Молекулярно-генетическая идентификация линий мягкой пшеницы из коллекции КНИИСХ, устойчивых к листовой ржавчине

Размещено на http://www.allbest.ru/

МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования

«КУБАНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ»

(ФГБОУ ВПО «КубГУ»)

Кафедра генетики, микробиологии и биотехнологии

ВЫПУСКНАЯ КВАЛИФИКАЦИОННАЯ РАБОТА БАКАЛАВРА

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ИДЕНТИФИКАЦИЯ ЛИНИЙ МЯГКОЙ ПШЕНИЦЫ ИЗ КОЛЛЕКЦИИ КНИИСХ, УСТОЙЧИВЫХ К ЛИСТОВОЙ РЖАВЧИНЕ

Работу выполнил Д.С. Миков

Краснодар 2014

Реферат

Объект - мягкая пшеница (Triticum aestivum).

Материал - интрогрессивные линии мягкой пшеницы коллекции КНИИСХ

Методы: Полевая оценка устойчивости к бурой ржавчине, ПЦР-анализ.

Показано, что переданы гены устойчивости к бурой листовой ржавчине от диких сородичей в мягкую пшеницу, некоторые из которых удалось идентифицировать в коллекции интрогрессивных линий мягкой пшеницы КНИИСХ.

Область применения результатов: селекция мягкой пшеницы на устойчивость к бурой ржавчине

Содержание

Введение

1. Аналитический обзор

1.1 Бурая ржавчина - наиболее вредоносная болезнь мягкой пшеницы

1.2 Использование генофонда диких сородичей для селекционного улучшения мягкой пшеницы

1.3 Молекулярные маркеры в генетических исследованиях и селекции

2. Материал и методы исследования

2.1 Полевые методы исследования

2.2 Выделение геномной ДНК

2.3 ПЦР анализ линий пшеницы

2.4 Рестрикция

3. Молекулярно-генетическая идентификация линий мягкой пшеницы из коллекции КНИИСХ, устойчивых к листовой ржавчине

Заключение

Библиографический список

Введение

Генетика была и остается теоретической базой селекции. Каждое крупное открытие генетики в области механизмов реализации, преобразовании генетической информации и особенно взаимодействия генов в системе генотипа практически неизменно порождало новые направления в селекции. Под направлением понимается не задача селекции, а путь к достижению ее результата.

Так, уже само открытие генов как единиц наследственности, способных к рекомбинации, легло в основу ранней идеи конструирования новых селекционных форм за счёт соединения ценных признаков разных родительских форм путём скрещивания. Несмотря на очевидную наивность такого подхода с позиции современной генетики, он привёл к значительным успехам в отдельных областях селекции, например, пушном звероводстве и декоративном садоводстве. Закон Н.И. Вавилова о гомологических рядах в наследственной изменчивости открыл путь поиска доноров ряда ценных признаков в селекции культурных растений, а именно использование генофондов диких сородичей. Открытие индуцированного мутагенеза положило начало развитию селекции с использованием радиационного и химического мутагенеза, которое обеспечило существенный успех особенно в создании штаммов-продуцентов в селекции микроорганизмов. Открытие феномена цитоплазматической мужской стерильности сначала у кукурузы, а затем у многих других культурных растений, привело к буквальному перевороту в области селекции с использованием гетерозиса, а в настоящее время - созданию целой индустрии гибридного семеноводства.

Совершенно очевидно, что для технологии молекулярного маркирования генов уже предопределена большая роль в селекции. Ранее всего это новое направление проявит себя, по-видимому, в селекции по хозяйственно-важным признакам с относительно простой генетической детерминации. В частности это признаки качества и устойчивости к болезням и вредителям. Действительно, возможность направлена обогатить исходный материал формами с уже доказанным наличием генов, контролирующих эти признаки, означает выигрыш уже на старте селекционного процесса.

Тема данной работы полностью лежит в русле этих генетических и селекционных исследований, что и определяет её актуальность.

Научная новизна работы состоит в идентификации известных к настоящему времени генов устойчивости к бурой листовой ржавчине в селекционном материале Краснодарского НИИ сельского хозяйства им. П.П. Лукьяненко.

Практическая значимость обусловлена возможностью использовать линии-носители генов устойчивости в селекционном процессе.

Цель работы состоит в распознавании линий, несущих известные гены устойчивости к листовой ржавчине, среди коллекции интрогрессивных линий мягкой пшеницы, полученных с использованием генетического материала её диких сородичей.

Задачи:

· Повести ПЦР-анализ интрогрессивных линий на наличие маркеров к генам устойчивости к листовой ржавчине;

· Сравнить результаты ПЦР-анализа на наличие искомых генов с результатами полевой оценки устойчивости тех же линий;

· Выявить возможные случаи несоответствия результатов молекулярно-генетических и полевых исследований и обсудить предполагаемые их причины.

1. Аналитический обзор

1.1 Бурая ржавчина - наиболее вредоносная болезнь мягкой пшеницы

Пшеница мягкая (Triticum aestivum) - основная хлебная культура большинства стран - широко возделывается от северных полярных районов до южных пределов Африки и Америки. Сегодня в мире пшеницу высевают на площади около 225 млн. га. Селекция мягкой пшеницы уже достигла того уровня, когда её потенциальная урожайность во многом зависит от устойчивости возделываемых сортов к неблагоприятным абиотическим и биотическим факторам внешней среды. Из всех болезней, вызывающих большие потери урожая пшеницы, главным являются: ржавчинные болезни (стеблевая, листовая и желтая), мучнистая роса, болезни колоса и корней. В годы эпифитотийного развития вредных организмов, только от воздействия грибных болезней потери урожая зерновых культур могут достигать 30-50% и более. Аналогичные потери урожая происходят от вредителей и сорных растений; одновременно ухудшается качество продукции.

Особое место среди болезней занимает бурая ржавчина, которая остается одной из основных болезней пшеницы в России, несмотря на значительные успехи в создании устойчивых сортов. Возбудитель листовой (бурой) ржавчины пшеницы - биотрофный грибной патоген Puccinia triticina Erikss. (синоним - Puccinia recondita f. sp. tritici Dietel & Howl). Симптомы поражения проявляются в основном на листовой пластинке и влагалищах в виде беспорядочно разбросанных урединиопустул бурого цвета, которые содержат урединиоспоры. Размножение преимущественно вегетативное - урединиоспорами, которые переносятся ветром и дождём на зеленые участки листьев и способны распространяться ветром на большие расстояния [McDonald, 2002]. Споры могут передвигаться на высоте до 3000 метров в виде облака, преодолевая большие расстояния. В течение вегетационного периода выращивания пшеницы в условиях умеренного климата формируется до 10 урединиальных генераций гриба. Подсчитано, что при поражении одного процента листовой поверхности бурой ржавчиной число сформировавшихся урединиоспор на 1 га посевов в сутки составляет 10¹¹, что может приводить к ежедневному появлению 100 тыс. спор, несущих мутацию, часть из которых способна преодолеть защитные системы растений. Патоген перезимовывает даже в суровые зимы в виде урединиоспор в урединиях на отмерших листьях [Eversmeyer, 1988], а также телиоспор на стерне. В некоторых районах он зимует в виде уредомицелия в узлах кущения озимой пшеницы. Таким образом, жизненная стратегия этого патогена базируется на быстром инфекционном цикле, большой споруляционной способности и высокой эффективности инфекции.

