Размещено на http://www.allbest.ru/

Министерство образования и науки Российской Федерации

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение Высшего профессионального образования

"Московский государственный университет тонких химических технологий имени М.В. Ломоносова"

Кафедра химии и технологии биологически активных соединений им. Н.А. Преображенского

Отработка технологии выделения и очистки белка Xvent-2 из Шпорцевой лягушки

Квалификационная работа бакалавра

Научный руководитель от МИТХТ

им. М.В. Ломоносова

к. х. н., доц. Е.А. Ларкина

Научный руководитель от ИБХ им.А.Н. Баха РАН

к. б. н.А.С. Воронина

Студент гр. БТ-42 В.А. Кормилицына

Москва 2015

Оглавление

• Введение
• Обзор литературы
• 1. Выделение клеточных органелл
• 2. Гомогенизация
• 3. Растворимость белков
• 4. Центрифугирование
• 5. Высаливание
• 6. Диализ
• 7. Ионообменная хроматография
• 8. Белковый электрофорез
• 9. Изоэлектрическое фокусирование
• Экспериментальная часть
• 1. Реагенты и прочие материалы
• 2. Растворы для изоэлектрического фокусирования
• 3. Методы исследования
• Получение биологического материала
• Гомогенизация
• Диализ
• Ионообменная хроматография
• Изоэлектрическое фокусирование
• Высаливание
• Подготовка пробы для проведения электрофореза
• Вестерн-блот анализ
• Перенос белков на нитроцеллюлозную мембрану
• Иммунноокрашивание
• Результаты работы и их обсуждение
• Выводы
• Список литературы

Введение

Жизнь каждого организма начинается с оплодотворения яйцеклетки, которая является самой большой стволовой клеткой в организме. Из стволовых клеток, в ходе развития организма, образуются все органы и ткани путем многократного деления. После деления между клетками начинают возникать различия, клетки специализируются благодаря воздействию на них различных белков [1]. Специализация клеток в высших организмах называется клеточной дифференцировкой. Она обусловлена тем, что в разных типах клеток работают разные гены. Спектр работающих генов устанавливается специальными белками, называемыми факторами транскрипции. Эти белки связываются с определенными участками ДНК и регулируют активацию или репрессию гена, находящегося рядом с этим участком. От наличия белка будет зависеть, будет ли клетка подвижной или нет, какие вещества смогут проходить через мембрану клетки, какие биохимические реакции смогу протекать.

Соматические клетки организма обладают одинаковым набором генов, в каждой ткани активны лишь те гены, которые являются ответственными за данную дифференцировку. Избирательная активация генов приводит к синтезу специализированных белков, определяющих дифференцировку. Важную роль играет регуляция синтеза белков на запасенных матрицах, то есть трансляционная регуляция [2].

Работа по изучению распределения клеток по функциональности была проведена на зародышах земноводных в Германии Дарьей Онищук и сотрудниками лаборатории [3]. Синтез белка Xvent-2 в клетках зародышей необходим для дальнейшей дифференцировки стволовых клеток, так как белок способствует определению функций клеток зародышей земноводных.

Первая дифференцировка в зародыше это разделение на дорзальную и вентральную область. Дифференцировка клеток в вентральной части зародыша отвечает за брюшную область, а дорзальной за спинную область. Образованию тканей в вентральной части способствует ген Xvent-2, который кодирует белки, способные контролировать мРНК на матрице ДНК. Эти специфичные белки называются факторами транскрипции и содержат в своей структуре ДНК-связывающие домены, которые обеспечивают связывание только с определенными участками ДНК. Ген Xvent-2 способствует дифференцировке клеток с помощью регуляции экспрессии гена. Связывание белка возможно с высоко и низкомолекулярными лигандами, что способствует изменению структуры белка и влияет на эффективность экспрессии гена. Влияние на экспрессию белка осуществляется через транскрипцию, если процесс синтеза мРНК на основе ДНК уменьшается, то изменяется уровень содержания мРНК в клетках зародыша, вследствие чего предполагали, что должен замедляется биосинтез белка Xvent-2. Ранее считалось, что белок Xvent-2 присутствует только на ранних стадиях развития зародышей лягушек, так как количество мРНК перед органогенезом не детектировалось.

В зародышах лягушек одним из факторов транскрипции является белок Xvent-2. Он участвует в регуляции самой ранней дифференцировки клеток после оплодотворения, а именно в закладке вентральной части зародыша. Отсюда и его название. Ранее считалось, что белок Xvent-2 присутствует только на ранних стадиях развития зародышей лягушек [4]. Однако, лаборатории "Регуляции биосинтеза белка" Института ИБХ им.А.Н. Баха РАН Ворониной А.Н. и Пшенниковой Е.С., было показано, что белок, обнаруженный на ранних стадиях развития зародыша, также содержится в клетках взрослых особей. Поэтому важной задачей является выделение белка Xvent-2 в чистом виде из поздних зародышей, кожи или нервной ткани взрослых лягушек.

белок стволовая клетка лягушка

Обзор литературы

Важное место в биохимических исследованиях занимает выделение индивидуальных белков из органов и тканей. Очищенные индивидуальные белки нужны для изучения их первичной структуры, получения кристаллов белков с целью исследования их пространственной структуры методом рентгеноструктурного анализа, установления взаимосвязи между первичной, пространственной структурой белка и его функцией [5].

При проведении эксперимента следует убедиться в наличии исследуемого белка в исходном материале. Применение различных методов при проведении выделения и очистки исследуемого белка может помочь в выборе более эффективных методов для дальнейших работ с данным материалом. Проверка наличия белка на различных стадиях помогает определить присутствия исследуемого материала в тканях и возможные потери при обработке. При не полном разрушении клеток возможно ошибочное суждение о содержании в этих клетках белка.

