В дрожжевых клетках (спиртовое брожение) пируват вначале подвергается декарбоксилированию, в результате чего образуется ацетальдегид. Данная реакция катализируется ферментом пируватдекарбоксилазой, который требует наличия ионов Mg и кофермента (ТПФ):

Образовавшийся ацетальдегид присоединяет к себе водород, отщепляемый от НАДН, восстанавливаясь при этом в этанол. Реакция катализируется ферментом алкогольдегидрогеназой:

Таким образом, конечными продуктами спиртового брожения являются этанол и СО₂, а не молочная кислота, как при гликолизе.

Процесс молочнокислого брожения имеет большое сходство со спиртовым брожением. Отличие заключается лишь в том, что при молочнокислом брожении пировиноградная кислота не декарбоксилируется, а, как и при гликолизе в животных тканях, восстанавливается при участии ЛДГ за счет водорода НАДН.

Известны 2 группы молочно-кислых бактерий. Бактерии одной группы в процессе брожения углеводов образуют только молочную кислоту, а бактерии другой из каждой молекулы глюкозы «производят» по одной молекуле молочной кислоты, этанола и СО₂.

Существуют и другие виды брожения, конечными продуктами которых могут являться пропионовая, масляная и янтарная кислоты, а также другие соединения.

11. Характеристика основных потребностей микроорганизмов в макро- и микроэлементах. Ауксотрофы и прототрофы.

Для роста и размножения бактерий, а, следовательно, и для их питания, необходимы различные химические соединения, растворенные в воде. По количественному вкладу в построение клетки различают макро- и микроэлементы. К макроэлементам относят 10 элементов таблицы Менделеева: углерод, водород, кислород, азот, серу, калий, кальций, фосфор, магний, железо. Микроэлементы нужны бактериям в очень малых, следовых, количествах, они представлены марганцем, молибденом, цинком, медью, кобальтом, никелем, хлором, бромом и некоторыми другими металлами и неметаллами. Большинство из них содержится в виде примесей в макроэлементах или может попадать в питательные среды из стеклянной посуды, воды или воздуха. Некоторые бактерии могут обходится и без микроэлементов.

Для роста микроорганизмов так же необходим азот, который входит в состав органических соединений или солей в разной степени восстановления. Это могут быть соли аммония, нитраты или отдельные аминокислоты. Для удовлетворения потребности бактерий в азоте используют также продукты неполного расщепления белков животного происхождения - гидролизаты , пептоны и сложные белковые смеси - нативную сыворотку животных, асцитическую жидкость и др.

Кроме углерода, азота и других химических элементов, многие бактерии нуждаются в факторах роста, к которым относятся витамины, основания нуклеиновых кислот и другие биологически активные вещества. По этому признаку микроорганизмы можно разделить на две группы: ауксотрофы , для которых в среде необходимо наличие одного или нескольких факторов роста и прототрофы , они в факторах роста не нуждаются.

12. Механизм регуляции активности ферментов в микроорганизмах.

Поскольку практически все реакции в клетке катализируются ферментами, регуляция метаболизма сводится к регуляции интенсивности ферментативных реакций. Скорость последних может регулироваться двумя основными способами: путем изменения количества ферментов и/или изменения их активности, т. с. степени испольвания их каталитического потенциала.

Регуляция активности ферментов

Рис. 28. Регуляторные воздействия на уровень клеточных метаболитов (продуктов)

Факторы, регулирующие активность ферментов, разнообразны по своей природе (рис. 28). Физические факторы (температура, давление, свет, магнитное поле, электрические импульсы оказывают менее специфическое действие, чем химические. В свою очередь действие последних также может быть разделено на несколько типов. Одни химические вещества связываются с активным центром фермента, например субстраты, кофакторы, конкурентные ингибиторы, что приводит к изменению ферментативной активности. Другие вещества взаимодействуют со специальными участками на поверхности молекулы определенного типа фермента, не имеющими непосредственного отношения к центрам каталитической активности, но тем не менее приводящими к ее изменению.

Наконец, активность некоторых ферментов регулируется путем химической модификации их молекулы, в основе которой лежит ковалентное обратимое связывание с ферментом определенной группировки, что приводит к изменению его активности. У прокариот известны две ферментные системы, активность которых регулируется таким путем. Глутаминсинтетаза E. coli, катализирующая синтез глутамина, существует в двух формах, различающихся присутствием в одной из них остатка адениловой кислоты. Присоединение его с помощью ковалентной связи, катализируемое соответствующим модифицирующим ферментом, приводит к образованию менее активной аденилированной глутаминсинтетазы:

Удаление адениловой группы, ведущее к возникновению деаденилированной формы фермента, резко повышает его каталитическую активность. Аналогичный механизм регулирования активности фермента путем присоединения и удаления остатка уксусной кислоты (ацетилирование -- деацетилирование) обнаружен для цитратлиазы у фотосинтезирующей бактерии Rhodopseudomonas gelatinosa. В этом случае активна ацетилированная форма фермента.

Наиболее быстрым, точным и тонким механизмом регуляции активности ферментов является регуляция, которой подвергается определенный тип ферментов, получивших название аллостерических21. Эти ферменты, как правило, занимают ключевые позиции в обмене веществ, располагаясь в "стратегических" пунктах клеточного метаболизма -- начале метаболических путей или местах разветвлений, где расходятся или сходятся несколько путей.

Рис. 29. Связывание субстрата с ферментом (А) и действие отрицательного (Б) и положительного (И) эффектора на каталитическую активность аллостерического фермента: 1 -- каталитический центр; 2 -- регуляторный центр (no Schlegel, 1972)

Аллостерические ферменты имеют каталитический и регуляторный (аллостерический) центры, пространственно разобщенные, но функционально тесно взаимосвязанные. Каталитическая активность фермента меняется в результате связывания с его регуляторным центром определенных метаболитов, называемых эффекторами. Кроме конечных продуктов данного пути, эффекторами могут быть субстраты ферментов, а также некоторые конечные продукты родственных метаболических путей. Если действие эффектора приводит к понижению каталитической активности фермента, такой эффектор называется отрицательным, или ингибитором. Положительным называют эффектор, действие которого повышает каталитическую активность фермента. Положительным эффектором, или активатором, чаще всего бывает субстрат данного фермента.