Бурая ржавчина является одним из наиболее вредоносных и распространенных заболеваний мягкой пшеницы в мире. При сильном поражении посевов эта болезнь может снижать урожай зерна до 70% [Дмитриев, 1975]. Регулярное поражение пшеницы бурой ржавчиной приводит к более высоким потерям зерна, чем от стеблевой и желтой ржавчины [Воронкова, 1980]. На пораженных растениях развиваются мелкие зерновки, в колосе снижается завязываемость семян, особенно в колосках у верхушки основания колосьев [Mains, 1930]. Резко ухудшается и качество продукции, полученной с пораженных растений [Воронкова, 1980]. Выход муки из зерна уменьшается на 40%, в клейковине содержится меньше белков [Степанков, 1975], обедняется аминокислотный состав [Берлянд-Кожевникова, 1977], снижается натура и стекловидность зерна, показатели седиментации и силы муки [Мочалова, 1978].

1.2 Использование генофонда диких сородичей для селекционного улучшения мягкой пшеницы

Выделение Н.И. Вавиловым учения о селекции на повышение устойчивости к болезням в самостоятельный раздел селекции как науки подчёркивает специфичность её задач и методов. Прежде всего среди таких особенностей следует упомянуть практически неизбежное обращение к генетическим ресурсам дикорастущих сородичей мягкой пшеницы.

Поскольку в настоящее время потенциальная урожайность мягкой пшеницы во многом зависит от устойчивости возделываемых сортов к неблагоприятным абиотическим и биотическим факторам, поэтому перед селекционерами стоит задача создания сортов, которые сочетают в себе генетические структуры высокой продуктивности с системами, обеспечивающими минимальные потери урожая от воздействия негативных факторов внешней среды. Обеспечение комплексной устойчивостью сортов и гибридов к действию биотических и абиотических стрессов должно быть главной целью интегрированных селекционно-агротехнических программ [Жученко, 2001].

К сожалению, запаса генетического материала самой мягкой пшеницы недостаточно для решения этой проблемы [Feldman, Sears, 1981; Hope et al., 1984; Kimber 1984]. Более того, ее генофонд был в значительной степени обеднен из-за широкого распространения однотипных сортов с перекрывающимися родословными. В особенности это касается генов устойчивости к болезням, ограничение разнообразия которых является одним из основных лимитирующих факторов селекции [Давоян,2006].

Огромный резерв хозяйственно-ценных признаков мягкой пшеницы представляет собой генофонд многочисленных родственных ей видов и родов [Вавилов, 1935; Мигушова, 1973; Чикида 2001; Fedak, 1985; Sheperd, Islam, 1988].

Многие из них уже были использованы для передачи полезных признаков в мягкую пшеницу [Скурыгина, 1979; Zeller and Hsam, 1983; Knott, 1987; Jialing et al., 1994]. Так, в настоящее время значительная часть эффективных генов устойчивости к болезням происходит из этого генофонда [McIntosh et al., 1995b, 1998]. Число диких сородичей - потенциальных источников ценных генов устойчивости достаточно велико: это виды родов Triticum, Aegilops, Agropyron, Secale, Haynaldia и другие.

По их генетической конституции, дикие сородичи могут быть разделены на первичный, вторичный и третичный генофонды [Jiang et al., 1994; Friebe et al., 1996]. Первичный генофонд мягкой пшеницы включает виды с гомологичными геномами: гексаплоидные формы (стародавние сорта), культивируемый тетраплоид T. turgidum и его дикая форма T. dicoccoides, донор генома A - T. monococcum с разновидностями boeoticum и urartu и донор генома D - Ae. Tauschii. Гены из первичного генофонда могут быть переданы путём прямой гибридизации, в следствие гомологичных рекомбинаций хромосом, беккросированием и отбором [Gill, Raupp, 1987; Kimber, 1993].

Вторичный генофонд включает в основном полиплоидные виды родов Triticum и Aegilops, имеющие один из гомологичных геномов общих с мягкой пшеницей. В эту же группу могут быть включены диплоидные виды эгилопсов с геномом S, родственным геному B пшеницы. Гены от этих видов также могут быть переданы путем гибридизации и отбора при условии, что они локализованы в гомологичных геномах. При локализации генов в негомологичных геномах необходимо использовать специальные цитогенетические методы.

Третичный генофонд состоит из диплоидных и полиплоидных видов, генетически наиболее отдалённых от мягкой пшеницы, содержащих геномы негомологичные таковым (A, B и D) у пшеницы. Передача генов от этих видов в мягкую пшеницу не может быть осуществлена с помощью гомологичной рекомбинации. Поэтому для переноса генов из этого генофонда используются специальные цитогенетические методы.

В связи с этим, большая часть коллекции диких сородичей представлена образцами двух родов - Aegilops и Triticum. Род Aegilops - 154 образцами, принадлежащими к 19 видам. Triticum - 37 образцами, принадлежащим к 12 видам.

В КНИИСХ ещё в 70х годах при помощи специальных цитогенетических методов были получены синтетические линии на основе диких сородичей и мягкой пшеницы для переноса генов в последнюю. Например, синтетик авродес был получен на основе сорта Аврора и Ae. Speltoides, авролата - Аврора и Ae. Umbelullata, а Tr. Migushovae - с использованием Tr. Timopheevi и Ae. Tauschii. [Давоян Р.О., 2006]. Всего на настоящий момент известно о передаче 15 генов устойчивости к листовой ржавчине от этих трёх синтетиков. Так Ae. Speltoides с геномом S является источником генов Lr28, Lr35, Lr47 и Lr51, которые были переданы мягкой пшенице [McIntosh et al., 2003]. Ae. Tauschii обладает также достаточно большим количеством генов устойчивости: Lr20, Lr21 Lr22a, Lr32, Lr39, Lr42, Lr43. От Ae. Umbellulata передан лишь один ген устойчивости Lr9, но он на протяжении достаточно долгого времени являлся одним из самых высокоэффективных генов и использовался во многих сортах по всему миру.