1. Выделение клеточных органелл

Свежеполученный материал не всегда сразу пригоден для выделения из него необходимых органелл, также не всегда есть возможность использовать данный материал сразу. Для хранения его можно подвергнуть заморозке или охлаждению. В ходе заморозки также могут произойти процессы, способствующие разрушению клеточной мембраны, например, при охлаждении замерзает вода, свободно находящаяся в растворе, вследствие чего образуются кристаллы льда. При образовании кристаллов возможно разрушение мембраны клетки, а также некоторых органелл, но сохранение при этом белка. Также при определенной температуре соли, содержащиеся в растворе, могут начать кристаллизоваться, что приведет к изменению значения pH в растворе [6,7]. При небольших температурах, когда раствор не успел закристаллизоваться, может начаться разрушения белков за счет протеаз, так как происходит разрушение лизосом, из которых высвобождаются протеазы. Для предотвращения необходимо замораживать более резко, при низких температурах.

Использование уксусной кислоты может обеспечить разрушение клеточной стенки, за счет того, что недиссоциированная уксусная кислота вследствие своей липофильности лучше проникает внутрь клетки, через стенку клетки, и денатурирует белки клеточной плазмы. Также кристаллизация происходит при менее жестких условиях, так как температура кристаллизации самой уксусной кислоты довольно высокая +16°С, что позволяет хранить материал в простых холодильниках. Уксусная кислота тормозит развитие бактерий, что обеспечивает долгое сохранение биологического материала.

Большая часть ферментов находится во внутриклеточном пространстве. Такие белки менее стабильны, чем белки находящиеся во внеклеточном пространстве. Различие таких белков в их стабильности зависит от дисульфидных мостиков. У белков находящихся во внутриклеточном пространстве среда, в которой они находятся, является восстанавливающей.

Для выделения белка из твердой ткани её размельчают с помощью гомогенизатора.

2. Гомогенизация

Разрушение клеток, находящихся в суспензии, происходит либо при вращении лопастей (гомогенизатора Уорринга), либо при поступательном движении вверх и вниз поршня или шаров (гомогенизаторы Поттера-Эльвегейема). Гомогенизаторы Уорринга, как правило, имеют режущие лопасти, вращающиеся с большой скоростью. Количество и конструкция этих лопастей бывают разными, но все они обычно заострены под прямым углом друг к другу, а форма их обеспечивает хорошее перемешивание содержимого сосуда. Для поддержания низкой температуры в процессе гомогенизации, чтобы исследуемый материал не разрушился, стакан охлаждают при помощи льда. Благодаря особому расположению лопастей и конструкции стакана в ходе фракционирования возникают гидродинамические силы, в результате которых разрушается клеточная стенка.

Большинство гомогенизаторов представляют собой прибор, состоящий из пестика с ручным (гомогенизаторы Даунса и Тёнбрэка) или механическим (гомогенизатор Поттера-Эльвегёйма) приводом, который вращается или движется вверх и вниз в стеклянном цилиндрическом сосуде. Необходимо следить за тем, чтобы зазор между пестиком и стенками сосуда оставался постоянным, так как скорость разрушения клеток зависит не только от скорости вращения пестика, но и от соотношения между радиусами пестика и сосуда. Скорость вращения суспензии изменяется от минимальной у его стенок до максимальной у поверхности пестика. Следовательно, чем меньше расстояние между этими поверхностями, тем выше градиент скорости. Возникающие при высоких скоростях силы достаточны для разрушения довольно тонких мембран животных клеток; растительные и бактериальные клетки при этом не разрушаются.

После разрушения клеток, полученную смесь называют гомогенатом, в котором находятся все органеллы клетки. Для разделения органелл используют центрифугирование. Белки из исходного материала переходят в жидкую фазу.

3. Растворимость белков

Различные белки могут иметь различия в физико-химических свойствах. Наличие различных гидрофобных и гидрофильных групп на поверхности белковых молекул, может являться признаком определения их растворимости в различных растворителях. По большей части гидрофобные группы белков стремятся сгруппироваться внутри белковых молекул, но также значительное количество находится на поверхности и взаимодействует с растворителем.

Поведение белков в растворителе определяется гидрофобными участками белка на поверхности молекул, а также важную роль играют заряженные и полярные группы. Основным растворителем, с которым взаимодействуют группы, является вода. Производя различные изменения свойств основного растворителя можно влиять на эффективность растворимости белка. Изменяя такие показатели как ионная сила, pH, изменение температуры, добавление органических растворителей, которые могут смешиваться с водой в определённом соотношении. Для осаждения белков может быть применено селективное выделение с помощью использования нейтральных солей.

Большая часть растворимых белков находится в клеточной жидкости, часто их содержание в виде концентрированной смеси может достигать 40% [8]. Эти белки хорошо растворимы при физиологических условиях концентраций солей в нейтральном значении pH. Следовательно, при физиологическом значении рН (около 7,0 - 7,4) клеточные белки имеют общий отрицательный заряд. Растворимость происходит за счёт полярного взаимодействия белка с растворителем и ионного взаимодействия с солями, находящимися в растворе. Также могут оказывать воздействие электростатические силы отталкивания, возникающие между молекулами, имеющими одинаково заряженные группы. Из-за небольших сил отталкивания белки могут образовывать осадок, так как электростатических сил недостаточно. Электростатическое отталкивание уменьшается при уменьшении заряда до нуля, молекулы начинают притягиваться друг к другу при приближении значения к изоэлектрической точки молекулы. Изоэлектрическая точка каждого белка определяется соотношением кислых и основных групп боковых радикалов аминокислот. То значение рН, при котором белок имеет суммарный нулевой заряд, называется изоэлектрической точкой данного белка. В этой точке белок не обладает подвижностью в электрическом поле. Суммарный заряд белковой молекулы, зависит от рН среды: в кислой среде он положителен, в щелочной отрицателен.

При высокой гидрофобности молекулы на поверхности может уменьшаться её взаимодействие с растворителем, из чего следует уменьшение взаимодействия заряженных групп поверхности молекулы с солями, содержащимися в растворителе.