Связывание эффектора с регуляторным центром приводит к изменению сродства фермента к субстрату в результате какого-то конформационного изменения фермента (рис. 29).

Наиболее простой случай аллостерической регуляции -- регуляция первого фермента неразветвленного биосинтетического пути его конечным продуктом. Если конечный продукт накапливается в избытке, он подавляет активность первого фермента в процессе, называемом ингибированием по принципу обратной связи Примером такого типа регулирования является ингибирование биосинтеза L-изолейцина (рис. 30) Первый фермент на пути синтеза L-изолейцина L-треониндезаминаза является аллостерическим и ингибируется только L-изолейцином.

Рис. 30. Регуляция биосинтеза L-изолейцина по механизму отрицательной обратной связи; ф, -- треониндезаминаза; ф -- фз -- ферменты, катализирующие промежуточные стадии биосинтеза L-изолейцина. Стрелкой показано ингибирование треониндезамнназы L-изолейцином

13. Механизм поглощения субстратов у микроорганизмов.

Основной источник энергии в клетке - окисление субстратов кислородом воздуха. Этот процесс осуществляется тремя путями: присоединением кислорода к атому углерода, отщеплением водорода или потерей электрона. В клетках окисление протекает в форме последовательного переноса водорода и электронов от субстрата к кислороду. Кислород играет в этом случае роль восстанавливающегося соединения (окислителя). Окислительные реакции протекают с высвобождением энергии. Для биологических реакций характерны сравнительно небольшие изменения энергии. Это достигается за счет дробления процесса окисления на ряд промежуточных стадий, что позволяет запасать ее небольшими порциями в виде макроэргических соединений (АТФ). Восстановление атома кислорода при взаимодействии с парой протонов и электронов приводит к образованию молекулы воды.

Тканевое дыхание

Это процесс потребление клетками тканей организма кислорода, который участвует в биологическом окислении. Такой вид окисления называют аэробным окислением. Если конечным акцептором в цепи переноса водорода выступает не кислород, а другие вещества (например пировиноградная кислота), то такой тип окисления называют анаэробным.

Т.о. биологическое окисление - это дегидрирование субстрата с помощью промежуточных переносчиков водорода и его конечного акцептора.

Дыхательная цепь (ферменты тканевого дыхания) - это переносчики протонов и электронов от окисляемого субстрата на кислород. Окислитель - это соединение, способное принимать электроны. Такая способность количественно характеризуется окислительно-восстановительным потенциалом по отношению к стандартному водородному электроду, рН которого равен 7,0. Чем меньше потенциал соединения, тем сильнее его восстанавливающие свойства и наоборот.

Т. о. любое соединение может отдавать электроны только соединению с более высоким окислительно-восстановительным потенциалом. В дыхательной цепи каждое последующее звено имеет более высокий потенциал, чем предыдущее.

Дыхательная цепь состоит из:

1.НАД - зависимой дегидрогеназы;

2.ФАД- зависимой дегидрогеназы;

3.Убихинона (КоQ);

4.Цитохрмов b, c, a+a3 .

НАД-зависимые дегидрогеназы. В качестве кофермента содержат НАД и НАДФ. Пиридиновое кольцо никотинамида способно присоединять электроны и протоны водорода.

ФАД и ФМН-зависимые дегидрогеназы содержат в качестве кофермента фосфорный эфир витамина В2 (ФАД).

Убихинон (КоQ) отнимает водород у флавопротеидов и превращается при этом в гидрохинон.

Цитохромы - белки хромопротеиды, способные присоединять электроны, благодаря наличию в своем составе в качестве простетических групп железопорфиринов. Они принимают электрон от вещества, являющегося немного боле сильным восстановителем, и передают его более сильному окислителю. Атом железа связан с атомом азота имидазольного кольца аминоксилоты гистидина с одной стороны от плоскости порфиринового цикла, а с другой стороны с атомом серы метионина. Поэтому потенциальная способность атома железа в цитохромах к связыванию кислорода подавлена.

В цитохроме с порфириновая плоскость ковалентно связана с белком через два остатка цистеина, а в цитохромах b и а, она ковалентно не связано с белком.

В цитохроме а+а3 (цитохромоксидазе) вместо протопорфирина содержатся порфирин А, который отличатся рядом структурных особенностей. Пятое координационное положение железа занято аминогруппой, принадлежащей остатку аминосахара, входящего в состав самого белка.

В отличии от гема гемолгобина атом железа в цитохромах может обратимо переходить из двух в трехвалентное состояние это обеспечивает транспорт электронов (См. подробнее приложение 1 "Атомная и электронная структура гемопротеинов ").

Механизм работы электронтранспортной цепи

Наружная мембрана митохондрии (рис. 4.8.1) проницаема для большинства мелких молекул и ионов, внутренняя почти для всех ионов (кроме протонов Н) и для большинства незаряженных молекул.

Все вышеперечисленные компоненты дыхательной цепи встроены во внутреннюю мембрану. Транспорт протонов и электронов по дыхательной цепи обеспечивается разностью потенциалов между ее компонентами. При этом каждое увеличение потенциала на 0,16 В освобождает энергию, достаточную для синтеза одной молекулы АТФ из АДФ и Н3РО4. При потреблении одной молекулы О2 образуется 3 АТФ.

Процессы окисления и образования АТФ из АДФ и фосфорной кислоты т.е. фосфорилирования протекают в митохондриях. Внутренняя мембрана образует множество складок - крист. Пространство органиченное внутренней мембраной - матриксом. Пространство между внутренней и наружной мембранами называется межмембранным.

14. Характеристика пентозофосфатного пути расщепления глюкозы

Открытие пути прямого окисления углеводов, или, как его называют, пентозофосфатного цикла, принадлежит О. Варбургу, Ф. Липману, Ф. Дикенсу и В.А. Энгельгарду. Расхождение путей окисления углеводов - классического (цикл трикарбоновых кислот, или цикл Кребса) и пентозофос-фатного - начинается со стадии образования гексозомонофосфата. Если глюкозо-6-фосфат изомеризуется во фруктозо-6-фосфат, который фосфо-рилируется второй раз и превращается во фруктозо-1,6-бисфосфат, то в этом случае дальнейший распад углеводов происходит по обычному гликолитическому пути с образованием пировиноградной кислоты, которая, окисляясь до ацетил-КоА, затем «сгорает» в цикле Кребса.

