Биотехнологический способ получения меченого стабильными изотопами липид-транспортирующего белка чечевицы (Lens culinaris)

В отличие от аллергенных фрагментов и мутантов, конформационные варианты аллергена сохраняют все Т-клеточные эпитопы, потому что их первичная структура не меняется. Для конформационных вариантов некоторых аллергенов показано, что ликвидация внутримолекулярных дисульфидных связей эпитопов IgE, инициирует денатурацию белка и снижение аллергенности. В данном контексте, аллерген пыльцы Parietaria judaica Par J 1 также был объектом ряда исследований. Модель его пространственной структуры демонстрирует наличие конформационного иммунодоминантного эпитопа в N-концевой области (остатки 1 - 30), который включает критически важные остатки: два цистеина (C14 и C29) образующих дисульфидный мостик и несколько заряженных аминокислот (K21, K23, E24 и K27). Гипоаллергенный мутантый LTP - аналог аллергена пыльцы Parietaria species rPar J 1 - был создан с запрограммированным посредством сайт-направленного мутагенеза дефектом дисульфидных мостиков [104,105,106]. В то время как уже несколько гипоаллергенных LTP из пыльцы были исследованы на наличие иммуногенных свойств, разработка гипоаллергенных LTP из растительной пищи для ASIT ограничена. В частности, гипоаллергенные аналоги nsLTPs полученные из растительной пищи не были оценены как потенциальные вакцины [96].

Решению проблемы может помочь использование при создании вакцин пептидов, отличающихся по аминокислотной последовательности от антигенных детерминант LTP, но сохраняющих способность связываться с комплиментарными антителами.

Такие пептиды являются имитаторами антигенных детерминант.

Пептиды-имитаторы могут быть достаточно вырожденными и обнаруживать перекрестную реактивность с антителами к разным видам LTPs, обладающими частичной структурной гомологией. Вырожденные пептиды могут иметь свойство индуцировать при иммунизации антитела, перекрестно реагирующие с антигенными вариантами одного и того же вида LTP, то есть проявлять молекулярную мимикрию.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1 Оборудование

Настольная микроцентрифуга MiniSpin (Eppendorf); спектрофотометр «Ultraspec 3300 PRO» (Amersham); весы электронные (Sartorius); весы электронные «JP2-3000» (Chyo); pH-метр «501А» (Orion Research); мешалка магнитная «MM3M» (Завод комплектных лабораторий); встряхиватель для пробирок «ВП» (Россия); МАЛДИ-времяпролетный масс-спектрометр Reflex III (Bruker); спектрополяриметр J-810 (Jasco); микроволновая печь (Samsung); настольные ламинарные боксы «Gelaire» (Flow Laboratories) и «ВЛ-22» (Сампо); сухой термостат 132000 (Boekel); aвтоклав ВК-75 (Тюменский завод медицинского оборудования и медицинской техники); низкоскоростная центрифуга с охлаждением «Minifuge GL» (Heraeus); термостатируемые качалки «Environ-Shaker» и «Incubator-Shaker» (Lab-line); термостат для микропробирок «Termostat 5320» (Eppendorf); встряхиватель для микропробирок «5432» (Eppendorf); система для заливки гелей «Mighty Small SE 245 Dual Gel Caster» (Amersham); камера для вертикального электрофореза «2050 Midget Electrophoresis Unit» (Hoefer) c источником питания «EPS 500/400» и системой охлаждения «2219 Multitemp II Thermostatic Circulator» (LKB); ультразвуковой гомогенизатор «5/75.MK2»; вакуумный концентратор «SpeedVac» (Savant); препаративная центрифуга «J2-21» (Beckman); насос перистальтический «2120 Varioperpex II» (LKB); система для фильтрования (Millipore); лазерный денситометр «2202» (LKB); хроматограф «Gillson-303»; двухканальный самописец «REC-481».

2.2 Реактивы и расходные материалы

Уксусная кислота (Лекбиофарм); этанол (Ферейн); трис(гидроксиметил)-аминометан (трис) (Serva); соляная кислота (Реахим); калия хлорид (Реахим); магния хлорид (Merck); кальция хлорид (Sigma); магния сульфат (Merk); тиамина хлорид (витамин В1) (Мосхимфармпрепараты); железа (III) хлорид (Реахим); глицерин (Merck, Serva); бакто-агар (Ferak); бакто-триптон (Difco); дрожжевой экстракт (Difco); ампициллина натриевая соль (Ферейн); канамицина сульфат (Биохимик); тетрациклин (Синтез); [15N]-меченный хлорид аммония (15NH4Cl) (CIL); [13C]-меченая глюкоза (CIL); изопропилтио-в-D-галактопиранозид (IPTG) (Promega); D-глюкоза (Ferak); в-меркаптоэтанол (BME) (Fluka); изопропанол (Реахим); акриламид (Bio-Rad); N,N'-метиленбисакриламид (Bio-Rad); мочевина (Bio-Rad); персульфат аммония (PSA) (Bio-Rad); метанол (Реахим); Кумасси G-250 (Serva); натрия гидрофосфата додекагидрат (Fluka); натрия дигидрофосфат (Fluka); фенилметилсульфонилфторид (PMSF) (Sigma); Ni2+-сефароза (Amersham Biosciences); гуанидина гидрохлорид (Gu-HCl) (Fluka); трицин (Serva); глицин (Bio-Rad); натрия хлорид (Реахим); додецилсульфат натрия (SDS) (Bio-Rad); N,N,N',N'-тетраметилен-1,2-диамин (TEMED) (Fluka); белковый маркерный набор (Fermentas); пептидно-белковый маркерный набор (2,512-16,949 кДа) (Amersham); имидазол (Sigma); мембрана диализная (Sigma); трифторуксусная кислота (ТФУ) (Applied BioSystems); бромциан (Sigma); бромфеноловый синий (LKB); ацетонитрил (Реахим); азид натрия (Fluka); 2,5-дигидроксибензойная кислота (Sigma).

Колонка для ВЭЖХ Dr. Masch GmbH Reprosil-Pur C18-AQ (d=5 мкм, 250x10 мм); микрошприцы на 25 и 1000 мкл (Hamilton); шприц для стерильной фильтрации Multifit Luer-Lok® 50cc (Becton Dickinson); фильтры для стерильной фильтрации Millex-GV PVDF 0,22 мкм (Millipore); наконечники для автоматических дозаторов сменные на 10, 200, 1000 мкл (QSP); микропробирки полипропиленовые на 0,6, 1,5 и 2 мл (QSP).

При проведении экспериментов использовалась деионизированная вода, полученная на установке «Milli-Q» (Millipore). Водные растворы твердых веществ очищались с помощью фильтров Туре НVLP 0,45 мкм и 0,22 мкм (Millipore).Экспрессию рекомбинантного белка проводили в штамме E. coli BL-21 (DE3) фирмы Novagen.