4. Центрифугирование

Растворенные белки отделяют от остальных, более тяжелых органелл, методом центрифугирования. Этот метод основан на оседании частиц дисперсной фазы в жидкости в возрастающем гравитационном поле.

Фракционирование клеточных органелл проводится с помощью дифференциального центрифугирования, то есть центрифугирования при различных скоростях вращения ротора. При этом ступенчатое увеличение центробежной силы приводит к последовательному осаждению различных органелл, то есть их разделению в соответствии с плотностью и размером. Так как белки растворимы, то они остаются в супернатанте, а остальные более тяжелые органеллы, такие как ядра, митохондрии, гликогены, оседают под действием центробежных сил.

Для твердых частиц существует время, которое необходимо для осаждения частиц. Это время прямо пропорционально вязкости и обратно пропорционально разности плотностей, а также квадрату радиуса частиц. Если уменьшается радиус частиц, то при этом должна возрастать угловая скорость, чтобы время осаждения не изменялось. Большое значение играет разность плотностей.

Плотность безводних белков составляет 1,34 г/см³, как показано на рисунке 1.

Рис. 1. Зависимость скорости осаждения клеточных органелл от их плотности.

Белки имеют низкую константу седиментации, а значит медленнее оседают. Это позволяет отделить белки от остальных органелл.

5. Высаливание

Для очистки белков применяется метод высаливания при высоких концентрациях солей. Белки имеют низкую растворимость при низкой ионной силе и при высокой концентрации соли. Процесс высаливания в большей степени определяется гидрофобностью белка, а не полярным взаимодействием с растворителем. На поверхности белка могут быть такие гидрофобные группы как фенилаланин, тирозин, триптофан, лейцин, изолейцин, метионин, валин. Около гидрофобных групп в водном растворе происходит упорядочение молекул воды вокруг боковых цепей аминокислотных остатков [9]. Когда молекулы воды находятся в свободном состоянии вокруг белковой молекулы и негидротируют её, система является менее устойчивой и происходит осаждение белка.

Агрегация белка происходит при электростатическом взаимодействие (сольватации) между ионами соли, растворенным веществом и растворителем. При этом уменьшается количество свободных молекул воды и происходит отрыв молекул воды от гидрофобных групп белковых молекул, в результате чего неполярные участки на поверхности белка становятся отрытыми для взаимодействия. Эти неполярные участки могут взаимодействовать между собой. При этом заряд молекулы снижается и уменьшается изоэлектрическое отталкивание между белками, что приводит к притягиванию белков друг к другу и осаждению. Растворимость белков определяется их взаимодействием с растворителем. Белки, содержащие на своей поверхности большое количество гидрофобных групп, являются более трудно растворимыми при высоких содержаниях в растворе солей. Это происходит из-за того, что на поверхности белка содержится не большое число заряженных групп, которые могут взаимодействовать с растворителем [10]. Белки, содержащие на своей поверхности достаточно большое количество полярных групп, способны лучше взаимодействовать с молекулами воды и быстрее растворяться.

На растворимость белков также может влиять pH среды, так как при понижении заряда может уменьшаться полярность поверхности белка. Наибольшее количество заряженных групп на поверхности белки могут содержать при нейтральном pH среды равном 7. Однако при приближении к их изоэлектрической точке белки выпадают в виде осадка и плохо растворяются. Температура также может влиять на растворимость белка, но изменения менее значительны. При повышении температуры растворимость белков падает, так как ухудшаются гидрофобные взаимодействия между молекулами.

При применении метода высаливания белков важно учитывать природу соли, ее физико-химические характеристики. Необходимо подобрать наиболее эффективно действующую соль при осаждении белков. Наиболее высокую эффективность проявляют соли, анионы которых имеют большой заряд.

Механизм высаливания состоит в том, что добавляемые анионы и катионы солевого раствора снимают гидратную оболочку белков, являющуюся одним из факторов его устойчивости. Снятие гидратной оболочки происходит при взаимодействии анионов (SO₄^2-) и катионов (Na⁺, NH₄⁺) с зарядами белка (группы NH₄⁺ и COO^-). При этом происходит нейтрализация зарядов белка ионами соли. В результате заряд исчезает, и соответственно, исчезает взаимоотталкивание молекул. Происходит сближение и слипание молекул, в результате чего они образуют осадок белковых молекул.

Способность анионов коагулировать белковый раствор возрастает в следующей последовательности, называемой рядом Гофмейстера:

SCN^-< J^-<ClO^{3 -} < NO^3-< Cl^-<СН₃СОО^-< SO₄^2-

Действие катионов на осаждение белков располагается в следующем ряду с уменьшением эффективности:

NH₄⁺ > К⁺>Na⁺

Соль сульфата аммония является наиболее выгодной в применении, так как является одной из наиболее дешёвых и эффективных. Сульфат более удобен из-за лучшей растворимости. При комнатной температуре растворимость аммонийных солей сульфата равна примерно 4.1М. Эту соль используют для высаливания чаще всего, так как сульфат-ионы делают молекулу белка более компактной (менее растворимой) за счёт взаимодействия с положительно заряженными аминокислотами, наиболее стабильной и предотвращают протеолиз и действие бактерий. Это взаимодействие более эффективно при pH<pI.

6. Диализ

Одним из методов очистки белков является диализ. При диализе из раствора, содержащего белки за счёт осмотических сил удаляются нежелательные низкомолекулярные вещества и заменяются буферной системой, против которой проводят диализ. Процесс диализа основан на процессах осмоса и диффузии. В процессе осмоса происходит односторонняя диффузия молекул буфера через полупроницаемую мембрану, а в результате процесса диффузии происходит взаимное проникновения молекул одного вещества между молекулами другого, что приводит к выравниванию концентраций по всему занимаемому объёму [11]. При этом перенос вещества происходит из области с высокой концентрацией в область с низкой концентрацией. За счет того что происходит уравновешивание концентраций внутри диализного мешка и снаружи, соль содержащаяся в образце диффундирует из диализного мешка через мембрану. Для более эффективного диализа необходимо сменять буферный раствор, в который выходят соли из образца. Мембрана пропускает только низкомолекулярные вещества, а так как белки являются высокомолекулярными, то не могут проникать через мембрану и остаются в образце.

