоры, для перезимовки и перенесения неблагоприятных условий, способствуя тем самым сохранению вида [42].

Большинство видов рода - сапротрофы, некоторые - факультативные паразиты высших растений с различной степенью паразитизма.

1.2 География грибов рода Fusarium

Грибы рода фузариум широко распространены в природе. Виды этого рода, как и другие микроскопические грибы, участвуют в общем круговороте веществ в природе. Обладая большим разнообразием ферментов, они способны разрушать органические соединения. Отдельные виды рода фузариум обладают свойством синтезировать различные биологически активные вещества (например, витамины, антибиотики и токсины). Грибы этого рода развиваются преимущественно в почве, однако могут существовать на различных растительных и животных субстратах в воде и других местах обитания [24].

Фузариум сохраняется в почве, на растительных остатках, а частично и в самих растениях в виде мицелия, хламидоспор, а в случае наличия сумчатой стадии -- в виде перитециев. Конидии этого гриба могут переноситься водой, насекомыми, орудиями производства и воздушными течениями. Лучшее развитие грибов из рода фузариум, как и многих других, происходит при повышенной влажности воздуха и почвы. Немаловажным фактором для их существования является также тепло. Сочетание необходимой температуры и влажности обусловливает массовое развитие этих грибов.

Род фузариум в целом представляет обширную биологически неоднородную группу грибов. Среди них есть и достаточно выраженные паразиты растений, и группы полупаразитов, способных поражать только ослабленные организмы, и, наконец, сапрофиты, живущие на растительных остатках, в почве и на отмерших частях растений. Известны фузариумы, паразитирующие на насекомых, а также вызывающие микозы и токсикозы человека и теплокровных животных.

Грибы из рода Fusarium широко распространены в природе и являются возбудителями заболеваний более 200 видов культурных растений, вызывая их увядание и гибель [26].

Виды рода Fusarium широко распространены в Сибири - в зонах тайги, подтайги, северной лесостепи (увлажненные годы), в Прибалтике, Белоруссии, Молдавии, Литве, Нечерноземной зоне и центральной части европейской территории России, на Северном Кавказе, а также в Ставропольском крае [40].

Биология видов рода Fusarium связана с условиями среды обитания, поэтому, чтобы знать, с какими расами фитопатогенов бороться, необходимо, в первую очередь определить область их распространения, которая зависит от агроклиматических условий. Например, в России и за ее пределами распространённость F. graminearum как основного возбудителя фузариоза колоса и других болезней фузариозной этиологии очень широка.

Надо отметить, что в Канаде, США, Австралии, Китае, Южной Корее, ЮАР, Венгрии, Болгарии, Румынии F. graminearum является основным возбудителем фузариоза колоса зерновых культур. Серьёзные эпифитотии наблюдались в 1940, 1942, 1945, 1957, 1967, 1980, 1985 гг. в Канаде; в 1910, 1918, 1926, 1982 гг. в США; в 1951 г. в Австралии. В Китае за последние 30 лет вспышки фузариоза колоса наблюдались 8 раз, в Болгарии в 1974 - 1976 гг. отмечено сильное развитие фузариоза колоса и корневых гнилей. Эпифитотии болезни возникали в 1970, 1987, 1991 и 1996 гг. в Венгрии [18].

В Финляндии, Норвегии, Северной Ирландии, Германии, Польше, Чехии, Словакии, Венгрии, Словении, Румынии, Франции, Италии, Индии, в ЮАР, в большинстве районов США широко распространены грибы рода Fusarium, вызывающие сухую гниль клубней [24].

1.3 Фузариоз растений

1.3.1 Признаки поражения

При фузариозе поражаются сосудистая система (фузариозное увядание) и ткани растения (гниль корней, плодов и семян). При фузариозных увяданиях поражения и гибель растений происходят из-за резкого нарушения жизненных функций вследствие закупорки сосудов мицелием гриба и выделения им токсических веществ. У пораженных растений наблюдается плохое цветение, пожелтение и опадание листьев, потемневшие слаборазвитые корни, общее увядание. На срезе стебля и листьев видны темные сосуды. При температуре ниже +16°С больные растения достаточно быстро погибают.

На луковицах, чаще у донца появляются вдавленные внутрь красновато-бурые пятна (поэтому фузариоз у луковичных очень часто называют красной гнилью), которые при повышенной влажности покрываются розовато-белым налетом. При хранении болезнь быстро прогрессирует и луковицы загнивают, являясь при этом серьезным источником инфекции.

Фузариозные увядания особенно опасны для всех луковичных растений, неорегелии, розы, хризантемы, эхмеи, антуриума, герберы, цикламена, бальзамина, зигокактуса и других членистых кактусов.

1.3.2 Фузариоз корней - корневые гнили

Корневые гнили пшеницы, ржи, ячменя, овса относятся к числу внешне малозаметных, но весьма вредоносных заболеваний хлебных злаков. Возбудителями корневых гнилей являются широко распространенные виды грибов, живущие на оболочках и внутри семян, в почве и на остатках отмерших растений. Они поражают многие виды растений из самых разнообразных семейств, легко переносят различные климатические и почвенные условия.

Корневые гнили хлебных злаков-инфекционные заболевания, вызываемые полупаразитными грибами (одним или комплексом) родов: Drechslera, Fusarium, Ophi-obolus, Cercosporella и других, приводящие к загниванию, разрушению корневой и прикорневой частей растений или к поражению сосудистой системы, в результате чего наблюдаются угнетение растений, пожелтение и засыхание листьев, белостебельчатость, белоколосица, задержка колошения, щуплость зерна и пустоколосость, а также гибель продуктивных стеблей. Инфекция корневых гнилей накапливается в почве, особенно при бессменном выращивании хлебных злаков, на растительных остатках, в ряде случаев возможна передача инфекции с семенами.