Если второго фосфорилирования гексозо-6-монофосфата не происходит, то фосфорилированная глюкоза может подвергаться прямому окислению до фосфопентоз. В норме доля пентозофосфатного пути в количественном превращении глюкозы обычно невелика, варьирует у разных организмов и зависит от типа ткани и ее функционального состояния.

У млекопитающих активность пентозофосфатного цикла относительно высока в печени, надпочечниках, эмбриональной ткани и молочной железе в период лактации. Значение этого пути в обмене веществ велико. Он поставляет восстановленный НАДФН, необходимый для биосинтеза жирных кислот, холестерина и т.д. За счет пентозофосфатного цикла примерно на 50% покрывается потребность организма в НАДФН.

Другая функция пентозофосфатного цикла заключается в том, что он поставляет пентозофосфаты для синтеза нуклеиновых кислот и многих коферментов. При ряде патологических состояний удельный вес пентозофосфатного пути окисления глюкозы возрастает. Механизм реакций пентозофосфатного цикла достаточно расшифрован.

Пентозофосфатный цикл начинается с окисления глюкозо-6-фосфата и последующего окислительного декарбоксилирования продукта (в результате от гексозофосфата отщепляется первый атом углерода). Это первая, так называемая окислительная, стадия пентозофосфатного цикла. Вторая стадия включает неокислительные превращения пентозофосфатов с образованием исходного глюкозо-6-фосфата (рис. 3). Реакции пен-тозофосфатного цикла протекают в цитозоле клетки.

Первая реакция - дегидрирование глюкозо-6-фосфата при участии фермента глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы и кофермента НАДФ+. Образовавшийся в ходе реакции 6-фосфоглюконо-д-лактон - соединение нестабильное и с большой скоростью гидролизуется либо спонтанно, либо с помощью фермента 6-фосфоглюконолактоназы с образованием 6-фос-фоглюконовой кислоты (6-фосфоглюконат):

Во второй - окислительной - реакции, катализируемой 6-фосфоглюко-натдегидрогеназой (декарбоксилирующей), 6-фосфоглюконат дегидрируется и декарбоксилируется. В результате образуется фосфорилированная кетопентоза - D-рибулозо-5-фосфат и еще 1 молекула НАДФН:

Под действием соответствующей эпимеразы из рибулозо-5-фосфата может образоваться другая фосфопентоза - ксилулозо-5-фосфат. Кроме того, рибулозо-5-фосфат под влиянием особой изомеразы легко превращается в рибозо-5-фосфат. Между этими формами пентозофосфатов устанавливается состояние подвижного равновесия:

При определенных условиях пентозофосфатный путь на этом этапе может быть завершен. Однако при других условиях наступает так называемый неокислительный этап (стадия) пентозофосфатного цикла. Реакции этого этапа не связаны с использованием кислорода и протекают в анаэробных условиях. При этом образуются вещества, характерные для первой стадии гликолиза (фруктозо-6-фосфат, фруктозо-1,6-бисфосфат, фосфотрио-зы), а другие - специфические для пентозофосфатного пути (седогептуло-зо-7-фосфат, пентозо-5-фосфаты, эритрозо-4-фосфат).

Основными реакциями неокислительной стадии пентозофосфатного цикла являются транскетолазная и трансальдолазная. Эти реакции катализируют превращение изомерных пентозо-5-фосфатов:

Коферментом в транскетолазной реакции служит ТПФ, играющий роль промежуточного переносчика гликольальдегидной группы от ксилулозо-5-фосфата к рибозо-5-фосфату. В результате образуется семиуглеродный моносахарид седогептулозо-7-фосфат и глицеральдегид-3-фосфат.

Транскетолазная реакция в пентозном цикле встречается дважды, второй раз - при образовании фруктозо-6-фосфата и триозофосфата в результате взаимодействия второй молекулы ксилулозо-5-фосфата с эритро-зо-4-фосфатом:

Фермент трансальдолаза катализирует перенос остатка диоксиацетона (но не свободного диоксиацетона) от седогептулозо-7-фосфата на гли-церальдегид-3-фосфат:

Шесть молекул глюкозо-6-фосфата, вступая в пентозофосфатный цикл, образуют 6 молекул рибулозо-5-фосфата и 6 молекул СО₂, после чего из 6 молекул рибулозо-5-фосфата снова регенерируется 5 молекул глюко-зо-6-фосфата. Однако это не означает, что молекула глюкозо-6-фосфата, вступающая в цикл, полностью окисляется. Все 6 молекул СО₂ образуются из С-1-атомов 6 молекул глюкозо-6-фосфата.

Валовое уравнение окислительной и неокислительной стадий пентозофосфатного цикла можно представить в следующем виде:

или

Образовавшийся НАДФН используется в цитозоле на восстановительные синтезы и, как правило, не участвует в окислительном фосфорилировании, протекающем в митохондриях.

15. Особенности пути Ембдена-Мейергофа-Парнаса (гликолиз)

Гексозодифосфатний шлях (гліколіз), або схема Ембдена - Мейєргофа-Парнаса, починається із глюкози і через ряд послідовних реакцій деграда-ції призводить до утворення пірувату . Перша реакція відбува-ється з витратою енергії у вигляді макроергічного зв'язку АТФ і пов'язана з утворенням фосфорильованого похідного глюкози - глюкозо-6-фосфату. У наступній реакції відбувається ізомеризація глюкозо-6-фосфату у фруктозо-6-фосфат. При дії фосфофруктокінази відбувається утворення фруктозо-1,6-дифосфату. У наступній реакції під впливом альдолази утворюється дві триози: 3-фосфогліцериновий альдегід і фосфодиоксиацетон, які є ізомера-ми і тому можуть переходити один в одного. Альдолаза фруктозо-1,6-дифосфату є ключовим ферментом для цього шляху, виявлення активності якого чітко вказує на наявність гексозодифосфатного шляху. Наступні реакції пов'язані з окисненням 3-фосфогліцеринового альдегіду під впливом гліцераль-дегід-3-фосфатдегідрогенази з утворенням макроергічного зв'язку 1,3-дифосфо-гліцеринової кислоти. Наявний в цій речовині макроергічний зв'язок перетворюється в макроергічний зв'язок АТФ під час першого субстратного фосфо-рилювання. Друге фосфорилювання пов'язане з перетворенням макроергіч-ної сполуки - фосфоенолпіровиноградної кислоти в піруват. Більш докладно механізми утворення АТФ під час двох субстратних фосфорилювань будуть описані в наступних розділах. Подальша доля пірувату у випадку аеробних процесів пов'язана з перетворенням в ацетил-КоА; в анаеробних умовах від пірувату можуть починатись перетворення за різними схемами процесів бродіння.