2.3 Методы

2.3.1 Приготовление компетентных клеток

Консервированную при -70°С суспензию клеток штамма BL21 (DE3) E. coli оттаивали при комнатной температуре, после чего высевали в 10 мл жидкой среды LB (Luria-Bertani) без антибиотика и растили в течение ночи (16-20 ч) при 37?С и 200 об/мин-1 до конечной OD600=2,0-3,0. Ночную культуру клеток в объёме 2 мл инокулировали в 200 мл жидкой среды LB без антибиотика и подращивали до оптической плотности 0,3-0,5, снижая температуру с 37?С до 20-25?С. После этого культуру центрифугировали при 3000 об/мин-1 при 5?С в течение 10 мин в двух пробирках на 50 мл (в два приема), супернатант выливали. Дальнейшую работу с клетками проводили на льду. Клеточный осадок ресуспендировали в 5-10 мл охлажденного до 4?С 0,1 М CaCl2, объединяли, доводили объем охлажденным 0,1 М CaCl2 до 45-50 мл, перемешивали и центрифугировали в тех же условиях, супернатант выливали. Клеточный осадок ресуспендировали в 10 мл холодного буфера TB (Transformation Buffer), выдерживали 20 мин на льду, после чего повторно перемешивали и разливали в охлажденные стерильные 0,5 мл пробирки по 40 мкл. Приготовленные таким образом компетентные клетки замораживали в жидком азоте, хранили при температуре -70?С.

Состав среды LB:

Компоненты	Концентрация, m/V
Бакто-триптон	1%
Дрожжевой экстракт	0,5%
NaCl	1%



Состав буфера ТВ:

Компоненты	Концентрация
HEPES	10 мM
CaCl2Ч2H2O	15 мM
KCl	250 мM
Глицерин	15% (m/V)
MnCl2Ч4H2O	55 мM
H2O

2.3.2 Химическая трансформация клеток E.coli

Производили химическую трансформацию клеток штамма BL(DE3) плазмидами pET-His8-TrxL-Lc-LTP2. 50 мкл взвеси компетентных клеток в 200 мкл в пробирках до 0°С и смешивали с 5 мкл лигазной смеси и по 0,5 мкл плазмиды в концентрации 1 нг/мкл. Инкубировали на льду в течение 20 мин. Осторожно смешивали носиком автоматической пипетки, не пипетируя и инкубировали на льду в течение 15 минут. Далее охлаждённую смесь опускали в водяную баню с температурой воды 42_ С и выдерживали в течение 45 секунд.

Затем быстро вынимали пробирки из воды и переносили на лёд, где клеточная суспензия охлаждалась при 0°С в течение 3 минут. К содержимому пробирок добавляли по 800 мкл питательной среды SOC. Затем полученную в объёме 1 мл суспензию клеток в среде SOC термостатировали при 37°С в течение 40 мин, после чего центрифугировали при 4000 об/мин-1 в течение 2 мин при комнатной температуре. Далее из каждой пробирки отбирали по 800 мкл супернатанта, а клеточный осадок ресуспендировали в оставшихся 200 мкл и высевали на чашки Петри с LB-агаром c добавлением 20 мМ глюкозы и 50 мкг/мл ампициллина. Чашки с трансформантами инкубировали при температуре 37°С в течение ночи (16-20 ч).



Состав среды SOC:

Компоненты	Концентрация
Бакто-триптон	2%
Дрожжевой экстракт	0,55%
NaCl	10 мМ
KCl	10 мМ
MgCl2	10 мМ
MgSO4	10 мМ
Глюкоза	20 мМ

2.3.3 Препаративная экспрессия в клетках E. coli на 13 C15N-меченной среде

Препаративную экспрессию гибридного белка [15N]-His8-TrxL-Lc-LTP2 проводили в клетках E. coli штамма BL21 (DE3). Объём культуральной жидкости составлял 2 л. Добавили по 3 колонии трансформированных клеток в каждую из восьми пробирок с 10 мл питательной среды LB с добавлением 20 мМ глюкозы и 100 мкг/мл ампициллина. Клетки выращивали при температуре 37°С и перемешивании с частотой 200 об?мин-1 пока OD600 не стала равной 1,35. Центрифугировали при 4000 об?мин-1 при температуре 4°С в течение 12 мин. Полученный клеточный осадок три раза промывали не содержащей 15NH4Cl и 13C-D-глюкозы средой M9 от компонентов богатой среды. Для этого клетки каждый раз ресуспендировали в небольшом объеме бедной среды и осаждали центрифугированием в тех же условиях. Затем клеточный осадок, отмытый и ресуспендированный в небольшом объеме (0,5-1 мл) содержащей 15NH4Cl и13C-D-глюкозу среды М9, в объем 2 л культуральной среды. Засевали клетки в выращивали в колбах на 2 л, в каждой из которых предварительно было налито по 312 мл среды М9, при температуре 25-37°С и перемешивании с частотой 200 об?мин-1. Индукцию экспрессии гибридного белка проводили, добавляя 0,2 мМ IPTG на стадии логарифмического роста культуры при OD600=0,8. Инкубировали в течение 10 ч.

Состав среды М9 (10x), pH 7,2:

Компоненты	Концентрация, г/л
Na2HPO412H2O	171,9
KH2PO4	30
NaCl	5
15NH4Cl	10
[13C]-меченая глюкоза	3,6

Состав среды M9 (1x):

Компоненты	Концентрация
M9	1х
[13C]-меченая глюкоза	20 мМ
MgSO4	2 мМ
CaCl2	0,1 мМ
FeCl3	10 мкМ
Тиамина хлорид (витамин В1)	1 мМ
Ампициллин	100 мкг/мл

2.3.4 SDS-электрофорез в ПААГ

Анализ полученных на разных стадиях выделения фракций и клеточных образцов проводили c помощью SDS-электрофореза по методу Леммли и в оптимизированной для разделения небольших белков и пептидов трис-трициновой системе. Аликвоты образцов смешивали с денатурирующим буфером, кипятили на водяной бане в течение 3-5 мин и вносили микрошприцом в лунки геля. При анализе клеточного материала в лунку вносили эквивалент 0,1 опт. ед.

Электрофорез белков проводили при постоянной силе тока: 15 мА в концентрирующем геле, 20 мА на границе раздела и 25 мА в разделяющем геле. Продолжительность электрофореза составляла приблизительно 1,5 часа. По окончании электрофореза проводили одновременное окрашивание и фиксирование белковых полос (1 час), а затем отмывку геля до обесцвечивания фона.

Электрофорез в трис-трициновой системе проводили при постоянном напряжении 90-100 В в течение 4 часов. По окончании электрофореза проводили одновременное фиксирование и окрашивание белковых полос (40 мин) и отмывку геля (до обесцвечивания фона).

Растворы для проведения вертикального электрофореза:

1) Растворы для проведения белкового электрофореза.