Корневые гнили по типу проявления объединяют разнообразные болезни: гнили проростков, ожог проростков, корневая гниль, гниль основания стебля, гниль узла кущения, надлом стебля и др. Термин корневая гниль охватывает болезни, возбудители которых проникают из почвы в корневую систему или основание стеблей.

Признаки различных гнилей сходны друг с другом. Часть растений бывает заражена двумя, тремя возбудителями. Симптомы болезней могут изменяться также в результате присутствия на пораженном органе сапрофитных микроорганизмов. Поэтому в полевых условиях распознать их бывает нелегко.

Источниками первичной инфекции являются семена, почва и растительные остатки. Патогенные грибы способны сохраняться в почве в течение нескольких лет Продолжительность выживания при отсутствии основных хозяев зависит от того, в какой форме гриб сохраняется. Так, конидии видов рода Helminthosporium сохраняют жизнеспособность до 3 лет, конидии и аскоспоры Ophiobolus graminis - 2 - 4 года, ооспоры представителей из родов Pythium и Aphanomyces - до 5 лет и более, хламидоспоры видов Fusarium - свыше 5 лет. Некоторые виды грибов, являясь обитателями почвы, могут сохранять жизнеспособность чрезвычайно долго, в связи с чем севообороты в борьбе с ними часто не дают должного эффекта.

Возбудители корневых гнилей обладают широкой специализацией, способны поражать не только хлебные и дикорастущие злаки, но и растения из других семейств. Это свойство помогает патогенам выживать в течение многих лет в отсутствии основных хозяев.

Корневые гнили широко распространены в различных зонах страны.

Фузариозная корневая гниль

Возбудители - виды грибов рода Fuzarium (F. culmorum Sacc, F. avenaceum Sacc, F. oxysporum Schl.). Эта болезнь - одна из главных причин гибели всходов и раннего усыхания растений на корню. Поражаются корни и узел кущения; на растениях образуются продольные темные пятна, которые впоследствии буреют, загнивают. Нередко у основания стебля наблюдается розовый налет, состоящий из мицелия и конидий гриба. Листья желтеют и отмирают. Первичные и вторичные корни, подземные междоузлия также отмирают. У более взрослых растений нижняя часть стебля становится бурой, возникает белостебельность.

Сохраняется возбудитель на семенах, растительных остатках, в почве в форме грибницы, хламидоспор. Распространяется через почву, а также путем заражения колоса и семян конидиями. Устойчивых сортов к болезни нет.

1.3.3 Пораженность сортов ярового ячменя фузариозом колоса в Республике Беларусь

В конце XX ? начале XXI века на посевах ярового ячменя все чаще отмечаются вспышки развития фузариоза колоса (возбудители грибы р. Fusarium Link: Fr. ). При благоприятных условиях болезнь может вызывать снижение урожая до 40-60% и более. В результате поражения колосьев резко ухудшаются посевные, товарные и питательные качества зерна [7].

Ячменное поле республики представлено в основном посевами яровых сортов. На территории Беларуси в Государственный реестр сортов, опущенных для возделывания, включено 24 сорта ярового ячменя, из них 13 пивоваренных сортов и 11 кормовых.

Сорта различаются по срокам созревания: раннеспелые (скороспелые), среднеспелые и среднепоздние, и по направлению использования: кормовые и пивоваренные. В зависимости от погодных условий вегетационного сезона они поражаются в разной степени возбудителями болезней колоса.

В условиях 2002 г., из-за сложившихся погодных условий (высокая температура и низкая влажность воздуха, отсутствие атмосферных осадков), в фазе колошения культуры пораженность сортов фузариозом колоса была низкой. Распространенность болезни варьировала от 4,0 до 18,0%. Наибольшее развитие фузариоза колоса (2,0-4,5%) отмечено в группе позднеспелых пивоваренных сортов, немного ниже (1,5-2,5%) в кормовых.

В условиях 2003 г. степень поражения позднеспелых пивоваренных сортов ячменя находилась в пределах 20,0-31,3% при развитии болезни - 5,3-8,0, раннеспелые - 12,0-13,3 и 2,7-3,7% соответственно.

В вегетационном сезоне 2004 г. пораженность фузариозом колоса сортов ярового ячменя колебалась в пределах 26,0-56,0%, а степень поражения варьировала от 6,5 до 16,5% (рис.1).

Рис. 1. Степень поражения фузариозом колоса сортов ячменя на полях сортоиспытательных станций и участков Республики Беларусь (данные маршрутных обследований 2004-2005 гг.)

1.4 Патологическое действие токсинов грибов рода Fusarium

Фузариозные зерна обычно легковесные и плохого качества, теряют жизнеспособность или являются причиной гнили проростков. Рост грибов приводит к накоплению в пораженном зерне токсических метаболитов (микотоксинов), опасных для здоровья людей и животных [9].