Рис. 2 Схема и аппарат для проведения диализа.

Традиционным является способ диализа через целлофановую пленку. Из неё делают диализные трубки различного диаметра. Обычно они не пропускают молекулы крупнее 15 000-20 000 Да [12].

7. Ионообменная хроматография

Выделить и очистить необходимый белок можно на основе таких свойств, как молекулярная масса, заряд и аффинность, для этого используются различные виды хроматографии [13]. Для разделения, а также очистки белков может использоваться такая способность белков, как адсорбция на твердых поверхностях. Возможно использование как метода колоночной адсорбционной хроматографии, так и метода адсорбции "в объеме", который является быстрым и эффективным методом очистки.

При работе с такими высокомолекулярными частицами, как белки существуют особенности разделения. Например, различные участки белка могут взаимодействовать с сорбентом с разной силой, так что сорбенты должны обладать достаточной сорбционной емкостью, которая выражается в г·см^-3.

Для проведения адсорбционной хроматографии с высокомолекулярными соединениями необходим адсорбент с рыхлой структурой, позволяющее белку взаимодействовать с центрами связывания, находящимися внутри частиц. Если это условие не выполняется, то значительно снижается емкость сорбента, белок взаимодействует только с центрами находящимися на поверхности и не проникают внутрь частиц, уменьшается число центров связывания доступных для белковых структур.

Использование ионообменных адсорбентов является одним из наиболее эффективных хроматографических методов очистки белков. В ионообменниках возникают электростатические силы между заряженными группами ионообменника и полярными группами, находящимися на поверхности белков. В ионообменниках возможно также физическое взаимодействие из-за сродства образца к адсорбенту. Из-за разности взаимодействий хроматография может идти с разной скоростью.

Полимеры, из которых образован ионообменный сорбент на своих поверхностях внутри и снаружи гранул имеет ковалентносвязанные с поверхностью группы, эти группы являются ионогенами и способны удерживать молекулы противоположные по знаку с помощью электростатического взаимодействия. Чем больший заряд имеет объект исследования на своей поверхности за счет полярных групп, тем больше суммарный заряд молекулы, от которой зависит сила взаимодействия с ионообменником за счет кулоновских взаимодействий. Чем сильнее взаимодействие, тем медленнее объект будет двигаться по колонке. Связь, образующая при этом между молекулами находящимися в растворе и неподвижной фазой, обратима и при элюировании ионы способны замещаться, вытесняя с неподвижной фазы удерживаемый компонент. При обмене ионами связанная с неподвижной фазой частица переходит в раствор и вымывается с сорбента.

Сорбенты, которые могут быть использованы для низкомолекулярных соединений, могут не подходить для очистки высокомолекулярных, так как при сорбировании не должны меняться свойства белка. Матрица не должна взаимодействовать с белком, вследствие чего могут быть нарушены физико-химические особенности белка. Низкомолекулярные смолы содержат полистирольные заместители, в которых сшивки не дают белку возможность проникнуть внутрь матрицы, в результате чего белки реагируют только с поверхностями частиц. А так как поверхность частиц содержит гидрофобные и ионные группы, то связывание их с белком может затруднять элюцию и быть необратимым.

Пористость смоле придают заряженные группы. Поэтому перед применением заряжают группы сорбента. За счёт взаимодействия зарядов и отталкивания их в структуре сорбента, его пористость стабилизируется. Это позволяет белкам лучше проникать в структуру целлюлозы и взаимодействовать с заряженными центрами.

Так как белки на своей поверхности имеют множество различных заряженных групп, то при взаимодействии с сорбентом происходит связывание нескольких центров.

Процесс адсорбции представляет собой распределение высокомолекулярного растворенного белка между жидкой и твердой фазами. Коэффициент распределения между фазами определяется как количество вещества, адсорбировавшегося на сорбенте, относительно общего количества вещества в растворе.

Ученый Scopes R. при проведении эксперимента с ионообменниками пришёл к выводу, что связывание заряженных групп белка с несколькими центрами ионообменника может быть описано одной константой диссоциации [14,15]. Константа диссоциации для взаимодействия белка с заряженными группами ионообменника определяется по формуле:

K_p=

где K_p - константа диссоциации;

m - концентрация свободных центров связывания (центры связывания белок должен занимать без повреждения структуры);

p-концентрация белка в свободном растворе;

q-концентрация белка связанного с носителем.

Следует учитывать, что некоторые центры адсорбента не всегда быстро связываются с белковыми заряженными группами, для некоторых необходимо больше времени. Также при элюции белка со смолы некоторые белки вымываются не сразу, что ведёт к потере материала. Попадание белков в труднодоступные центры связывания может происходить из-за сжатия пор адсорбента. Такое явление возможно из-за смены буфера, который воздействует на заряженные адсорбционные центры.

Существуют как слабые, так и сильные ионообменники, их сила зависит он количества ионогенных заряженных групп. В сильном ионообменнике все группы несут один определённый заряд. А в слабом ионообменнике ионизированы не все группы, способные нести заряд, а только те, которые зависят от значения pH. Однако существует такое понятие как блокирующие контрионы. В роли контрионов могут выступать соли, ионы, содержащиеся в буферных растворах, а также ионы, которые содержат сами ионообменники. Контрионы образуют ионные пары с заряженными ионогенными группами обменника и не дают подойти к этим группам объектам образца. Тем не менее, блокирующие контрионы теряют свое взаимодействие со ионогенной группой при тепловом воздействии молекул воды. Ионная связь между блокирующей группой теряется, и на неподвижную фазу могу присоединяться полярные группы белков или другие конртионы.

