Размещено на http://www.allbest.ru/

Содержание

• Введение
• Глава 1. Обзор литературы
• 1.1 Биоэкологические особенности кукурузы
• 1.2 Агротехника кукурузы
• 1.3 Технология производства кормового белка из кукурузы
• 1.3.1 Сырье кукуруза, используемая для производства кормового белка
• 1.3.2 Характеристика одноклеточных микроорганизмов
• 1.3.3 Культивирование кормовых дрожжей
• Глава 2. Собственные исследования
• 2.1 Материалы и методика исследований
• 2.2 Результаты собственных исследований
• 2.3 Обсуждение результатов собственных исследований
• Глава 3. Аппаратурно - технологическое оформление
• 3.1 Оборудование, используемое для производства кормовых дрожжей
• 3.2 Автоматизация производственных процессов
• Глава 4. Охрана труда
• Глава 5. Экономическая эффективность
• Глава 6. Охрана окружающей природы
• Выводы
• Список литературы

Введение

Основной причиной, сдерживающей рост продуктивности сельскохозяйственных животных, является слабая кормовая база и несбалансированность рационов по основным элементам питания, что отрицательно сказывается на росте производства продуктов животноводства, ведет к перерасходу кормов и росту себестоимости единицы производимой продукции.

Для получения высокой продуктивности от животных необходимо не только разнообразить кормовые рационы, но и обеспечить их биологическую полноценность. При этом особое внимание следует уделять белковой обеспеченности животных, тем более, что дефицит его в рационах животных в Республике Северная Осетия-Алания составляет около 15 тыс. тонн.

К сожалению, в нашей климатической зоне не удается вырастить на полях достаточное количество кормового белка.

Известно, что более половины растительного вещества, получаемого в сельском и лесном хозяйстве, является побочным продуктом, который используется лишь частично или выбрасывается. Это та часть растительной биомассы, которая из-за высокого содержания древесно-целлюлозных веществ не может быть непосредственно использована в питании человека или сельскохозяйственных животных. Тем не менее именно данную часть растительной биомассы можно считать значительным запасом неископаемого углерода на нашей планете. Кроме того, по мере использования ископаемых, в будущем, прогнозируется организация специальных плантаций, на которых будет осуществляться фотосинтез для получения сырья для химической и микробиологической промышленности. Поэтому на протяжении многих лет ведутся интенсивные исследования и поиски методов переработки и конверсии целлюлозолигниновых (ЦЛ) и крахмалсодержащих материалов в различные продукты: белок, биогаз, этанол, сахара, органические кислоты и др. Несмотря на множество возможностей использования растительной биомассы, дефицит белка в нашей климатической зоне заставляет в настоящее время концентрировать внимание исследователей на возможных путях конверсии целлюлозолигниновых (ЦЛ) и крахмалсодержащих материалов в кормовой белок. Одним из наиболее перспективных путей в этом направлении является производство кормовых дрожжей.

Известно, что более половины растительного вещества, получаемого в сельском и лесном хозяйстве, является побочным продуктом, который используется лишь частично или выбрасывается. Это та часть растительной биомассы, которая из-за высокого содержания древесно-целлюлозных веществ не может быть непосредственно использована в питании человека или сельскохозяйственных животных. Тем не менее именно данную часть растительной биомассы можно считать значительным запасом неископаемого углерода на нашей планете. Кроме того, по мере использования ископаемых, в будущем, прогнозируется организация специальных плантаций, на которых будет осуществляться фотосинтез для получения сырья для химической и микробиологической промышленности. Поэтому на протяжении многих лет ведутся интенсивные исследования и поиски методов переработки и конверсии целлюлозолигниновых (ЦЛ) и крахмалсодержащих материалов в различные продукты: белок, биогаз, этанол, сахара, органические кислоты и др. Несмотря на множество возможностей использования растительной биомассы, дефицит белка в нашей климатической зоне заставляет в настоящее время концентрировать внимание исследователей на возможных путях конверсии упомянутых материалов в кормовой белок. Одним из наиболее перспективных путей в этом направлении является производство кормовых дрожжей.

Цели и задачи исследования

Целью нашей работы явилось изучение возможности использования стебля кукурузы в качестве сырья для производства кормового белка.

Для выполнения поставленной цели, необходимо было решить следующие задачи:

1. Составить методику исследований;

2. Изучить химический состав стебля кукурузы;

3. Получить кормовой белок;

4. Определить состав полученного кормового белка;

5. Провести экономические расчеты.

биоэкологический кукуруза кормовой белок

Глава 1. Обзор литературы

1.1 Биоэкологические особенности кукурузы

Ботаническое описание. Кукуруза (Zea mays L.) -- однолетнее растение семейства Мятликовые, однодомное, раздельнополое, перекрестноопыляющееся.

Корневая система мочковатая, многоярусная, сильноразветвленная, способная проникать на глубину до 2,5 м. Распространяется в радиусе более 1 м. Кроме подземных узлов нижние узлы над поверхностью почвы образуют воздушные, или опорные, корни. Корни кукурузы имеют воздушные полости, свидетельствующие о повышенной чувствительности корней к наличию кислорода. Корневая система угнетается при плотности почвы более 1,3 г/см³ (П.И Сусидко, В.С. Циков., 1978).

Стебель кукурузы диаметром 2...6 см, хорошо облиствененный, прямостоячий, округлый, гладкий. Высота растений колеблется от 60 см до 5 м. Стебель состоит из заполненных сердцевиной междоузлий, разделенных утолщенными стеблевыми узлами; до 5 сближенных междоузлий находятся в почве. Кукуруза -- одностебельный злак. До образования зерна сердцевина стебля может запасать до 8... 12 % сахара, затем его количество снижается с образованием в зерне запасающих углеводов (Г.С Посыпанов., 2006).

Листья кукурузы крупные, линейные, цельные, параллельно-нервные, сверху опушенные, в чередующемся порядке расположены по двум противоположным сторонам стебля. Они состоят из листовой пластинки и влагалища, имеют язычок. Число листьев колеблется от 6 до 48 и напрямую связано со скороспелостью. Растения кукурузы имеют соцветия двух типов: мужское -- метелка и женское -- початок. Колоски метелки двухцветковые, с тремя пыльниками в каждом цветке. Каждый пыльник дает до 2500 пыльцевых зерен, а вся метелка -- до 15...20 млн. (Н.Г Сыкало., 1976).