Грибы рода Fusarium продуцируют сильные микотоксины, которые в химическом и токсико-биологическом отношении образуют несколько неоднородных групп:

Трихотеценовые микотоксины

Трихотецены представляют собой группу токсинов, состоящую из более чем 170 сходных по строению веществ, оказывающих одинаковый токсический эффект при разных летальных дозах. По своим химическим свойствам вещества можно разделить на два основных типа: тип А и тип Б в зависимости от характера их воздействия на продуктивность животных. К трихотеценам типа А относятся, помимо прочих, токсин Т-2, токсин НТ-2, диацетоксискирпенол (ДАС) и неозоланиол (НЕО). Обычно они в 10 раз токсичнее, чем трихотецены типа Б, к которому относятся: диоксиниваленон (ДОН, также известный как вомитоксин) и его 3-ацетил и 15-ацетил производные (3-АцДОН и 15-АцДОН соответственно), ниваленон (НИВ) и фузаренон Х [11].

Токсическое действие трихотеценов проявляется главным образом в форме обширного воспаления слизистых оболочек пищеварительного тракта, вплоть до некротического. Они поражают также нервную и сердечно- сосудистую системы, печень, подавляют иммунитет. Синдром при отравлении трихотеценовыми микотоксинами у теплокровных характеризуется рвотой, диареей, абортами, некротическими ангинами, кровоизлияниями, гематологическими нарушениями и нервными расстройствами. Также трихотецены повышают чувствительность организма к патогенным микроорганизмам: кандидам, сальмонеллам, криптококку, микобактериям, листериям, к вирусу герпес симплекс типа 1.

Трихотеценам свойственно дермонекротическое действие: они легко определяются пробой на коже кролика и часто заканчиваются летально.

Эти токсины продуцируются: F.graminearum (ДОН);F.sporotrichiella, F.sambucinum, F.tricinctum (Т-2); F.nivale (ниваленон) и др. видами грибов рода Fusarium

Зеараленоновые микотоксины

К этой группе микотоксинов относятся: F2-токсин (зеараленон), FES, RAL. Основным токсином этой группы является зеараленон [zearalenone (zea - кукуруза, RAL - rezorcylie acid lactone )] и его производные (?- и ?-зеараленон), которые характеризуются отсутствием дермонекротической реакции и летальности, даже при введении очень высоких доз [35].

Зеараленоновые микотоксины, обладая эстрогеноподобным действием, стимулируют рост яичников и матки, провоцируя наступление течки. У свинок наблюдаются все видимые признаки наступления половой охоты, несмотря на отдаленность возраста половой зрелости, что даже может привести к случке, но в конечном итоге течка оказывается ложной. Другими объективными симптомами отравления у свинок служат вагиниты, отек вульвы (у хрячков - препуция), набухание молочных желез, аноэстроз, продолжающийся вплоть до 50 дней, удлинениями полового цикла, а также выпадениями влагалища и прямой кишки. У свиноматок и молодых племенных свиней заболевание проявляется в гибели эмбрионов, уменьшении веса матки или веса эмбрионов, рождении слабых поросят, искривлении конечностей и увеличении размеров вульвы у поросят, а также сопровождается вульвовагинитами, нарушениями полового цикла, снижением оплодотворяемости, абортами, мертворождениями и уродствами плодов. Токсин также отрицательно влияет на подвижность, количество и качество сперматозоидов в сперме хряка.

Эти микотоксины чаще всего загрязняют зерновые корма, особенно кукурузу, пшеницу, выделяются в зеленой траве (часто в травяной муке), силосе и др [11].

Продуцируются: F.graminearum, F.roseum, F.moliniforme и др.

Фумонизины

Продуцируются грибом F.moliniforme, имеющим широкое распространение. Токсическое действие фумонизинов выражается в снижении продуктивности, поражении печени, почек, иммуносупрессии, нервных явлениях. К фузариотоксикозам восприимчивы лошади, КРС, МРС, свиньи и птица. Описаны случаи тяжелых алиментарных токсикозов у людей, возникших при поедании хлеба, изготовленного из зерна, пораженного фузариями.

Заражение происходит алиментарным путем, и, чем выше продуктивность животных или птицы и интенсивнее протекают в их организме обменные процессы, тем сильнее сказывается на них присутствие в корме микотоксинов [38].

Особенно чувствительными к фузариотоксинам являются свиньи. Заболевание возникает у них, как правило, в осенне-зимний период, когда свиньям скармливают кукурузу, пораженную токсигенными грибами в поле или на складах. Болеют животные всех возрастных групп, но чаще поросята 1-6 месячного возраста. Летальность может достигать 50-80%.

Течение заболевания острое, подострое и хроническое. Течение и клиническое проявление микотоксикоза зависят от количества микотоксина, попавшего в организм; степени токсичности корма; длительности воздействия токсина на животное и стойкости организма [37].

1.5 Интегрированная система защиты растений

Защита посевов зерновых культур включает комплекс мероприятий, направленных на повышение всхожести семян и защиту растений от источника инфекций; уничтожении сорняков - конкурентов за обеспеченность элементами минерального питания, влагу и свет; защиту растений от вредителей и болезней, во многом определяющих продуктивность культур и качество получаемой продукции.

Необходимым условием достижения максимальной эффективности при внедрении приемов защиты зерновых культур от вредных организмов и получения высоких урожаев отличного качества является полное соблюдение агротехники возделывания растений (способ обработки почвы, система удобрений, подбор сортов, соблюдение севооборотов), принятой для данной природно-климатической зоны [25].