Чтобы разорвать ионную связь между молекулой белка и матрицей, следует учитывать следующие особенности: Белковая молекула является относительно большой, следовательно, имеет большую массу, что делает поведение молекулы более постоянным, инертным. При отрыве молекулы от матрицы необходимо обеспечить такое расстояние между матрицей и молекулой, при котором кулоновское притяжение перестанет воздействовать на молекулу, и в результате броуновского движения молекула не могла вновь приблизиться к группам матрицы.

Большое значение в ионообменнике играет размер пор, поэтому первое, что необходимо определить, какой размер пор необходим для проведения ионообменной хроматографии для выбранного материала. Пористость ионитов определяют частотой сетки, которую образуют сшивающие агенты. Высокопористыми являются те смолы, которые содержат мало сшивающего агента и сильно набухают. Те смолы, которые содержат большое количество сшивающего агента и слабо набухают, являются низкопористыми. Пористые ионообменные смолы получают путем суспензирования мономеров в присутствии порообразователей, в качестве которых используют вещества, способные растворяться в мономерной смеси, не участвующие в сополимеризации и легкоудаляемые из сополимера [16]. В мономеры вводят ионогенные группы методоми сульфирования, фосфорилирования, метилирования, с последующим аминированием, и т.д. [17]

Для низкомолекулярных соединений (аминокислот, нуклеотидов, олигонуклеотидов) удобно использовать ионообменные смолы на основе полистирола. Для более крупных полипептидов и полинуклеотидов с молекулярной массой менее 10 000 можно использовать ионообменные сефадексы типов А-25 и С-25 (таблица 1). Фракционирование и очистку особо крупных молекулярных агрегатов и вирусов с молекулярной массой более 10⁶ приходится вести на поверхности гранулы, для чего можно использовать ионообменные сефадексы типов А-50 и С-50 (Таблица 1) или смолы.

Таблица 1. Типы и свойства ионообменных гелей [18]

Сефадексы являются ионообменниками на основе декстрана и представляют собой полисахариды - линейные полимеры глюкозы, звенья которых связаны в-1,6-глюкозидной связью. Нити дестрана сишиты между собой эпихлоргидрином.

В качестве смолы может быть использована целлюлоза, которая представляет собой полисахарид - линейный полимер, образованный остатками глюкозы, связанными в-1,4-глюкозидной связью. Каждое звено глюкозы несет три свободные гидроксильные группы, которые позволяют модифицировать целлюлозу путем химического присоединения разнообразных заместителей.

Для катионообменников используют гранулы, которые могут нести сульфогруппу и нести при этом отрицательный заряд. Также гранулы нести ди этиламиноэтильную группу, которая имеет положительный заряд и такие гранулы явля. тся анионообменными (Рис.2).



Рис. 2 Фрагменты анионо- и катионообменных гранул.

Для подготовки к работе катионообменную смолу промывают буфером, содержащим ионы натрия, которые связывают с сульфогруппой, а при взаимодействии с белком, ионы натрия вытесняются положительно заряженными группами белка. Анионообменную смолу подготавливают к работе промывая буфером содержащим ионы хлора, которые также затем вытесняются отрицательными группами белка (Рис.3).

Рис. 3 Ионный обмен при адсорбции отрицательно заряженного белка [19].

Для низкомолекулярных ионов лучше подойдет сильная мелкопористая смола с высокой емкостью. Для биополимеров, которые часто образовывают многоточечные связи с ионообменником, наиболее эффективна будет слабая смола ионообменника.

Чем крупнее молекула белка, тем меньше её емкость связывания, так как больше вероятность многоточечного связывания молекулы. Следовательно, емкость выбираемого ионообменника должна быть меньше.

Ионообменники на основе целлюлозы имеют меньшую емкость, чем ионообменные сефадексы. Наибольшее применение нашли смолы карбоксиметил (КМ) - целлюлоза, являющаяся слабым катионообменником, а также диэтиламиноэтил (ДЭАЭ) - целлюлоза - слабый анионообменник (Таблица 2).

Таблица 2. Функциональные группы, используемые в ионообменних сорбентах

Анионообменники	Сила	Функциональные группы
Четвертичный аммоний (Ч)	Сильный	-O-CH2N+ (CH3) 3
Диэтиламиноэтил (ДЭАЭ)	Слабый	-O-CH2CH2N+H (CH2CH3) 2
Диэтиламинопромил (АНП)	Слабый	-O-CH2CHOHCH2N+H (CH2CH3) 2
Катионообменники
Сульфопропил (СП)	Сильный	-O-CH2CHOHCH2O (CH2) 3SO3-
Метилсульфонат (С)	Сильный	-O-CH2CHOHCH2OCH2CHOHCH2 SO3-
Карбоксиметил (КМ)	Cлабый	-O-CH2COO-

Так как белок, который необходимо очистить методом ионообменной хроматографии содержится в буфере, также как целлюлоза, то выбор буферной системы, в которой будет проводиться разделение, очень важен. Буфер необходим для поддержания определенного значения pH, так как содержит ионы, участвующие в ионном обмене и сохраняющие стабильность системы в ионообменнике. Буферные растворы не должны химически взаимодействовать с сорбентом и менять его свойства, поэтому наиболее оптимальным будет, если буфер и сорбент будут иметь заряд с одинаковым знаком. При изменении ионных сил может происходить модификация структуры сорбента, изменение сил связывания белка с иногенными группами и денатурация белка. Во избежание этого, хроматографию на анионообменниках предпочтительно вести в таких буферах, у которых буферный компонент является катионом, т.е. трисовом, пиридиновом и имидазольном. Для катионообменников следует использовать буферы, где буферным компонентом служит анион кислотного остатка, такие как ацетатный, фосфатный, бикарбонатный и другие буферы, которые можно найти в литературе [20,21].