Як найбільш показовий приклад можна навести гомоферментативне молочнокисле бродіння, за якого з пірувату утворюється молочна кислота.

Процес спиртового бродіння відбувається за цією ж схемою, але піруват піддається декарбоксилюванню з утворенням ацетоальдегіду, який потім 'Дновлюється НАД+-залежною алкогольдегідрогеназою до етанолу.

Деякі види ентеробактерій здійснюють бродіння з утворенням цілої серії кислот, серед яких домінує мурашина, яка потім може піддаватись утилізації під дією ферменту форміатгідрогенази до С02 і Н2. Такі реакції називають mурашинокислим бродінням. Для ентеробактерій також характерний особли-ним Шлях синтезу етанолу з пірувату через утворення ацетил-КоА з наступним відновленням його до етанолу.

Бродіння з утворенням ацетату може відбуватись декількома шляхам Один з них пов'язаний з відновленням СОг до оцтової кислоти; під час інш го відбувається утворення ацетату з ацетил-КоА.

Більш складним процесом є пропіоновокисле бродіння, яке складається фрагменту циклу Кребса на ділянці від щавлевооцтової до янтарної кислоти Кінцевий продукт бродіння - пропіонова кислота.

Найбільший спектр кінцевих продуктів утворюється в результаті маслянокислого бродіння: ізопропанол, масляна кислота, бутанол, ацетон, етанол, оцтова кислота.

16. ПУТЬ ЭНТНЕРА -- ДУДОРОВА

Общая схема третьего пути расщепления углеводов эубактериями представлена на рис. 67.

Первые два его этапа -- фосфорилирование молекулы глюкозы и ее дегидрирование до 6-фосфоглюконовой кислоты -- идентичны первым двум этапам окислительного пентозофосфатного пути. Специфичны для пути Энтнера -- Дудорова две следующие реакции: 1) дегидратирование 6-фосфоглюконовой кислоты, приводящее к образованию КДФГ-кислоты; 2) расщепление продукта первой реакции на два C3-фрагмента. Конечными продуктами второй реакции являются пировиноградная кислота и 3-ФГА. Последний окисляется в пировиноградную кислоту так же, как в гликолитическом пути. Следовательно, при разложении молекулы глюкозы до пирувата по пути Энтнера -- Дудорова образуется 1 молекула АТФ (2 молекулы АТФ синтезируются на отрезке пути 3-ФГА ® пировиноградная кислота минус 1 молекула АТФ, затраченная на фосфорилирование глюкозы), 1 молекула НАД-H2 и 1 молекула НАДФ-H2.

Путь Энтнера -- Дудорова имеет важное значение, когда сбраживаемыми субстратами служат глюконовая, маннановая, гексуроновые кислоты или их производные. Он функционирует у довольно широкого круга эубактерии, главным образом, грамотрицательных, получающих энергию в процессе дыхания (энтеробактерии50, виды Azotobacter, Pseudomonas, Alcaligenes, Rhizobium, Spirillum, Xanthomonas, Thiobacillus и др.). У анаэробов он встречается довольно редко. В качестве примера организма, сбраживающего сахара по пути Энтнера -- Дудорова, можно привести облигатно анаэробную бактерию Zymomonas mobilis. Однако ее изучение позволяет предполагать, что Z. mobilis -- вторичный анаэроб, произошедший от цитохромсодержащих аэробов. Путь Энтнера -- Дудорова обнаружен у некоторых клостридиев, что еще раз подчеркивает неоднородность эубактерий, объединенных в эту таксономическую группу.

У энтеробактерий гликолитический и окислительный пентозофосфатный пути функционируют как центральные конститутивные пути метаболизирования углеводов, путь Энтнера -- Дудорова -- как индуцибельный.

Согласно существующим представлениям путь Энтнера -- Дудорова сформировался позднее гликолитического и окислительного пентозофосфатного путей и возник как ответвление последнего, поскольку начала окислительного пентозофосфатного пути и пути Энтнера -- Дудорова идентичны и для последнего необходимо было сформировать только два новых фермента (6-фосфоглюконатдегидратазу и КДФГ-альдолазу). Появление пути Энтнера -- Дудорова, вероятно, было вызвано высокой потребностью клеток в пирувате, поэтому возникла необходимость сформировать механизм, при помощи которого пируват образовывался бы из исходного субстрата как можно более коротким и прямым путем. Действительно, к получению пирувата по пути Энтнера -- Дудорова ведут всего 4 реакции, в то время как в гликолитическом пути для этого требуется 9 ферментативных преобразований.

Как можно видеть из схемы процесса (рис. 67), путь Энтнера -- Дудорова имеет несколько точек пересечения с гликолитическим и окислительным пентозофосфатным путями: 6-фосфоглюконовая кислота представляет собой промежуточное соединение пути Энтнера -- Дудорова и окислительного пентозофосфатного; пируват и 3-ФГА -- промежуточные соединения пути Энтнера -- Дудорова и гликолиза.

В природе есть много мест с полным или почти полным отсутствием молекулярного кислорода. Это глубокие слои воды, почвы, илы морей и континентальных водоемов. Особую экологическую нишу для развития анаэробов представляют рубец и кишечник животных и человека. Облигатно анаэробный способ существования широко распространен среди эубактерий. Систематическое изучение анаэробных эубактерий, предпринятое в последние десятилетия, обнаружило неоднородность входящих в эту группу организмов, способных получать энергию в процессах брожения, фотосинтеза и анаэробного дыхания.