Стоковые растворы для заливки ПААГ:

Раствор I: раствор акриламида 30%Т, 3%С (29,1% акриламид, 0,9% метиленбисакриламид, вода);

Раствор II: 1,875 М трис-HCl, pH 8,8;

Раствор III: 1,25 М трис-HCl, pH 6,8;

Раствор IV: 10% SDS;

Раствор V: 10% ТЕМЕД;

Раствор VI: 10% PSA (свежеприготовленный).

Состав концентрирующего и разделяющего гелей:

Компоненты	Разделяющий (15%Т, 3%С)	Концентрирующий (5%Т, 3%С)
Раствор I	8 мл	1,3 мл
Вода	4,48 мл	6 мл
Раствор II	3,2 мл	-
Раствор III	-	830 мкл
Раствор IV	160 мкл	83 мкл
Раствор V	160 мкл	164 мкл
Раствор VI	120 мкл	60 мкл



Буфер для образцов:

50 мМ трис-HCl, pH 6,8, 2% SDS, 5% BME, 12% глицерин, 0,01% бромфеноловый синий.

Растворы для обработки гелей:

1. Раствор для окрашивания белковых полос: 25% изопропиловый спирт, 10% уксусная кислота, 0,1% Кумасси G-250;

2. Раствор для отмывания гелей после окрашивания: 10% уксусная кислота.

Электродный буфер (10x):

1,93 М глицин, 0,25 М трис, рН 8,3, 1% SDS.

2) Растворы для проведения пептидного электрофореза.

Стоковые растворы для заливки ПААГ:

Раствор I: раствор акриламида 49,5%Т, 3%С (48% акриламид, 1,5% метиленбисакриламид, вода);

Раствор II: раствор акриламида 49,5%Т, 6%С (46,5% акриламид, 3% метиленбисакриламид, вода);

Раствор III: 3 М трис-HCl, 0,3% SDS, pH 8,45;

Раствор IV: 10% раствор PSA (свежеприготовленный);

Раствор V: 10% раствор ТЕМЕД.

Состав концентрирующего, спейсорного и разделяющего гелей:

Компоненты	Концентрирующий (5%Т, 3%С)	Спейсорный (10%Т, 3%С)	Разделяющий (16,5%Т, 6%С)
Раствор I	500 мкл	610 мкл	-
Раствор II	-	-	5 мл
Вода	4,2 мл	1,4 мл	1 мл
Раствор III	1,55 мл	1 мл	5 мл
Мочевина	-	-	5,4 г
Раствор IV	50 мкл	20 мкл	90 мкл
Раствор V	80 мкл	25 мкл	80 мкл



Буфер для образцов:

50 мМ трис-HCl, pH 6,8, 1% SDS, 1% BME, 8 М мочевина, 0,05% Кумасси G-250.

Растворы для обработки гелей:

1. Фиксатор: 10% уксусная кислота, 50% метанол;

2. Раствор для окрашивания белковых полос: 0,025% Кумасси G-250, 10% уксусная кислота;

3. Раствор для отмывания гелей после окрашивания: 10% уксусная кислота.

Электродные буферы:

Анодный: 0,2 М трис-HCl; pH 8,9;

Катодный: 0,1 M трис; 0,1 M трицин; pH 8,25; 0,1% SDS.

2.3.5 Выделение и очистка гибридного белка

Лизирование клеток

Клеточную культуру BL-21(DE3)/pET-His8-TrxL-Lc-LTP2 центрифугировали при 8000 об.мин-1 в течение 30 мин для получения клеточного осадка, который далее ресуспендировали в 10-30 мл буфера А1 (50 мМ трис-HCl, 0,5 M NaCl, 20 мМ имидазола, pH 7,8) с добавлением 1 мМ PMSF и гомогенизировали на льду с помощью ультразвука (6 циклов по 30 сек, затем 2 цикла по 45 сек). Лизат центрифугировали при 15 000 об?мин-1 в течение 30 мин. После этого полученный осветленный лизат разделяли с помощью аффинной хроматографии на колонке нормального давления.

Металлохелатная хроматография и диализ

Очистку гибридного белка [15N]-His8-TrxL-Lc-LTP2 проводили с помощью металлохелатной хроматографии на колонке с Ni2+-сефарозой при скорости потока 0,7 мл/мин. Осветленный лизат наносили на металлохелатную колонку, уравновешенную буфером А1. Далее колонку тщательно промывали буфером А1 для удаления неспецифически связавшихся с ней примесей. Элюцию проводили буфером В1 (50 мМ трис-HCl, 0,5 M NaCl, 0,5 М имидазола, pH 7,8). Детектирование вели при длине волны 280 нм. Наличие и чистоту гибридного белка в элюате оценивали методом SDS-электрофореза.

Далее элюат диализовали против 3 л тридистиллированной воды (MWCO 12 кДа) в течение ночи при температуре 4°С и постоянном перемешивании. Выпавший осадок отделяли центрифугированием при 14 000 об.мин-1 в течение 10 мин, полученный супернатант лиофильно высушивали.

2.3.6 Расщепление гибридного белка

Расщепление гибридного белка [15N]-His8-TrxL-Lc-LTP2 проводили с помощью реакции с бромцианом в кислой среде. Навеску гибридного белка растворяли в 80% (v/v) ТФУ в концентрации 10-20 мг/мл, добавляли 100-кратный молярный избыток бромциана и инкубировали в темноте 16-20 ч при комнатной температуре. Реакцию останавливали добавлением трехкратного объема воды, после чего упаривали образец на вакуумном концентраторе SpeedVac. К высушенному препарату добавляли воду, и образец снова упаривали. Процедуру добавления воды и упаривания повторяли не менее трех раз. Степень расщепления гибридного белка оценивали методом SDS-электрофореза.

2.3.7 Выделение и очистка целевого белка

Повторная аффинная хроматография и обессоливание образца

Очистку целевого белка от нерасщепленного гибридного белка и белка-партнера проводили с помощью повторной металлохелатной хроматографии в той же буферной системе на колонке с Ni2+-сефарозой в системе буфер А1 (50 мМ трис-HCl, 0,5 M NaCl, 20 мМ имидазола, pH 7,8) / буфер B2 (50 мМ трис-HCl, 20 мМ имидазола, pH 7,8), содержащей 6М гуанидина гидрохлорид, в концентрации 20-25 мг/мл (см. п. 2.3.5.2.). Образцы для нанесения на металлохеллатную колонку готовили, растворяя упаренный после расщепления бромцианом образец в буфере (50 мМ трис-HCl, 20 мМ имидазола, pH 7,8), содержащем 6М гуанидина гидрохлорид, в концентрации 20-25 мг/мл. Остатки кислоты нейтрализовали, добавляя раствор щелочи (1 М NaOH) до pH 7-8. Затем производили процедуру обессоливания образца.

Проводили очистку фракции образца от 6М гуанидина гидрохлорида. Производили разбавление в 10 раз, прибавляя к 50 мкл образца к 450 мкл воды. Затем добавляли 500 мкл 20% ТХУ, перемешивали и оставляли при температуре -20_ С в течение 20 минут.

