Технологія виробництва інтерферону

Размещено на http://www.allbest.ru/

НАЦІОНАЛЬНИЙ АВІАЦІЙНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

ІНСТИТУТ ЗАОЧНОГО ТА ДИСТАНЦІЙНОГО НАВЧАННЯ

КАФЕДРА БІОТЕХНОЛОГІЇ

КУРСОВА РОБОТА

з дисципліни «Технологія імунобілогічних препаратів»

на тему: «Технологія виробництва інтерферону»

Виконала: студентка групи БР-401з

Батуєва І.І.

6.051401 «Біотехнологія»

Київ - 2016



ВСТУП

Інтерферон є одним із сучасних засобів терапії та профілактики вірусних захворювань. Процес отримання інтерферону є не тільки дуже важливим для медицини, а й технологічно складним. Найголовнішою характеристикою отриманого препарату, крім йому властивих, є якість. Лікарські препарати повинні бути не тільки ефективні у використанні, але також і безпечні для людини, тому процес виробництва інтерферону повинен бути організований з чітким дотриманням технології..

Об'єктом дослідження даної роботи є інтерферон - біологічно активний білок, який відносять до класу цитокінів. Інтерферон продукується клітинами організму у відповідь на вірусну хворобу. Він забезпечує противірусний захист організму, володіє протизапальною, імуномоделюючою, протипухлинною, радіопротективною та антиміотичною дією. Предметом дослідження є технології виробництва інтерферонів.

Метою є огляд найпоширеніших технологій виробництва інтерферону, їх аналіз та порівняння, зіставлення рівнів продуктивності методів, їх трудомісткість.



1. Природа інтерферону

інтерферон фармакокінетичний рекомбінантний немодифікований

Інтерферони - група низькомолекулярних білків, які володіють рядом спільних біологічних властивостей, головною з яких є здатність при контакті з клітинами викликати в них стійкість до вірусних інфекцій. Їх молекулярна маса становить 22*103 - 94*103 дальтон. Інтерферон був відкритий А.Айзексом і Ж. Ліндеманом в 1957 році в клітинах курча, яке було заражене грипом.

Інтерферони хребетних і, також, людини розділяють на три групи: ?-, або лейкоцитарні, ?-, або фібробластні, та ?- , або імунні (продукуються Т-лімфоцитами). Найбільш сильним є ?-інтерферон. Ці групи інтерферонів розрізняють за структурою молекул, низкою біологічних властивостей і типом клітин, які його продукують в організмі.

Деякі характеристики інтерферонів людини наведено в таблиці 1.1.

Таблиця 1.1. Деякі характеристики інтерферонів людини

Тип інтерферона	Характеристика
	Клітинипродуценти	Індуктор	Число генів інтер-фе-рона	Локалізація в хромосомах	Наявність нітронів в генах	Стабіль-ість при рН2	Число амінокислот	Мол. маса, кДа
							В первинній молекулі	В кінцевій молекулі
?	Лейкоцити переферичної крові	Вірусна дволанцюгова РНК	14	9	-	Так	166	143	17
?	Фібробласти	____	2 (або 5)	9, 2, 5	-	Так	166	145	17
?	Лімфоцити	Мітогени та антигени	1	12	+	Ні	166	146	17

Інтерферони ? і ? є глікопротеїнами, а інтерферон ? - протеїном.

Інтерферони - клітинні білки, і тому вони є видоспецифічними, тобто кожному виду тварин властивий свій інтерферон. Але в свою чергу, інтерферони не є вірусоспецифічними. Є винятки такої специфічності: інтерферон людини захищає клітини великої рогатої худоби краще, ніж коров'ячий інтерферон [1, 2, 3].

Слід зазначити, що у кожного виду тварин є декілька ?-інтерферонів (зокрема, у людини знайдено 14 різних генів ?-інтерферонів), один або кілька ?-інтерферонів і завжди один ?-інтерферон. На рис.1.1 наявна послідовність гену ?-інтерферона людини і виведена відповідна структура білка, який містить 166 амінокислотних залишків. З послідовності нуклеотидів можна побачити, що на початковому етапі синтезується попередник інтерферону, який містить сигнальний пептид з 23 залишків амінокислот. Сигнальний пептид відщеплюється в результаті процесингу при секреції білку. Аналогічно ?- і ?-інтерферони синтезуються у вигляді попередників.

?- і ?-Інтерферони є типовими глобулярними білками (вміст ?-спіральних структур 40-75%). В ?-інтерферонах було знайдено два дисульфідні зв'язки [4].

Встановлено, що індукторами інтерферонів можуть бути: інактивовані температурою або ультрафіолетом віруси грипу, рео-, рота- та інші віруси; деякі поліаніонні речовини (бактеріальні ендотоксини, полікарбонові кислоти, кополімери пірану); синтетичні дволанцюгові полірибонуклеотиди. Відомо, що дволанцюгова РНК стимулює утворення інтерферону [3].

Гени, що кодують IFN-? та IFN-? локалізовані на 9-й хромосомі каріотипу людини, ген IFN-? -- на 12-й хромосомі [5].



Рис. 1.1 Послідовність амінокислот в ?-інтерфероні людини та нуклеотидів, що кодують білок



2. Механізм дії інтерферону

Інтерферони викликають стан несприйнятливості до широкого спектра вірусних інфекцій, що індукується у всіх клітинах, які мають рецептори до інтерферонів. Вони індукують як локальні, так і системні противірусні реакції в інших клітинах. Крім того, інтерферони володіють ще двома важливими властивостями: пригнічують поліферацію клітин (і, таким чином, потенційно є протипухлинним засобом) і модулюють імунну систему.

Інтерферони синтезуються і секретуються одними клітинами і проявляють свій ефект, діючи на інші клітини. В цьому відношенні вони подібні до гормонів [4].

Інтерферони становлять першу «лінію оборони» проти вірусів, яка діє ще до того, як імунні механізми виявляються повністю задіяні. Інтерферони не мають специфічності відносно вірусів і пригнічують репродукцію різних вірусів, чутливість яких неоднакова. Противірусна активність інтерферонів реалізується через гальмування попадання вірусної частинки в клітину, інгібування синтезу мРНК і трансляції вірусних білків, також через блокування процесів складання вірусної частинки і її виходу з інфікованої клітини. Вважається, що гальмування синтезу вірусних білків - це основний механізм противірусної дії інтерферонів.

У результаті зв'язування молекул інтерферонів зі специфічними інтерфероновими рецепторами на поверхні клітин відбувається активація групи генів, локалізованих у людини в 21-й хромосомі. Цей процес супроводжується формуванням понад 20 нових внутрішньоклітинних білків, що сприяють виникненню резистентності до вірусів і яких немає в клітинах, що не піддались впливу інтерферонів [6].