Только небольшая часть облигатно анаэробных эубактерий может быть отнесена к первичным анаэробам, т. е. возникшим в докислородную эпоху и сохранившим до настоящего времени основные черты метаболизма того периода в результате обитания в анаэробных экологических нишах: получение энергии в процессе брожения, отсутствие электронтранспортных цепей, слабо развитые биосинтетические способности.

Большинство существующих облигатных анаэробов среди эубактерий имеют вторичное происхождение как следствие повторной адаптации к анаэробным условиям, сопровождающейся, как правило, изменениями деградационного характера: потерей способности взаимодействовать с O2, утратой некоторых компонентов переноса электронов, большей зависимостью от готовых органических соединений среды обитания и т. д. Примером могут служить строго анаэробные эубактерии, составляющие основную микрофлору рубца и пищеварительного тракта животных и человека. Это в большинстве грамотрицательные кокки или палочки, способные сбраживать сахара и/или аминокислоты. У многих из них обнаружены цитохромы b и a и показана способность синтезировать АТФ по механизму мембранзависимого фосфорилирования.

В представленном в этой главе материале проанализированы энергетические процессы, сформированные на первом этапе эволюции жизни на Земле. То, что брожение -- наиболее примитивный способ получения энергии организмами, в настоящее время никем не ставится под сомнение. Гораздо сложнее оценить, какой путь в процессе эволюции пройден теми или иными организмами. Очевидно, что при имеющихся возможностях обмена генетической информацией в мире прокариот сохранение их в первоначальном виде маловероятно. Описание представленных в этой главе нескольких групп анаэробных эубактерий, в первую очередь, пропионовокислых бактерий и клостридиев, служит иллюстрацией этого.

Рис. 67

17. Понятие о ферментах. Их значение и классификация.

Ферменты (от лат. fermentum - брожение, закваска), специфические белки, присутствующие во всех живых клетках и играющие роль биологических катализаторов. Через их посредство реализуется генетическая информация и осуществляются все процессы обмена веществ и энергии в живых организмах. Ферменты бывают простыми или сложными белками, в состав которых наряду с белковым компонентом (апоферментом) входит небелковая часть - кофермент. Эффективность действия ферментов определяется значительным снижением энергии активации катализируемой реакции в результате образования промежуточных фермент-субстратных комплексов. Присоединение субстратов происходит в активных центрах, которые обладают сходством только с определенными субстратами, чем достигается высокая специфичность (избирательность) действия ферментов. Одна из особенностей ферментов - способность к направленному и регулируемому действию. За счёт этого контролируется согласованность всех звеньев обмена веществ. Эта способность определяется пространственность структурной молекулы ферментов. Она реализуется через изменение скорости действия ферментов и зависит от концентрации соответствующих субстратов и кофакторов, рH среды, температуры, а также от присутствия специфических активаторов и ингибиторов (например, адениловых нуклеотидов, карбонильных, сульфгидрильных соединений и др.). Некоторые ферменты помимо активных центров имеют дополнительные, т.н. аллостерические регуляторные центры. Биосинтез ферментов находится под контролем генов. Различают конститутивные ферменты, постоянно присутствующие в клетках, и индуцируемые ферменты, биосинтез которых активируется под влиянием соответствующих субстратов. Некоторые функционально взаимосвязанные ферменты образуют в клетке структурно организованные полиферментные комплексы. Многие ферменты и ферментные комплексы прочно связаны с мембранами клетки или её органоидов (митохондрий, лизосом, микросом и т.д.) и участвуют в активном транспорте веществ через мембраны.

Известно более 20000 различных ферментов, из которых многие выделены из живых клеток и получены в индивидуальном состоянии. Первый кристаллический фермент (уреаза) выделен американским биохимиком Д.Самнером в 1926 г. Для ряда ферментов изучена последовательность аминокислот и выяснено расположение полипептидных цепей в трёхмерном пространстве. В лабораторных условиях осуществлен искусственный химический синтез фермента рибонуклеазы. Ферменты используют для количественного определения и получения различных веществ, для модификации молекул нуклеиновых кислот методами генной инженерии, диагностики и лечения ряда заболеваний, а также в ряде технологических процессов, применяемых в лёгкой, пищевой и фармацевтической промышленностях.

Будучи белками, ферменты обладают всеми их свойствами. Вместе с тем биокатализаторы характеризуются рядом специфических качеств, тоже вытекающих из их белковой природы. Эти качества отличают ферменты от катализаторов обычного типа. Сюда относятся термолабильность ферментов, зависимость их действия от значения рН среды, специфичность и, наконец, подверженность влиянию активаторов и ингибиторов.

По первой в истории изучения ферментов классификации их делили на две группы: гидролазы, ускоряющие гидролитические реакции, и десмолазы, ускоряющие реакции негидролитического распада. Затем была сделана попытка разбить ферменты на классы по числу субстратов, участвующих в реакции. В соответствии с этим ферменты классифицировали на три группы. 1. Катализирующие превращения двух субстратов одновременно в обоих направлениях: А+В)С+D. 2. Ускоряющие превращения двух субстратов в прямой реакции и одного в обратной: А+В)С. 3. Обеспечивающие каталитическое видоизменение одного субстрата как в прямой, так и в обратной реакции: А)В.

Одновременно развивалось направление, где в основу классификации ферментов был положен тип реакции, подвергающейся каталитическому воздействию. Наряду с ферментами, ускоряющими реакции гидролиза (гидролазы), были изучены ферменты, участвующие в реакциях переноса атомов и атомных групп (феразы), в изомеризации (изомеразы), расщеплении (лиазы), различных синтезах (синтетазы) и т. д. Это направление в классификации ферментов оказалось наиболее плодотворным, так как объединяло ферменты в группы не по надуманным, формальным признакам, а по типу важнейших биохимических процессов, лежащих в основе жизнедеятельности любого организма. По этому принципу все ферменты делят на 6 классов.