Следует соблюдать севооборот, своевременно проводить уборку на семенных участках, осуществлять сушку, воздушно-тепловой, солнечный обогрев и протравливание семян рекомендованными препаратами. Яровые нужно сеять в оптимально ранние сроки, озимые - в оптимально поздние. Следует тщательно выбирать глубину заделки семян. Под злаки нужно вносить органические удобрения, активизирующие деятельность антагонистов, проводить известкование кислых почв, вносить фосфорно-калийные удобрения, осуществлять подкормку всходов осенью и весной. Лущение стерни и ранняя зяблевая вспашка, использование относительно устойчивых сортов также помогут избавиться от корневых гнилей.

Уборка хлебов в сухую погоду в сжатые сроки. Просушивание зерна до нормальной влажности (12-14%). Прогревание продовольственного зерна в сухом виде при 80-90° в течение нескольких часов (ослабляется ядовитое свойство). Просушивание, проветривание и прогревание на солнце посевного зерна.

Действенными средствами борьбы является использование приемов агротехники в сочетании с химическими средствами защиты растений. Согласно исследованиям сотрудников лаборатории фитопатологии РУП «Институт защиты растений», наиболее эффективными препаратами против возбудителей фузариоза на ячмене являются: Максим, КС (флудиоксанил, 25 г/л) -- 2,0 л/т; Кинто ДУО, ТК (тритиконазол, 20 г/л + прохлораз, 60 г/л) -- 2,0--2,5 л/т; Ламадор, КС (протиоконазол, 250 г/л + тебуконазол, 150 г/л) -- 0,2 л/т [43].

Химическая защита растений от фитопатогенов пока занимает ведущее место в арсенале мер борьбы, особенно в системах интенсивных технологий возделывания сельскохозяйственных культур. Однако она не является экологически безопасной и должна сочетаться с биологическими средствами защиты. Последние следует рассматривать как важную, неотъемлемую компоненту интегрированной системы защиты в современном растениеводстве, а в ряде случаев и как единственное средство контроля фитопатогенов. Например, в защищенном грунте, где по решению Минздрава уже с 1990 г. полностью запрещено применение химических пестицидов.

В основе биологического метода защиты растений от фитопатогенов (биологического контроля) лежат природные, естественные явления сверхпаразитизма и антибиоза (антагонизм, фунгистазис, супрессивность), регулирующие взаимоотношения между сапрофитной, паразитной и патогенной микробобиотой [30]. Наиболее значительна роль антибиоза в ризоплане - зоне, окружающей корни и корневые волоски в пределах до 100 мкм, входящей в состав ризосферы. Использование этих регуляторных механизмов направлено не на полное уничтожение популяции фитопатогена, а на существенное ограничение ее развития и значительное снижение вредоносности. Поэтому при осуществлении биологического контроля наибольший практический интерес представляют микроорганизмы-антагонисты (в особенности продуценты антибиотиков) и гиперпаразиты. Последние в ходе сопряженной эволюции с грибами-хозяевами создали динамическую равновесную систему (гомеостаз), обеспечивающую сохранение и воспроизводство обоих компонентов в естественной природной среде.

Использование различных биопрепаратов для контроля фитопатогенов является одним из перспективных методов биологической защиты растений от микозов, бактериозов, вирозов и фитонематод. В свою очередь, поиск высокоэффективных биоагентов должен осуществляться с учетом того, что основными естественными врагами фитопатогенных грибов являются грибы-гиперпаразиты и антагонисты, меньше - бактерии, еще меньше - актиномицеты и вирусы [46].

Источником получения штаммов антагонистов являются так называемые супрессивные почвы, в которых осуществляется либо угнетение, либо естественная биологическая элиминация фитопатогена. Хотя супрессивные почвы известны повсеместно, их площадь невелика. Наиболее детально исследованы нейтральные или слабощелочные почвы (рН 6,5 - 7,6) в отношении офиоболеза, фузариоза и других корневых (прикорневых) гнилей злаков.

1.6 Перспективное использование штаммов Fusarium Link

У растений нет специальных клеток, как у животных-фагоцитов, способных захватывать и переваривать проникшие патогены, растворяя их своими ферментами. Однако еще в начале XX в. появились сообщения о том, что у растений наблюдается сходный процесс внутриклеточного переваривания, получивший название фагоцитоза. Поскольку эта способность у растений может проявляться в отношении патогенных организмов, то она отнесена к факторам активного иммунитета. При внутриклеточном переваривании возникают активные цитоплазматические реакции, действующие в направлении ослабления, локализации и уничтожения внедрившихся патогенов. Процесс взаимоотношений между патогеном и клетками хозяина хорошо прослеживается на примере эндотрофной микоризы. Так, гриб Fusarium oxysporum (возбудитель трахеомикозных болезней у двудольных растений), проникая в клетки корней злаков, не вызывает в тканях серьезных повреждений и его мицелий обычно развивается нормально. Однако иногда гифы подвергаются частичному или полному перевариванию. Эти фагоцитарные свойства клеток сдерживают распространение гриба, не дают ему перейти к паразитическому образу жизни, но и не убивают его полностью. Такое равновесие между корнями злаков и грибом непостоянно и зависит от влияния факторов внешней среды [23].

В последние годы во многих странах интенсивно изучается возможность использования непатогенных штаммов Fusarium sp. для защиты растений от фузариозов.

Многочисленные публикации сообщали, что непатогенные Fusarium sp. успешно снижали развитие фузариозного увядания на многих культурах в тепличных и полевых испытаниях [46]. Несколько штаммов непатогенного Fusarium sp. изолированных из супрессивной к увяданию почвы контролировали фузариозное увядание томата и других овощных культур в испытаниях, проведенных в условиях закрытого грунта. Attitalla с соавторами указали, что непатогенный Fusarium sp. - эффективный биоагент, способный к снижению развития фузариозного увядания томата, может использоваться как индуктор устойчивости.