1.3 Молекулярные маркеры в генетических исследованиях и селекции

Еще в первые десятилетия развития генетики стало ясно, что генетические маркеры могут быть полезными при анализе сложных признаков. Однако низкая встречаемость и ряд других недостатков не позволили классическим генетическим маркерам, а впоследствии и белковым маркерам широко войти в селекционную практику. Последнее поколение генетических маркеров (молекулярные, или ДНК-маркеры) характеризуется более высокой частотой встречаемости в геноме и основано на универсальных, а значит широко востребованных и постоянно развивающихся методах анализа. Это стало залогом бурного развития направлений генетики и селекции, связанных с использованием ДНК-маркеров.

Роль молекулярных маркеров в современной генетике трудно переоценить. С их помощью составлены подробные молекулярные карты генома человека и десятков видов растений и животных, на которые нанесены важнейшие гены, определяющие рост и развитие организмов, морфологические признаки, устойчивость к заболеваниям и другие свойства. Молекулярные маркеры широко используются в популяционной генетике, сравнительной генетике и геномике, в филогенетических исследованиях. Благодаря молекулярным маркерам расширяются возможности медицинской диагностики, появляются новые более точные методы паспортизации пород животных и сортов растений. Использование молекулярных маркеров позволяет значительно ускорять процесс селекции [Алтухов и др., 2002; Банникова, 2004; Сулимова, 2004; Смарагдов, 2009; Матвеева и др., 2011; Хлесткина, 2011].

Приступая к данному разделу обзора, необходимо уточнить широко употребляемые здесь термины «селекция» и «отбор». По Н.И. Вавилову (1938) селекционная наука как целая объединяет в себе 5 основных разделов, названных им: учением об исходном материале, учением об изменчивости, теорией гибридизации, теорией селекционного процесса (отбора) и теорией селекции по специальным признакам [Вавилов, 1967]. В число специальных признаков включена, в частности, устойчивость к болезням. С этих позиций теория отбора - только часть селекции, хотя и чрезвычайно важная.

Специалисты в области молекулярно-генетических технологий (особенно англоязычные) часто редуцируют понятие селекции, используя соответствующий термин как синоним отбора. Точка приложения и, как следствие, роль молекулярно-генетических методов в селекции теряют свою определённость.

Молекулярные маркеры (синоним - ДНК-маркеры) - это генетические маркеры, анализируемые на уровне ДНК. ДНК-маркеры являются третьим поколением генетических маркеров. Им предшествовали белковые маркеры, а еще ранее - классические морфологические генетические маркеры. Впервые теоретическое обоснование использованию генетических маркеров («сигналей») дал около века назад А.С. Серебровский: «… сигналями мы называем удобные для менделистических наблюдений альтернативные гены с более или менее известной локализацией, которые, не оказывая воздействия на изучаемый трансгрессирующий признак и влияя достаточно определенным образом, облегчают генетический анализ этого признака, позволяя следить за наследованием того участка хромосомы, в котором эти сигнали расположены» [Серебровский, 1970].

В настоящее время насчитывается несколько десятков типов молекулярных маркеров. Наиболее широко используемыми ДНК-маркеры являются:

· AFLP (amplified fragment length polymorphism) - полиморфизм длины амплифицированных фрагментов.

· CAPS (cleaved amplified polymorphic sequences) - расщепленные амплифицированные полиморфные последовательности.

· DArT (diversity array technology) - ДНК-чип технология для изучения разнообразия.

· IRAP (inter-retrotransposon amplified polуmorphism) - полиморфизм амплифицированных последовательностей между ретротранспозонами.

· ISSR (inter simple sequence repeats) - межмикросателлитные последовательности.

· RAPD (random amplified polymorphic DNA) - случайно амплифицированная полиморфная ДНК.

· RFLP (restriction fragment length polymorphism) - полиморфизм длины рестрикционных фрагментов.

· SCAR (sequence characterized amplified region) - амплифицированная область, охарактеризованная нуклеотидной последовательностью.

· SNP (single-nucleotide polymorphism) - однонуклеотидный полиморфизм.

· SSAP (sequence-specific amplification polymorphism) - полиморфизм сиквенс-специфичной амплификации.

· SSCP (single strand conformation polуmorphism) - полиморфизм конформации одноцепочечной ДНК.

· SSR (simple sequence repeats) - простые повторяющиеся последовательности (микросателлиты).

· STS (sequence tagged site) - сайт/локус, маркированный нуклеотидной последовательностью.

Их разделяют на три группы, согласно основному методу анализа: маркеры, исследуемые с помощью блот-гибридизации, ПЦР и ДНК-чипов. Данная классификация отражает процесс «эволюции» ДНК-маркеров. Первая из трех перечисленных выше групп представляет собой первое поколение ДНК-маркеров, получивших широкое распространение в 1980-е годы. В 1990-е годы ключевые позиции заняли ПЦР-маркеры, в 2000-е годы их существенно потеснили молекулярные маркеры, основанные на использовании ДНК-чипов. В последние 2-3 года для анализа полиморфизма ДНК все чаще используют метод прямого секвенирования генома или его отдельных участков.

К молекулярным маркерам наравне с классическими генетическими применяют термины «локус», «аллель», «доминантный», «кодоминантный». Молекулярные маркеры подразделяют на монолокусные и мультилокусные. Монолокусные маркеры наследуются чаще всего по кодоминантному типу, мультилокусные - по доминантному.

Таблица 1. Классификация молекулярных маркеров

Метод анализа	Класс
	Монолокусные	Мультилокусные
Блот-гибридизация	RFLP	Минисаттелиты
Полимеразная цепная реакция (ПЦР)	SSR	RAPD
	STS	ISSR
	SSCP	AFLP
	CAPS	SSAP
	SCAR	IRAP
ДНК-чипы	SNP	DArT

Среди молекулярных маркеров различают маркеры с известной локализацией (в определенной хромосоме или участке хромосомы, или вблизи конкретного гена) и маркеры, о локализации которых ничего не известно (как правило, это мультилокусные маркеры). Как те, так и другие находят свое применение в генетических исследованиях и в селекции. Молекулярные маркеры с неизвестной локализацией нельзя использовать для маркирования определенного гена или хромосомы, зато их успешно применяют в филогенетических исследованиях, для паспортизации сортов растений и пород животных. Некоторые мультилокусные маркеры подходят для создания генетических карт (DArT- и AFLP-маркеры), а также для геномной селекции (DArT)). На выбор ДНК-маркеров подходящего типа для решения конкретной задачи влияют и такие характеристики, как уровень внутривидового полиморфизма и возможность автоматизации процесса анализа полиморфизма ДНК (рисунок 1).

С внедрением ДНК-маркеров наибольший размах приобрели среди прочих такие направления, как построение молекулярных карт отдельных хромосом и геномов, картирование на них генов и локусов количественных признаков (QTL). В 1980 г. Дэвид Ботштейн совместно с Р. Уайтом, М. Школьником и Р. Дэвисом разработал первые монолокусные генетические маркеры на основе анализа полиморфизма ДНК (а именно полиморфизма длины рестрикционных фрагментов - RFLP) и показал, что с их помощью можно проводить построение генетических карт [Botstein et al., 1980].

