Технологія виробництва інтерферону

Субстанція інтерферону ?-2 виготовляється за рекомбінантною технологією переважно шляхом біосинтезу штаму Escherichia coli, у який вбудовано ген інтерферону людини. Вектором для проходження трансформації бактеріального геному є бактеріофаг, або плазміда. Процес виготовлення й очищення інтерферону в плазмідній технології складається з таких стадій: формування клітинної біомаси, її дезінтеграція; розчинення «тілець включення» шляхом денатурації білкових структур за допомогою сечовини або гуанідинхлориду; ренатурація денатурованих молекул інтерферону; очищення. З 1л культури кишкової палички отримують близько тисячі доз продукту. З використанням плазмідної технології також ампліфікують ген інтерферону в клітинах дріжджів Saccharomyces cerevisiae.

N-кінцевим амінокислотним залишком природного ІФН-?2 є цистеїн, який зв'язаний дисульфідним зв'язком із 98 цистеїном білка. Також у певної частини молекул рекомбінантних ІФН-?2, що виділяють з клітин Escherichia coli, на N-кінці залишається додатковий залишок метіоніну (формілметіоніну), що робить рекомбінантних ІФН-?2 модифікованим білком. Надлишковий N-кінцевий метіонін може впливати на стабільність та імуногенність білків, а також в більшості випадків призводить до втрати їх біологічної активності. Тому в роботі був розглянутий спосіб видалення N-кінцевого метіоніну. Фармакокінетичні характеристики рекомбінантного немодифікованого (стандартного) ІФН не дозволяє підтримувати постійним його рівень у плазмі, що частково пояснює недостатньо високий терапевтичний ефект. З огляду на це, також було розглянуто технологію виготовлення модифікованого рекомбінантного інтерферону ?-2 людини.

Для виготовлення рекомбінантного ?-1 інтерферону використовують штам дріжджів Pichia pastoris KM71.

Рекомбінантний інтерферон ?, який отримують в бактеріальній системі, являє собою неглікозильований білок, що має заміну цистеїну в положенні 16 на серин. Рекомбінантний ІФН-?-1b людини отримують в нерозчинній формі у вигляді тілець включення. У порівнянні з розчинною формою, експресія білку у вигляді тілець включення має ряд переваг - нерозчинні агрегати білку не проявляють токсичної дії, практично не атакуються протеазами, та з високим виходом виділяються центрифугуванням. Вихід готового продукту з 1 г цільового білку, отриманого при екстракції на першому етапі з тілець включення, становить 0,3 цільового білку. Чистота білку не менше 98 %.

СПИСОК ВИКОРИСТАНИХ ДЖЕРЕЛ

1. Биотехнология: Учеб. пособие для вузов. В 8 кн. / под ред. Н.С. Егорова, В.Д. Самуилова. Кн. 2 Современные методы создания промышленных штаммов микроорганизмов / В.Г. Дебабов, В.А. Лившиц. - М.: Высш. шк., 1988. - 208 с.

2. Колешко, О.И. Микробиология с основами вирусологии: учебник / О.И. Колешко, Т.В. Завезенова - Иркутск: Изд-во Иркут. ун-та, 1999. - 452 с.

3. Елинов, Н.П. Основы биотехнологии. Для студентов институтов; аспирантов и практических работников. / Н.П. Елинов. - СПБ: Изд-во «Наука», 1995. - 600 с.

4. Овчинников, Ю.А. Биоорганическая химия. / Ю.А. Овчинников. - М.: Просвещение, 1987. - 815 с.

5. Губський, Ю.І. Біологічна хімія: підручник. / Ю.І. Губський. - Київ-Тернопіль: Укрмедкнига, 2000. - 508 с.

6. Гаркава, К.Г. Біотехнологія. Вступ до фаху: навч.посіб./ К.Г. Гаркава, Л.О. Косоголова, О.В. Карпов, Л.С. Ястремська. - К.: НАУ, 2012. - 296 с.

7. Биотехнология. Принципы и применение: Пер. с англ. / под ред. И. Хиггинса, Д. Беста, Дж. Джонса. - М.: Мир, 1988. - 480 с.

8. Burmester, Gerd-Ruediger. Color Atlas of Immunology / Gerd-Ruediger Burmester, Antonio Pezzutto, Timo Ulrichs, Alexandra Aicher. - Stuttgart-New York: Thieme, 2003. - 322 p.