Механизм действия, непатогенного Fusarium sp. основан, вероятно, на конкуренции и индукции системной устойчивости. Конкуренция может быть далее разделена на сапротрофное соревнование за питательные вещества в почве и ризосфере [5] и паразитическое соревнование за места инфекции на корнях. Системную индуцированную устойчивость относят к защитной реакции растения вызванной биотической или абиотической индукцие. При этом биологические агенты колонизируют корневую систему и вызывают в различной степени устойчивость к патогену. Это явление отмечено по отношению к штаммам F. Oxysporum [12], также другим видам грибов и бактерий.

Роль непатогенных грибных штаммов (при взаимодействии: ави-рулентный гриб - растение - фитопатоген) целиком вписывается в схему вакцинации при условии, что грибные организмы непосредственно друг с другом не взаимодействуют [17]. В пользу такого допущения свидетельствуют эксперименты японских ученых, выделивших со здоровых растений батата несколько изолятов F.oxysporum, большинство из которых оказались непатогенными по отношению к батату, огурцу, дыне, редису и капусте. При этом некоторые непатогенные изоляты вызывали перекрестную защиту батата от фузариоза. Среди семи видов рода фузариум только F.oxysporum вызывал подобную защиту. В опытах in vitro между патогенными и непатогенными штаммами антагонизм отсутствовал, перекрестная защита имела системный характер и обнаруживалась лишь в том случае, когда предварительная инокуляция растений непатогенным штаммом проводилась за двое суток до заражения патогеном. Одновременная инокуляция не влияла на устойчивость растений [46].

1.7 Штаммы гриба Fusarium sambicinum

1.7.1 Гриб Fusarium sambicium, штамм ВСБ-917

Гриба Fusarium sambicium, штамм ВСБ-917 содержит низкомолекулярные олигопептидные соединения, щелочные олигопептиды, 18 аминокислот (в т.ч. незаменимые триптофан, лизин, метионин). Содержание аспарагиновой и глутаминовой аминокислот приближается к их содержанию в животных белках; ненасыщенные жирные кислоты (50% -- линоленовая кислота); углеводы представлены гликанами, органическими кислотами (в т.ч. яблочной, лимонной, янтарной); витамины группы В (фолиевая кислота), никотиновая кислота и убихиноны Q6, Q9, Q10. Минеральный состав -- 22 жизненно важных микро- и макроэлемента [31].

Препарат, на его основе обладает общеукрепляющим действием. Повышает устойчивость организма к неблагоприятным воздействиям (загрязнение среды, влияние патогенной микрофлоры, воздействие высоких и низких температур, токсические эффекты этанола и т.д.). Повышает физическую и умственную работоспособность, а также ускоряет восстановление организма после перенесенных нагрузок и заболеваний различной этиологии. Оказывает гепатопротекторное действие, нормализует нарушенную дезинтоксикационную и белковообразующую функцию печени. Это обусловлено содержанием в составе препарата убихинонов Q6, Q9, Q10 и линоленовой кислоты, которые влияют на синтез Pg, простациклина PgI2, лейкотриена и тромбоксана, а также повышением активности ферментов системы цитохрома P450 и фермента антиоксидантной защиты глутатионредуктазы [29]. Обладает иммуномодулирующей активностью, обусловленной воздействием на иммунокомпетентные органы; способствует нормализации показателей как клеточного, так и гуморального иммунитета. Оказывает прямое вирулицидное действие, при этом имеет место нарушение синтеза вирусоспецифических структур, в частности нуклеокапсидов, и процесса формирования вирионов, что в свою очередь приводит к продукции дефектной низкоинфекционной вирусной популяции, обеспечивающей развитие иммунитета. Способствует восстановлению нормальной менструальной функции, нормализации уровня общего холестерина, ЛПВП, ТГ в крови.

1.7.2 Штамм гриба Fusarium sambicinum ВКПМ F-676 продуцент убихинона Q10

Штамм Fusarium sambicsmum 139 - продуцент убихинона /конфермент Q-10/, способен расти на среде, содержащей молочную сыворотку. Он позволяет расширить ассортимент микробных продуцентов убихинона и снизить себестоимость продукта в 10 раз за счет использования отхода молочного производства [44].

Продуцента убихинона (кофермент Q-10) имеет медицинское назначение, испоьлуется для диотоксичности, некоторых противоопухолевых антибиотиков и психотропных средств.

Известные продуценты убихинона относятся к грибам Asperdillus fumipatus и Vadosporium fulvum и культивируются на дорогостоящих средах сложного состава, что повышает стоимость конечного продукта. Кроме того, среди них имеются патогенные формы.

Известен непатогенный штамм Fusarium sambucinum синтезирующий убихинон (прототип, 2) до 131,0 мкг/гсб при культивировании на известной питательной среде Чапека. Убихинон определен методом Крэйна.

Штамм Fusarium sambicsmum 139 получен адаптацией и отбором известного штамма F. sambucium к питательной среде на основе молочной сыворотки и депонируется во ВКПМ института "ВНИИ генетика".