Початки (видоизмененные боковые побеги) располагаются в пазухах листьев, имеют укороченные междоузлия и видоизмененные листья, образующие обертку. Число полноценных початков на растении может быть различным. У современных гибридов, как правило, только один початок получает полноценное развитие.

Плод -- зерновка, обычно голая. В зависимости от группы и сорта (гибрида) зерновки кукурузы имеют различную окраску -- белую, кремовую, желтую, оранжевую, красную. В початке в зависимости от сорта и условий выращивания образуется от 200 до 1000 зерен. По пленчатости, величине и форме зерна, а также по распределению мучнистой и роговидной части эндосперма в зерновке различают следующие подвиды кукурузы: зубовидный, кремнистый, крахмалистый, сахарный, лопающийся, восковидный и пленчатый. Подвиды кукурузы имеют различное назначение и распространение (Н.Н Иванов.,1974).

В производстве кукурузы на зерно и на силос преобладают зубовидный и кремнистый подвиды, меньше выращивают крахмалистый, сахарный и лопающийся подвиды.

Требования к теплу. Кукуруза -- теплолюбивое растение. Семена прорастают при 8--10°. Всходы появляются при температуре не ниже 10--12°. Прирост биологической массы прекращается при среднесуточной температуре ниже 10° (Г.Е Шмараев., О.Н Коровина., 1982).

Наиболее благоприятная температура для роста кукурузы 25--30°, у зерновых колосовых культур -- 20--25° Растения кукурузы перестают расти в высоту при понижении температуры до 4--5° и при повышении до 45--48° (Э.С Бантинг., 1983).

В период формирования генеративных органов (выход в трубку-- выметывание метелки) оптимальная температура 19--23°. Однако чрезмерно высокая температура в этот период значительно губительней, чем низкая, которая только задерживает прорастание пыльцы. На отрицательное влияние температур выше 24° в "критический" период развития кукурузы (10 дней до выметывания и 20 дней после появления метелок) указывают многие исследователи (В.В Хохлачев.,1989).

Заморозки 2--3° повреждают всходы, а осенью -- листья. Кукуруза легче переносит весенние заморозки, чем осенние. Поврежденные всходы способны оправиться и в течение недели отрасти. Скороспелые сорта более северного происхождения лучше переносят пониженные температуры и заморозки, чем южные позднеспелые сорта и гибриды кукурузы. (Н.И Третьяков., 1985)

Сумма биологически активных температур, необходимая для созревания скороспелых сортов кукурузы, составляет 1800--2000°, среднеспелых и позднеспелых -- 2300--2600°. Среднеспелые и позднеспелые гибриды различаются между собой по сумме температур, необходимой для достижения фазы выметывания метелки, практически требуют одинаковой суммы температур для прохождения последующих фаз. (Н.И Володарский., 1986)

Отношение к влаге. Кукуруза относится к сравнительно засухоустойчивым культурам, уступая сорго, суданской траве и просу. Благодаря мощной мочковатой корневой системе она энергично поглощает воду из почвы и экономно ее использует на образование единицы урожая сухой массы и зерна. Кукуруза относительно хорошо переносит засуху до фазы выхода в трубку. Связь урожайности с запасами почвенной влаги значительно повышается от момента посева к фазе выметывания (впоследствии она снижается). Недостаток влаги в почве снижает урожай зерна до 30--40%, при этом образуются мелкие початки с пониженным количеством зерен и через-зерницей, у части растений початки совсем не образуются. Растения кукурузы плохо реагируют на переувлажнение почвы, резко снижая урожай зерна и зеленой массы (С.И Слухай., 1974).

Отношение к свету. Кукуруза -- светолюбивое растение короткого дня. Продолжительность световой стадии в зависимости от сорта (гибрида) -- 30--40 дней. При продвижении культуры к северу прохождение световой стадии значительно затягивается. Быстрее всего она зацветает при 8--9-часовом дне. Продолжительность дня свыше 12--14 ч удлиняет вегетационный период кукурузы.

Кукуруза требует интенсивного солнечного освещения, особенно в молодом возрасте. Чрезмерное загущение посевов, засоренность их приводят к снижению урожая початков. При затенении кукурузы тормозится формирование органов плодоношения, увеличивается разрыв в цветении мужских и женских соцветий и количество бесплодных растений (Н.Н Третьяков., И.А Шкурпела., 1979).

Требования к почвенным условиям. Высокие урожаи кукуруза дает на чистых, рыхлых, воздухопроницаемых почвах с глубоким гумусовым слоем, обеспеченных питательными веществами и влагой, с рН 5,5--7. К ним относятся черноземные, темно-каштановые, темно-серые суглинистые и супесчаные, а также пойменные почвы. Почвы, склонные к заболачиванию, сильно засоленные, а также с повышенной кислотностью (рН ниже 5) непригодны для возделывания кукурузы.

Особенности минерального питания. Кукуруза усваивает много питательных веществ из почвы. На создание 1 ц зерна с соответствующим количеством листостебельной массы она потребляет в среднем 2,4--3 кг азота, 1 -- 1,2 -- фосфора и 2,5--3 кг калия. Урожай кукурузы зависит от обеспеченности растений прежде всего этими элементами питания.

Кроме азота, фосфора и калия в жизни растений большое значение имеют сера, кальций, магний, железо и микроэлементы (марганец, бор, медь и др.). (Н.Б Абубекиров., М.К. Каюмов, 1978)

Потребление элементов минерального питания растениями кукурузы в течение вегетации идет неравномерно, оно соответствует ходу накопления органического вещества и продолжается включительно до восковой спелости зерна. Азот имеет особенно большое значение на ранних этапах роста растений, в период от всходов до образования 4--5 листьев. В начальный период роста кукуруза предъявляет повышенные требования и к уровню фосфорного питания. Критический период в питании фосфором начинается с образования 3--4 листьев. Недостаток фосфора в первый период (до образования 10-го листа) в обмене веществ растений кукурузы имеют место необратимые процессы. Вот почему необходимо рядковое внесение удобрений и прежде всего содержащих фосфор (А.Л.Запорожченко,1978).