Далее смесь центрифугировали при 14 000 об/мин-1 при температуре +4_ С в течение 15 минут, после чего супернатант отбрасывали, а к осадку добавляли 500 мкл ацетона. После центрифугирования повторяли операцию отмывки ацетоном и осаждения образца. Полученный осадок ресуспедировали с добавлением воды и высушивали при помощи вакуумного концентратора SpeedVac.

Высокоэффективная жидкостная хроматография

Финальную стадию очистки рекомбинантного [15N]-меченного Lc-LTP2 проводили методом обращённо-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ОФ-ВЭЖХ) на колонке Reprosil-Pur C18-AQ (d=5 мкм, 250x10 мм) в системе буферов, содержащих ацетонитрил и ТФУ: А2 - 5% ацетонитрил, 0,1% ТФУ; В2 - 80% ацетонитрил, 0,1% ТФУ. Аликвоту полученного после повторной металлохеллатной хроматографии проскока наносили на колонку, предварительно уравновешенную буфером А2.

Разделение смеси продуктов проводили при скорости потока 2 мл/мин в линейном градиенте концентрации ацетонитрила от 5 до 80% за 60 мин в присутствии 0,1% ТФУ.

Для этого использовали следующую программу контроллера:

Время, мин	Содержание буфера В2, %	Продолжительность, мин
0	0	0
15	0	15
75	100	60
85	100	10
95	0	10

Детекцию осуществляли при длине волны 214 нм. Фракции элюата, соответствующие основным пикам на хроматограмме, собирали и лиофильно высушивали на вакуумном концентраторе SpeedVac.

2.3.8 Масс-спектрометрический анализ

Масс-спектрометрический анализ был проведен в НИИ Биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича РАМН на MALDI-времяпролетном масс-спектрометре Reflex III (Bruker), оснащенном УФ-лазером с рабочей длиной волны 337 нм. В качестве матрицы использовали 2,5-дигидроксибензойную кислоту в 20% ацетонитриле, 0,1% ТФУ в концентрации 10 мг/мл.



3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Ранее в УНЦ ИБХ РАН из семян чечевицы обыкновенной Lens culinaris был выделен ряд изоформ белка Lc-LTP, относящегося к первому подклассу липид-транспортирующих белков растений. Для данных изоформ были установлены полные аминокислотные последовательности и структуры кДНК, а также был произведён анализ антимикробной активности. В частности, антимикробная активность была показана для изоформы Lc-LTP2, которая помимо этого обладает достаточно высокой устойчивостью к протеолитическому расщеплению трипсином, что было установлено экспериментально. Lc-LTP2 обладает антимикробной активностью и является перекрестным аллергеном, внесенным в базу данных по аллергенам Международного союза иммунологических обществ (www.allergen.org) под аббревиатурой Len c 3. Полная последовательность данного белка образуется в результате посттрансляционного процессинга пребелка длиной 118 аминокислотных остатков (а.о.), при котором происходит отщепление сигнального пептида, состоящего из 25 а.о., с C-конца молекулы и высвобождение активного белка длиной 93 а.о., содержащего восемь консервативно расположенных остатков цистеина.

Незаменимым источником информации на различных стадиях исследования механизмов межмолекулярного взаимодействия с участием белков, является исследование их пространственного строения такими методами высокого разрешения как гетероядерная спектроскопия ядерного магнитного резонанса (ЯМР) и масс-спектрометрия. Спектроскопия ядерного магнитного резонанса (ЯМР) позволяет изучать динамические характеристики сложных соединений, распределение электронной плотности в них и даёт представление о стехиометрии и конформационной подвижности белковой глобулы. Всё это делает метод ЯМР-спектроскопии одним из наиболее полезных для описания поверхностных структурных мотивов и предсказания структурно обусловленных аллергенных потенций белка.

Сигналы в спектрах ЯМР могут давать только ядра атомов, обладающих нечетным спиновым числом, поэтому для используемой в широкой практике спектроскопии ЯМР наибольшее значение имеют ядра, имеющие I = Ѕ. Из ядер атомов, наиболее часто встречающихся в органических соединениях, магнитным моментом обладают изотопы 1H, 13C, 19F, 31P, 15N (спиновое число Ѕ). Спектроскопия ЯМР используется для регистрации сигналов данных ядер. Предпочтительное применение стабильных изотопов по сравнению с их радиоактивными аналогами обусловлено отсутствием радиационной опасности и возможностью определения локализации метки в молекуле белка.

Технология включения атомов стабильных изотопов (дейтерия 2H, углерода 13C, азота 15N) в молекулы с использованием биотехнологических приёмов имеет ряд преимуществ перед альтернативным методом химического синтеза изотопно-меченых соединений: в частности, является более экономически выгодной, менее трудоёмкой и гарантирует образование L-стереоизомеров синтезированных макромолекул, благодаря чему и определяет одну из главных стратегий биохимического и структурно-функционального исследования того или иного белка.

Как известно, высокий уровень экспрессии белков эукариотического происхождения может быть достигнут в прокариотических экспрессионных системах. Но существуют некоторые ограничения применения данной технологии, накладываемые физиолого-биохимическими особенностями бактериальной клетки. Процесс ко-трансляционного формирования структуры эукариотического белка в бактериальной клетке характеризуется тем, что при сравнительно малом уровне продукции гетерологичного полипептида (0,01-0,1% от суммарного клеточного белка) соответствующий белок, как правило, растворим, при повышении уровня экспрессии обнаруживаются как растворимые, так и нерастворимые формы белка, а при дальнейшем возрастании уровня экспрессии до 5-10% или выше от суммарного клеточного белка - практически весь синтезируемый рекомбинантный белок обнаруживается в виде нерастворимых «телец включения» (inclusion body).

Для получения биологически активного целевого продукта, белки, заключенные в тельца включения, должны быть ренатурированы и подвергнуты рефолдингу при жестких условиях, включающих в себя хаотропные агенты и восстановление тиолов. Как было показано в предшествующих экспериментах в УНЦ ИБХ РАН, процедура рефолдинга Lc-LTP2 не приводит к желаемым результатам, в связи с чем, было решено с акцентировать внимание на оптимизации стадий получения промежуточного гибридного продукта, с использованием высокоэффективного штамма-продуцента, а также получения максимального количества функционально-активной формы очищенного препарата методами выделения и очистки.