1. Оксидоредуктазы - ускоряют реакции окисления - восстановления. 2. Трансферазы - ускоряют реакции переноса функциональных групп и молекулярных остатков. 3. Гидролазы - ускоряют реакции гидролитического распада. 4. Лиазы - ускоряют негидролитическое отщепление от субстратов определенных групп атомов с образованием двойной связи (или присоединяют группы атомов по двойной связи). 5. Изомеразы - ускоряют пространственные или структурные перестройки в пределах одной молекулы. 6. Лигазы - ускоряют реакции синтеза, сопряженные с распадом богатых энергией связей. Эти классы и положены в основу новой научной классификации ферментов.

18. Участие микроорганизмов в круговороте веществ

В соответствии со своей ролью и функцией в балансе природы орга-низмы разделяются на три группы. Зеленые растения синтезируют орга-нические вещества, используя энергию солнца и углекислоту, поэтому их называют продуцентами. Животные являются потребителями (коису-ментами); они расходуют значительную часть первичной биомассы для построения своего тела. Тела животных и растений в конце концов под-вергаются разложению, при котором органические вещества превра-щаются в минеральные, неорганические соединения. Этот процесс, на-зываемый минерализацией, осуществляют в первую очередь грибы и бактерии; в балансе природы они служат деструкторами. Таким обра-зом, биоэлементы участвуют в циклических процессах. Здесь уместно коротко остановиться на биогеохимических круговоротах углерода, азо-та, фосфора и серы.

Круговорот углерода. В круговороте углерода микроорганизмы вы-полняют функцию, очень важную для поддержания жизни на Земле. Они обеспечивают минерализацию углерода, переведенного зелеными растениями в органические соединения, и тем самым поддерживают весьма неустойчивое равновесие (рис. 1.1). Атмосферный воздух содер-жит чуть больше 0,03% двуокиси углерода (12 мкМ/л). Фотосинтетиче екая же продуктивность зеленых растений так велика, что запас С0₂ в атмосфере был бы исчерпан примерно за 20 лет. Это относительно короткий срок в человеческих масштабах времени; ведь считается, что запасов энергии и угля на Земле хватит на срок от 1000 до 3000 лет. Да-же если учесть запасы С0₂ в океанах, то этого газа хватило бы лишь примерно на 2000 лет.

Зеленым растениям пришлось бы вскоре прекратить фиксацию С0₂, если бы низшие животные и микроорганизмы не обеспечивали возвра-щение этого газа в атмосферу в результате непрерывной минерализации органического материала. В общем балансе веществ на земном шаре почвенным бактериям и грибам принадлежит не меньшая роль, чем фо-тосинтезирующим зеленым растениям. Взаимозависимость всех живых существ на Земле находит наиболее яркое выражение в круговороте углерода.

Рис. 1.1. Круговорот углерода в биосфере.

Круговорот азота (рис. 1.2). Центральное место в круговороте азота занимает аммоний. Он является продуктом разложения белков и ами-нокислот, попадающих вместе с остатками животного и растительного происхождения в почву. В хорошо аэрируемых почвах аммоний подвер-гается нитрификации; бактерии родов Nitrosomonas и Nitrobacter окис ляют его до нитрита и нитрата. В качестве источника азота растения могут использовать и ассимилировать как аммоний, так и нитрат. В от-сутствие кислорода из нитрата рбразуется молекулярный азот (денитри-фикация). Бактерии, участвующие в этом процессе, используют при этом нитрат в качестве окислителя (акцептора водорода), т.е. «дышат» с помощью NO^ вместо 0₂; в этом случае говорят о «нитратном дыха-нии». Денитрификация ведет к потере азота почвой. Наряду с этим бак-терии способны и к фиксации молекулярного азота. Связывающие азот бактерии живут или свободно в почве (вне симбиоза), или в симбиозе с высшими растениями (симбиотические азотфиксаторы). Основную роль в круговороте азота наряду с животными и растениями играют бактерии.

Рис. 1.2. Круговорот азота.

Круговорот фосфора. В биосфере фосфор представлен почти исклю-чительно в виде фосфатов. В живых организмах фосфорная кислота су-ществует в форме эфиров. После отмирания клеток эти эфиры быстро разлагаются, что ведет к освобождению ионов фосфорной кислоты. До-ступной для растений формой фосфора в почве служат свободные ионы ортофосфорной кислоты (Н₃Р0₄). Их концентрация часто очень низка; рост растений, как правило, лимитируется не общим недостатком фос-фата, а образованием малорастворимых его соединений, таких как апа-тит и комплексы с тяжелыми металлами. Запасы фосфатов в месторож-дениях, пригодных для разработки, велики, и в обозримом будущем производство сельскохозяйственной продукции не будет ограничиваться недостатком фосфора; однако фосфат должен быть переведен в раство римую форму. Во многих местах фосфат из удобрений попадает в про-точные водоемы и озера. Так как концентрация ионов железа, кальция и алюминия в водоемах невысока, фосфат остается в растворенной фор-ме, что приводит к эвтрофизации водоемов, особенно благоприятной для развития азотфиксирующих цианобактерий. В почвах же из-за обра-зования нерастворимых солей фосфаты чаще всего быстро становятся недоступными для усвоения.

Круговорот серы (рис. 1.3). В живых клетках сера представлена главным образом сульфгидрильными группами в серусодержащих ами-нокислотах (цистеин, метионин, гомоцистеин). В сухом веществе орга-низмов доля серы составляет 1%. При анаэробном разложении органи-ческих веществ сульфгидрильные группы отщепляются десульфуразами; образование сероводорода при минерализации в анаэробных условиях называют также десульфурированием. Наибольшие количества встре-чающегося в природе сероводорода образуются, однако, при диссими-ляционном восстановлении сульфатов, осуществляемом сульфатредуци-рующими бактериями.

Этот сероводород, образующийся в отсутствие молекулярного кис-лорода в осадках водоемов, может быть окислен анаэробными фото-трофными бактериями (Chromatiaceae) до серы и суль-фата. Когда сероводород проникает в зоны, содержащие 0₂, он окисляется либо абиотическим образом, либо аэробными серобактерия-ми до сульфата . Серу, необходимую для синтеза серусодер-жащих аминокислот, растения и часть микроорганизмов получают пу-тем ассимиляционной сульфатредукции; животные же получают восста-новленные соединения серы с пищей.

Рис. 1.3. Круговорот серы.

19. Общие принципы регуляции синтеза ферментов.