Серед цих ферментів можна виділити 2',5'-олігоаденілатсинтетази та протеїнкінази. Обидва ферменти проявляють свою активність у присутності дволанцюгових РНК, а саме такі РНК є продуктами реплікації багатьох вірусів або вони наявні у віріонах. Перший фермент синтезує 2',5'-олігоаденілати (з АТФ), які активують клітинну рибонуклеазу-1. Другий фермент фосфорилює фактор ініціації трансляції IF-2. Інтерферон також активує фосфодиестеразу, що розщеплює частину тРНК і, таким чином, попереджає подовження пептидних ланцюгів. Кінцевим результатом цих процесів є інгібування біосинтезу білка і розмноження вірусів в інфікованій клітині, а потім - її лізис. Механізм дії інтерферону показано на рис.2.1.

Рис. 2.1 Механізм дії інтерферону

Деякі віруси здатні протистояти дії інтерферонів, блокуючи синтез або гальмуючи активність індукованих інтерфероном білків. Таким чином, під впливом інтерферонів у клітині синтезується два ферменти, один із яких гальмує синтез вірусних білків, інший - розщеплює створені вірусні РНК. У результаті цього нові вірусні частинки або взагалі не формуються, або їх кількість зменшується в багато десятків або сотень разів.

Ефективність дії інтерферонів залежить під природи й функціонального стану систем, які модифікуються ними: від наявності (або відсутності) рецепторів до інтерферону на поверхні клітини, від рівня продукування внутрішньоклітинних молекул-посередників, які реалізують індукований інтерфероном каскад реакцій; оптимізація терапевтичних схем, зокрема підбір дози, шляхи введення, тривалість інтерферонотерапії та її об'єднання з іншими лікувальними діями (лікарськими препаратами) [6].



3. Виробництво інтерферону

3.1 Виробництво лейкоцитарного інтерферону

За цією технологією можна отримати 1мкг інтерферону з 1л донорської крові, що становить одну дозу [10].

Цей метод добування інтерферону є першим із запропонованих. Він базується на використанні донорської крові, і був запропонований К.Кантеллом в 1977 році. При цьому лейкоцити інкубуються разом із вірусом (наприклад, вірус Сендай або вірус хвороби Ньюкасла), а в якості компонента поживного середовища слугує сироватка крові людини або бика (іноді - казеїн молока). Далі суміш очищують за допомогою хроматографічних методів і отримують достатньо концентрований препарат інтерферону [4].

В якості клітин-продуцентів інтерферону використовують лейкоцити людини, виділені з донорської крові, лейкоцитарної або еритроцитної маси. Для індукції інтерферону використовується вірус хвороби Ньюкасла, штам «Н», у вигляді неочищеної алантоїсної рідини із вірусом [11].

Для отримання великих кількостей ІФН використовують шестиденні одношарові культури клітин курячого ембріона або культивовані лейкоцити крові людини, заражені певним видом вірусу. Іншими словами, для отримання ІФН створюють певну систему вірус-клітина [12].

Весь технологічний процес проводять в колбах, матрацах або бутелях. Регламентом не передбачено очищення інтерферону від баластних білків. Як показує практика роботи підприємств і товариств із великим об'ємом випуску препарату, діючий Регламент більш прийнятний при виготовленні інтерферону в малих кількостях.

Підприємства, які перероблюють за день від 30 до 100 л донорської крові та таку ж кількість суспензії лейкоцитів на інших етапах технологічного процесу, першими виявили недоліки отримання інтерферону в матрацах, колбах або бутелях. Цими недоліками є дуже велика трудомісткість, багатостадійність технології, великий об'єм ручної праці, відсутність можливості автоматизації окремих технологічних процесів.

При веденні в матрацах або бутелях стадії праймингу, індукції та біосинтезу інтерферону, враховуючи відсутність автоматичного контролю та підтримання температурних параметрів суспензії, призводить до отримання інтерферону з різною противірусною активністю, що в свою чергу відбивається на собівартості та рентабельності препарату.

Іншим недоліком даної технології є відсутність стадії очищення інтерферону від чужорідних антигенів (тобто, вірусного індуктора, білків алантоїсної рідини, включаючи овальбумін). Присутність чужорідних антигенів в інтерфероні для ректального використання може викликати сенсибілізацію організму до цих антигенів, особливо до овальбуміну.

Після відкриття в 80-х роках лімфотропних вірусів, в тому числі вірусу імунодефіциту людини (ВІЛ), що викликає синдром набутого імунодефіциту людини (СНІД) та можливе зараження людей через кров або препарат, виготовлений з такої крові, гостро поставило питання про введення стадії очистки і додаткових методів інактивації можливих вірусів-контамінантів в нативному ЧЛІ для назального використання.

Існуючі методи очистки інтерферону є достатньо трудомісткими і мало придатні для очистки великих об'ємів інтерферону. Так, наприклад, в технології виготовлення препарату інтерферону для ін'єкцій використовують багатоетапну процедуру осаджування білків роданідом калію з фракціонуванням в етанолі, контролюючи при цьому рН. Метод при 1000-кратній концентрації ЧЛІ дозволяє в 100 разів його очищувати з 60% виходом кінцевого продукту.

Інший відомий метод очистки інтерферону від домішок - використання імуносорбції. Інтерферон специфічно адсорбували з суміші білків на імуносорбенті, з іммобілізованими антиінтерфероновими імуноглобулінами, із подальшим елююванням. Був описаний метод очистки інтерферону шляхом його осаджування сульфатом амонію із подальшим розчиненням осаду в 2-8 М сечовині і далі гель-фільтрацією на колонці з гелем Акрилекс II-60.

Інші дослідники осаджували інтерферон трихлороцтвою кислотою і проводили хроматографію розчиненого осаду на колонці з Сефадексом G-100.

Однак, усі вказані методи дозволяють отримувати високочисті препарати інтерферону з достатньо високим виходом за противірусною активністю, але із втратами інших біологічно активних білків, які продукуються лейкоцитами на стадії біосинтезу інтерферону.

Іншим недоліком є те, що достатньо важко в промисловому масштабі проводити роботи з хроматографічним обладнанням при великому об'ємі виробництва інтерферону.

Слід також зазначити, що традиційні шляхи очищення від контамінуючих домішок, включаючи алантоїсні білки, які видаляють на стадії готового препарату, є достатньо трудомісткими, технічно складними, тривалими та недоречні для виробництва у великому масштабі [11] .

Даним способом виробляють такі препарати: Інтерферон, Інтерлок. Їх призначають для лікування вірусних захворювань, лейкозу, злоякісної меланоми, раку нирок, карциноїдного синдрому (Інтерферон), вірусних захворювань очей, гепатитів (Інтерлок).