За этой пионерской работой последовало создание RFLP-карт различных видов животных и растений. Насколько эффективно RFLP-маркеры позволили продвинуться в картировании геномов, иллюстрирует следующий пример. Первая RFLP-карта генома пшеницы [Liu, Tsunewaki, 1991] содержала в 1,5 раза больше локусов и была в 1,2 раза длиннее прежней классической генетической карты, ставшей результатом трудов многих исследователей в течение нескольких десятилетий.



Рис. 1 - Уровень внутривидового полиморфизма и возможность автоматизации анализа различных типов ДНК-маркеров [Хлесткина, 2011]

Выяснилось, что RFLP-маркеры, разработанные для одного вида, могут использоваться для анализа геномов родственных видов и родов. Таким образом, стало возможным сравнительное картирование геномов, благодаря которому внутри отдельных семейств удалось выявить ряды ортологичных генов и проследить преобразования структуры генома отдельных видов в ходе эволюции от общего предка. Результаты этих работ крайне важны для современных исследований в области сравнительной геномики [Moore et al., 1995].

Благодаря использованию RFLP-карт появилась возможность определять точное положение отдельных генов в геноме и клонировать их последовательности на основе картирования (map-based gene cloning- позиционное клонирование генов). Пионером в области позиционного клонирования генов является американский исследователь Стивен Тэнксли. Под его руководством при использовании данного метода был впервые клонирован ген устойчивости к бактериальной пятнистости плодов томата [Martin et al alal., 1993]. С. Тэнксли был первым и среди тех, кто оценил потенциальные преимущества отбора по генотипу и в 1983 г. одновременно с Жаком Бекманом предложил использовать ДНК-маркеры в селекции [Beckmann, Soller, 1983; Burr et al al., 1983; Tanksley, 1983].

Анализ проявления того или иного признака осуществляется на строго определенной стадии развития. Образцы для генотипирования можно отобрать практически в любой удобный момент. Отбор проб для выделения необходимого количества ДНК на ранних стадиях развития селектируемых организмов позволяет своевременно изымать из селекционного процесса значительное количество материала, не потратив на анализ и уход за ним лишних средств.

На результаты фенотипирования влияют различные факторы окружающей среды. Генотип не зависит от изменения условий среды. Если отбор ведется на основании анализа фенотипа, то при полном доминировании невозможно отличить доминантные гомозиготы от гетерозигот и, следовательно, выбрать индивидуумы для скрещивания в текущем поколении. С помощью ДНК-маркеров легко справиться с этой задачей.

Методы селекции, в которых применяются ДНК-маркеры, разделяют на две основные группы:

1). ОПМ - отбор с помощью маркеров (MAS -marker-assisted selection); синонимы: МАС (маркер-ассоциированная селекция) и МОС (маркер-опосредованная/ориентированная селекция). Подход в современной селекции растений и животных, позволяющий проводить отбор по генотипу при использовании ДНК-маркеров, тесно сцепленных с селектируемым геном.

2). Геномная селекция (genomic selection). Метод современной селекции растений и животных, позволяющий при использовании равномерно распределенных по геному ДНК-маркеров проводить отбор по генотипу в отсутствие данных о генах, влияющих на признак.

Метод ОПМ предполагает использование ДНК-маркеров, тесно сцепленных с целевым геном, вместо или вместе с фенотипическим анализом. Маркеры, тесно сцепленные с целевым геном, являются надежным инструментом для предсказания фенотипа. Отбор нужного аллеля целевого гена осуществляется на основе тесно сцепленного с ним аллеля соседнего маркерного локуса. Бульшая точность отбора достигается при использовании пары маркеров, расположенных вблизи гена по разные стороны от него (т. е. маркеров, фланкирующих целевой ген). Если ген отсеквенирован и выявлены различия нуклеотидной последовательности разных аллелей данного гена, то можно разработать так называемый «внутригенный маркер». Использование такого маркера позволит отбирать нужные генотипы с наиболее высокой точностью.

Метод ОПМ хорошо зарекомендовал себя при беккросной и линейной селекции, а также при создании пирамид генов [Moose, Mumm, 2008].

При беккросной селекции можно вести отбор по внутригенному маркеру (foreground selection), по маркерам, тесно сцепленным с геном (recombinant selection), по генетическому фону (background selection), а также комбинировать отбор по генетическому фону с отбором по внутригенному маркеру или по маркерам, тесно сцепленным с геном. Использование значительно большего числа маркеров, равномерно распределенных по геному, позволяет не только контролировать передачу целевого гена от донора реципиенту, но и ускорять восстановление генома реципиента.

2. Материал и методы исследования

Работа выполнена в лаборатории биотехнологии Краснодарского научно-исследовательского института сельского хозяйства им. П.П. Лукьяненко в 2013-2014 годах.

Объект исследования - мягкая пшеница (Triticum Aestivum). Исследованы 70 интрогрессивных линий мягкой пщеницы из коллекции КНИИСХ, несущие генетический материал от синтетических форм Т. miguschovae, авродес и авролата. Полный список этих линий приведен в таблице 3 по ходу изложения результатов их сравнения. Для идентификации маркеров использовалась геномная ДНК. В ПЦР-анализе распознавались маркеры 7 известных генов устойчивости к листовой ржавчине: Lr9, Lr21, Lr35, Lr39, Lr47, Lr50, Lr51.

Геномно-добавленная форма Т. miguschovae (ААGGDD), была получена от скрещивания T. militinae с устойчивой к листовой ржавчине формой Aegilops tauschii [Жиров Е.Г., 1980]. Этот синтетический гексаплоид обладает высокой фертильностью, компактным колосом и достаточно лёгким вымолотом. Полученная форма отличается от видов секции Triticum по двум геномам и по наличию иной цитоплазмы, которая однозначна с цитоплазмой T. timopheevii. Обладает абсолютной устойчивостью к листовой, стеблевой, жёлтой ржавчинам и к мучнистой росе.

Геномно-замещённые синтетические формы Авродес и Авролата были получены на основе выделения и использования тетракомпонента мягкой пшеницы (AABB, 2n=28). Возможность удаления одного из субгеномов (генома D) впервые была продемонстрирована Кербером [Kerber, 1964]. Такие тетракомпоненты в отсутствии генома D утратили хлебопекарные свойства. Однако скрестив полученные тетракомпоненты с Ae. Tauschii и отобрав амфидиплоид, Кербер и Дик восстановили гексаплоидность пшеницы и ее хлебопекарные качества [Kerber, Dick, 1969]. Таким образом, было показано значение D генома с одной стороны, а возможность замещать один из субгеномов мягкой пшеницы геномами других видов - с другой стороны.