Морфолого-культуральные признаки Fusarium sambucinum 139. На среде Чапека с сахарозой, сусло-агаре, молочном агаре, культура хорошо растет и образует колонии с пушистым войлокообразным мицелием. На сусло-агаре, на 7-е сутки мицелий приобретает светло-кремовый цвет. Края колонии равные. Штамм имеет несептированный мицелий. Макроконидии веретенообразные, серповидные, реже конечные. Строма в культуре риса желтая. Оптимальные условия для роста и биосинтеза убихинона t -28⁰C, pH среды 5,0

Физиолого-биохимические признаки. В качестве источника углерода штамм использует глюкозу, сахарозу, мальтозу, этиловый и изопентиловый спирты, слабо растет на метаноле.

Источниками азотного питания служат сульфат аммония, нитрат аммония, хлорид аммония. Усваивает кукурузный экстракт, слабее дрожжевой автолизат и пептон.

Для биосинтеза убихинона на синтетической среде необходимо наличие этилового и изопентилового спиртов или глюкозы. Штамм активно развивается на вторичном сырье солодовом отваре, отваре виноградных выжимок, пивном сусле, молочной сыворотке. Обычно используемая дорогостоящая синтетическая среда Чапека не содержит органических форм азота и поэтому не обеспечивает биосинтеза достаточного для микробиологической промышленности количества убихинона Q-10 [45].

Предлагаемая среда разбавленная молочная сыворотка (1:1) содержит необходимые органические соединения (белковые вещества, аминокислоты, углеводы, молочную кислоту, жир, витамины), что позволяет увеличить выход биомассы и убихинона, определенного методом Крэйна в 1,34 и 3,5 раза, ускорить и упростить технологический процесс. При этом снижается себестоимость целевого продукта, за счет удешевления среды в 10 раз, обеспечивается безотходная, экологическая приемлемая технология переработки молочных продуктов.

Культивирование нового штамма F. sambucinum 139 на молочной сыворотке, разведенной водой 1 1 позволяет получить до 44,0 г/л биомассы и до 462,0 мкг/гсб убихинона Q-10, что выше по сравнению с прототипом F. sambucinum, культивируемого в подобных условиях, соответственно в 2,3 раза и в 1,8 раз.

1.7.3 Гриб Fusarium sambucinum штамм BKMF 3051 D

Штамм предназначен для медицинской и пищевой промышленности и может быть использован для получения биологически активных веществ, таких как фосфолипиды, ферменты, простагландины и витамины [2].

Получаемые данным способом биологически активные вещества могут быть использованы в косметической промышленности для приготовления косметических средств (кремы, шампуни и т.д.) [17].

В медицине указанные биологически активные вещества могут быть использованы в качестве субстанции для приготовления лекарственных средств, которые применяются при лечении язвы желудочно-кишечного тракта и ран различной этиологии [5].

В ветеринарии простагландины используют для синхронизации охоты у сельскохозяйственных животных, для ликвидации яловости и для пересадки социтов с целью создания высокопородистого скота.

Известен способ получения фосфолипидов микробиологическим методом путем культивирования дрожжей на жидкой питательной среде.

Однако этот способ не позволяет одновременно получить другие биологически активные вещества, такие как простагландины, ферменты и витамины.

Известен способ получения простагландинов методом инкубирования арахидоновой кислоты с гомогенатом пузырьковых желез баранов.

Недостатком указанного способа является ограниченность сырьевой базы фермента, и способ не является промышленным.

Также известен способ получения простагландинов из кораллов Карибского моря Plexawra Homomalla, но выделяют этим способом только производные простагландина А2, которые не получили широкого применения в медицине и ветеринарии, и поэтому необходима переработка их в ПГЕ2 и F2?.

Известен способ получения коллагеназы микробиологическим методом. В качестве продуцента используют Clostridium histolyticum, единственным недостатком которого является продукция летального ?-токсина и гемолизина, что требует тщательной и дорогой очистки продукта или использования нетоксичных специально выведенных штаммов.

Известен способ получения липидов, обладающих хемотаксическим действием, состоящий в культивировании гриба Fusarium sambucinum штамма BKMF-842 на питательной среде, содержащей источники углерода, азота и фосфора, при аэрации воздухом, составляющей 0,8-1,2 л/л/мин, с последующим отделением биомассы и выделением целевого продукта.

Недостатком указанного способа является то, что культуральная жидкость, содержащая биологически активные вещества, не используется, что значительно снижает выход целевого продукта.

Здесь выход целевых продуктов достигается тем, что в качестве продуцента используют гриб Fusarium sambucinum штамм BKMF 3051 D, который выращивают на питательной среде следующего состава, г/л: меласса 20-30; сахароза 20-25; аммоний азотнокислый 3-4; калий фосфорнокислый однозамещенный 2-5, при температуре 26оС с перемешиванием мешалкой со скоростью 210 об/мин, аэрацией 1 л/л/мин в течение 32-72 ч. По окончании роста гриба биомассу отделяют от культуральной жидкости, которую стабилизируют добавлением 7% по объему этилового спирта и получают продукт следующего состава, мг/л: фермент с коллагеназной активностью 100-300; фосфолипиды 8-12; простагландин Е2 и его эфиры 2-5; простагландин F2? и его эфиры 1-6 [12].

Биомассу инкубируют в среде с этанолом четыре раза последовательно, извлекая биологически активные вещества органическими растворителями. Биологически активные вещества, извлеченные из биомассы, растворяют в этиловом спирте или масле (парфюмерном, подсолнечном и т.д.) до следующей концентрации биологически активных веществ, простагландин Е2 и его эфиры 0,04-0,1; простагландин F2? и его эфиры 0,03-0,07; фосфолипиды 1,5-3; каротиноиды 0,01-0,03.