Інтерферон-? виготовляють шляхом суперпродукції фібробластів людини стимулятором у присутності інгібіторів обмінних процесів. Препарат має противірусну, імуномодулюючу дію та протипухлинну активність. Призначається при виявленні хронічних вірусних інфекцій в офтальмології, гінекології та урології, дерматології, гематології, онкології.

При тривалому прийомі інтерферону в організмі виробляються антитіла до інтерферону, що робить його нездатним до боротьби з вірусами. Причина цих явищ криється в наявності альбуміну в препаратах на основі інтерферону.

Альбумін отримують з крові, тому існує ризик (хоч і мінімальний) зараження гепатитом та іншими хворобами, що передаються через кров [12].

3.2 Виробництво рекомбінантного інтерферону

Радикальним рішенням стало вирішення проблеми добування інтерферону використовуючи методи генної інженерії. Зокрема, гени інтерферону вдалося еспресувати в різних клітинах, наприклад, в клітинах бактерій, дріжджів та ссавців [4].

В наш час інтерферон отримують переважно з використанням генно-інженерних штамів Escherichia coli, з 1л культури кишкової палички отримують близько тисячі доз продукту [10].

3.2.1 Технологія виготовлення рекомбінантного ?-2 інтерферону

Субстанція інтерферону ?-2 виготовляється переважно шляхом біосинтезу штаму Escherichia coli, у який вбудовано ген інтерферону людини. Вектором для проходження трансформації бактеріального геному є бактеріофаг. Іноземні аналоги, як і більшість інших генно-інженерних продуктів, виготовляють за технологією, де ампліфікатором цільового гена слугують плазміди. Плазмідозалежні технології є високопродуктивними, проте мають істотний недолік: цільовий продукт утворює в клітині нерозчинні у воді кристалоподібні форми - «тільця включення».

Процес виготовлення й очищення інтерферону в плазмідній технології складається з таких стадій: формування клітинної біомаси, її дезінтеграція; розчинення «тілець включення» шляхом денатурації білкових структур за допомогою сечовини або гуанідинхлориду; ренатурація денатурованих молекул інтерферону; очищення [6].

До інтерферону ?-2 людини відносять два алельні варіанти: інтерферон ?-2b та інтерферон ?-2а, які відрізняються в області коду однією нуклеотидною заміною в позиції 137 (2a: A, 2b: G), що призводить до амінокислотної заміни (2a: Lys, 2b: Arg) [13].

Рекомбінантна плазміда рТТКм містить вставку повнорозмірного гена лейкоцитарного інтерферону ?-2b людини і ген Kan (аміноглікозид фосфотранстфераза). Синтез цільового гена регулюється триптофановим промотором. Плазміда рЕТ24 виготовлена на основі експресуючого вектора рЕТ24а ("Novagen"), транскрипція структурного гена в якому регулюється промотором lac-оперона. Рекомбінантна плазміда рЕТ24, містить ген Кan і послідовність, що кодує Т7 термінатор транскрипції.

Компетентні клітини за стандартною методикою отримують з використання CaCl2. Клітини, трансформовані відповідно рекомбінантними плазмідами рТТКм і рЕТ24, висівають газоном на чашки Петрі з агаризованим середовищем LB, яке містить необхідні антибіотики в кінцевій концентрації. Ізольовані клони-трансформанти використовують для отримання інокулята, який вирощують при температурі 30°С протягом 16-18 годин.

Штам-продуцент E.coli BLR-IFN/pET24 вирощують на поживних середовищах LB (0,5% дріжджового екстракту, Мerck, 1,5% триптонної води, Мerck, 0,5% г NaCl, Merck), TB (10% дріжджовий екстракт, Мerck, 10% пептон, Мerck, 5мМ гліцерин, Мerck, 72 мМ К2НРО4, Мerck, 17 мМ КН2РО4, Мerck) №3 (10% дріжджового екстракту, Мerck, 10% гідролізат казеїну, Мerck, 5мМ гліцерин, 1 мМ MgSO4, 90 мкМ CaCl2), амінопептид (Самсон-Мед, Росія). Синтез гена рекомбінантного ІФН ?-2b індукують різними концентраціями ізопропіл-?-D-тіогалактопіранозіду (ІПТГ) від 0,1мм до 1 мМ. Посівний матеріал у співвідношенні 1:50 вносять в свіже живильне середовище LB з відповідними антибіотиками. Ріст бактерій контролюють шляхом вимірювання оптичної щільності клітин на спектрофотометрі. В якості хімічного індуктору механізму біосинтезу рекомбінантного білка в культуральне середовище додають індуктор - ізопропіл-?-D-тіогалактопіранозід (ІПТГ) до кінцевої концентрації 1 мМ.

Ферментацію проводять при температурі 37°С. Час накопичення біомаси та цільового білка складає близько 4 годин в умовах інтенсивної аерації при перемішуванні (220 об/хв). Вивчають динаміку зростання бактеріальної культури методом вимірювання оптичної щільності відібраних аліквот протягом усього культивування через кожну годину. По закінченню процесу ферментації клітинну біомасу збирають центрифугуванням при 11000 об/хв протягом 15 хвилин.

Лізис клітин-продуцентів проводять обробкою лізоцимом і ДНК-азою у присутності іонів Mg2+. Тільця включення збирають центрифугуванням при 11000 об/хв протягом 25 хвилин.

Схеми очищення тілець включення рекомбінантного ІФН ?-2b з різних продуцентів BLIFN/pTТКм і BLR-IFN/pET24 мають відмінності. Тільця включення ?2b-IFN / рТТКм оброблюють серією відмивочних розчинів, що мають у своєму складі: детергенти (тритон Х-100, твін-20), сечовину і ізопропанол. Розчинення тілець включення проводять в розчині: 6 М гуанідин, 10 мМ дитіотреітолу, 20 мМ Тріс-НСl, рН-8,0. Для тілець включення р?2b-IFN/рЕТ24а була розроблена схема очищення відмивочними розчинами, що містять: детергент (дезоксихолат натрію), ЕДТА. Розчин для розчинення тілець включення містить 8 М сечовину, 20 мМ Тріс-НСl, рН-8,0, 10 мМ ДТТ, 1 мМ ЕДТА. Рефолдинг проводили в буфері наступного складу: 20 мМ Тріс-НСl, рН-8,0, 70 мМ NaCl, 0,1% Тритон Х-100, 0,1% твін-20, 5 мМ ДТТ.