9. Wood, P. Understanding immunology (Second edition) / Peter Wood. - Harlow: Pearson Education Limited, 2006. - 300 p.

10. Сартакова, О.Ю. Промышленная микробиология: учебное пособие по курсу «Основы микробиологии и биотехнологии» / О.Ю. Сартакова, И.И. Ползунова. - Барнаул: Изд-во АлтГТУ, 2009. - 173 с.

11. Кулагин, В.Ф. Разработка научных основ технологии крупномасштабного производства человеческого лейкоцитарного интерферона: автореф. дисс. докт. мед. наук: 03.00.06. / Кулагин Валерий Федорович; Научно-производственное объединение «Иммунопрепарат». - Уфа, 1995. - 75 с.

12. Способ получения зрелого интерферона альфа-2 человека с использованием дрожжей Saccharomyces cerevisiae и штамм-продуцент интерферона альфа-2 человека (варианты); пат. WO 2012/128662 A1 Всемирная Организация Интеллектуальной Собственности / Корниенко Е.В.; заявитель и патентообладатель Козлов Дмитрий Георгиевич, Яковенко Андрей Романович, Тезов Владимир Адольфович

13. Мельник, А.И. Получение очищенного рекомбинантного ?2b-интерферона человека / А.И. Мельник, И.В. Орловская, Н.М. Жолобак, Н.Я. Спивак // Мікробіологічний журнал. - 2012. - Т. 74, №3. - С. 72-78

14. Method for the production of high-level soluble human recombinant interferon alpha in E. coli and vectors useful for such a production; pat. US 2009/0258394 A1 United States Patent Application Publication / inventors: Mohamad Dahmani Fathallah, Imen Rabhi-Essafi; assignee: Institut Pasteur

15. Гибридный белок, штамм бактерий Escherichia coli - продуцент гибридного белка и способ получения безметионинового интерферона ?-2b человека из этого гибридного белка [Текст]; пат. RU 2 441 072 C1 Федеральная Служба по Интеллектуальной Собственности / авторы: Козлов Д.Г., Чеперигин С.Э., Губайдуллин И.И., Яковенко А.Р., Казаров А.А.; патентообладатели: Федеральное государственное унитарное предприятие «Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов», Общество с ограниченной ответственностью «ФАРМАПАРК», Министерство образования и науки Российской Федерации

16. Гибридный белок, обладающий пролонгированным действием, на основе рекомбинантного интерферона ?-2 человека (варианты), способ его получения и штамм Saccharomyces cerevisiae для осуществления этого способа (варианты); пат. RU 2 515 913 C1 Федеральная Служба по Интеллектуальной Собственности / авторы: Козлов Д.Г., Чеперигин С.Э., Губайдуллин И.И., Ефремов Б.Д., Котлова Е.К., Рябиченко В.В., Честухина Г.Г., Яроцкий С.В.; патентообладатель: Федеральное государственное унитарное предприятие «Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов»

17. Conjugates of biologically active proteins having a modified in vivo half-life; pat. US 2009/0298762 A1 United States Patent Application Publication / inventors: Marc Besman, Stewart Chipman, David Leung, Jach Singer; assignee: Cell Therapeutics, Inc.

18. Recombinant production of polyanionic polymers and uses thereof; pat. US 2002/0169125 A1 United States Patent Application Publication / inventors: David W. Leung, Philip A. Bergman, Alan Lofquist, Gregory E. Pietz, Christopher K. Tompkins, David W. Waggoner JR.; assignee: Cell Therapeutics, Inc.