Гриб Fusarium sambucin штамм BKMF 3051 D депонирован Всесоюзной коллекцией микроорганизмов ИБФМ АН СССР.

Использование штамма BKMF 3051 D гриба Fusarium sambucinum и использование не только биомассы гриба, но и культуральной жидкости для получения биологически активных веществ позволяет значительно увеличить выход целевого продукта.

Гриб Fusarium sambuc. BKMF 3051 D выращивают в ферментере на среде с мелассой, сахарозой, аммонием азотнокислым, калием фосфорнокислым однозамещенным при температуре 26оС с перемешиванием мешалкой со скоростью 210 об/мин, аэрацией 1 л/л/мин в течение 32-72 ч. Затем биомассу и культуральную жидкость разделяют путем фильтрования на нутч-фильтре. Культуральную жидкость водный экстракт стабилизируют добавлением 7% по объему этилового спирта и получают продукт, содержащий коллагеназу, фосфолипиды, простагландины Е2 и F2?.

Биомассу смешивают с 96% -ным этиловым спиртом в соотношении 1:1,5 (масса/объем) и выдерживают при комнатной температуре в течение 48 ч. Смесь фильтруют, фильтрат упаривают в вакууме до 1/7 от начального объема при температуре не выше 45⁰С. Водно-спиртовый остаток подкисляют 2 н. соляной кислотой до рН 4,0-4,5 и экстрагируют хлороформом 3 раза. Хлороформные экстракты объединяют и упаривают в вакууме досуха при температуре 40-45⁰С. Остаток, содержащий БАВ, растворяют в 96%-ном этиловом спирте в соотношении 1:5 (масса/объем) и хранят в холодильнике от 0 до 5⁰С. Биомассу после первой экстракции еще три раза последовательно инкубируют в среде с 82%-ным этанолом в соотношении 1:2 в течение 7 сут. извлекая БАВ органическими растворителями, как описано выше. Спиртовые растворы БАВ объединяют и анализируют на их количественное содержание.

Методом газожидкостной хроматографии качественно и количественно определяют содержание простагландинов Е2 и F2?. Анализ проводят на хроматографе Газхром 1109 с модифицированным детектором электронного захвата (ионизационно-резонансным). Используют стеклянную колонку длиной 2 м, диаметром 3 мм, заполненную силанизированным сорбентом хроматоном NAW-DMCS c нанесенной жидкой фазой 1% SE-30. Условия анализа: температура колонки 210⁰С, температура детектора 230⁰С, температура испарителя 275⁰С, скорость газа-носителя (азот особой чистоты) 30-35 мл/мин. Время удерживания для ПГF2? 23 мин и для ПГВ2 7,5 мин. Количество простагландинов Е2 и F2? рассчитывают по площади пиков по сравнению со стандартными образцами [23].

Определение количества ПГЕ2 проводят также по методу Bygdeman путем щелочной изомеризации в ПГВ2 и измерением оптической плотности методом УФ-спектрофотометрии на спектрофотометре при длине волны 278 нм и расчете по калибровочной кривой [13].

Строение простагландинов подтверждают методом хромато-масс-спектрометрии на масс-спектрометре "Hewlett Packard 5985 B" c квадрупольным масс-анализатором в режиме непрерывного сканирования при ионизации электронным ударом с энергией 20 эВ. Условия хроматографии: стеклянная капиллярная колонка длиной 25 м, диаметром 0,25 мм, покрытая неподвижной метилсиликоновой фазой СР-СИЛ-5. Температура 180-320⁰С, 5⁰С /мин. Скорость газа-носителя (гелия) 36 мл/мин. Идентификацию хроматографических пиков осуществляют по времени удерживания и характерным фрагментам в масс-спектрах, используя каталог (ESA/BXK Mase Spectral Date Base, Washington). ПГЕ2 время удерживания 16,7 мин; ПГF2? 16,3 мин.

Масс-спектры: ПГЕ2 m/e: 510 M+, 495 (M-15), 439 (M-71), 420 (M-90), 349 (M-71-90), 225, 205, 199, 173.

ПГF2? m/e: 584 M+, 569 (М-15), 513 (М-71), 494 (М-90), 423 (М-71-90), 333 (М-2х90), 243, 217, 191, 173.

Количество фермента с коллагеназной активностью определяют спектрофотометрическим методом по поглощению при длине волны 590 нм, расчет проводят по калибровочной кривой [14].

Количественное определение фосфолипидов проводят методом УФ-спектрофотометрии, измеряя величину оптической плотности на спектрофотометре при длине волны 820 нм.

Для определения содержания фосфолипидов значение содержания фосфора умножают на 25. Коэффициент 25 учитывает соотношение атомного веса фосфора и молекулярного веса фосфолипидов [34].

Каротиноиды определяют после выделения их из целевого продукта препаративной ТСХ на силикагеле в системе: петролейный эфир-диэтиловый эфир-уксусная кислота 80: 20:1. Зону с Р 0,78-0,80 элюируют 2 мл хлороформа. К элюату добавляют 2 мл 33%-ного раствора хлорида сурьмы, 0,3 мл уксусного ангидрида и определяют оптическую плотность полученного окрашенного раствора при длине волны 620 нм [32].

Биологически активная добавка к пище, получаемая из грибов, обладает широким спектром биологического действия и не только стимулирует иммунную систему организма, но и через наличие ?-глюкана стимулирует образование интерферонов, глобулинов и фактора некроза опухолей в организме.