Ренатурацію проводять на магнітній мішалці протягом 16-ти годин при температурі +40°С. Концентрований розчин тілець включення р?2b-IFN/рТТКм розводять в 50 разів буфером наступного складу: 20 мМ Тріс-НСl, рН-8,0, 70 мМ NaCl, 0,1% Тритон Х-100, 0,1% твін-20. Розчин центрифугують. В якості робочої фракції використовують надосадок. Для рефолдингу розчин р?2b-IFN/pET24 розбавляють в 50 разів в буфері наступного складу: 20 мМ Тріс-НСl, рН-8,0, 70 мМ NaCl, 0,1% Тритон Х-100, 0,1% твін-20, 5 мМ ДТТ.

Хроматографічну очистку ІФН зазвичай здійснюють в три стадії. Отриманий ренатурований ІФН на першому етапі піддають очищенню за допомогою сорбенту СМ - Тoyopearl-650M. На другій стадії хроматографічної очистки розчин ІФН наносять на сорбент ДЕАЕ - Тoyopearl-650M. Очистку мономерної форми ІФН від залишків полімерних форм ІФН проводять гель-фільтрацією на смолі типу TSK-гель «Тоyopearl» HW-55.

Антивірусну активність очищеного рекомбінантного ІФН ?-2b оцінюють за пригніченням цитопатичної дії (ЦПД) тест-вірусу - вірусу везикулярного стоматиту (ВВС, штам Індіана, Депозитарій Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України).

У 96-лункові планшети зі сформованим моношаром клітин L929 вносять послідовно два рази розведені зразки і зразки міжнародного стандарту ІФН людини. Через 24 години клітини інфікували ВВС в дозі 100 ТЦД50, залишаючи лунки для контролю вірусу (необроблені клітини, інфіковані ВВС) і для контролю клітин (необроблені клітини, неінфіковані ВВС). Планшети культивують при 37°С протягом 24 год в насиченій Н2О атмосфері з постійним рівнем СО2 (5%). Отримані результати беруть до уваги тільки за умови, якщо в контрольних лунках цитодеструктивних змін не було, а в контролі вірусу спостерігають повну деструкцію клітин.

Облік кількості живих клітин проводять після їх забарвлення кристалічним фіолетовим. Для цього з лунок видаляють надосадову рідину, а до клітин на 15 хв вносять 0,2% розчин барвника Crystal Violet в 2% етанолі. Барвник видаляють, а пофарбований моношар клітин промивали водою.

Титром ІФН вважають значення, зворотне максимальному розведенню зразка, що забезпечує захист 50% клітин від ЦПД вірусу. Титр ІФН виражали в log2(розведення)-1, кількісно біологічну активність визначають, порівнюючи активність досліджуваного розчину і міжнародного стандарту ІФН.

Використовують такі бактеріальні штами Escherichia coli: BL21 (DE3) B F- dcm ompT hsdS (rB- mB-) gal ? (DE3), і Escherichia coli BL21(DE3) CodonPlus-RIL (F- ompT hsdS (rB-mB-) dcm gal ? (DE3) endA Hte [argU ileY leuW Camr], Origami B та ін [14, 15].

З використанням плазмідної технології також ампліфікують ген інтерферону в клітинах дріжджів Saccharomyces cerevisiae. Ген ІФН ?-2b людини ампліфікують в реакції ПЛР з використанням праймерів N466 (ataccatggaaaagagatgtgatctgcctcaaacccacagcctaggtagccgt) та N467 (atctcgagtcattcttacttcttaaggattgcaagttt). Матрицею слугує ДНК плазми. Отриманий в результаті ампліфікації фрагмент ДНК розміром 510 послідовностей піддають елююванню з агарного гелю, оброблюють рестриктазами NcoI та XhoI і клонують в лабораторній плазміді. В результаті отримують нову робочу плазміду, яку розщеплюють по сайтах NcoI та XhoI. Найбільший з отриманих фрагментів ДНК, що несе векторну частину плазміди і послідовність, що кодує пре-про область ?-фактора дріжджів, злиту с послідовністю, яка кодує промоторну ділянку гена GAL1 дріжджів, яку називають фрагмент-1. Потім, використовуючи для ПЛР праймери N449 (5'-atatagatctccagtcaacactacaa) і стандартний зворотній pUC-праймер, який називають N169 (5'-gagcggataacaatttcacacagg), ампліфікують фрагмент ДНК плазміди, що містить послідовність про-ділянки ?-фактора дріжджів та злитий з ним ген інтерферону. Ампліфікований фрагмент ДНК розщеплюють за унікальними кінцевими сайтами BglII та XhoI і називають фрагментом-2. Потім, в результаті випалювання один на одного двох синтетичних олігонуклеотидів N573 (5'-gatccgaattccaa) отримують синтетичний адаптер, що називають фрагментом-3. В результаті спільного лігування трьох отриманих фрагментів ДНК отримують плазміду pUC18x-GAL1pFF-IFN2b. Також можна отримати ген лідерного поліпептиду, що мітить потрійну про-ділянку ?-фактора дріжджів S. cerevisiae.

Джерелом гену інтерферону ?-2a людини слугує плазміда pUC18x-GAL1ppI-IFN2a, яка побудована аналогічно до pUC18x-GAL1pFFF-IFN2b, тільки замість праймера N466 використовують N617 (agcctaggtagccgtcggtaccttgatgctcctggcacagatgcgtaagatctctctttt). Ампліфікований фрагмент ДНК розміром 480 послідовностей піддають елююванню з агаризованого гелю, оброблюють рестриктазами XmaJI та XhoI і клонують в плазміді pUC18x-GAL1ppI-IFN2b, яка розщеплена за тими ж ділянками. В ході побудови у складі векторів експресії pPDX3-F-2b, pPDX3-FF-2b або pPDX-FFF-2b ген інтерферону ?-2b людини заміщують на ген інтерферона ?-2a людини. Для цього зі складу вектора pPDX3-F-2b, pPDX3-FF-2b або pPDX-FFF-2b вищеплюють унікальний NcoI/XhoI фрагмент ДНК, який включає ген інтерферону ?-2b людини, а векторний залишок лігують з NcoI/XhoI фрагментом ДНК плазміди pUC18x-GAL1ppI-IFN2a, що кодує ген інтерферону ?-2a людини. В результаті отримують вектори експресії pPDX3-F-2a або pPDX3-FF-2a або pPDX3-FFF-2a, відповідно.

Отримані вектори експресії несуть у своєму складі ген зрілого інтерферону ?-2a людини, який злитий із послідовностями лідерних поліпептидів, що містить у своєму складі одинарну, подвоєну чи потроєну про-ділянки ?-фактору дріжджів, відповідно.