Особенности роста и развития. В начальный период (до образования первого надземного стеблевого узла) кукуруза растет очень медленно. Максимальный рост происходит перед выметыванием метелки: при благоприятных условиях 10--12 см в сутки. После цветения рост растений в высоту прекращается. Критическими периодами в формировании высокого урожая кукурузы являются фаза 2--3 листьев, когда происходит дифференциация зачаточного стебля, и фаза 6--7 листьев, когда определяется размер початка. Наиболее ответственны фазы развития кукурузы: формирование метелки, которое происходит у скороспелых, среднеспелых и позднеспелых гибридов (сортов) соответственно в фазе 4--7, 5--8 и 7--11 листьев (эти фазы совпадают с V этапом развития мужского соцветия); формирование початка, которое происходит у указанных гибридов по скороспелости соответственно в фазе 7--11, 8--12 и 11--16 листьев (эти фазы совпадают с V этапом развития женского соцветия). (Р.У.Югенхеймер,1979)

Обычно метелки начинают цвести на 2--3 дня раньше женских соцветий. При недостатке влаги, пониженных температурах этот разрыв увеличивается. Цветение отдельных цветков початка начинается с нижних цветков, перемещаясь к верхним. Все цветки початка отцветают за 5--7 дней. В зависимости от сортовых особенностей зерно созревает после оплодотворения за 55--70 дней. Засуха, переувлажнение почвы, недостаток минерального питания в период цветения и оплодотворения ухудшают оплодотворение, снижают озерненность початков. Максимальный вес сырой массы растений отмечается в фазе молочной спелости, сухого вещества -- в конце восковой спелости (С.К.Эржибов, Н.С Леонова., 1973).

Продолжительность вегетационного периода у кукурузы колеблется от 75 до 180 дней и более. По длине вегетационного периода выделяют следующие группы гибридов (сортов) кукурузы: раннеспелые с продолжительностью от всходов до полного созревания зерна 80--90 дней (листьев на главном стебле 10--12), среднераннеспелые -- 90--100 дней (12--14 листьев), среднеспелые-- 100--115 дней (14--16 листьев), среднепозднеспелые--115--130 дней (16--18 листьев), позднеспелые--130-- 150 дней (18--20 листьев), очень позднеспелые -- больше 150 дней (более 20 листьев) (П.П.Домашнев,1992).

Формирование урожая зеленой массы и сухого вещества по фазам роста и развития кукурузы возможно. Очень быстро урожай нарастает в период перед выметыванием и во время выметывания метелок. После оплодотворения и завязывания зерен дальнейшее накопление урожая происходит за счет развивающихся початков (И.П Фирсов.,2006).

1.2 Агротехника кукурузы

Размещение кукурузы в севообороте после хороших предшественников является важным приемом повышения ее урожайности. Степень влияния предшественника зависит от биологических особенностей его, агротехники, применяемой при возделывании, почвенных и климатических условий. Влияние предшественника на урожай кукурузы проявляется в зависимости от почвенно-климатических особенностей района возделывания. Влияние предшественника на почву, развитие последующей культуры и ее продуктивность многогранно. Однако в конкретных условиях вычленяются и особые, определяющие уровень урожая, факторы. В степной зоне, где определяющим фактором продуктивности растений является влага, главная особенность предшественника -- сколько влаги после него остается (А.И.Жолобов, 1983).

Расходование воды кукурузой после разных предшественников происходит также неодинаково. В первой половине вегетации, когда в почве еще достаточно влаги и питательных веществ, кукуруза после всех предшественников обеспечивает хорошие приросты при одинаковом примерно расходовании воды. Во второй половине вегетации ее посевы после плохих предшественников из-за меньших исходных запасов влаги оказываются в худших условиях влагообеспеченности, что отрицательно сказывается на урожае зерна (И.Т.Ефимов, 1974).

Вторым важнейшим фактором повышения урожая является обеспеченность кукурузы питательными веществами. Разные полевые культуры, предшествующие, кукурузе, оставляют в почве неодинаковое количество доступных растениям веществ. Для кукурузы важное значение имеет мобилизация питательных веществ из почвы, особенно азота, в период ее вегетации, что зависит от предшественника.

Нитрификационная способность почвы во время появления всходов кукурузы выше после озимой пшеницы, чечевицы и люцерны, ниже -- после подсолнечника и кукурузы. В период максимального роста кукурузы (от пяти-шести листьев до выбрасывания метелок) содержание нитратного азота уменьшилось после гороха в три раза, после других предшественников -- в 1,5--2 раза. Содержание подвижных форм фосфора и калия под кукурузой на черноземах обыкновенных существенно от предшественников не зависит (А.И Фисюнов., 1974).

Засоренность посевов кукурузы также зависит от места ее в севообороте. Предшественники представляют собой своеобразный агрофон, а погодные условия отдельных лет при непосредственном влиянии самой кукурузы оказывают разное действие на засоренность последней как в количественном, так и в видовом отношении.

Культуры, предшествующие кукурузе, оказывают всестороннее влияние на почвенные условия, определяющие в конечном итоге уровень урожая ее (И.С Гогулян., 1977).

В комплексе приемов обработки почвы под кукурузу ведущая роль принадлежит основной обработке. Выбор способа последней зависит от типа почвы, климатических условий, рельефа, предшественника и степени засоренности полей (Д.С Филева., П.И.Сусидко, 1973).

Основная обработка под кукурузу после культур сплошного сева обычно состоит из двух приемов: лущения стерни и зяблевой вспашки. Лущение способствует очистке полей от сорняков и эффективной борьбе против вредителей, а разрыхленный верхний слой повышает способность почвы впитывать влагу осадков и уменьшает испарение. При этом она увлажняется даже, если выпадают незначительные осадки. Во время вспашки почва хорошо крошится, легче и лучше обрабатывается (В.С.Циков, Л.А. Матюха, 1989).

Весной, как только позволяет состояние почвы, зябь боронуют в один-два следа тяжелыми боронами в сжатые сроки -- за два-три дня. Запоздание с боронованием в сухую ветреную погоду приводит к потерям влаги. Боронование более эффективно поперек вспашки. Показателем высокого качества его являются хорошая выровненность пашни, рыхлый мелкокомковатый слой почвы глубиной 4--5 см.

Основной способ посева кукурузы на зерно и силос -- квадратно-гнездовой, на зеленый корм -- пунктирный и сплошной (лесная и лесостепная зоны). Пунктирные посевы кукурузы применяют на чистых от сорняков полях и при обеспеченности хозяйств гербицидами (В.С.Белкин,1971).