Регулирование конечным продуктом активности аллостерического фермента определенного биосинтетического пути обеспечивает мгновенную реакцию, приводящую к изменению выхода этого продукта. Если последний оказывается ненужным, отпадает надобность и в ферментах, участвующих в его синтезе. Проявлением максимальной экономичности клеточного метаболизма служат выработанные клеткой механизмы, регулирующие ее ферментный состав. Очевидна целесообразность синтеза только тех ферментов, которые необходимы в конкретных условиях. Показано, что у прокариот в одних условиях фермент может содержаться в количестве не более 1 -- 2 молекул, в других -- составлять несколько процентов от клеточной массы.

Количество определенного фермента в клетке может регулироваться на нескольких уровнях: на этапе транскрипции, трансляции, а также в процессе сборки и разрушения ферментного белка (см. рис. 28). В иерархии регуляторных воздействий наиболее сложный механизм, контролирующий количество ферментов в клетке, связан с процессом транскрипции. Специфические химические сигналы могут инициировать или блокировать транскрипцию определенного участка ДНК в иРНК. В случае индукции образованная иРНК участвует в определенной последовательности реакций, называемой трансляцией и заканчивающейся синтезом полипептидных цепей. Регуляция белкового синтеза на уровне трансляции может осуществляться на любом из ее этапов, например на этапе инициации, элонгации и др. Не исключена также возможность изменения времени жизни иРНК. под воздействием разных эффекторов, в том числе конечных продуктов метаболических путей. Хотя механизмы регуляции синтеза белка на уровне трансляции еще точно не установлены, ясно, что на этом этапе имеются широкие возможности для регуляции скорости синтеза различных белков.

Известно, что фермент может выполнять метаболическую функцию после приобретения соответствующей структуры. Скорость образования структур высшего порядка также находится под контролем определенных молекул. Таким образом, контроль на уровне сборки функционально активного фермента может играть существенную роль в метаболической регуляции. Наконец, скорость разрушения фермента под воздействием специфических метаболических сигналов будет также определять его концентрацию в клетке.

Регуляция синтеза ферментов на этапе транскрипции основана на том, что "считывание" бактериальных генов происходит избирательно и скорость образования копий соответствующих иРНК (а отсюда и дальнейшая их трансляция в белки) находится под сложным контрольным механизмом. Скорость синтеза ферментов, определяемая этой стадией, может меняться в разной степени. По данному признаку все ферменты делятся на два класса. Ферменты, синтез которых в растущей клетке происходит с постоянной скоростью в результате постоянного транскрибирования соответствующих генов и, следовательно, они присутствуют в клетке в более или менее постоянной концентрации, называются конститутивными. К ним относятся, например, гликолитические ферменты. Метаболические пути, функционирующие с участием конститутивных ферментов, контролируются посредством других регуляторных воздействий, например аллостерического ингибирования.

Кроме этого в бактериальных клетках имеются ферменты, количества которых могут резко меняться в зависимости от состава питательных веществ среды. Это происходит в результате того, что гены, детерминирующие эти ферменты, включаются или выключаются по мере надобности. Их называют индуцибельными. При отсутствии в среде субстратов этих ферментов последние содержатся в клетке в следовых количествах. Если в среду добавить вещество, служащее субстратом определенного фермента, происходит быстрый синтез этого фермента в клетке, т. е. имеет место индукция синтеза фермента. Если же в питательной среде в готовом виде содержится вещество, являющееся конечным продуктом какого-либо биосинтетического пути, происходит быстрое прекращение синтеза ферментов этого пути. Это явление получило название репрессии конечным продуктом. Ферменты, синтез которых подавляется конечным продуктом, могут быть дерепрессированы, т. е. скорость их синтеза превысит обычную, если концентрация конечного продукта упадет до очень низкого уровня. Дерепрессия этих ферментов аналогична явлению индукции.

Репрессия конечным продуктом. Все биосинтетические пути находятся под контролем механизма репрессии конечным продуктом. Точно так же образование большинства анаболических ферментов регулируется путем репрессии их синтеза. Репрессия осуществляется особыми присутствующими в клетке веществами -- репрессорами. Факторами, модифицирующими активность репрессоров, могут быть конечные продукты биосинтетических путей, а также промежуточные продукты некоторых катаболических или амфиболических путей.

Репрессия может быть координированной, т. е. синтез каждого фермента данного пути в одинаковой степени подавляется конечным продуктом. Часто синтез ферментов одного пути репрессируется в разной степени. В разветвленных биосинтетических путях механизмы репрессии могут быть модифицированы (как и механизмы ингибирования), чтобы лучше обеспечить регуляцию нескольких конечных продуктов из общего исходного субстрата. Синтез многих ферментов в таких путях репрессируется только при совместном действии всех конечных продуктов. Если реакция на общем участке разветвленного пути катализируется изоферментами, синтез каждого из них находится под контролем "своего" конечного продукта.

Механизм репрессии конечным продуктом на уровне транскрипции стал проясняться с 50-х гг. Большой вклад в это внесли работы Ф. Жакоба и Ж. Моно. Было показано, что наряду со структурными генами, кодирующими синтез ферментов, в бактериальном геноме существуют специальные регуляторные гены. Один из них -- ген-регулятор (ген R), функция которого заключается в регуляции процесса транскрипции структурного гена (или генов). Ген-регулятор кодирует синтез специфического аллостерического белка-репрессора, имеющего два центра связывания: один узнает определенную последовательность нуклеотидов на участке ДНК, называемом оператором (ген О), другой -- взаимодействует с эффектором. Ген-оператор расположен рядом со структурным геном (генами) и служит местом связывания репрессора. В отличие от операторных генов гены-регуляторы расположены на некотором расстоянии от структурных генов (продукты регулярных генов -- репрессоры являются свободно диффундирующими белковыми молекулами).

Часто структурные гены, относящиеся к одному биохимическому пути, объединены в группу, составляющую вместе с оператором единицу транскрипции и регуляции -- оперон. Все структурные гены, объединенные в оперон, имеют один операторный участок, локализованной на краю оперона, и координирование регулируются одним репрессором. Оперон представляет собой весьма рациональную и эффективную систему регуляции метаболического пути.