Для аналізу рівня секреції інтерферону ?-2a людини клітини отриманих штамів SCR-F-2b, SCR-2b-FF, SCR-2b-FFF, SCR-2a-F, SCR-2a-FF та SCR-2a-FFF культивують на середовищі YPD наступного складу (в мас.%): пептон-2, дріжджовий екстракт-1, глюкоза-2, агар-2, вода-інше, протягом 44 годин при 28°С на роторній качалці зі швидкістю 250 об./хв. Накопичення інтерферону в культуральній рідині аналізують, використовуючи метод електрофорезу в ПААГ і метод аналітичної оберненофазної хроматографії.

Результати аналізу (рис.3.2.1.1) показують, що штами SCR-2b-FF і SCR-2a-FF, секреція інтерферону ?-2 в яких направляється новими лідерними поліпептидами, що містять у своєму складі подвоєну про-ділянку ?-фактора дріжджів, а також штами SCR-2b-FFF і SCR-2a-FFF, секреція інтерферону ?-2 в яких направляється новими лідерними поліпептидами, що несуть у своєму складі потроєну про-ділянку ?-фактора дріжджів, перевершують за продуктивністю штами SCR-2b-F і SCR-2a-F, що являються аналогами штамів-прототипів, секреція інтерферону ?-2 в яких направляється стандартною пре-про ділянкою ?-фактора дріжджів, в 1.3 та 1.2 рази відповідно.

Рис.3.2.1.1 Результати аналізу рівня секреції інтерферону ?-2 людини

У процесі ренатурації молекул інтерферону може спостерігається утворення некоректних внутрішньо- та міжмолекулярних зв'язків. Це спричинює часткове утворення неправильних мономерних форм рекомбінантного інтерферону, конформація яких відрізняється від такої у природному інтерферону, а також виникнення його олігомерних структур, яких не має у природному інтерфероні [6].

N-кінцевим амінокислотним залишком природного ІФН-?2 є цистеїн, який зв'язаний дисульфідним зв'язком із 98 цистеїном білка. Також у певної частини молекул рекомбінантних ІФН-?2, що виділяють з клітин Escherichia coli, на N-кінці залишається додатковий залишок метіоніну (формілметіоніну), що робить рекомбінантних ІФН-?2 модифікованим білком.

Надлишковий N-кінцевий метіонін може впливати на стабільність та імуногенність білків, а також в більшості випадків призводить до втрати їх біологічної активності. У зв'язку з тим, що з 2005 року Європейська Фармакопея обмежила виробництво та використання на території європейських країн препаратів, що містять модифікований ІФН-?2, проблема видалення N-кінцевого зі складу ІФН-?2 бактеріального походження набула великого значення.

До різновидів ферментативних способів видалення N-кінцевого метіоніну зі складу рекомбінантних білків відносять:

Видалення метіоніну з використанням метіонін амінопептидази;

Способи, засновані на біосинтезі подовженого білка, між N-кінцевим метіоніном та зрілою частиною якого введена коротка послідовність сайту впізнавання якої-небудь протеїнази. Наступна протеїназна обробка подовженого білка призводить до видалення введеної послідовності разом з N-кінцевим метіоніном.

Основний метод оснований на біосинтезі в клітинах E. coli попередника безметіонінового ІФН-?2, що містить у своєму складі послідовність зрілого інтерферону, злитого з послідовністю дріжджового білка SUMO (Small Ubiquitine-like protein Modifier), який відносять до родини убіквітин-подібних білків (УПБ).

Будують ген, що кодує гібридний білок SUMO-2b - попередник безметіонінового ІФН ?-2b, складовою частиною якого є послідовність безметіонінового інтерферону ?-2b людини, злита з послідовністю білка SUMO дріжджів Saccharomyces cerevisiae.

Штам бактерій E. coli для біосинтезу виготовляють з Escherichia coli BL21 (DE3). Штами культивують у відповідному поживному середовищі, що включає джерела Карбону, Нітрогену та мінеральні солі, що зазвичай використовують для вирощування клітин E. coli при температурі від 24 до 37°С. При досягненні ранньої логарифмічної стадії фази росту культури в середовище культивування вносять індуктор ІПТГ в концентрації від 0,1 до 2 мМ або лактозу в концентрації від 0,5 до 3%. Через 0,5-10 годин росту клітини штамів-продуцентів накопичують цільовий білок SUMO-2b у вигляді нерозчинних тілець включення в кількості від 5 до 30% від сумарного білка клітин. Нерозчинні тільця включення виділяють та очищують, а гібридний білок SUMO-2b піддають розчиненню.

Після біосинтезу білка SUMO-2b, проводять ферментативне вищеплення цільового білку шляхом обробки протеїназою з родини ULP в умовах, що сприяють формуванню в інтерфероні правильно замкнутих дисульфідних зв'язків.

Очищений безметіоніновий інтерферон ?-2b людини має наступні характеристики: чистота не нижче 96%, послідовність перших п'яти N-кінцевих амінокислот ідентична послідовності нативного безметіонінового ІФН-?2 людини, специфічна активність складає 2,0?108 МЕ/мг [16].

Фармакокінетичні характеристики рекомбінантного немодифікованого (стандартного) ІФН не дозволяє підтримувати постійним його рівень у плазмі, що частково пояснює недостатньо високий терапевтичний ефект.

Більшість відомих модифікацій направлено на збільшення фізичних розмірів (гідродинамічного об'єму) або заряду (від'ємного) молекул лікувальних білків, яке втілюють з метою уповільнення процесу їх фільтрації з плазми крові через пори ниркових канальців.

Хімічна модифікація ІФН за допомогою поліетиленгліколей (ПЕГ) дозволила отримати молекули ПЕГ-ІФН, для яких характерний довший час перебування в плазмі крові і покращений фармакокінетичний профіль.

Для отримання пролонгованих похідних ІФН також використовують наступні способи його біомодифікації:

генетична гібридизація ІФН з довгоживучими білками крові людини, наприклад, альбумін сироватки або фрагмент імуноглобуліну, або фрагмент антитіла, що забезпечує нековалентне зв'язування з альбуміном сироватки крові людини безпосередньо в кровообігу (Albainterferon-alfa-2b);

генетична гібридизація ІФН зі штучними поліпептидами, в яких наявні сайти N-глікозилування і переважають повтори із залишків гліцину, аспарагінової кислоти і глютамінової кислоти [18];

генетична гібридизація ІФН з поліаніонним поліпептидом із залишків глютамінової кислоти (84 і 173 залишку) в клітинах E. coli. Білок не секретується і потребує довгої та трудомісткої очистки як від інших внутрішньоклітинних білків, так і від клітинних ендотоксинів [19-21];

генетична гібридизація ІФН з С-кінцевим пептидом (СТР) ?-субодиниці хоріонічного гонадотропіну людини, що містить 28 амінокислотних залишків, які формують чотири сайти О-глікозилування. Одна чи кілька копій СТР, які приєднуються до С-кінця молекули, суттєво подовжують тривалість життя терапевтичних білків в плазмі крові. Використання СТР-технології обмежено необхідністю отримувати модифіковані білки виключно в клітинах тварин, що забезпечує коректне О-глікозилювання [22-28];

генетична зміна природної послідовності ІФН з метою конструювання сайтів N-глікозилювання. Модифікований таким чином ІФН, що продукується в культурі клітин СНО, містить чотири або п'ять N-вуглеводневих ланцюгів і володіє в 25 разів збільшеним часом життя в кровообігу. Для нього характерне збільшення протипухлинної активності, але зниження специфічної противірусної активності in vitro [29].