Сроки посева устанавливают исходя из биологических особенностей кукурузы, требований ее к теплу и увлажнению почвы. Оптимальный срок посева большинства сортов и гибридов кукурузы наступает когда устойчивая среднесуточная температура почвы на глубину 10 см достигнет 10--12° С (Э.Д.Адиньяев,1988).

Для получения полных и дружных всходов кукурузы немаловажное значение имеет оптимальная глубина заделки семян при которой они обеспечиваются достаточным количеством влаги, воздуха и тепла. Глубина посева семян зависит главным образом от влажности почвы и ее механического состава.

Урожай кукурузы во многом зависит от своевременности и качества проведения работ по уходу за посевами. Мероприятия по уходу за посевами сводятся к следующему: послепосевное прикатывание, боронование до и после появления всходов кукурузы, культивация междурядий, борьба с сорняками, вредителями и болезнями (А.Б.Саламов, 1962).

Однако только механическими мерами очистить посевы кукурузы от сорняков невозможно. Дозы гербицидов уточняются в каждом конкретном случае в зависимости от почвенно-климатических условий и характера засоренности поля.

Урожай и качество зерна кукурузы в значительной степени зависят от сроков уборки. Кукурузу убирают при достижении полной физиологической спелости зерна в максимально сжатые сроки, которые не должны превышать 15--20 дней. Запаздывание с уборкой приводит к значительным потерям урожая зерна и снижению его качества -- початки, попадая под осенние дожди и заморозки, поражаются грибными болезнями и повреждаются вредителями, стебли грубеют, значительное количество листьев опадает, теряются кормовые достоинства листостебельной массы (В.В.Хохлачев , 1983).

1.3 Технология производства кормового белка из кукурузы

1.3.1 Сырье кукуруза, используемая для производства кормового белка

Сельское хозяйство может поставить микробиологической промышленности неограниченное количество сырья, содержащего целлюлозу, гемицеллюлозы, лигнин. В твердых стеблях присутствует 40--50% целлюлозы, 20--40% гемицеллюлозы и 18-- 25% лигнина. Подсчитано, что ежегодно на Земле образуется 1,8-10¹¹ т биодеградативного лигноцеллюлолитического материала, 40% которого составляет целлюлоза, и только 0,5% растущих запасов этого материала используется (А.М.Безбородов, 1989).

Кукуруза -- одна из основных культур мирового земледелия. Благодаря высокой урожайности, разностороннему использованию и успехам селекции кукуруза значительно продвинулась на север. Мировые площади под этой культурой постоянно расширяются. По данным ФАО, в 2003 г. кукурузу на зерно возделывали в мире на площади более 142,68 млн га, средняя урожайность составила 4,47 т/га.

В Российской Федерации культивируют два основных направления возделывания кукурузы: на зерно и на силос.

· на зерно кукурузу выращивают в основном в Северо-Кавказском, Нижневолжском, Центрально-Черноземном регионах, площадь посева в 2003 г. составила 720 тыс. га, урожайность -- 3,25 т/га;

· на силос и зеленый корм кукурузу выращивают практически повсеместно, за исключением Северного региона и других северных районов, за последние 5 лет площадь составила около 3 млн га, урожайность -- 17 т/га. Из зерна кукурузы получают муку, крупу, крахмал, хлопья, консервы, этиловый спирт, пиво, декстрин, глюкозу, сироп, масло, витамин Е. Зерно кукурузы -- ценный компонент для комбикормов. В чистом виде зерно кукурузы, несмотря на высокую кормовую ценность (1 кг содержит 1,34 корм, ед.), является несбалансированным по белку кормом. Силос используется, в основном, для корма скота.

1.3.2 Характеристика одноклеточных микроорганизмов

Микроорганизмы используют разнообразные источники энергии. Из химических источников энергии для получения SCP рассматривают углеводороды, водород, углеводы. Для экономики производства SCP очень важно иметь крупномасштабное производство, основанное на проточном культивировании и на пользовании самого дешевого и доступного сырья. Для крупномасштабных процессов больше пригодны углеводороды (Скрябин Г.К., Ерошин В.К., 1984).

Тем не менее для получения белка одноклеточных в разных странах используют всевозможные углеводсодержащие отходы промышленности и сельского хозяйства: мелассы, мелассную барду, сыворотки, крахмал, гидролизаты древесины, сульфитные жидкости и для производства белковых продуктов культивируют чаще всего дрожжи Candida. Они имеют ряд преимуществ перед пекарскими дрожжами: содержат больше белка, используют более широкий спектр углеводов, включая ксилозы (древесный сахар), а также некоторые органические кислоты, менее чувствительны к катаболитной репрессии, образуют больше биомассы, почти не нуждаются в факторах роста и, в отличие от сахаромицетов, совершенно не накапливают этанола в аэробных условиях.

Целлюлолитические микроорганизмы содержат целлюлазный ферментный комплекс, который состоит из трех различных синергичных компонентов С₁ С_х и в-глюкозидазы (А.М.Безбородов, 1989).

Существует много целлюлолитических микроорганизмов бактерий, актиномицетов, грибов), но большая часть их может атаковать только модифицированную, аморфную целлюлозу и не действует на кристаллические участки субстрата, так как не содержит некоторых компонентов, необходимых для биодеградации этого полимера. Поэтому часто бывает полезно объединение ферментов двух дополняющих друг друга штаммов. Наибольшей способностью к синтезу целлюлаз обладают грибы рода Trichoderma. Они могут деградировать нативнуго целлюлозу, но лучше после предварительной обработки щелочью их использовать для удаления лигнина и гемицеллюлозы.

Дрожжи подвергают термолизу (плазмолизу), потому что живые дрожжи хуже усваиваются и могут вызвать у животных заболевания кандидомикозой. Кормовые дрожжи состоят из мертвых дрожжевых клеток. Если необходимо, то дрожжи витаминизируют, их облучают ультрафиолетом, чтобы эргостерол дрожжей превратился в витамин D₂ (И.М.Грачева, 1980).