Основываясь на такой возможности, в конце семидесятых годов прошлого столетия в лаборатории цитогенетики КНИИСХ под руководством Е.Г. Жирова был разработан оригинальный подход по перестройке генома мягкой пшеницы. Путем замещения генома твёрдой пшеницы на геномы AABB был получен тетраплоидный компонент сорта Аврора. С использованием этого тетракомпонента были созданы синтетические геномно-замещённые формы, у которых геном D мягкой пшеницы был замещён соответственно на геномы Ae. speltoides и Ae. umbellulata (авродес и авролата).

2.1 Полевые методы исследования

Реакцию растений на поражение листовой ржавчиной определяли в полевых условиях. Популяцию линий заражали в фазе выхода в трубку смесью уредоспор ржавчины, собранных с разных сортов пшеницы. Определение устойчивости проводили по международной шкале. Майнса и Джексона [Mains E.B., Jackson H.S., 1926]. К устойчивым относили растения с типом реакции 0 (иммунные), 1 (высокоустойчивые) и 2 (умеренно устойчивые). К восприимчивым относили растения с типом реакции 3 (умеренно восприимчивые) и 4 (сильно восприимчивые).

Рисунок 2 - Шкала устойчивости Мейнса и Джексона

2.2 Выделение геномной ДНК

Геномную ДНК пшеницы выделяли по методу Плашке с соавторами [Plaschke J. et al., 1995] с незначительными модификациями. Для выделения использовали пяти-семи дневные этиалированные проростки растений пшеницы. Образец представлял смесь ДНК, выделенной из 5-10 индивидуальных проростков одного сорта или линии, взятых в эквимолярном количестве. Методика выделения:

- отбирают 2 участка листа длиной 3 см из отдельных растений и сушат при 40 ⁰С;

- измельчают материал с помощью механического гомогенизатора;

- в пробирки с гомогенатом добавляют 300 мкл предварительно разогретую смесь СТАБ буфера с меркаптоэтанолом в соотношении 7 мкл меркаптоэтанола на 5 мл СТАБ буфера;

- помещают пробирки с материалом в водяную баню на час при 65 ⁰С;

- охлаждают пробирки до комнатной температуры;

- добавляют 150 мкл хлороформа;

- ставят на качалку и мещают в течение 15 минут;

- пробирки с материалом центрифугируют 5 минут при 15 тыс.g;

- отбирают 120 мкл надосадочной жидкости в чистые пробирки;

- добавляют 150 мкл предварительно охлажденного до -20 ⁰С 70% раствора этанола;

- перемешивают и помещают материал в холодильник при -20 ⁰С на 5-10 минут;

- материал в пробирках центрифугируют 5 минут при 15 тыс.g;

- сливают надосадочную жидкость и добавляют 200 мкл 70% раствора этанола;

- сушат материал 15-20 минут;

- добавляют 100-200 мкл бидистилированной воды;

- растворяют материал при 4 ⁰С в течение ночи;

2.3 ПЦР анализ линий пшеницы

Идентификацию Lr-генов осуществляли с использованием ПЦР (полимеразная цепная реакция), с праймерами, маркирующими отдельные гены. Праймеры отбирали на основании литературных данных, нуклеотидные последовательности представлены в таблице 2.

Реакционная смесь объёмом 25 мкл содержала 1x PCR buffer (50мМ К Cl, 20 мМ трис-Н Cl, рН 8,4 , 2-5 мМ Мg Cl2, 0,01% твин-20), 2 mM MgCl₂, по 0,2 мМ каждого dNTP, 12.5 pmol каждого праймера , 50 нг ДНК и 1 ед. Taq-полимеразы. Амплификацию вели согласно условиям, рекомендуемым авторами, с незначительными модификациями [Brown-Guedira, Singh; Petsova et al., 2000].

Продукты амплификации разделяли электрофорезом в 2% агарозном геле в 0,5 х ТВЕ-буфере. Гели окрашивали бромистым этидием и фотографировали в ультрафиалетовом свете c помощью фотобокса «INFINITI 1000».

Таблица 2 - Характеристика праймеров, сцепленных с генами устойчивости к листовой ржавчине [Гультяева, 2012]

Ген	Праймер	Последовательность нуклеотидов
Lr 39	GDM35-L	CCTGCTCTGCCCTAGATACG
	GDM35-R	ATGTGAATGTGATGCATGCA
Lr 50	GDM87-l	AATAATGTGGCAGACAGTCTTGG
	GDM87-r	CCAAGCCCCAATCTCTCTCT
Lr 9	FJ13/1	CCACAСTACCCCAAAGAGACG
	RJ`13/2	TCCTTTTATTCCGCACGCCGG
Lr35	BCD260F1	GAAGTTAAAGAGGTCTTGAC
	35R2	TTTTGAGAATCAGTCATCAC
Lr 47	PS10R	GCTGATGACCCTGACCGGT
	PS10L	TCTTCATGCCCGGTCGGGT
Lr21	D14L	CGCTTTTACCGAGATTGGTC
	D14R	CCAAAGAGCATCCATGGTGT
Lr51	S30-13L	GCATCAACAAGATATTCGTTATGACC
	AGA7-759R	TGGCTGCTCAGAAAACTGGACC

В качестве маркера молекулярной массы использовали ДНК маркер М 24 100 bp производства «СибЭнзим».

В качестве положительных контролей для определения известных генов были использованы синтетические формы и дикие сородичи.

В качестве отрицательного контроля использовали восприимчивый к листовой ржавчине сорт Аврора.

Таблица 3 - Условия ПЦР для праймеров, использованных в работе [Гультяева, 2012]

Маркер к гену	Условия амплификации	Мол. вес продукта
Lr 39	94 04 мин. 35 циклов(94 0 30 сек.; 550 30 сек.;720-30сек.) 72 05 мин.	160
Lr 50	94 04 мин. 30 циклов(94 0 30 сек.; 600 30 сек.;720-30сек.) 72 05 мин.	110
Lr 9	94° 6 мин; 30 циклов (92° 30 с, 68° 30 с, 72° 60 с); 72° 5 мин	1100
Lr35	94° 3 мин; 35 циклов (94° 45 с, 60° 45 с, 72° 60 с); 72° 7 мин	900
Lr 47	94° 5 мин; 35 циклов (94° 45 с, 61° 30 с, 72° 30 с); 72° 7 мин	282
Lr 21	94°С 5 мин., 30 циклов (94°С - 1 мин, 50° - 1 мин., 72°С - 2мин.), 72°С - 5 мин.	885
Lr 51	94°C 4 мин, 40 циклов (94°C - 45 с, 52°C - 45 с, 72°C - 60 с),72°C - 10 мин.	783

2.4 Рестрикция

Для идентификации нужного нам фрагмента после амплификации реакций на гены Lr21 и Lr51 было необходимо провести рестрикцию реакционной смеси.