генетична гібридизація (кон'югація) ІФН з високорозчинними, хімічно та імунологічно інертними неструктурованими поліпептидами (НП), що здатні в фізіологічних умовах імітувати поведінку молекул ПЕГ. Такі НП у водних розчинах при фізіологічно сольових, температурних та буферних умовах стійкі до фолдингу (формування третинної структури), агрегації, неспецифічної адсорбції і підтримують стабільне положення типу «клубок». До таких НП відносять: XTEN-поліпептиди (вміщують випадкові чергування 6 амінокислотних залишків аланіну, глютамінової кислоти, гліцину, проліну, серину і треоніну), PAS-поліпептиди (вміщують залишки проліну, аланіну і серину), HAP, або ОЯ8-поліпептиди (мають багато залишків гліцину).

Для отримання гібридного ІФН використовують штами E. coli або Saccharomyces cerevisiae ВКПМ Y-3927 і Saccharomyces cerevisiae ВКПМ Y-3928.

Для посіву в ферментері отримують посівну культуру шляхом культивування штама-продуцента цільового гібридного білку в середовищі наступного складу, в мас.%: пептон 1-3, дріжджовий екстракт 0,5-3, глюкоза 1-3, вода-залишок, рН середовища-природній на протязі 16-40 годин при температурі 22-32°С на орбітальній качалці 100-350 об./хв.

Посівною культурою засівають ферментер (0,5-1000 л), який містить ферментаційне середовище наступного складу, в мас.%: пептон 1-3, дріжджовий екстракт 0,5-3, глюкоза або сахароза1-4, вода-залишок, рН середовища-природній. Кількість посівної культури, яку вносять в ферментер, становить 3-15% від об'єму ферментаційного середовища.

Ферментацію проводять при 22-32°С, аерації 0,5-1000 л/хв і швидкості перемішування культури 100-1500 об./хв. Через 16-30 год після посіву в ферментер процес проводять без підживлення або починають підживлювати 30-60% розчином глюкози або сахарози зі швидкістю 2-10 г/л/год і утримують рН в діапазоні 5,0-7,2. Загальна тривалість ферментації складає 38-68 год.

Продукція цільового гібридного білку в таких умовах складає не менше 0,12 г/л [17].

Очистка проводиться так само, як і для не гібридного ІФН ?-2b:

1. Культуральну рідину, що містить цільовий білок, відділяють від біомаси дріжджів за допомогою центрифугування при 8500g на протязі 10 хвилин;

2. Отриманий центрифугат культуральної рідини очищують від клітинних обломків за допомогою мікрофільтрації на мембранному касетному модулі з поліпропілену із номінальним відсіканням 0,2 мкм і номінальною площею фільтрації 0,1 м2 ;

3. Захват ІФН із отриманого мікрофільтрату проводять, використовуючи катіонобмінну хроматографію на носії SP-Sepharose Fast Flow (GE Healthcare). Для цього триманий фільтрат підкислюють оцтовою кислотою до значення рН 4,4-4,5. Підкислений фільтрат пропускають через колонку з SP-Сефарозой, збалансований 40 мМ буферним розчином ацетату амонію, рН 4,5, що містить 0,05% Tween 80 (буфер А). Після проходження фільтрату через колонку і наступної промивки колонки розчином 0,12 M NaCl в буфері А, ІФН піддають елююванню розчином 0,4 M NaCl в буфері А;

4. Проводять тонку очистку ІФН з отриманого елюату з використанням препаративної оберненофазної високоефективної рідинної хроматографії.

Характеристики ефективності етапів виділення і очистки інтерферону ?-2b з культуральної рідини наведено в таблиці 3.2.1.1 [30].

Характеристики ефективності етапів виділення і очистки гібридного ?-2b з культуральної рідини наведено в таблиці 3.2.1.2 [17].

Таблиця 3.2.1.1. Результати етапів очистки ІФН ?-2b з культуральної рідини штама-продуцента Saccharomyces cerevisiae ВКПМ Y-3493 [30]

Етап	Опис етапу	Метод очистки	Ефективність етапу (%)	Вихід ІФН ?-2b (%)
0	Культуральна рідина	-	-	-
1	Відділення біомаси	Центрифугування	100	100
2	Очистка від обломків клітин	Мікрофільтрація	82	82
3	Захват	Катіонобмінна хроматографія на SP-сефарозі	91	75
4	Тонка очистка	Хроматографія в оберненій фазі С 18	74	55
5	Концентрування	Катіонобмінна хроматографія на CM-сефарозі	90	50



Таблиця 3.2.1.2 Результати етапів очистки гібридного ІФН ?-2b з культуральної рідини штама-продуцента Saccharomyces cerevisiae ВКПМ Y-3493

Етап	Опис етапу	Метод очистки	Ефективність етапу (%)	Вихід GFNa-80(%)
0	Культуральна рідина	-	-	100
1	Відділення біомаси	Центрифугування	90	90
2	Захват	Катіонобмінна хроматографія на SP-сефарозі	80	72
3	Тонка очистка	Хроматографія в оберненій фазі С 18	75	54
4	Концентрування	Катіонобмінна хроматографія на CM-сефарозі	76	41

В результаті отримують не менше 0,05г цільового гібридного білку з 1 л культуральної рідини.

Принципова технологічна схема виготовлення рекомбінантного інтерферону наведена в Додатку А [17].