В нашей стране на большинстве гидролизных заводов внедрены продуктивные штаммы кормовых дрожжей С. scottii и С. tropicalis. Но в условиях нестерильного, многотоннажного производства развивается не монокультура, а ассоциация культур из 5--8 различных видов. Энзиматический гидролиз целлюлозы протекает очень медленно и неэффективно в связи с плохим проникновением фермента и ингибированием целлюлазной -активности образующимся промежуточным продуктом гидролиза -- целлобиозой. Выход древесных Сахаров можно сильно увеличить путем предварительного механического измельчения материала или предобработки его щелочью, аминами или аммонием. Используют целлюлазу гриба Trichoderma viride. Сахарный раствор с ферментом подвергают рециклированию, целлобиозу удаляют, пропуская ее через мембранные фильтры либо выращивая одновременно на продуктах гидролиза микроорганизмы, например С. utilis или Sacch. cerevisiae. Выращивание дрожжей приводит к более полной сахарификации целлюлозы. Из 1 т сухой древесины получают до 200 кг дрожжей и 4--6 кг фурфурола. В качестве симбиотической культуры предложены дрожжи С. utilis и Т. viride, которые выращивают на рисовой соломе, обработанной щелочью. Дрожжи используют 2--5 г целлюлозы/л за 7--10 дней (А.М Безбородов, 1989).

В качестве монокультуры предложен гриб Myrothecium verrucaria используемый для превращения в биомассу измельченных газет. Нативную целлюлозу расщепляют некоторые мицеллиальные грибы. Грибы дают большую биомассу, а культуральную жидкость после сепарации биомассы можно использовать как источник гидролитических ферментов для соковой и винодельческой промышленности. Наибольшей способностью к синтезу целлюлаз обладают грибы Asp. fumigatus, Fusarium moniliforma, T. viride, Gliocladium diliquescens, Chaetomium cellulolyticum, Ver-ticillium sp. Работает целый ряд установок, на которых бумажная макулатура, опилки, солома, торф превращаются в биомассу нитчатых грибов. Кроме грибов, возможно использование и других микроорганизмов, особенно термофильных, поскольку при высоких температурах целлюлоза более растворима и более доступна для ферментов. Для утилизации целлюлозы предложены термофильные целлюлолитические бактерии, актиномицеты и штаммы спороцитофаг. С помощью Thermoactinomyces получают более 45 г биомассы на 100 г целлюлозы (Л.И.Воробьева, 1987). В зависимости от природы перерабатываемого сырья для производства кормовых дрожжей чаще всего используют культуры родов Candida, Trichosporon. Выбирая культуру, надо следить, чтобы скорость ее роста в соответствующей среде была максимальной, в состав биомассы входило бы много белков, витаминов, чтобы культура в определенных условиях была вирулентной (могла конкурировать с сопутствующей микрофлорой) (А.Сассон, 1987).

1.3.3 Культивирование кормовых дрожжей

Современная биотехнология предлагает по крайней мере три принципиальные возможности конверсии ЦЛ и крахмалсодержащих материалов в белок:

1) прямое культивирование микроорганизмов с целью получения биомассы;

2) кислотный или ферментативный гидролиз целлюлозы с получением биомассы;

3) биоконверсия целлюлозы в биомассу через этанол и органические кислоты.

Конечным критерием оценки любого биотехнологического процесса должна являться себестоимость целевого продукта. Однако при создании новой технологии получения продукта часто возникают трудности сравнения значений этой величины при производстве продукта в разных странах и даже разных отраслях народного хозяйства нашей страны. Поэтому в настоящее время в оценке биотехнологических процессов преобладает эмпирический подход. Процессы оцениваются по таким параметрам, как продуктивность (производительность процесса), выход продукта, удельные энергозатраты и др. (У.Е.Виестур, 1987). Наиболее обоснованной оценкой является сопоставление экспериментального выхода продукта с теоретически возможным, рассчитанным из уравнения материально-энергетического баланса. Промышленное производство белка одноклеточных организмов всегда осуществляется методом глубинного культивирования в жидких средах; применяются как одноэтапное, так и непрерывное культивирование. Непрерывное культивирование сложнее, чем одноэтапное, но более экономично: производительность ферментеров выше. Именно этот метод был избран для промышленного производства белка одноклеточных организмов. Метод непрерывного культивирования основан на поддержании в системе динамического равновесия. Для перемешиваемой глубинной культуры постоянного объема это означает постоянство скорости роста микроорганизмов, которое обеспечивается путем равномерного ее разбавления свежей питательной средой (при сохранении объема). Среды, используемые при непрерывном культивировании, всегда составляют таким образом, чтобы один из субстратов (обычно это источник углерода) лимитировал рост, поэтому его содержание в культуральной жидкости минимально. Такой способ широко применяется в экспериментах по физиологии микроорганизмов (Воробьева Л.И.,1987).

Даже в микробиологических лабораториях, где работа с чистыми культурами в асептических условиях -- обычное дело, опыты по непрерывному культивированию требуют особого внимания. Специальное устройство аппаратуры, строгое соблюдение правил работы -- все направлено на то чтобы избежать загрязнения посторонней микрофлорой. Важность асептики при непрерывном культивировании становится ясной. Метод этот представляет интерес как для лабораторий, так и для промышленности только в том случае, если стационарное состояние культуры удается поддерживать в течение нескольких дней, недель или даже месяцев. Все это время культуру надо перемешивать, подавать непрерывно стерильную питательную среду и воздух и часть ее постоянно удалять. Температура должна поддерживаться постоянной; обычно регулируется и рН среды. Нужно периодически отбирать пробы для контроля постоянства условий и чистоты культуры. При промышленном производстве условия асептики могут быть соблюдены только в специальных сложных установках. В их конструкции должна быть учтена необходимость стерилизации перед началом каждого производственного цикла. Это касается также работы любого датчика или пробоотборника, встроенного в ферментер для непрерывного наблюдения и контроля всех параметров культуры

Количество азота и фосфора в питательной среде определяют исходя из их ожидаемого содержания в биомассе. Основная ферментация в производстве кормовых дрожжей идет по непрерывному методу культивирования при D = 0,1--0,4 ч. Схема получения кормовых дрожжей из гидролизата приведена ниже.

Рисунок.1. Схема получения кормовых дрожжей из гидролизата

Рассмотрение технической реализации основных биотехнологических процессов, в первую очередь техники ферментации, целесообразно вести на основе универсальной технологической схемы, аппаратура создается (подбирается) для реализации определенной технологии (Грачева И.М., 1980).