Для того чтобы добиться максимального выхода растворимой формы гибридного полипептида необходимо, во-первых, оптимизировать скорость его биосинтеза, во-вторых - влиять на процессы котрансляционного формирования его третичной структуры, посттрансляционного процессинга (в частности - ограниченного протеолиза) и межкомпартментного транспорта (секреция гибридного белка в культуральную среду). Другим аспектом подбора системы экспрессии являлась необходимость эффективного униформного введения атомов стабильных изотопов в молекулы белков, для чего большое значение имеет правильный выбор штамма микроорганизма-продуцента, способного к устойчивому росту на среде, содержащей стабильные изотопы и высокий уровень экспрессии продукта, содержащего целевой полипептид. Кроме того, при выборе системы экспрессии, учитывалось то, что исследуемые в данной работе белки содержат в своей структуре 4 дисульфидных связи. Исходя из этих условий, для стадии экспрессии была выбрана система штамма Escherichia coli BL21 (DE3) и плазмидного вектора pET. В бакериальную хромомсому данного штамма E. coli встроена последовательность, кодирующая T7 РНК-полимеразу, а также имеется область lacUV5 промотора. Целевой ген клонирован в плазмиде рЕТ под контролем сильного промотора бактериофага Т7, способного специфически распознаваться Т7 РНК-полимеразой клетки-хозяина. Т7 РНК-полимераза является чрезвычайно селективным и высокопроцессивным ферментом, следствием его активности является мобилизация практически всех пластических и энергетических ресурсов клетки на обеспечение высокого уровня экспрессии гетерологичной генетической последовательности. В случае «протечки» промотора данной системы, синтезируемый продукт может составлять более 50% от общей массы клеточного белка уже через несколько часов после индукции. Подобная нестабильность плазмиды, ведущая к гиперсинтезу чужеродного метаболита, является потенциально токсичной для клетки-хозяина. Дополнительный уровень жесткости промотора Т7 обеспечивается наличием в системе белка-репессора lacI, способного регулировать базальный уровень экспрессии чужеродной последовательности. В промоторной области имеется последовательность lacI оператора длиной 25 пар оснований. В отсутствие индуктора, на данном участке происходит связывание lacI репрессора, что эффективно снижает уровень транскрипции T7 РНК-полимеразой. Индуктором, как правило, является искусственный молекулярный миметик алло-лактозы (природного триггера транскрипции lac оперона) - изопропилтио-в-D-галактопиранозид (IPTG). Одна из субъединиц тетрамерного lacI-репрессора оказывается аллостерически связанной с эффекторной молекулой IPTG и уже не может препятствовать Т7 РНК-полимеразной активности.

Важным преимуществом данной конструкции является то, что плазмида pET дает возможность экспрессировать полипептиды в виде слитного белка с фрагментом тиоредоксина. Являясь хорошо растворимым белком, фрагмент тиоредоксина способствует замыканию дисульфидных связей и обеспечивает высокий уровень секреции слитного белка в раствор. Это, с одной стороны, не позволяет получить большого выхода целевого продукта, как в случае наработки белков в составе телец включения, но позволяет исключить дополнительную стадию ренатурации полипептидов в активную форму. Кроме того, ещё одним блоком на С-конце химерного полипептида является синтетически полученный гистидиновый октамер. Наличие октагистидиновой последовательности делает возможным выделение белка непосредственно из реакционной смеси при помощи аффинной колонки с Ni-сефарозой. В состав вектора также входит сайт инициации репликации (Ori) плазмиды pBR322. Для удобства идентификации, трансформированных данной плазмидой клонов, при выращивании на соответствующей селективной среде помимо гена гибридного белка, в неё встроен маркерный ген в-лактамазы, определяющий устойчивость трансформированных клеток к ампициллину. Поскольку расщепление гибридного белка с высвобождением Lc-LTP2 предполагается проводить при помощи реакции с бромцианом, в качестве таргетного сайта для щепящего агента в состав плазмиды между тиоредоксином и последовательностью гена Lc-LTP2 был встроен фрагмент, кодирующий последовательность из трёх аминокислотных остатков: Asp-Pro-Met, синтезированный химико-ферментативным способом с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР). Как известно, бромциан проявляет высокую селективность лишь по отношению к пептидным связям, в которых карбоксильная группа принадлежит остатку метионина. Это позволяет проводить расщепление аминокислотной цепи по данному остатку в условиях кислого pH. Тиоредоксин в данных условиях не подвергается фрагментации, благодаря тому, что единственный остаток метионина в его первичной структуре был предварительно замещён на остаток лейцина (M37L) при помощи сайт-специфического мутагенеза. Кроме того, существует дополнительная возможность расщепления пептидной связи между остатками Asp и Pro, поскольку пептидная связь Asp-Pro особенно лабильна в условиях кислотного гидролиза при повышенной температуре.



Рис. 3 - Схема плазмидного вектора, сконструированного для экспрессии слитного белка тиоредоксина I E. сoli c белком Lc-LTP2

На основании результатов, проведённых ранее в УНЦ ИБХ РАН, эксперементов по гетерологической экспрессии Lc-LTP2 в клетках E. coli BL21(DE3)/pET-His8-TrxL-Lc-LTP2 на богатой питательной среде при температуре 30-37°С было установлено, что гибридный белок накапливается в клетках E. coli преимущественно в растворимой фракции. Схема выделения целевого белка включала лизирование клеток и центрифугирование, очистку гибридного белка с помощью аффинной хроматографии в нативных условиях, диализ, расщепление гибридного белка бромцианом, повторную металлохеллатную хроматографию и финальную очистку Lc-LTP2 методом ОФ-ВЭЖХ. С помощью сравнительного анализа методами MALDI масс-спектрометрии, N-концевого секвенирования по методу Эдману, SDS-электрофореза в ПААГ и ОФ-ВЭЖХ, была показана идентичность очищенного рекомбинантного Lc-LTP2 природному белку.



3.1 Экспрессия гибридного белка в клетках E.coli

Целью данной работы являлось получение высокоочищенного препарата 13C15N-меченого рекомбинантного аналога Lc-LTP2, для исследования его пространственной структуры методом гетероядерной ЯМР-спектроскопии.

Метод заключается в выращивании штамма-продуцента E. coli на бедной ростовой среде, содержащей 13C15N-изотопномодифицированные субстраты.

Начальным этапом данной работы являлась процедура химической трансформации предварительно подготовленных компетентных клеток E.coli BL21 (DE3) ранее полученной плазмидой pET-His8-TrxL-Lc-LTP2. Клетки микроорганизма-продуцента предварительно выращивались на богатой среде LB при температуре роста 37°С, оптимальной для данного штамма. В целях облегчения детекции трансформированых клонов в среду для культивирования штамма-продуцента добавляли ампициллин, выступающий в роли селектируемого маркера. Далее культуру E. coli BL21(DE3)/pET-His8-TrxL-Lc-LTP2 выращивали при температуре 30-37°С на обеднённой среде М9, которая содержит в качестве единственного источника азота хлорид аммония и в качестве единственного источника углерода D-глюкозу. Причём в нашем случае была использована среда М9 с [13C]-меченой глюкозой и [15N]-меченым хлоридом аммония. Чтобы исключить возможность включения в молекулы экспрессируемого белка изотопов 12C и 14N, ночную культуру трансформированных клеток подвергали отмывке средой М9, не содержащей D-глюкозы и хлорида аммония, и далее осуществляли культивирование на меченой среде М9. В связи с тем, что в ряде экспериментальных работ было показано увеличение содержания растворимой формы рекомбинантных белков при понижении температуры культивирования [112], после добавления IPTG клеточные культуры обоих штаммов инкубировали при пониженной температуре 28оС. Культуру выращивали до достижения средней экспоненциальной фазы роста клеток, которая характеризуется постоянной максимальной скоростью деления клеток (Escherichia coli при 37°С делится примерно каждые 20 мин). Величина клеток и содержание в них белка тоже остаются в экспоненциальной фазе постоянными. Можно сказать, что бактериальная культура в этом случае состоит из «стандартных клеток».