На відміну від плазмідної технології добування інтерферону ґрунтується на використанні як ампліфікатора цільового гену (гену інтерферону) бактеріофагу, у геном якого генно-інженерним методом вбудований ген інтерферону. Бактеріофаг (вірус бактерій), уражаючи бактеріальну клітину, розмножується в ній, копіюючи багаторазово свою ДНК, і вбудований в неї ген інтерферону, синтезує свої білки, у тому числі й інтерферон. На певній стадії розвитку бактеріофаг лізує бактеріальну клітину. Інтерферон виходить у культуральну рідину, причому у водорозчинному стані, не утворюючи нерозчинних форм. Синтез організований таким чином, що інтерферон нагромаджується поза клітиною, у культуральному середовищі, тому не утворює «тілець включення», як це відбувається за плазмідною технологією добування інтерферону. Нагромадження інтерферону в культуральній рідині дозволяє очищати його за спрощеною схемою: не відбувається формування біомаси, її дезінтеграція, денатурація білків для розчинення «тілець включення» та ренатурація молекул інтерферону. Відсутність стадії концентрування клітин (формування біомаси), а, отже, й клітинних бімсів, дозволяє добувати високоочищений препарат інтерферону менш складним методом, ніж той, який використовують для очищення аналогів [6].

Очищення проводять іонообмінною хроматографією. Чистоту білка контролюють методом електрофорезу в панакриламідному гелі, що та відповідає рекомендаціям ВООЗ: в очищеному препараті міститься не менш як 95 % білка інтерферону [6].

Рекомбінантні інтерферони ?-2 використовують для терапії вірусних та пухлинних захворювань, включаючи лікування твердих пухлин, таких як рак сечового міхура, рак нирки, ВІЛ-індукована саркома Капоши та ін. Інтерферон має також знеболювальну дію. Також дані інтерферони є основними терапевтичними засобами, які використовують для лікування хронічних форм гепатитів B та C [13, 16].

Відомі такі фармацевтичні препарати, що містять в якості діючої речовини ?-2 інтерферон: «Роферон» (Hoffman-La Roche AG, Швейцарія), «Інтрон-А» (Schering-Plough, США), «Реальдирон» (Biotechna, Литва), «Реаферон» («Вектор-Медика», Росія), «Інтераль» (НДІ ОЧБ, Росія). Препарати «Реаферон», «Інтераль» і «Інтрон-А» містять в якості стабілізатора альбумін людини, що вимагає додаткової перевірки лікарських форм на відсутність вірусів гепатиту В, С та ВІЛ. Препарат «Інтрон-А» додатково містить в якості стабілізуючого агенту гліцин [31].

3.2.2 Технологія виготовлення рекомбінантного ?-1 інтерферону

Для виготовлення рекомбінантного ?-1 інтерферону використовують штам дріжджів Pichia pastoris KM71 [31].

Для отримання штаму дріжджів Pichia pastoris - продуцента ?-1 інтерферону людини, клітини дріжджів штаму PS99 трансформують плазмідою pHIN.

Клітини дріжджів вирощують в 100 мл середовища YEPD при 30°С до набуття культурою оптичної густини, відповідній 2-4 од. поглинання при довжині хвилі 600 нм. Клітини двічі промивають стерильною водою, після чого суспендують в 0,3 мл 100мМ розчину ацетату літію та інкубують при 30°С на протязі 30 хв. До 50 мкл отриманої суспензії клітин додають 0,1-1 мкг плазмідної ДНК, 50 мкг ДНК сперми лосося, спершу денатурованої нагріванням (10 хв при 100°С) і 0,3 мл розчину 100 мМ ацетату літію, що містить 40% ПЕГ 4000. Далі пробу інкубують 30 хв при 30°С і 20 хв при 42°С, занурюють на 15 с в крижану баню і центрифугують 10 с при 10000 об./хв. Клітини суспендують в 1 мл стерильної води та висівають на тверде середовище SC. Клони трансформантів виростають через 2-3 доби. Вирощені клони пересівають на чашки із середовищем SC, що містить 2% глюкозу, окремими колоніями, потім відбивають на середовище ММ (1,34% Yeast Nitrogen Base (“Difco”, USA), 0,5% метанолу, 2% агару (“Difco”, USA) для відбору трансформантів, не зростаючих на середовищі з метанолом, що свідчить про інтеграцію чужорідного гену в локус АОХІ (фенотип Met-) [32].

По закінченню процесу культивування видаляють клітини дріжджів за допомогою центрифугування при 6-7 тис. об./хв на протязі 15 хвилин, при +4°С. Всі наступні дії здійснюють при температурі +4°С. Надосадову рідину пропускають через нітроцелюлозний фільтр з діаметром пор 0,45 мкм (Millpore Inc.).

Отриманий таким чином фільтрат концентрують на ультрафільтраційній установці УПЛ-0,6 із використанням мембрани АР-0,2-15ПА (НПК «Біотест»), яка відсікає сполуки із молекулярною масою менше 15 кДа, на цій стадії відбувається видалення низькомолекулярних компонентів середовища і зменшення вихідного об'єму до 100-200 мл.

Далі проводять сольове осадження цільового білку, доводячи насичення сульфату амонію до 60%. Осад цільового білку збирають центрифугуванням при 12-14 тис. об./хв на протязі 20 хвиин. Отриманий осад розчиняють в 50 мМ амоній-ацетатному буфері (рН 5,5), що містить 2 мМ ЕДТА, 0,05% Твін-20, і наносять на колонку, яка містить 1000 мл Сефакрилу HR 100, збалансованого таким самим буфером. Перші 350 мл відкидали, фракції, що містять цільовий білок, об'єднують.

Отриманий таким чином елюат титрують 10% аміаком до рН 7,0 і наносять на колонку, що містить 50 мл ДЕАЕ-целюлозу, збалансовану 50 мМ амоній-ацетатним буфером (рН 7,0), який містить 2 мМ ЕДТА, 0,05% Твін-20. Відмивають колонку послідовно 100 мл збалансовуючим буфером і 100 мл збалансовуючим буфером, який містить 0,1 М хлориду натрію. Елюювання проводять градієнтом концентрації хлористого натрію від 0,1 М до 1,0 М в 50 мМ амоній-ацетатному буфері (рН 5,5), який містить 2 мМ ЕДТА, 0,05% Твін-20.

Електрофорез в редукуючих умовах показує, що молекулярна маса отриманого білку становить приблизно 20 кДа. За даною схемою очистки можна отримати препарат інтерферону ?-1b, з вмістом домішок не більше 5%. Питома активність становить 0,3-1,0?108 МЕ/мг. Активність препарату змінюється в залежності від терапевтичної форми та композиції (табл. 3.2.2.1) Середній вихід з 1л культури становить 7-9 мг [31].