Проведение процесса ферментации с точки зрения его инженерной реализации сводится к обеспечению дозированной согласно технологическому режиму подачи показанных на рис. 2 (и ряда не показанных, специфичных для конкретных технологий) потоков в ферментатор, отвода из него культуральной жидкости, тепла, отработанного воздуха (газов) и измерению (если необходимо -- поддержанию) нужных для конкретного биологического агента физико-химических параметров среды, а также к управлению межфазным транспортом веществ в культуральной жидкости, т. е. обеспечению оптимальных концентраций субстратов/продуктов для конкретной культуры и гомогенности среды внутри биореактора. При этом большинство сред -- корродирующие, непрозрачные, многокомпонентные, пенящиеся. Они могут содержать нерастворимые компоненты.

Если задаться целью систематизации самих технологических способов, то, как показывает результат нашей попытки такой систематизации, их разнообразие настолько велико, что, в отличие от классификации конструкций аппаратов, получаемая система настолько сложна, что ее использование затруднительно.

Глава 2. Собственные исследования

2.1 Материалы и методика исследований

Исследовательскую работу проводили на базе НИИ биотехнологии ГГАУ.

Для проведения экспериментов использовали дрожжи сухие пекарские Saccharomyces cerevisiae.

Питательную среду готовили на основе стеблей от кукурузы.

На первоначальном этапе экспериментов проводили работы по заготовке сырья для питательной среды. С этой целью образцы кукурузы были измельчены до состояния травяной муки и хранились до момента использования в стеклянной таре.

Следующим этапом проведения наших работ явилось непосредственное приготовление питательной среды. Так как сахара в такого рода муке оказывается незначительное количество, то на первом этапе необходимо провести гидролиз сырья.

Питательную среду готовили четырьмя методами.

· По одному методу смесь из воды и муки (5/1) подвергали термической обработке путем автоклавирования при 1,5 атм в течении 45 минут (термический гидролиз).

· Второй способ - кислотный гидролиз. Здесь проводилась аналогичная операция, но с добавлением концентрированной серной кислоты в количестве 0,5 % от объема сырья и воды.

· Третий способ - ферментативный гидролиз. В качестве ферментного препарата мы использовали целловеридин, который добавляли в полученную ранее смесь, нагревали до 40 ⁰С и выдерживали в течении 45 минут при постоянном перемешивании.

Содержимое баллонов для проведения гидролиза по первому, второму способам помещали в автоклав и автоклавировали в течение 90 мин при 1 атм.

Приготовленный гидролизат по второму способу был нейтрализован раствором гидроксида кальция (известковое молоко) из расчета 0,75 кг гидроксида кальция на 1 кг гидролизата и затем продували острым паром в течение 10 мин с целью удаления летучих веществ, ингибирующих рост дрожжей (фурфурол, оксиметилфурфурол и т. д.). Далее питательную среду подвергали стерилизации автоклавированием в течение 30 минут при 1 атм.

Подготовка питательной среды. Для обеспечения оптимальных условий культивирования необходимо осветлить наш субстрат, для чего нами было произведено центрифугирование при 3000 об./мин. с последующей деконтацией. В дальнейшем наш субстрат был профильтрован через обеззольный бумажный фильтр.

Культивирование дрожжей. Выращивание дрожжей проводили в ферментере общим объемом 3 литра, заполненном на 2/3 свежей питательной средой, в который засевали дрожжи из расчета 3-5%. Заполненный ферментер оснащали датчиками измерения рН, термометром, трубками для отвода воздуха, отбора проб, подключения к перистальтическому насосу и компрессору для подачи воздуха. Собранный таким образом ферментер автоклавировали в течение 1 часа при 1 атм с целью стерилизации питательной среды. В остывшую питательную среду добавляли сухие дрожжи в количестве 20 г.

Культивирование проводили при температуре 37°С и постоянном перемешивании с помощью мешалки; рН среды поддерживали на уровне 4,5-5,0. Аэрацию осуществляли из расчета 4-5 литров на 1 литр питательной среды в час. В процессе культивирования каждый час отбирали пробы суспензии с целью контроля рН среды, концентрации клеток и количества глюкозы. По истечении 9 часов процесс выращивания дрожжей завершали.

В нашей работе мы использовали лабораторную установку БИОЛУК - 2Ш.

Установка может использоваться при процессах переработки субстратов сложного химического состава, для интенсификации микробиологических процессов, а так же для ускоренного автоматического отбора активных штаммов, перспективных при использовании в различных областях народного хозяйства и промышленности. Установка БИОЛУК - 2Ш может применяться в процессах обучения методом периодического и непрерывного культивирования в крупномасштабных поисковых работах в областях: генетики, биохимии, микробиологии, физиологии популяционной микробиологии и экологии.

Ферментативная установка БИОЛУК - 2Ш состоит из 2 блоков, соединенных двумя стойками. Первый блок - это ферментер идеального смешения, системы приборов автоматического контроля и регулирования заданных параметров. Последние установлены на верхнем блоке.

Конструктивно ферментер выполнен в виде стеклянного сосуда, закрывающегося сверху и снизу крышками изготовленными из нержавеющей стали, имеющей специальные отверстия для установки датчиков и другого оборудования. Датчики рН и другое оборудование, вводимое в ферментер крепятся в отверстии на крышке при помощи уплотнительного кольца из резины, а также металлических шайб и гаек. Все трубчатые соединения выполнены из селиконовой резины.

В верхнем блоке установлены: регулятор оборотов двигателя мешалки ферментера, регулятор объема поступающего воздуха, 2 компрессора для прокачки воздуха, двигатель дозатора.

На передней панели блока установлены: выключатель питания; выключатель первого и второго компрессора; регуляторы подачи воздуха 2^х компрессоров; ротаметр; дозатор; выключатель дозатора; переключатель режима работы дозаторов; выключатель двигателя мешалки и регулятор оборотов мешалки.

На задней стенке расположены гнезда для включения приборов и заземления: гнезда для включения внешнего дозатора; контактора; термометра; нагревателя; магнитного клапана и гнездо для заземления.

Для предотвращения выноса из ферментера влаги парами выходящего газа и очистки его от биологических частиц на штанге ферментера установлен конденсатор, выход которого подсоединен к склянке с антисептиком.