8. Белковый электрофорез

Данный метод используется для разделения молекул по различным параметрам, которые могут действовать как вместе, так и каждый в отдельности. Используются такие параметры молекул как размер (молекулярная масса), пространственная конфигурация, вторичная структура и электрический заряд.

В настоящее время в основном для проведения электрофореза используется полиакриламидные гели или гели агарозы. Такой выбор обусловлен тем, что в жидких средах происходит конвекция, из-за которой деформируются и смешиваются разделяющие зоны. Для предотвращения конвекции используют гели, которые также могут удерживать жидкость, не давая ей вытекать, за счет наличия в строении геля сетки. Жидкость, которую удерживает гель, является электродным буфером, в котором мигрируют макромолекулы. Макромолекулы сталкиваются с нитями полимера, из которых состоит структура геля. В результате трения о нити макромолекулы задерживаются. Чем более соизмеримы размеры молекулы с диаметром пространственной ячейки геля, тем больше вероятность прекращения дальнейшей миграции молекулы.

В этом случае решающее влияние на электрофоретическую подвижность различных макромолекул и степень разделения оказывает соотношение их линейных размеров. Можно изменять концентрацию полимеров, от этого зависит, какие размеры пор будут в геле. Также можно менять электрический заряд макромолекулы, изменением среды, в которой она находится, то есть pH буфера. При разделении возможно использование метода изменения конфигурации молекулы путем её денатурации.

Полиакриламидный гель состоит из акриламида (СН₂=СН-CONH₂) и N,N'-метиленбисакриламида ("Бис") - (CH₂=CH-CONH) ₂-СН₂, который выступает в качестве "сшивки" линейных полимеров акриламида. Полимеризацию с получением полиакриламидного геля проводят непосредственно перед использованием его для разделения белков методом электрофореза. Для начала процесса полимеризации молекул в ПААГ используют персульфат аммония. В молекуле персульфата присутствует связь между атомами кислорода, при разрыве которой, образуются два радикала.

Из-за воздействия радикала на молекулу акриламида, происходит разрыв двойной связи в структуре акриламида, вследствие чего, присоединяется радикал по месту разрыва, а у атома углерода остаётся неспаренный электрон, к которому присоединяется следующая молекула с радикалом:

Метилен-бис-акриламид также полимеризуется только одним концом, в то время как второй конец может соединяться с другой линейной полимерной цепочкой, образуя "сшивку".

Для увеличения скорости протекания реакции полимеризации ПААГ часто используют тетраметилэтилендиамин (ТЕМЕД) - (СН₃) ₂N-CH₂-CH₂--N (СН₃) ₂.

Перед проведением электрофореза следует сначала определить какой размер пор в ПААГ необходим для эффективного разделения. Для этого в разном соотношении смешиваются акриламид и бисакриламид. Вводим обозначение процентного отношения суммарной массы мономеров в акриламиде к объему их раствора - Т, а также процентное отношение массы бисакриламида к общей массе мономеров - С. Чем больше содержание акриламида, тем гуще нити полимера, меньше промежутки между ними и сильнее трение. Увеличение содержания "сшивки" (С) сначала повышает жесткость геля, так как средняя длина свободных участков нитей уменьшается. Разумеется на это расходуется энергия, трение при этом увеличивается, а миграция биополимеров в геле замедляется. Оптимальное содержание "сшивки" в ПААГ при значениях С в пределах 2-5 %. В таблице приведены соответствия молекулярных масс разделяемых белков (М) и концентраций ПААГ (Т):

Таблица 3. Молекулярные массы разделяемых белков (М) в зависимости от концентрации ПААГ (Т)

М, тыс. Дальтон	Т, % М, тыс.
10-40	15-20
40-100	10-15
100-300	5-10
>300	5

Ориентировочно о характере различия электрофоретических подвижностей двух белков в данных условиях разделения можно судить в том случае, когда известны их молекулярные массы и изоэлектрические точки, а также содержание в них ионогенных аминокислот.

Электрофоретическая подвижность молекул в ПААГ зависит от молекулярных масс белков и концентрации ПААГ. Подвижность биополимеров, находящихся в геле, пропорциональна подвижности в свободной жидкости. Подвижность определяется отношением суммарного заряда макромолекулы к ее массе. По силе трения молекулы о гель, а также по размерам пор определяют молекулярные массы белков.

Электрофорез проводят в буферной системе - рабочем буфере. От pH буфера, в котором находится белок, зависит суммарный заряд молекулы, а значит и отношение массы к заряду. Наилучшее разделение проводится при наиболее различных зарядов всех белков в смеси, для обеспечения разности зарядов белков выбирают величину pH буфера максимально удалённую от изоэлектрических точек всех белков. Разделение белков с кислым значением pH следует проводить в слабощелочном буфере, при котором разделение будет проходить от катода к аноду. При разделении щелочных белков наоборот, следует выбрать буфер с слабокислым значением pH и их миграция будет проходить от анода к катоду.

При выборе буфера также следует учитывать его электропроводную способность и электрофоретическую подвижность его ионов. Ионы буфера под действием электрического тока могут мигрировать в одном направлении с разделяемыми макромолекулами. Качество разделения улучшается, если для щелочных белков использовать трисовый буфер, а для кислых белков - барбитуратный буфер.