Для гена Lr51 была использована рестриктаза Pst I с сайтом узнавания 5'...CTGCAvG...3'; 3'...G^ACGTC...5'. Условия рестрикции были следующими:

1х SE-Буфер О, BSA (100 мкг/мл);

Инкубировать 1 час при 37°С.

После рестрикции образуется фрагмент, длиной около 400 п.н.

Для идентификации фрагмента, сцепленного с геном Lr21 была использована рестриктаза MSP1 с сайтом узнавания 5'...CvCGG...3'; 3'GGC^C. Условия рестрикции были следующими:

1x SE Буфер O, BSA (100 мкг/мл);

Инкубировать 1 час при 38°С.

После рестрикции образуется фрагмент, длиной около 400 п.н.

Молекулярно-генетическая идентификация линий мягкой пшеницы из коллекции КНИИСХ, устойчивых к листовой ржавчине

Ген Lr39(Lr41) передан в мягкую пшеницу от Ae. Tauschii Coss. (= Ae. Squarrosa L., Triticum tauschii (Coss.) Schmal.). Источником этого гена являются несколько образцов Ae. Tauschii различного географического происхождения. С использованием одного из них была получена линия пшеницы KS86WGRC02. Ген Lr39 у этой линии картирован в коротком плече хромосомы 2D и сцеплен с SSR-маркером Xgwm210 [Raupp et al., 2001; Singth et al., 2004].

Вторым источником этого гена является линия пшеницы KS90WGRC10, получившая ген устойчивости от другого образца Ae. Tauschii. Изначально предполагалось, что эта линия несет ген, отличный от Lr39 и локализованный в хромосоме 1D [Cox et al., 1994]. Новому гену был присвоен символ Lr41. Однако в дальнейшем с использованием гибридологического анализа и молекулярных маркеров S. Singh с соавторами (2004) показали, что линии KS86WGRC02 и KS90WGRC10 имеют один и тот же ген.

В коллекции Lr-линий ВИЗР имеются оба образца с геном Lr39. В результате ежегодной полевой и лабораторной оценки линия KS90WGRC10 характеризовалась как высоко устойчивая [Гультяева, 2012].

В лаборатории КНИИСХ нами с помощью специальных цитологических методов была получена геномно-добавленная форма T. migushovae, содержащая в себе генетический материал Ae. tauschii и T. timopheevi, на основе которой были созданы интрогрессивные линии мягкой пшеницы.

По результатам ПЦР-анализа в лаборатории биотехнологии КНИИСХ маркер гена Lr39 был идентифицирован в высоко-устойчивых к листовой ржавчине линиях 1731 и 1755.

Рисунок 3 - Электрофорез. М - маркер длины, 1 - Tr. Migushovae, 2-24 - линии.

Ген Lr50 перенесен в мягкую пшеницу от Triticum Timopheevii subsp. armeniacum и локализован в длинном плече хромосомы 2В. Источником этого гена являются несколько образцов дикого вида, с использованием которых созданы беккросные линии на основе трех сортов озимой мягкой пшеницы [Brown-Guedira et al., 2003]. В связи с этим несколько линий с геном Lr50 (U2657 (Karl92*3/TA874), KS96WGRC36 (TAM 107*4/ TA 870) и U3193 (TAM 107*4/TA874) рекомендованы для селекции в качестве доноров и используются при анализе вирулентности P. triticina. Ген описан как частично эффективный в Северной Америке и России [Brown-Guedira, Singh; Гультяева и др., 2009].

В условиях лаборатории отдела биотехнологии КНИИСХ передача гена Lr50 в интрогрессивные линии осуществлялась с помощью геномно-добавленной формы T. migushovae.

В литературе описано два микросателлитных маркера гена Lr50. В ходе работы нами был использован маркер Xgdm87.

По результатам ПЦР-анализа в лаборатории биотехнологии КНИИСХ маркер гена Lr 50 был выявлен в линиях 449, 569, 763, 828, 899, 1417, 1731, 1741, 1897, 643.

Ген Lr9 передан мягкой пшенице от Aegilops umbellulata Zhuk. и локализован в длинном плече хромосомы 6B [Sears, 1961]. Первые сорта с Lr9 созданы в 60-70-х годах прошлого столетия в США. Ген Lr9 массово включали в селекционные программы во многих странах, в том числе и в России. Этот ген наиболее часто встречается в яровых сортах, выращиваемых в Поволжье, на Урале и Западной Сибири. Среди сортов, включенных в Государственный реестр селекционных достижений и рекомендуемых к возделыванию в РФ, доля носителей Lr9 составляет 9% [Гультяева, 2012].

Рисунок 4 - Электрофорез. М - маркер длины, 1 - Tr. Migushovae, 2-24 - линии.

До недавнего времени ген Lr9 относился к группе высокоэффективных во всем мире. Выращивание сортов с ним предопределило появление вирулентных изолятов гриба, которые впервые были отмечены в США в 1971 г. спустя четыре года с начала массового возделывания [McIntosh et al., 1995]. В настоящее время вирулентность к гену Lr9 отмечается как в регионах выращивания сортов с этим геном, так и за их пределами. В России ген Lr9 утратил эффективность в Западной Сибири [Мешкова и др., 1998]. В современной селекции ген Lr9 рекомендуется использовать в сочетании с другими высокоэффективными Lr-генами, например, Lr24 [Gupta etl al., 2010].

Исходя из своих родословных, можно сделать вывод о том, что полученные нами в лаборатории биотехнологии КНИИСХ интрогрессивные линии могут содержать известные гены устойчивости к листовой ржавчине Lr9 от Ae. umbellulata.

На сегодняшний день ген Lr9 является единственным известным геном устойчивости к листовой ржавчине, переданным в мягкую пшеницу от Ae. umbellulata. Данный ген является высокоэффективным в некоторых странах Европы, в том числе и в России [Zhemchuzina, Kurkova, 2010]. Молекулярный маркёр, сцепленный с Lr9, находится на расстоянии 8 сМ от гена; длина соответствующего ему фрагмента амплификации составляет 1100 п.н. [Schachermayr et al., 1994].

Интрогресивные линии с генетическим материалом Ae. umbellulata были созданы путём скрещивания геномно-замещённой формы Авролата с исходным сортом пшеницы Аврора [Давоян и др., 2004]. Для идентификации маркёра, сцепленного с Lr9, были отобраны 21 линия. Все линии были устойчивы к листовой ржавчине, тип реакции некоторых из них представлены в таблице 3. В 21 проанализированной линии маркера, сцепленного с геном с Lr9, выявлено не было (рисунок 5).