Измерение рН жидкости в ферментере осуществляется в диапазоне от 0 до 10 единиц рН при температуре жидкости 25°С и в диапазоне от 0 до 9 единиц рН при температуре от 25 до 60°С.

Отделение дрожжей от питательной среды проводили методом центрифугирования при 1500 оборотов/мин в течение 15 мин. Предварительно отбирали часть питательной среды для определения биомассы дрожжей.

Параллельно изучали наличие либо отсутствие содержания редуцирующих сахаров и общего азота в остаточной питательной среде с целью анализа ее сбалансированности по этим компонентам.

Осадок высушивали в сушильном шкафу при температуре 100-110°С в течение 2-3 часов. В результате получали порошкообразный препарат.

Определение содержания редуцирующих сахаров (ГОСТ 1396.18)

Исследования проводили по методу Бертрана. В химический стакан на 100 мл вносили пипеткой 1 мл исследуемой жидкости, 10 мл дистиллированной воды, 10 мл раствора Фелинга №1 и 10 мл раствора Фелинга №2. Стакан с содержимым ставили на печь и кипятили три минуты с момента закипания. Содержимое стакана переносили на фильтр бумажный. Осадок на фильтре промывали горячей водой до тех пор, пока стекающие капли не светлели.

Воронку с осадком на фильтре переносили в другую колбу. Осадок растворяли раствором железоаммонийных квасцов. Содержимое колбы титровали 0,1 Н раствором КМnO₄ до цвета, похожего на цвет перманганата калия. Каждый мл 0,1 Н раствора КМnO₄ соответствует 6,36 мг меди. Умножая количество перманганата калия, пошедшего на титрование на 6,36, получали количество меди в миллиграммах.

Пользуясь таблицей Бертрана, по известному количеству меди находили количество глюкозы в мг.

Определение концентрации дрожжевых клеток

Подсчет количества дрожжевых клеток проводили с помощью счетной камеры Горяева, которая представляет собой толстое предметное стекло, разделенное бороздками. На центральную часть стекла нанесена сетка. Площадь квадрата сетки указана на одной из сторон предметного стекла и соответствует 1/25 мм² (большой квадрат) или 1/400 мм² (малый квадрат). Часть предметного стекла, на которой нанесена сетка, на 0,1 мм ниже двух других сторон. Это глубина камеры; она всегда указывается на предметном стекле.

Вначале углубление с сеткой покрывали специальным шлифованным покровным стеклом и, слегка прижимая, смещали покровное стекло в противоположные стороны до появления колец Ньютона. Это указывает на то, что покровное стекло притерто к сторонам камеры. Только при этом условии объем взвеси дрожжей, находящийся в камере, соответствует расчетному.

После этого камеру заполняли исследуемой суспензией, которую вносили через бороздку камеры капилляром или пипеткой. Подсчет клеток начинали через 3-5 минут после заполнения камеры, чтобы клетки осели и при микроскопировании были видны в одной плоскости. Число клеток подсчитывали под объективом 40*, в 10 больших или 20 маленьких квадратах сетки, перемещая последние по диагонали.

Количество клеток в 1 мл исследуемой суспензии вычисляли по формуле:

M = (a · 10³ · n) / (hS)

Где, М - число клеток в 1 мл суспензии;

а - среднее число клеток в квадрате сетки;

h - высота камеры в мм;

S - площадь квадрата сетки в мм²;

10³ - коэффициент перевода;

n - разведение исследуемой суспензии.

Определение биомассы дрожжей

Биомассу дрожжей определяли центрифужным методом. Для точного определения биомассы использовали питательную среду, профильтрованную через бумажный фильтр.

На технических весах взвешивали пустой, высушенный до постоянного веса центрифужный стаканчик. Затем наливали в него 10 мл дрожжевой суспензии, уравнивали противолежащие стаканчики по весу и центрифугировали в течение 5 мин при 2000 оборотов/мин.

По истечении указанного времени вынимали стаканчик, аккуратно сливали надосадочную жидкость и взвешивали стаканчик с осадком. Вычитая из этой массы вес пустого стаканчика, определяли вес дрожжевого осадка. Это число показывает массу дрожжей, находящихся во влажном состоянии в 10 мл суспензии, умножая его на 1000, рассчитывали массу дрожжевых клеток в 1 литре суспензии.

Для определения массы дрожжей в воздушно-сухом виде стаканчик с осадком помещали в сушильный шкаф, где выдерживали при температуре 110°С до постоянного веса. Массу дрожжей, находящихся в воздушно-сухом состоянии в 1 литре суспензии рассчитывали аналогично вышеуказанному способу.

Биомассу в натуральном виде определяли по формуле:

М = ((А - В) · 1000) / V

Где, М - биомасса, г / л;

А - масса центрифужной пробирки с осадком, г;

В - масса центрифужной пробирки без осадка, г;

V - объем культуральной жидкости взятый для центрифугирования, мл.

Биомассу в воздушно-сухом виде рассчитывали по формуле:

М₁ = (Б - В) · 1000) / V,

где, М₁ - биомасса в воздушно-сухом виде, г / л;

Б - масса центрифужной пробирки с осадком после высушивания, г.

Определение внешнего вида

Пробу объемом около 1000 мл помещали в стеклянный цилиндр и на белом фоне рассматривали при естественном освещении, осторожно перемешивая.

Определение запаха

Пробу объемом 150-200 мл помещали в широкогорлую колбу, которую прикрывали часовым стеклом, встряхивали, затем снимали стекло. Определение запаха производили при комнатной температуре и температуре 60?С.

Определение содержания первоначальной влаги (ГОСТ 1396.3 - 92 (27548.98))

Под первоначальной влажностью понимают вес воды, испарившейся из образца, приведенного в воздушно-сухое состояние сушкой при температуре 60-65 єС и пребыванием его в течение нескольких часов на воздухе.

На технических весах взвешивали сначала пустую фарфоровую чашку, а затем со 100 мл дрожжевой суспензии. По разности весов узнали массу навеску. Чашку с содержимым ставили в термостат при температуре 60-65°С.

Навеску сушили до тех пор, пока разность между двумя последними взвешиваниями не превышала 0,5 г. Навеску оставляли в лаборатории на 4-6 ч (для приведения в воздушно-сухое состояние) и снова взвешивали.