19. Recombinant production of polyanionic polymers and uses thereof; pat. AU 2002252429 A8 Australian Patent Office / inventors: David W. Waggoner JR., Gregory E. Pietz, Philip A. Bergman, Alan Lofquist, , Christopher K. Tompkins, David W. Leung; applicant: David W. Leung

20. Recombinant production of polyanionic polymers and uses thereof; pat. WO 02/077036 A2 World Intellectual Property Organization / inventors: Philip A. Bergman, Alan Lofquist, Gregory E. Pietz, Christopher K. Tompkins, David W. Waggoner JR.; applicant: David W. Leung

21. Long-acting polypeptides and methods of producing same; pat. US 2012/0015437 A1 United States Patent Application Publication / inventors: Fuad Fares, Udi Eyal Fima

22. Long-acting growth hormone and methods of producing same; pat. US 2012/0035101 A1 United States Patent Application Publication / inventors: Fuad Fares, Udi Eyal Fima

23. Long-acting veterinary polypeptides and methods of producing and administering same; pat. US 2012/0004286 A1 United States Patent Application Publication / inventors: Fuad Fares, Udi Eyal Fima

24. Long-acting interferons and derivatives thereof and methods thereof; pat. US 2011/0286967 A1 United States Patent Application Publication / inventors: Fuad Fares, Udi Eyal Fima

25. Long-acting coagulation factors and methods of producing same; pat. US 2010/0317585 A1 United States Patent Application Publication / inventors: Fuad Fares, Udi Eyal Fima

26. Long-acting growth hormone and methods of producing same; pat. US 2010/ 0081614 A1 United States Patent Application Publication / inventors: Fuad Fares, Udi Eyal Fima

27. N-terminal CTP extended pharmaceutical peptides and proteins; pat. US005759818A United States Patent / inventor: Irving Boime; assignee: Washington University

28. Glycosylated human alpha interferon muteins, method for obtaining them and use; pat. US 2012/0134960 A1 United States Patent Application Publication / inventors: Ricardo Agustin Lopez, Natalia Analia Ceaglio, Marina Etcheverrigaray, Marcos Rafael Oggero Eberhardt, Ricardo Kratje; assignees: Protech Pharma, S.A., Ricardo Agustin Lopez

29. Способ микробиологического синтеза зрелого интерферона альфа-2 человека, штамм Saccharomyces cerevisiae - продуцент зрелого интерферона альфа-2 человека (варианты); пат. RU 2 427 645 C1 Федеральная Служба по Интеллектуальной Собственности, Патентам и Товарным знакам / авторы: Козлов Д.Г., Чеперегин С.Э., Губайдуллин И.И., Ефремов Б.Д., Казаченко К.Ю., Яковенко А.Р., Казаров А.А., Котлова Е.К., Рябиченко В.В., Честухина Г.Г., Глазунов А.В., Черноморова Н.О., Акишина Р.И.; патентообладатель: Федеральное государственное унитарное предприятие «Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов»

30. Способ получения рекомбинантного альфа 1b-интерферона человека и фармацевтическая композиция для лечения вирусных заболеваний на основе рекомбинантного альфа 1b-интерферона человека; пат. RU 2 380 405 C2 Федеральная служба по интеллектуальной собственности, патентам и товарным знакам / авторы: Падкина М.В., Доброгорская М.В., Карабельский А.В., Самбук Е.В., Смирнов М.Н.; патентообладатели: Федеральное государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования Санкт-Петербургский государственный университет, Общество с ограниченной ответственностью «БИОТЕХ»

31. Штамм дрожжей Pichia pastoris - продуцент лейкоцитарного интерферона-1b человека, рекомбинантная плазмидная ДНК PHIN и способ ее конструирования; пат. RU 2 203 950 C1 Российское агенство по патентам и товарным знакам / авторы: Падкина М.В., Парфенова Л.В., Самбук Е.В., Смирнов М.Н.; патентообладатель: Общество с ограниченной ответственнотью «БИОТЕХ»

32. Промышленный способ получения и очистки рекомбинантного интерферона ?-1b человека из телец включения; пат. RU 2 473 696 C1 Федеральная служба по интеллектуальной собственности / авторы: Бобрускин А.И., Кононова Н.В., Мартьянов В.А., Шустер А.М.; патентообладатель: Закрытое акционерное общество «ГЕНЕРИУМ»

33. Способ очистки рекомбинантного интерферона ?-1b; пат. RU 2 392 282 C1 Федеральная служба по интеллектуальной собственности, патентам и товарным знакам / авторы: Воробьев И.И., Пономаренко Н.А. Мирошников А.И., Смирнов И.В.; патентообладатели: Учреждение Российской академии наук Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, Российская Федерация, от имени которой выступает Федеральное агентство по науке и инновациям

Додаток

Принципова технологічна схема виготовлення рекомбінантного інтерферону

Размещено на Allbest.ur