2. Материалы и методы экспериментальных исследований

2.1 Характеристика объекта исследований

Эксперимент поставлен на семенах злаковой культуры ячменя ярового. Семена были разделены на 4 группы: 1 группа (n=3) - контроль (семена замачивали в воде), 2 группа (n=3) - семена замачивали в экстракте гриба Fusarium sambucinum с разведением 1:1000, 3 группа (n=3) - семена замачивали в экстракте гриба Fusarium sambucinum с разведением 1:10000, 4 группа (n=3) - семена замачивали в экстракте гриба Fusarium sambucinum с разведением 1:100000.

Ячмень имеет сложный химический состав, который зависит от сорта, района произрастания, метеорологических и почвенных условий, массового соотношения отдельных частей зерна. Так, масса зародыша колеблется от 2,8 до 5%, цветочных пленок - от 6 до 17% [3].

Ячмень состоит на 80-88% из сухого вещества и на 12-20% из воды. Сухое вещество представляет собой сумму органических и неорганических веществ. Органические вещества -- это в основном углеводы и белки, а также жиры, полифенолы, органические кислоты, витамины и другие вещества. Неорганические вещества - это фосфор, сера, кремний, калий, натрий, магний, кальций, железо, хлор. Некоторая часть их связана с органическими соединениями.

Средний химический состав ячменного зерна выражается следующими данными (в % на сухое вещество): крахмал 45-70; белок 7-26; пентозаны 7-11; сахароза 1,7-2,0; целлюлоза 3,5-7,0; жир 2-3; зольные элементы 2-3 [1].

Углеводы. В ячмене в основном преобладают водорастворимые сахара и полисахариды [8]. К последним относятся крахмал м некрахмальные полисахариды: целлюлоза, гемицеллюлоза, гумми--вещества, пектиновые вещества. Основная часть полисахаридов представлена крахмалом, который расходуется зерном при прорастании на начальных стадиях развития зародыша.

Азотистые вещества. В ячмене азотистые вещества представлены белковыми и небелковыми составляющими. В нормально вызревшем ячмене белковые вещества составляют большую часть [20]. Белки в ячменном зерне распределяются неравномерно: наибольшее относительное содержание их в алейроновом слое в виде клейковины, во внешнем слое эндосперма в виде резервного белка, меньшее - в эндосперме, где белок входит в состав клеток.

Жиры (липиды). В ячмене жиры представлены жирными кислотами, глицеринсодержащими липидами и липидами, не содержащими глицерина. Жиры растворяются в этиловом и петролейном эфирах, бензоле и хлороформе. Жир представляет собой желто-бурое масло с тонким ароматом, из которого выделяются кристаллы при длительном отстаивании. В ячменном зерне жир распределяется следующим образом: в алейроновом слое, в зародыше. Небольшая часть жира при проращивании потребляется и гидролизуется липазой, а так как при сушке солода липаза инактивируется, основная часть жира переходит в дробину. В свободном виде жирные кислоты присутствуют в незначительном количестве.

Фенольные вещества. Эта группа веществ в ячмене представляет собой неоднородные соединения, которые делятся на простые фенольные кислоты и полифенолы. Состав и содержание фенольных веществ в ячмене зависит от сорта и состава ячменя и условий его произрастания. Между содержанием белка и полифенолов существует обратная зависимость: с повышением количества белка содержание полифенолов уменьшается. Ячмень содержит примерно 0,3% фенольных веществ.

Минеральные вещества. Общее содержание и соотношение отдельных минеральных веществ зависят от почвенно-климатических условий и количества вносимых удобрений [21]. Около 80% ионов находятся в связанном с органическими соединениями состоянии. Основная часть минеральных веществ приходится на фосфор, который входит в состав фитина, нуклеиновых кислот, фосфатидов и других соединений; калий (фосфаты калия); кремниевую кислоту, содержащуюся главным образом в оболочках ячменя. Некоторые микроэлементы, присутствуя в очень небольших количествах, оказывают влияние на биологическое состояние ячменя и технологию пивоварения.

Ячмень отличается высоким содержанием витаминов A, E, В1, В2, В6, PP, С, пантотеновой кислоты, фолиевой кислоты [27]. Витамины можно рассматривать как органические вещества, необходимые для нормального роста и поддержания жизни животных и человека; они обеспечивают нормальное протекание в организме жизненных процессов, в том числе процессов расщепления и синтеза белков, жиров и углеводов. В ячмене, так же как и во всех других растительных организмах, содержится ряд витаминов и провитамин А. Витамины требуются в небольшом количестве, они не используются организмом как строительный материал и не увеличивают имеющуюся в организме энергию, но основная задача их состоит в налаживании правильного обмена веществ.

Известно, что химические соединения, способные тормозить окислительные процессы, называют антиоксидантами. Поскольку реакции окисления имеют радикальный характер, то под термином «антиоксиданты» чаще всего понимают ингибиторы радикальных реакций. К ним относятся и многоатомные фенолы, которые содержатся в растениях [20].

Попадая в наш организм с пищей, они проявляют свои ингибирующие свойства в радикальных биохимических процессах. Эта способность фенолов исключительно важна. Как известно, многие формы онкологических заболеваний инициируются активными свободными радикалами. Образуя устойчивые, а потому малореакционноспособные радикалы, многоатомные фенолы обрывают цепи в радикальных реакциях и тем самым тормозят развитие радикальных реакций, в том числе тех, которые сопровождают рост злокачественных опухолей.

2.2 Оборудование и реактивы