В этот момент производили индукцию экспрессии, добавляя в среду индуктор IPTG. Снижение температуры привело к уменьшению скорости роста клеточной биомассы и увеличению времени культивирования. После 5-часовой экспрессии и процедуры выделения и очистки по описанным выше методикам, были произведены оценка эффективности экспрессии и анализ растворимости гибридного белка при помощи SDS-электрофореза в ПААГ.

Препаративная экспрессия проводилась в объеме 2 л питательной среды и при культивировании клеткок E. coli штамма BL-21(DE3) после индукции IPTG в течение 5 часов при температуре 28°С до конечной оптической плотности 2,4.

Для анализа эффективности экспрессии и оценки содержания растворимой фракции гибридного белка в культуральной жидкости BL-21(DE3)/pET-His8-TrxL-Lc-LTP2 клетки E. coli подвергали ультразвуковому лизированию и далее центрифугировали полученый лизат. Было обнаружено, что в результате экспрессии 13C15N-меченый His8-TrxL-Lc-LTP2 накапливался в трёх вариантах: в растворимой форме в культуральной жидкости, в составе телец включения (неструктурированный, либо обладающий дефектами конформации 13C15N-меченый Lc-LTP2) и в небольших количествах присутствовал в цитоплазме (в связи с нарушенной секрецией во внешнюю среду). При этом было обнаружено, что накопление гибридного белка происходило преимущественно в растворимой форме в цитоплазме, что, по видимому, было связано с уменьшением при понижении теапературы темпов его экспрессии, посттрансляционного прцессинга и секреции во внешнюю среду (рис. 6). Причём накопление белка подобным образом происходило в следующих концентрациях: в виде растворимой фракции, в концентрации 26,3 мг/л; в нерастворимой форме в составе телец включения - 14,5 мг/л. То есть приблизительная пропорция растворимой и нерастворимой фракций белка оказалась 2:1. При сравнении результатов экспрессии не меченного изотопами рекомбинантного His8-TrxL-Lc-LTP2, проведённых в УНЦ ИБХ РАН ранее, и 13C15N-меченного His8-TrxL-Lc-LTP2 было показано, что выход продукта экспрессии в клетках E. coli снижается в условиях бедной среды.

Формирование подобных нерастворимых белковых включений, обусловлено, в первую очередь, гидрофобными взаимодействиями молекул. Известно, что причиной повышения гидрофобности эукариотических белков при экспрессии их в прокариотических системах может являться отсутствие у последних системы гликозилирования, либо образование аномальных межмолекулярных дисульфидных связей. В бактериальных клетках отсутствует система гликозилирования белков, поэтому синтезируемые в них эукариотические полипептиды менее гидрофильны, чем их природные варианты, а, следовательно, обладают сниженной растворимостью и формируют тельца включения. Кроме того, внутриклеточные белки Е. coli характеризуются низким содержанием остатков цистеина и малым числом дисульфидных связей по сравнению с эукариотическими белками. Восстановительно-окислительные потенциалы бактериальных и эукариотических клеток также различаются, что, вероятно, приводило к неправильному образованию дисульфидных связей Lc-LTP2, продуцируемого клетками E. coli, и агрегации его в виде нерастворимых телец.

Данный вывод был сделан на основании анализа результатов SDS-электрофореза в ПААГ. Помимо этого контроль индукции производили также при добавлении к образцам, нанесённым на дорожку, в-меркаптоэтанола. Как известно, белки содержащие дисульфидные связи в присутствие в-меркаптоэтанола имеют склонность к денатурирации. Это происходит по причине того, что в-меркаптоэтанол образует аддукты со свободными цистеинами с последующим их восстановлением и потерей нативной конформации белка. Данная реакция происходит по схеме:

cysS-Scys + 2 HOCH2CH2SH > 2 cysSH + HOCH2CH2S-SCH2CH2OH

Восстановление дисульфидных связей приводит к разрушению третичной и четвертичной структуры белков.

При проведении электрофореза образцов 13C15N-His8-TrxL-Lc-LTP2 в присутствии BME было отмечено снижение электрофоретической подвижности гибридного белка, что, по-видимому, было связано с нарушением компактности третичной структуры и частичной денатурацией белка при восстановлении сульфгидрильных групп остатков цистеина, а также ассоциацией молекул BME с полипептидными цепями в области дисульфидных связей.

Рис. 4 - Контроли экспрессии и растворимости гибридного белка: 1 - суммарный клеточный лизат до индукции; 2,3 - суммарный клеточный лизат после индукции без и в присутствии в-меркаптоэтанола, соответственно; 4 - растворимая фракция клеточного белка (осветлённый лизат); 5 - нерастворимая фракция клеточного белка (осадок); М - смесь белков-стандартов молекулярных масс



Экспрессия и очистка рекомбинантного 13С, 15N-меченого Lc-LTP2 проводилась по схеме, изображенной на рис. 5.

Рис. 5 - Схема экспрессии и очистки рекомбинантного 13С15N-меченного Lc-LTP2

Также было показано, что такой фактор как количество видов изотопов, вводимых в молекулярный скелет полипептида, никак не влияет на уровень его экспрессии в E. coli, что было установлено при сравнении результатов экспрессии 13C15N- и 15N-меченого His8-TrxL-Lc-LTP2, показавших приблизительно одинаковый выход гибридного белка.

3.2 Выделение и очистка 13С, 15N-меченого Lc-LTP2

Осадок биомассы, полученный при центрифугировании после экспрессии, подвергали ультразвуковому лизису. Для того, чтобы не допустить деградацию гибридного белка и сохранить его целостность, процедура лизиса проводилась на льду и с добавлением в буфер ингибитора сериновых протеиназ PMSF. Далее методом центрифугирования получали осветлённый клеточный лизат, содержащий гибридный белок 13С, 15N -His8-TrxL-Lc-LTP2. Наличие гистидинового октамера на N-конце гибридного белка позволило провести аффинной очистку методом металлохелатной хроматографии в нативных условиях на колонке с Ni2+-сефарозой.