Рисунок 5 - Продукты амплификации с использованием пары праймеров FJ13/1 и RJ13/2 к диагностическому маркеру, сцепленному с геном устойчивости к листовой ржавчине Lr9: 1 - маркер длины; 2 - Кавказ; 3 - Аврора; 4 - линия TcLr9; 5 - Авролата; 6-26 - линии пшеницы с генетическим материалом Ae. umbellulata.

В настоящее время известно о передаче генов Lr35, Lr36, Lr47, Lr51 от вида Ae. speltoides [McIntosh et al., 2005].

Для передачи пшенице от диких сородичей генов устойчивости к болезням и других положительных признаков в лаборатории цитогенетики Краснодарского НИИСХ был разработан подход по перестройке генома мягкой пшеницы. Путём замещения генома твёрдой пшеницы на геномы ААВВ мягкой, был получен тетраплоидный компонент сорта Аврора [Жиров, Терновская, 1984]. С использованием полученного тетракомпонента, были созданы синтетические геномно-замещённые форма и Авродес, у которых геном D мягкой пшеницы был замещён геномом S Aе. speltoides. Используя эти формы, были получены интрогрессивные линии озимой мягкой пшеницы, характеризующиеся устойчивостью к болезням, высоким содержанием белка и другими интересными для селекции морфо-биологическими признаками.

Ген Lr35 передан мягкой пшенице от Ae. speltoides Tausch. и локализован в длинном плече хромосомы 2B. В одной транслокации с ним на расстоянии 3 cM находится ген Sr39 [Kerber, Dyck, 1990]

Ген описан как высоко эффективный в Западной Европе, США и Канаде [Mesterhazy et al., 2000] В полевых условиях Пушкинских лабораторий ВИР в 2002-2011 гг. пораженность линии Тэтчер с геном Lr35 колебалась от 0 до 50% [Гультяева, Баранова, 2010].

Образцы с генами Lr35 и Sr39 представляют особую значимость для использования в селекционных программах, поскольку, кроме устойчивости к бурой ржавчине, они не поражаются расой стеблевой ржавчины Ug99. В мировой практике нет примеров использования данной транслокации в коммерческих сортах пшеницы [McIntosh et al., 1995], поскольку в гей также присутствуют гены, обуславливающие хозяйственно-негативные признаки.

R. Mago с соавторами (2009) с использованием цитологических и молекулярных методов создали линию с укороченным сегментом транслокации, которая в настоящий период рекомендуется для использования в качестве донора этих генов.

В России также имеются примеры передачи устойчивости к бурой ржавчине от Ae. Speltoides. И.Г. Одинцова и соавторы (1991) в 1983-1988 гг. смогли получить устойчивые интрогрессивные линии от скрещивания и беккросирования мягкой пшеницей комплексно устойчивого амфидиплоида AD T, dicoccum x Ae. speltoides. Устойчивость линий к бурой ржавчине позволяет предположить участие в их контроле материала Ae. speltoides, т.к. коллекция T. dicoccum не содержит имунных фор, характерных для полученного интрогрессивного материала. С использованием иммунологического, цитологического и генетического методов было показано, что ряд устойчивых линий цитологически стабильны. Ген устойчивости у некоторых линий сцеплен с гаметоцидным геном, переданным от Ae. speltoides. Другая часть линий имела тот же ген устойчивости, но без гаметоцидного гена [Одинцова и др, 1991]. Эти линии получили массовое использование во многих селекцентрах б. СССР, поскольку имели комплексную устойчивость к бурой и стеблевой ржавчинам, а также к мучнистой росе. Следовательно, мареры генов устойчивости, переданных пшенице от Ae. speltoides, актуальны для скриннинга Lr-генов в России.

Рисунок 6 - Продукты амплификации с использованием пары праймеров BCD260F1 и 35R2 к диагностическому маркеру, сцепленному с геном устойчивости Lr35: 1 - маркер длины; 2 - Аврора; 3 - линия TcLr35; 4 - Авродес; 5-26 - линии пшеницы с генетическим материалом Ae. speltoides (26 - линия Р771).

В мировой литературе описано пять маркеров генов Lr35/Sr39. В данной работе использовался маркер BCD260F1/35R2 для скриннинга 22 устойчивых интрогрессивных линий мягкой пшеницы.

По результатам ПЦР-анализа, проведённого в лаборатории биотехнологии КНИИСХ, в высоко устойчивой линии Р771 был идентифицирован маркер гена Lr35.

Фрагмент хромосомы 7S#1с геном Lr 47 перенесен в мягкую пшеницу от Ae. speltoides и локализован в коротком плече хромосомы 7А [Dubcovsky et. al., 1998]. Ген относится к группе высокоэффективных во многих странах, в том числе и России [Helguera et al., 2000; Zhemchuzhina, Kurkova, 2010; Shabnam et al., 2011]. Источником этого гена у мягкой пшеницы является яровой сорт Pavon. Этот сорт широко используется в MAS-селекции в Австралии и Франции [Gupta et al., 2011]. В лаборатории КНИИСХ источником этого гена являются интрогрессивные линии, полученные с помощью синтетической геномно-замещённой формы Авродес. Ген Lr47 представляет потенциал для селекции в России.

ПЦР-маркер PS10 (праймеры PS10R и PS10L) создан на основе RFLP-маркера Xabc465, локализованного в 7S#1 транслокации, переданной пшенице от T. speltoides. Специфичность ПЦР-маркера оценивали с использованием 166 беккросных растений пшеницы, полученных на основе пяти образцов T. speltoides. Выявлено, что продукт амлификации размером 282 п.о. присутствовал только у образцов, имеющих также фрагмент рестрикции после гибридизации с RFLP-маркером. Был сделан вывод, что нуклеотидная последовательность маркера pS10 гомологична определенному участку хромосомы 7S T. speltoides, несущему ген Lr47, и маркер PS10 может быть рекомендован для его идентификации [Helguera et al., 2000].

В ходе ПЦР-анализа, проведённого нами в лаборатории биотехнологии КНИИСХ ни в одной из 22 линий не было идентифицировано маркера, сцепленного с геном Lr47.



Рисунок 7 - Продукты амплификации с использованием пары праймеров PS10R и PS10L к диагностическому маркеру, сцепленному с геном устойчивости Lr47: 1 - маркер длины; 2 - Аврора; 3 - образец № 3256; 4 - Авродес; 5-26 - линии пшеницы с генетическим материалом Ae. speltoides.

Ген Lr 21 передан в мягкую пшеницу от Ae. Tauschii Coss. (= Ae. squarrosa L., Triticum tauschii (Coss.) Schmal.) и локализован в коротком плече хромосомы 1D. L. Huang и B.S. Gill (2001) показали, что ген Lr40, ранее идентифицированный у линии KS89WGRC07, идентичен с Lr21. Ген Lr21 относится к группе высокоэффективных в США и Канаде [Kolmer et al., 2010]. В западной Европе пораженность линии TcLr21 варьировала от 0 до 100% по годам и по странам [Mesterhazy et al., 2000; Lind, Gultyaeva, 2007; Hanzalova et al., 2008]. При многолетнем анализе популяций P. triticina из различных регионов России мы ежегодно наблюдали высокие значения частот вирулентности к гену Lr21 [Гультяева, Баранова, 2010]. Однако в полевых условиях Северо-западного региона интенсивность поражения линий TcLr21 и KS89WGRC07 в период 2002-2011 гг. не превышала 30%.