Трение молекулы о гель может происходить в зависимости от ее молекулярной массы, но на трение может влиять другой фактор. Например, конфигурация молекулы белка. Белки, образующие глобулы, которые не подвержены распаду и присоединению к ним новых молекул, называются глобулярными белками, их размеры зависят от плотности упаковки полипептидных цепей в глобулы. Все глобулы взаимодействуют с ПААГ практически одинаково, в отличие от фибриллярных белков, которые изменяют свою структуру при взаимодействии с гелем, что помогает им легче пройти между нитями ПААГ. Поэтому чтобы белковые структуры вели себя одинаково при миграции, применяют метод распрямления молекулы полипептидной цепи, то есть разрушение связей в белке, до первичной структуры. При применении этого метода более точно определяется молекулярная масса белка. Для разрушения связей в белке его перед электрофорезом обрабатывают детергентом - додецилсульфатом натрия, и нагревают до 100°С. Такую методику впервые предложил Лэммли [22]. Гидрофобными частями детергент присоединяется к гидрофобным радикалам аминокислот в полипептидной цепи. Данное взаимодействие изменяет конформацию белков. Денатурированный под действием детергентов белок обычно остаётся в растворённом виде, так как гидрофильные части денатурирующего вещества удерживают его в растворе и белок приобретает отрицательный заряд. Полипептидная цепочка белка распрямляется из-за электрического отталкивания остатков серной кислоты, расположенных на поверхности белка.

Как уже говорилось, белки способны слипаться, образовывая новые большие молекулы, такой процесс называется агрегацией и может привести к образованию таких соединений как димеры или тримеры молекул. Они будут проявляться отдельно от основной молекулы белка, давая дополнительные полосы. Такой эффект может происходить за счет сохранения водородных связей в структуре. Для предотвращения этого можно использовать мочевину, под действие которой разрушаются в основном нековалентные связи, такие как гидрофобные взаимодействия и водородные связи. Мочевина образует водородные связи с амино - и карбонильными группами пептидного остова и некоторыми функциональными группами радикалов аминокислот, в результате чего происходит разрыв связей, участвующих в формировании вторичной и третичной структуры нативных белков, и образование новых связей с мочевиной.

Для разрушения дисульфидных мостиков в структуре белка используют меркаптоэтанол, который также предотвращает окисление белкового препарата, так как при окислении происходит образование дисульфидных связей:

Разрушение дисульфидных связей происходит из-за восстанавливающего действия меркаптоэтанола на дисульфидные мостики между аминокислотными остатками в молекуле белка:

Во время проведения электрофореза сами белки увидеть нельзя, поэтому для визуализации процесса используют красители, которые добавляют в смесь белков перед проведением электрофореза. Обычно подбирают такой краситель, который не взаимодействует с белком и несет электрический заряд с таким же знаком. Под действием электрического тока краситель также двигается в электрическом поле, однако он не должен значительно опережать миграцию исследуемых белков в ПААГ. Скорость миграции молекул красителя должна быть немного выше, чем наивысшая скорость миграции макромолекул. Для белков заряженных отрицательно, а также денатурированных при помощи додецилсульфата натрия, часто применяют краситель, имеющий отрицательных заряд - бромфеноловый синий.

Основной физический принцип метода разделения белковой смеси при помощи электрофореза заключается в том, что макромолекулы, которые необходимо подвергать разделению, имеют суммарный электрический заряд за счет нахождения на поверхности разнозаряженных зон [23]. На заряд может влиять значение pH среды, в которой содержатся макромолекулы. Если создать такие условия, что через буферный раствор, находящийся между изолированными стеклами, пропускать электрический ток, то будет образовываться градиент напряжения и в буферном растворе установится электрическое поле. Под действием электрического поля макромолекулы перемещаются к катоду или аноду, в зависимости от суммарного заряда, которым обладает молекула. От того какой размер самой молекулы и каким зарядом она обладает, будет зависеть скорость миграции в электрическом поле. При столкновении молекул с нитями геля, их подвижность замедляется. Вследствие торможения молекул и происходить разделение. Исходный набор макромолекул разделяется на зоны, в которых содержаться молекулы, имеющие одинаковый размер и заряд. В процессе проведения электрофореза эти зоны распределяются по длине геля.

9. Изоэлектрическое фокусирование

Метод изоэлектрического фокусирования основан на электрофоретическом разделение белков под действием электрического поля в градиенте рН [24]. Разделение происходит в соответствии с их изоэлектрическими точками, которыми обладают каждые заряженные биополимеры, что увеличивает специфичность данного метода. При достижении белком изоэлектрической точки в градиенте рН его суммарный заряд становится равным нулю и он перестает перемещаться в электрическом поле. Изоэлектрическая точка белка может меняться в зависимости от действия на него различных факторов, так как при изменении условий среды происходит модификация его структуры. В процессе проведения изофокусирования молекулы белка, находясь в кислой или щелочной среде, меняют свой заряд и двигаются по направлению к катоду или аноду под действием электрического поля, пока не становятся нейтрально заряженными.

В результате электрофоретического разделения исследуемого вещества может происходить диффузия белковых молекул из зоны фокусирования, но, попадая в более кислую или щелочную среду, молекулы белка будут терять нейтральность и под действием электрического поля снова возвращаться в зону изоэлектрической точки. Если молекула положительна заряжена при условиях pH среды, в которой она находится, то она мигрирует в сторону катода, где значение pH выше. В процессе миграции происходит депротонирование аминогрупп и карбоксилов молекулы, в результате чего положительный заряд уменьшается, а отрицательный возрастает. Скорость миграции при этом уменьшается, пока молекула не достигнет таких изменений заряда на поверхности, что станет нейтрально заряженной, миграция при этом прекращается (Рис. 3).

Рис. 3. Эффект фокусирования при ИЭФ, молекулы белка с pI 8,0 [25].

Для создания градиента рН применяют полимерные буферные вещества, которые имеют положительные и отрицательные заряды и свои изоэлектрические точки. Эти буферные вещества являются смесью синтетических полиаминополикарбоновых кислот, называемых амфолинами (амфолитами). Они находятся в диапазоне изоэлектрических точек (рI) от 3,0 до 10,0 единиц рН. Смесь амфолитов помещают в стабилизационную среду и подают напряжение, в результате распределения амфолинов создается градиент, в котором рН увеличивается в направлении от анода (+) к катоду (-).