Данный метод очистки белков основан на способности аминокислот (в основном остатков гистидина) образовывать мультидентатные комплексы с катионами переходных металлов (Co2+, Ni2+, Cu2+, Zn2+), фиксированными в виде хелатов на нерастворимой матрице. Матрица представляет собой поперечносшитую агарозу и содержит такие хелатирующие группы, как иминодиацетат (IDA), нитрилотриацетат (NTA) или карбоксиметиласпартат (CMA, TALON). Сила связывания между белком и ионами металла зависит от некоторых факторов, включая длину и положение аффинной метки в белке, тип используемых ионов металла и pH буфера. Элюция целевого белка после отмывки может проводиться путем подкисления буфера до pH 4,5-5,5 (при этом остатки гистидина, pKa которых составляет около 6,0, переходят в протонированную форму), пропускания через колонку градиента имидазола, который конкурирует с гистидином за связывание с ионами металлов, либо хелатированием ионов металла с помощью ЭДТА.

При пропускании осветленного лизата через металлохелатную колонку происходило связывание гибридного белка 13С, 15N -His8-TrxL-Lc-LTP2 со смолой в результате формирования комплексов гистидинов с ионами никеля. Для того чтобы снизить неспецифическую сорбцию примесных белков, содержащих сближенные остатки гистидина или цистеина, на колонку в рабочий буфер добавляли небольшое количество имидазола, которым после нанесения образца длительно промывали колонку. Для предотвращения ионообменных эффектов на колонке в состав рабочего буфера вводили также 0,5 M NaCl. Элюирование гибридного белка с колонки осуществляли ступенчатым градиентом имидазола.

Контроль за очисткой осуществляли с помощью SDS-электрофореза в ПААГ (рис. 6).

Рис. 6 - Электрофореграмма результатов очистки гибридного белка. Из раствора: 1 - растворимая фракция белка; 2- проскок; 3 - элюат; 4 -диализат. Из осадка: 5 - нерастворимая фракция белка; 6 - проскок; 7 - диализат. М - маркер молекулярных масс

Компоненты буфера, содержащиеся в элюате, удаляли диализом против воды в течение ночи. В ходе проведения диализа выпадал незначительный осадок, который удаляли центрифугированием. С помощью SDS-электрофореза было показано, что гибридный белок содержится как в полученном диализате, так и в осадке (рис. 9). Гибридный белок, выпадающий в осадок при обессоливании в ходе диализа, предположительно имеющий неправильную пространственную укладку цепи или аранжировку дисульфидных связей, в дальнейшем не использовался. Снижение электрофоретической подвижности гибридного белка в присутствии BME свидетельствовало о наличие в его структуре дисульфидных связей.

Для выделения рекомбинантного 13С, 15N -меченого Lc-LTP2 из состава гибридного белка далее проводилась реакция расщепления полипептидной цепи бромцианом по карбоксильной группе искусственно введенного остатка метионина. Реакция расщепления бромцианом является наиболее высокоселективной и проходит с образованием промежуточного циансульфониевого производного метионина, спонтанно превращающегося в кислых условиях в иминолактон гомосерина, который, в свою очередь, быстро гидролизуется с разрывом иминной связи.

Благодаря высокой специфичности мишени для нуклеофильной атаки BrCN, удалось получить эффективность выхода продуктов реакции менее 75%. Данный метод фрагментации гибридного белка по специфическому сайту полипептидной цепи Asp-Pro-Met был выбран в связи с отсутствием внутренних остатков метионина как в последовательности целевого белка, так и в последовательности мутантного по данной аминокислоте белка-партнера Trx (M37L). Реакция расщепления гибридного белка 13С, 15N -His8-TrxL-Lc-LTP2 бромцианом проводилась в 80% ТФУ и завершалась образованием 13С, 15N -His8-TrxL, содержащего C-концевой гомосерин-лактон, и 13С, 15N -меченого Lc-LTP2.

Анализ полученных фрагментов гибридного белка, очищенных от остатков бромциана и летучих продуктов реакции расщепления, производили методом SDS-электрофореза (рис. 7).

Рис. 7 - Электрофореграмма продуктов реакции: 1,2 - диализат без и в присутствии в-меркаптоэтанола; 3,4 - продукты реакции расщепления без и в присутствии в-меркаптоэтанола

В соответствии с результатами электрофореза продуктов расщепления Lc-LTP2, после диализа Lc-LTP2 обнаруживался в виде трёх фракций, соответствующих нерасщепленному гибридному белку (23,65 кДа), 13С15N -Lc-LTP2 в комплексе с белком-партнёром тиоредоксином (14 кДа) и индивидуальным молекулам 13С15N -Lc-LTP2 (9,8 кДа). В присутствие BME происходило восстановление сульфиднгидрильных групп в молекулах гибридного белка, что приводило к снижению электрофоретической подвижности гибридного белка, но не снижало подвижности тиоредоксина. В в отсутствии BME 13С15N-меченый Lc-LTP2 на электрофореграмме присутствовал в виде полосы, соответствующей димеру белка с расчетной М.м. 20,6 кДа. Подобная изменчивость в условиях электрофореза обусловлена восстановлением внутримолекулярных дисульфидных связей гибридного белка, которое способствует нарушению его компактной пространственной укладки, а также к диссоциации образующегося в условиях электрофореза димера 13С15N-Lc-LTP2. Анализ электрофоретической картины образования продуктов при расщеплении BrCN показал, что эффективность данной реакции составляла приблизительно 75%.

С целью высвобождения максимального количества целевого белка из образовавшегося набора продуктов реакции расщепления была проведена повторная очистка с помощью металлохеллатной хроматографии на колонке с Ni2+-сефарозой в системе с гуанидин гидрохлоридом (GuHCl). Перед проведением дополнительной аффинной очистки целевого белка из осветлённого лизата, на данной колонке проводилась процедура нативной металлохеллатной хроматографии этого же белка в комплексе с белком-носителем Trx из телец включения, что требовало перевода колонки в систему буферов с 6 M гуанидин гидрохлоридом. Гуанидин гидрохлорид (CH6ClN3 / CH5N3.ClH) является сильным хаотропным агентом. В его 6 М растворе практически все белки с упорядоченной структурой теряют свою третичную и вторичную структуру, поэтому он используется для денатурации и последующего рефолдинга белка. Известно, что при помощи высококонцентрированного (6-8 M) гуанидин HCl можно солюбилизировать нерастворимые или денатурированные белки, в том числе, находящиеся в составе телец включения. Гуанидин HCl нарушает гидрофобные взаимодействия, содействуя растворимости гидрофобных остатков в водном растворе, инициирует разрыв дисульфидной связи с восстановлением двух -SH радикалов. Для повышения солюбилизации продуктов реакции расщепления BrCN, полученный образец, очищенный от остатков бромциана и летучих компонентов, также подвергался дополнительной аффинной очистке в системе с 6 М гуанидина гидрохлорид. Плюс ко всему, гуанидин HCl является ингибитором РНКаз и антимикробным агентом, что было важно для исключения бактериальной контаминации очищенного препарата.