Ген Lr21 не нашёл применения в мировой селекции несмотря на то, что является одним из первых генов, интродуцированных в мягкую пшеницу от Ae. tauschii. Известен только один сорт AC Cora, созданный с его участием.

Несмотря на ограничение в использовании этого гена в селекции он является одним из наиболее изученных. Среди 67 известных Lr-генов только три (Lr1, Lr21, Lr34) клонированы и выявлено, что гены Lr1 и Lr21 относятся к NBS-LRR-классу (гены устойчивости, кодирующие белки с сайтом связывания нуклеотидов и регионом обогащенных лейцинов повторов) [Huang et al., 2003]. Это наиболее многочисленная группа клонированных к настоящему времени генов устойчивости растений.

Для идентификации гена Lr21 предложено 2 ПЦР-маркера: D14 и Lr21F/R. Оба этих маркера созданы на основе идентичного RFLP-маркера, конвертированного в CAPS и STS-маркеры. Для их амплификации используют общий прямой и различные обратные праймеры. Эффективность обоих маркеров подтверждена при анализе линий, созданных с использованием образцов Ae. tauschii различного географического происхождения [Talbert et al., 1994; Huang, Gill, 2001].

В данной работе был использован маркер D14. Молекулярный вес продукта амплификации у образцов с геном Lr21 при использование праймеров на маркер D14 составляет 885 п.о. Однако для идентификации маркера гена Lr21 при использовании данного маркера перед постановкой электрофореза требуется гидролиз продукта амплификации эндонуклеазой рестрикции MSP I [Huang, Gill, 2001].

В ходе амплификации и рестрикции, проведённой в лаборатории отдела биотехнологии КНИИСХ ни в одной из исследуемых линий не было найдено маркера к гену Lr21.

Ген устойчивости к листовой ржавчине Lr51, ранее известный как LrF7, был передан в пшеницу от T. speltoides [Dvorak, 1977]. Lr51 локализован на транслокации хромосомы 1B мягкой пшеницы. В полевых испытаниях на устойчивость к расе 5 P. triticina J. Dvorak показал, что растения, гомозиготные по Lr51, являются высокоустойчивыми, в то время как гетерозиготы показали достаточно низкий уровень устойчивости с небольшими пустулами, окружёнными некрозами и хлорозами [Dvorak, 1977].



Рисунок 8 - Продукты рестрикции с МSР1 амплифицированных фрагментов, полученных с использованием праймеров D14/L, D14/R к маркеру сцепленному с геном устойчивости Lr21. 1 - маркер длины; 2-4 T.migushovae, 5- Безостая 1, 6- Лавина, 7, 15 - Тс Lr21, 8-13 - линии полученные с участием T. migushovae, 14 - Ae. taushii. (2423)

Для идентификации гена Lr51 был разработан CAPS маркер к гену AGA7, сцепленным с транслокацией от T. speltoides, содержащей ген Lr51. Праймеры S30-13L и AGA7-759R были разработаны преимущественно для амплификации аллелей AGA7 B и S генома. В ходе амплификации и рестрикции маркера, сцепленного с геном Lr51, не было идентифицировано в синтетических формах, следовательно, в линиях его тоже нет.

Не смотря на то, что в высокоустойчивых линиях, полученных с использованием генетического материала Ae. Umbellulata не было обнаружено маркера, сцепленного с геном Lr9, все линии оказались высокоустойчивыми в полевых условиях. Так как на данный момент известно о передаче лишь одного гена устойчивости в мягкую пшеницу от Ae. umbellulata, то мы предполагаем, что в наши линии были переданы новые, ещё не описанные в литературе, гены устойчивости к листовой ржавчине. Поэтому в дальнейшем планируется продолжить исследование этих линий. Однако также существует небольшая вероятность того, что могла произойти мутация в маркере, и потому мы не смогли его обнаружить.

Рисунок 9 - продукты рестрикции с PST1 амплифицированных фрагментов, полученных с использованием праймеров S30BL, AGA7-759R к маркеру сцепленному с геном устойчивости Lr 51. 1 - маркер длины; 2-3 - образцы Ae. speltoides (2716, С4), 4-5 - Авродес, 6-17 - линии с генетическим материалом Ae. speltoides

Лишь в одной из линий, полученных с использованием генетического материала Ae. speltoides, был обнаружен маркер, сцепленный с геном устойчивости Lr35. Однако, остальные линии, не смотря на отсутствие маркеров генов устойчивости, в полевых условиях оказались не восприимчивыми к бурой ржавчине. К сожалению, в нашем распоряжении не имеются пока что праймеры к маркерам всех известных описанных в литературе генов устойчивости к листовой ржавчине, переданных от Ae. speltoides в мягкую пшеницу. Поэтому мы предполагаем, что в интрогрессивные линии мягкой пшеницы были переданы те гены, проверить наличие которых мы не в состоянии. Также мы предполагаем, что в наших линиях могут быть иные, ещё не описанные в литературе, гены устойчивости к листовой ржавчине.

Наличие гена Lr50 в интрогрессивных линиях мягкой пшеницы, показавших восприимчивость к листовой ржавчине в полевых условиях, скорее свидетельствует о том, что этот ген не является эффективным в условиях Краснодарского края и не дает устойчивость к местным расам возбудителя. Также данный результат можно объяснить феноменом пенетрантности, то есть зависимости фенотипического проявления гена от генетического окружения. То есть, в данных линиях могут присутствовать гены, которые подавляют эффект гена Lr50.

ржавчина болезнь пшеница молекулярный

Заключение

Данная квалификационная работа является частью исследований лаборатории биотехехнологии КНИИСХ по теме молекулярно-генетическая идентификация линий мягкой пшеницы, устойчивых к листовой ржавчине.

Подробно рассмотрена та часть этих многолетних исследований коллектива лаборатории, в которой принимал участие автор.

По результатам проведенных исследований обоснованы следующие выводы:

1). Из исследованных 70 интрогрессивных линий мягкой пшеницы в полевых испытаниях устойчивость к листовой ржавчине обнаружили 67; 3 - восприимчивость;

2). По итогам ПЦР-анализа среди 67 устойчивых линий молекулярные маркеры генов устойчивости обнаружены у 11 (16,4%); такой процент не следует считать низким, поскольку из 15 известных генов устойчивости в работе могло быть идентифицировано только 7 (по числу доступных праймеров);