Индукция синтеза ферментов. В большинстве случаев регуляция путем индукции характерна для катаболических путей, где в качестве индукторов выступают обычно субстраты этих путей. Классический пример индуцибельного фермента -- (3-галактозидаза Е. coli. Оказалось, что если клетки Е. coli выращивать в среде, содержащей глюкозу, то они не могут использовать лактозу. Если такие клетки поместить в среду, где лактоза -- единственный источник углерода, после некоторого периода в них происходит интенсивный синтез фермента (3-галактозидазы, катализирующего гидролиз лактозы на D-глюкозу и D-галактозу. С помощью этого фермента Е. coli может теперь использовать лактозу в качестве единственного источника углерода. Если затем клетки, растущие на среде с лактозой, перенести на среду с глюкозой, синтез (3-галактозидазы прекращается.

Изучение индукции (3-галактозидазы у Е. coli позволило установить, что рост клеток на среде с лактозой происходит не в результате отбора мутантов, у которых способность использовать лактозу есть следствие мутации. Способностью синтезировать этот фермент обладают все клетки. Было также показано, что в процессе индукции происходит не активирование уже имеющегося в клетках фермента (З-галактозидазы, а его синтез de novo из аминокислот.

20. Характеристика химического состава белков.

Изучая химический состав белков, необходимо выяснить, во-первых, из каких химических элементов они состоят, во-вторых, - строение их мономеров. Для ответа на первый вопрос определяют количественный и качественный состав химических элементов белка. Химический анализ показал наличие во всех белках углерода (50-55%), кислорода (21-23%), азота (15-17%), водорода (6-7%), серы (0,3-2,5%). В составе отдельных белков обнаружены также фосфор, йод, железо, медь и некоторые другие макро- и микроэлементы, в различных, часто очень малых количествах. Содержание основных химических элементов в белках может различаться, за исключением азота, концентрация которого характеризуется наибольшим постоянством и в среднем составляет 16%.

Кроме того, содержание азота в других органических веществах мало. В соответствии с этим было предложено определять количество белка по входящему в его состав азоту. Зная, что 1г азота содержится в 6,25 г белка, найденное количество азота умножают коэффициент 6,25 и получают количество белка.

Для определения химической природы мономеров белка необходимо решить две задачи: разделить белок на мономеры и выяснить их химический состав.

Расщепление белка на его составные части достигается с помощью гидролиза - длительного кипячения белка с сильными минеральными кислотами (кислотный гидролиз) или основаниями (щелочной гидролиз). Наиболее часто применяется кипячение при 110 градусах Цельсия с HCl в течение 24 ч. На следующем этапе разделяют вещества, входящие в состав гидролизата. Для этой цели применяют различные методы, чаще всего - хроматографию.

Главным частью разделенных гидролизатов оказываются аминокислоты. Белки являются одними из четырех основных органических веществ живой материи (белки, нуклеиновые кислоты, углеводы, жиры), но по своему значению и биологическим функциям они занимают в ней особое место. Около 30% всех белков человеческого тела находится в мышцах, около 20% - в костях и сухожилиях и около 10% - в коже.

Но наиболее важными белками всех организмов являются ферменты, которые, холя и присутствуют в их теле и в каждой клетке тела в малом количестве, тем не менее управляют рядом существенно важных для жизни химических реакций.

21. Характеристика форм покоя у бактерий.

Хорошо известно, что при попадании в неблагоприятные условия, многие бактерии способны переходить в покоящееся состояние. Это состояние характеризуется резким снижением метаболической, активности и полным» отсутствием деления. Ранее покоящееся состояние микроорганизмов связывали только со специализированными формами (спорами и цистами), образуемыми ограниченным числом бактерий. Однако сейчас становится ясно, что многие неспорулирующие; бактерии, в том числе и патогенные микроорганизмы, в определенных условиях могут переходить в покоящееся состояние, оставаясь при этом жизнеспособными. Под. покоящимся состоянием' мы понимаем такое, обратимое состояние бактериальной клетки, при котором уровень метаболической активности значительно снижен, а клетка может существовать в таком состоянии без деления длительное время.Такие покоящиеся клетки, как правило, изменяют свою форму, утолщают клеточную стенку и становятся менее чувствительными:к агрессивным внешним воздействиям. И; хотя обычные микробиологические: методы зачастую не могут выявить микроорганизмы, находящиеся в покоящемся состоянии, такие бактерии при наступлении благоприятных условий способны продолжить рост.

До недавнего времени существование покоящегося состояния для микобактерий in vitro или in vivo не было установлено, хотя для ряда других неспорулирующих бактерий переход в покоящееся состояние экспериментально установлен.

Основные признаки анабиотического или покоящегося состояния: 1) отсутствие или предельно заторможенный метаболизм, 2) сохранение структуры в течение продолжительного времени, 3) отсутствие в жидкой фазе заметных количеств свободной воды как непрерывной среды, 4) повышенная устойчивость против экстремальных факторов неделящееся, 5) способность восстанавливать процессы жизнедеятельности.

Очевидно, что переход в покоящееся состояние может происходить под влиянием различных факторов и наряду с универсальными чертами обладать какими-то особенностями и уникальными механизмами регуляции.

Кейлин объединил под названием гипобиоз любое неактивное неделящееся состояние жизнеспособного организма. В свою очередь, гипобиоз включает гипометаболизм и аметаболизи (или латентную жизнь). Гипометаболизм характеризуется крайне низкими, но все же измеряемыми, метаболическими активностями, примером его может служить зимняя спячка животных. Аметаболизм - полное отсутствие какого-либо метаболизма, например, в спорах.

Для бактерий выделяют конститутивное (эндогенное) и экзогенное покоящиеся состояния . Специализированные покоящиеся формы микроорганизмов, такие как споры и цисты, относятся к первому состоянию. Экзогенное состояние покоя наступает под действием неблагоприятных факторов, при этом вегетативные неспорулирующие бактерии могут переходить в неактивное состояние.

22. Характеристика водорастворимых витаминов

Тиамин (витамин В,)

Рибофлавин (витамин В₂)

Пантотеновая кислота (витамин В₃)

Никотиновая кислота (витамин В₅, РР)

Пиридоксин (витамин В₆)