В процессе нанесения смеси продуктов реакции расщепления на аффинную колонку, со смолой связывались только комплексы меченного белка-партнёра 13С15N -His8-TrxL и остаточной нерасщепленной гибридноый белок 13С15N -His8-TrxL-Lc-LTP2. Рекомбинантный 13С15N-меченный Lc-LTP2 не задерживался на колонке и выходил при ее промывании рабочим буфером. Для снятия с колонки продуктов реакции расщепления с колонки осуществляли элюирование ступенчатым градиентом имидазола.

Освобождение от соли гуанидина производилось путём осаждения трихлоруксусной кислотой (CCl3СООН). Как известно, при низких температурах (0 -- 10° С) осаждение высаливанием, протекает без денатурации, поэтому в данной работе инкубация раствора, содержащего белок, с ТХУ производилась при температуре -20_ С.

Для фракционирования белков имеет преимущество применение несмешивающихся с водой органических растворителей, так как после осаждения белков нет необходимости избавляться от солей. В данной работе разделение белковой и солевой фракций производилось при добавлении такого полярного апротонного растворителя, как ацетон. При этом происходило фракционирование смеси, основанное на различной растворимости белковых макромолекул и низкомолекулярного неорганического детергента - гуанидина гирохлорида, что вело к снижению диэлектрической проницаемости системы. В результате снижались гидратация и растворимость белка и при достаточно высокой концентрации органического растворителя происходило осаждение белковой фракции.

Финальная стадия очистки рекомбинантного белка представляла собой ВЭЖХ на обращенно-фазовой колонке Reprosil-Pur С18-AQ. При данном виде хроматографического разделения применяюся «обращенные» по отношению к полярным, то есть неполярные неподвижные фазы. Подвижная фаза в ОФ ВЭЖХ является полярной и представляет собой смесь полярного органического растворителя с водой. При том, чем гидрофобнее соединение, тем сильнее оно удерживается.

В нашем случае использовался наиболее распространённый вариант неподвижной фазы для ОФ ВЭЖХ - силикагель, химически модифицированный алкилсиланом, а именно, октадецилсисилированный силикагель, у которого алкильная цепь представлена восемнадцатью атомами углерода (Сl-Si(CH3)2-С18). Основной характеристикой обращенно-фазного адсорбента на основе силикагеля является массовая доля углерода. Эта величина отражает гидрофобность неподвижной фазы и, таким образом, и ее адсорбционную способность и у стандартной С18 фазы использованной нами колонки составляет величину порядка - 16-20%. Подобная эффективность и чувствительность разделения фракций при сорбции гидрофобных соединений достигается благодаря применению сорбентов с размером частиц 3-10 мкм. В качестве подвижной фазы в ОФ-ВЭЖХ могут быть использованы такие растворители, как ацетонитрил, вода, спирты и их смеси, способные самые различные биологически активные вещества детектируемые в широком УФ-диапазоне.

Хроматографическая очистка 13С15N-меченного Lc-LTP2 проводилась в системе растворителей ацетонитрил-вода с добавлением ТФУ при скорости потока 2 мл/мин в линейном градиенте концентрации ацетонитрила от 5 до 80% за 60 минут. Сначала осуществляли нанос проскока, полученного при проведении повторной металлохеллатной хроматографии на колонку С18. Далее промывали её буфером А2, за счёт чего происходила адсорбция целевого белка на силикагеле. Десорбция белка с колонки осуществлялась путем увеличения в элюенте концентрации ацетонитрила, препятствующего гидрофобным взаимодействиям белков с неполярным сорбентом колонки. Картина разделения проскока после повторной металлохелатной хроматографии на обращённо-фазовой колонке в используемом градиенте характеризовалась выходом основного пика 3 на 31 мин при 47% ацетонитрила, что соответствовало времени удерживания на колонке природного Lc-LTP2 (рис. 8).

Рис. 8 - Очистка рекомбинантного 13С,15N-меченного Lc-LTP2 методом ОФ-ВЭЖХ

Анализ полученной после ОФ-ВЭЖХ фракции (3) проводили методами MALDI-TOF масс-спектрометрии и пептидного SDS-электрофореза (рис. 20б, 21). На масс-спектре фракции 3 после ОФ-ВЭЖХ был обнаружен единственный пик с m/z 9790,860, который соответствовал однозарядному иону природного Lc-LTP2, тотально меченного стабильным изотопом 13С, 15N (расчетная М.м. 9790,700 Да).

Рис. 9 - Масс-спектрометрический анализ фракции 3 после ОФ-ВЭЖХ

Полученный результат свидетельствовал о том, что нами был выделен чистый 13С, 15N -меченный Lc-LTP2, стабилизированный четырьмя дисульфидными связями.

Методами гетероядерной ЯМР-спектроскопии и автоматического микросеквенирования по методу Эдмана была установливлена высокая (около 99%) степень включения изотопной метки в структуру молекулы Lc-LTP2.



ВЫВОДЫ

Оптимизированы условия экспрессии гибридного изотопномодифицированного Lc-LTP2, благодаря чему стали возможными высокая степень включения изотопной метки, а также более полное выделение растворимой формы синтезированного продукта в концентрации 26, 3 мг/л питательной среды.

Проведена оптимизация условий выделения и очистки 13С, 15N меченного Lc-LTP2 на этапах повторной аффинной хроматографии и ОФ-ВЭЖХ, что позволяет получать не менее 3,5 мг препарата на 1 л среды.

С помощью методов электрофореза в ПААГ, МАЛДИ-времяпролётной масс-спектрометрии и автоматического микросеквенирования по методу Эдмана установлена гомогенность полученных препаратов и их идентичность природному белку.

С помощью метода гетероядерной ЯМР-спектроскопии подтверждена высокая степень включения изотопной метки в молекулы Lc-LTP2.

Получено 6,92 мг препарата 13С, 15N -меченого рекомбинантного Lc-LTP2 для дальнейших исследований.



СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. J.C. Kader. Lipid-transfer proteins in plants. // 1996, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., Vol. 47, pp.: 627- 654.

2. J. Douliez, T. Michon, K. Elmorjani, D. Marion, Structure, biological and technological functions of lipid transfer proteins and indolines, the major lipid binding proteins from cereal kernels. // 2000, J. Cereal Sci., Vol. 32, pp.: 1 -20.

3. S. Tassin-Moindrot, A. Caille, J.P. Douliez, D. Marion, F. Vovelle, The wide binding properties of a wheat nonspecific lipid transfer protein. Solution structure of a complex with prostaglandin B2. // 2000, Eur. J. Biochem., Vol. 267 pp.: 1117 -1124.

4. J.P. Douliez, S. Jegou, C. Pato, D. Molle, V. Tran, D. Marion, Binding of two mono-acylated lipid monomers by the barley lipid transfer protein, LTP1, as viewed by fluorescence, isothermal titration calorimetry and molecular modeling. // 2001, Eur. J. Biochem., Vol. 268 pp.: 384-388.