Процент первоначальной влажности определяли по формуле:

Х = (а · в) / 100

где, Х - процент первоначальной влажности;

а - вес испарившейся воды, г;

б - вес навески корма до высушивания, г.

Воздушно-сухое вещество корма измельчали в ступке, переносили в стеклянную банку, закрывали притертой пробкой и наклеивали этикетку. Из этой пробы брали навески для дальнейших химических анализов.

Определение гигроскопической влаги ( ГОСТ 1396.3 - 92(27548 - 97))

Приведенный в воздушно-сухое состояние образец содержит некоторое количество влаги, называемой гигроскопической.

Бюксы ставили в сушильный шкаф на 1 ч при температуре 100-105°С. Из сушильного шкафа их помещали на полчаса в эксикатор для охлаждения. После охлаждения взвешивали с точностью до 0,0001 г и снова ставили в сушильный шкаф на полчаса. Высушивание продолжали до постоянного веса.

В подготовленных бюксах на аналитических весах взвешивали по 1-2 г образца в воздушно-сухом состоянии с точностью до 0,0001г.

Бюксы с навесками ставили в сушильный шкаф при температуре 100-105°С на 3 ч.

Вынимали из сушильного шкафа бюксы и помещали в эксикатор на 30 мин. После охлаждения в эксикаторе снова взвешивали, затем ставили в сушильный шкаф на 1 час и после охлаждения снова взвешивали на аналитических весах.

Сушку продолжали до тех пор, пока предыдущее взвешивание будет отличаться от последующего на 0,002-0,003 г.

Процент гигроскопической воды в воздушно-сухом веществе определяли по формуле:

Х = (а · 100) / в,

где, Х - процент гигроскопической воды;

а - количество испарившейся воды при высушивании, г;

в - вес навески вещества в воздушно-сухом состоянии, г.

Определение общего азота и сырого протеина (ГОСТ 1396.4(28074 - 89))

Исследования проводили по методу Къельдаля. Сущность метода заключается в том, что безазотистые органические вещества при их нагревании с концентрированной серной кислотой разлагаются до углекислого газа и воды, а азотсодержащие вещества распадаются до аммиака, который соединяется с серной кислотой и образует нелетучую соль сернокислый аммоний.

Реакция протекает по следующему уравнению:

2NH₃ + H₂SO₄ > (NH₄)₂SO₄

В процессе перегонки в избыточно щелочной среде выделяется аммиак:

(NH₄)₂SO₄ + 2NaOH > Na₂SO₄ + 2NH₄OH

2NH₄OH> 2NH₃ + H₂O

Выделяющийся в ходе реакции аммиак поглощается децинормальным раствором серной кислоты. Избыток серной кислоты титруют децинормальной щелочью. По количеству связанной серной кислоты определяют количество азота, содержащегося в образце. При этом известно, что 1 мл децинормального раствора серной кислоты соответствует 0,0014 г азота.

В пробирку наливали 5-10 мл исследуемой суспензии, точно взвешивали ее на аналитических весах. Содержимое сливали в колбу Къельдаля и взвешивали пустую пробирку. По разности весов определяли вес навески. В колбу Къельдаля приливали 20 мл концентрированной серной кислоты и содержимое аккуратно перемешивали. При этом происходило обугливание вещества.

В колбу вносили 5-6 г сложного катализатора и ставили для сжигания в специальном штативе в вытяжном шкафу. Сжигание проводили на слабом огне воизбежании потери азота. В период сжигания содержимое колбы необходимо перемешивать, чтобы на ее стенках не оставалось не сгоревших частиц. При появлении на горлышке бурых пятен и частиц их смывали в колбу холодной водой из промывалки и продолжали сжигание.

Жидкость в колбе сначала имеет бурый или почти черный цвет, но по мере минерализации органических веществ раствора в колбе начинает выделяться сернистый ангидрид и содержимое ее светлеет. По цвету определяли окончание минерализации. Раствор в колбе должен быть бесцветным, прозрачным или слегка желтоватым.

После осветления жидкости колбу остужали и осторожно небольшими порциями туда приливали 100-150 мл дистиллированной воды, омывая ею стенки колбы. Жидкость приобретает зеленовато-голубоватый цвет.

В приемную коническую колбу вливали из бюретки 20 мл децинормального раствора серной кислоты и 3-5 капель индикатора Таширо. Приемную колбу подставляли под стеклянную трубку, соединенную с холодильником аппарата Къельдаля, погружая конец трубки в раствор. В цилиндр отмеряли 20 мл 33% раствора едкого натра и осторожно по стенкам приливали в отгонную колбу.

Включали колбонагреватель (парообразователь) и начинали отгон аммиака, который поглощается 0,1 Н раствором серной кислоты. Конец отгона аммиака определяли с помощью лакмусовой бумажки, которую подставляли под стекающую каплю отгона. Если лакмус не синеет, отгон аммиака окончен.

Содержимое приемной колбы оттитровывали 0,1 Н раствором едкого натрия до красного окрашивания.

Устанавливали количество свободной серной кислоты, не связанной с аммиаком, после чего по разности серной кислоты, налитой в приемную колбу и количеству свободной кислоты, определяли, сколько кислоты связалось с аммиаком. Результат умножали на коэффициент 0,0014. В итоге получали количество азота в навеске образца (в граммах).

Содержание азота (в процентах) определяли по формуле:

Х = (а · 5 · 0,0014 · 100)/б

где, Х - содержание азота в корме (%);

а - объем серной кислоты связанной с аммиаком;

5 - взято 20 мл раствора, что составляет пятую часть;

б - навеска образца (г).

Для вычисления содержания в образце сырого протеина показатель содержания азота умножали на 6,25.

Определение сырого жира (ГОСТ 13496.65)

Метод основан на способности жира растворяться в органических растворителях: серном эфире, петролейном эфире, бензине и т. д. Так как кроме нейтрального жира в раствор переходят и жироподобные вещества, например: воска, смолы, фосфатиды, красящие вещества и др., то полученный экстрагированием жир принято называть сырым.

Наиболее удобно производить определение жира по методу обезжиренного остатка.

В пакетики из фильтровальной бумаги помещали 1-2 г навески корма, вкладывали в бюксы и высушивали в сушильном шкафу до постоянного веса при температуре 100 - 105°С (на пакетиках написать простым карандашом номер бюксов).