Отрицательный электрод притягивает положительные частицы и отталкивает отрицательные, а положительный наоборот будет притягивать отрицательные частицы. Катод окружен сильнощелочным раствором, таким как едкий натрий и называется католит. Анод находится в среде сильнокислого раствора - анолит. Промежуток между ними будет заполнен нейтральным электролитом.

Для эффективного разделения большое значение имеет подбор католита и анолита. Чтобы предотвратить разрушение амфолитов при соприкосновении с электродами, положительный электрод защищают с помощью кислоты, а отрицательный электрод - щелочью. Значение pH католита и анолита должны превышать крайние значения применяемой смеси амфолитов.

В качестве анолита часто используется слабая кислота, которая при диссоциации дает положительно заряженный протон водорода и отрицательный анион. В результате диффузии кислота попадает в рабочий канал, где происходит ионизация кислоты, так как она попадает в раствор с более высоким значением pH. Анионы, образуемые в процессе ионизации, переходят обратно в кислую среду, а протоны взаимодействуют с амфолитами. Вследствие таких взаимодействий амфолиты заряжаются положительным зарядом и начинают движение в среду с более щелочным значением pH. В щелочной среде амфолиты становятся нейтрально заряжены, а протоны взаимодействуют со следующими амфолитами. За счет всех произошедших взаимодействий возникает слабый ток, и протоны перемещаются от анода к катоду, а гидроксил-ионы, получаемые диссоциацией щелочи, двигаются по направлению от катода к аноду. Сила тока также будет зависеть от области pH, при которой используются амфолиты, и от значения pKa кислоты (анолита) и основания (католита).

На рис.4 изображена колонка для изоэлектрического фокусирования, где верхний сосуд 3 предназначен для кислотного буфера, в который помещен электролит 4, а нижний сосуд 8 - для щелочного буферного раствора, с помещенным в раствор электролитом 6. Нижний буферный раствор также содержит сахарозу для поддержания градиента и предотвращения вытеснения из рабочего канала 1 раствора глицерина в градиенте, содержащего амфолины и препарат, через диализный мешок 7. Так как в процессе фокусирования может происходить нагревание рабочей области из-за электрического тока, то иногда применяют охлаждающую рубашку 2.

Рис. 4. Колонка для аналитического изофокусирования белков [26].

1-рабочий объем; 2-охлаждающая рубашка; 3-верхний электродный сосуд для кислотного буфера; 4,6-электроды; 5-сифон; 7-диализный мешок; 8 - нижний электродный сосуд для щелочного буфера.

Градиент для проведения изоэлектрического фокусирования может быть как искусственным, так и естественным [27]. Искусственным называется градиент pH, который образован вследствие диффузии неамфолитных буферов в электрическом поле [28]. Градиенты такого типа не устойчивы, они часто изменяются при диффузии и миграции ионов. Создавать стабильный искусственный градиент pH можно за счет изменений концентраций кислотных и щелочных буферов при проведении изофокусирования. Градиент стабилизируется за счет буферных растворов [29]. Однако при использовании этого метода распределение идет очень долго.

Формирование естественного градиента pH происходит под действием электрического поля и при отсутствии конвекции молекул. Большую устойчивость системе при формировании такого градиента придает наличие амфолитов, которые под действием тока распределяются по принципу от анода к катоду с возрастанием pH. Так как каждый амфолит обладает определенной буферной емкостью, то в зависимости от этого будет прекращать миграцию в определенной точке и создавать градиент pH. Градиент также зависит от электропроводности амфолита, который находится в изоэлектрической точке. Устойчивость такого градиента зависит от действия на него таких факторов, как конвекция и диффузия. Во избежание этого в системе поддерживается постоянное напряжение, которое предотвращает перегревание и конвекцию. Также антиконвекционной средой служит сахароза, в градиенте плотности которой можно проводить фракционирование. Сахароза способствует стабилизации раствора, в котором проходит изофокусирование белков. Однако содержащиеся сахароза или глицерин, которые используются для создания градиентной плотности, так же как содержащаяся мочевина, которую используют для лучшего растворения белкового осадка, могут оказывать влияние на величину изоэлектрической точки белка [30]. Присутствие в генно-инженерных продуктах, а также некоторых высокоочищенных биотехнологических препаратов солей в высоких концентрациях (более 0,1 М) может искажать градиент рН и форму сфокусированных белков. Для нейтрализации этого эффекта образцы лучше готовить в деионизованной воде или растворе глицина.

Для индикации изоэлектрического равновесия при фокусировании применяют окрашенные маркеры. Также их применяют для визуализации и определения развития градиентов pH. В качестве маркеров могут быть использованы окрашенные белки.

Экспериментальная часть

1. Реагенты и прочие материалы

Ацетатный буфер (рН 3,6-5,6).

Растворы:

Раствор А (0,5 н. раствор СН₃СООН). Влить 30 мл ледяной уксусной кислоты в мерную колбу на 1 л и довести до метки дистиллированной водой. Раствор Б (0,5 н. раствор CH₃COONa). Поместить 68г соли CH₃COONa в мерную колбу на 1 л, растворить соль в дистиллированной воде и довести раствор до метки.

Слить растворы А и Б в количествах

Как исходные растворы, так и сами буферные смеси могут храниться длительное время при 8^оС.

Буфер А (pH=5,5, 50мМ раствор CH₃COONa): Поместить навески 8,2г соли ацетата натрия и 720г мочевины ("Calbiochem", США) в колбу на 2л, растворить в деионизированной воде и довести раствор до метки. Хранится при температуре 4-8 ^оС. При таких условиях хранения может быть пригоден для использования длительное время.

Трис-буфер (рН 7,2 - 9,0).

Растворы:

Раствор А (0,2М раствор трис (гидроксиметил) аминометана). Навеску 24,3 г соли трис (гидроксиметил) аминометана поместить в мерную колбу на 1л, растворить и довести до метки дистиллированной водой;