Таблиця 3.2.2.1. Вплив складу препарату на активність ?-1b інтерферону [31]

pH	ЕДТА, мг/мл	Твін-20, мг/мл	Вихідна активність препарату, МЕ/мл	Активність препарату через 6 міс. зберігання при +4°С, МЕ/мл	Збереження активності, %
Рідка форма
5,5	0,5	0,5	(11,0±0,8)?106	(9,5±0,6)?106	86,3
5,5	0,5	2,5	(10,8±0,8)?106	(9,1±0,8)?106	84,2
5,5	0,5	5,0	(10,6±0,8)?106	(8,9±0,7)?106	84,0
5,5	0,8	0,5	(11,1±0,8)?106	(10,7±0,8)?106	96,4
5,5	0,8	2,5	(10,4±0,8)?106	(9,9±0,8)?106	95,1
5,5	0,8	5,0	(10,8±0,8)?106	(10,3±0,8)?106	95,2
5,5	1,5	0,5	(11,3±0,8)?106	(10,7±0,7)?106	95,1
5,5	1,5	2,5	(10,6±0,8)?106	(10,0±0,8)?106	94,0
5,5	1,5	5,0	(10,5±0,8)?106	(9,8±0,7)?106	93,6
6,7	0,8	0,5	(11,0±0,8)?106	(9,8±0,6)?105	89,1
7,8	0,8	0,5	(10,7±0,8)?106	(8,3±0,6)?105	77,5
Суха ліофілізована форма
5,5	0,8	0,5	(9,8±0,9)?106	(9,3±0,7)?106	95,1
6,7	0,8	0,5	(10,3±0,6)?106	(8,6±0,8)?106	83,6
7,8	0,8	0,5	(9,9±0,6)?106	(7,7±0,9)?106	77,8

3.2.3 Технологія виробництва рекомбінантного ?-1 інтерферону

Інтерферон ? людини або фібробластний інтерферон секретується, в основному, фібробластами і є глікопротеїном із молекулярною масою 20 кДа. Його структура позначається як ІФН- ?-1а. Пептидна частина ІФН- ?-1а представлена 166 амінокислотними залишками. Молекула містить вільну сульфгідрильну групу цистеїну в положенні Cys16 і один внутрішньомолекулярний дисульфідний зв'язок в положенні Cys30-Cys140.

Рекомбінантний інтерферон ?, який отримують в бактеріальній системі, являє собою неглікозильований білок, що має заміну цистеїну в положенні 16 на серин (рис.3.2.3.1). Така заміна позбавляє проблеми утворення димерів за рахунок неправильного замикання дисульфідних зв'язків. Така структура фібробластного інтерферону має назву ІФН-?-1b.

Рис. 3.2.3.1 Послідовність амінокислот в ІФН-?-1b

Створення штама-продуцента людського інтерферону ?-1b дозволило отримувати біологічно активний білок в кількості, необхідній як для проведення різноманітних структурно-функціональних досліджень, так і для використання в медичній практиці [33].

Рекомбінантний ІФН-?-1b людини отримують в нерозчинній формі у вигляді тілець включення. У порівнянні з розчинною формою, експресія білку у вигляді тілець включення має ряд переваг - нерозчинні агрегати білку не проявляють токсичної дії, практично не атакуються протеазами, та з високим виходом виділяються центрифугуванням [34].

До 150 г тілець включення рекомбінантного ІФН-?-1b людини приливають 1000 мл розчину, який містить 0,3 % трифтороцтвої кислоти (ТФО). Після цього тільця включення гомогенізують в блендері із швидкістю 800 об./хв на протязі 1 хвилини, переносять в стакан з магнітною мішалкою і залишають перемішуватися протягом 1 години при температурі 4°С. Далі отриману суспензію центрифугують при 4°С протягом 40 хвилин на швидкості 10000 об./хв. Отриманий осад переносять в блендер, заливають 1,0 л розчину 1-пропанол:вода (1:1) з додаванням 0,3% ТФО, гомогенізують зі швидкістю 800 об./хв протягом 1 хвилини, охолоджують розчин при -20°С протягом 20-30 хвилин і ставлять перемішуватися при 4°С на 1-2 години.

Отриманий екстракт центрифугують при 4°С протягом 40 хвилин на швидкості 10000 об./хв. Потім отриманий супернатант фільтрують через скловолокно і розбавляють розчином, що містить 0,3 % ТФО до концентрації 1-пропанола 20 %.

На наступному етапі екстракт білку наносять на обернено-фазову колонку DAU-100 (розмір колонки 10?10 см) (YMC Co., LTD, Japan), наповнену сорбентом GEL-Butyl C4 (YMC Co., LTD, Japan) і збалансовану розчином, який містить 0,1 % ТФО і 20 % 1-пропанол. Навантаження на сорбент може досягати 40 мл сумарного білку на 1 мл носія. Після нанесення розчину білку, колонку промивають початковим розчином ТФО і 1-пропанолу до отримання на спектрофотометрі значень, що дорівнюють значенням базової лінії при довжині хвилі 280 нм. Сорбовані білки піддають елююванню в градієнті концентрації 1-пропанолу (від 20 % до 50 %) при довжині хвилі 280 нм. Фракції, що містять цільовий білок за результатами аналізу на обернено-фазній колонці, об'єднують. З об'єднаної фракції, зібраної з обернено-фазної колонки, осаджують білок додаванням рівного об'єму буферного розчину, який містить 50 мМ Na2HPO4, і доведенням рН отриманого розчину до 6,0.

Потім суспензію білку центрифугують з використанням центрифуги за 4°С протягом 30 хвилин на швидкості 14000 об./хв. Отриманий осад розмішують в 400 мл такому самому буферному розчині і знов центрифугують за аналогічних умов.

Далі осад наносять на колонку BPG 200/500 (розмір колонки 20?30 см) (JE Healthcare, USA), заповнену гелем Sephadex G-25 Fine (JE Healthcare, USA) та збалансовують розчином 10 мМ NaOH. Елюювання проводять в ізократичному режимі при довжині хвилі 280 нм. Із фракції, зібраної з колонки, осаджують білок шляхом внесення дигідрофосфату натрію до сумарної концентрації реактиву в розчині 50 мМ і доведеням рН розчину до 6,0 і проводять центрифугування суспензії білку з використанням центрифуги при 4°С протягом 30 хвилин за швидкості 14000 об./хв.

Отриманий осад гомогенізують в буферному розчині, який містить 100 мМ NaH2PO4, pH 4,2 і прогрівають до 65°С, додають рівний об'єм заздалегідь нагрітого до 65°С 75% розчину фенола у воді. Проводять інкубацію на протязі 20 хвилин в термошейкері при 65°С. Потім реакційну суміш охолоджують до 10°С, домагаючись повного розшарування фаз, та видаляють водну фазу за допомогою водоструминного насосу.

Отриманий розчин білку в фенолі розводять в 6,5 разів 30 % етиловим спиртом, додають ТФО до 0,1 % і наносять на обернено-фазну колонку DAU-50 (розмір колонки 5?20 см) (YMC Co., LTD, Japan), заповнену сорбентом С18 (YMC Co., LTD, Japan) та збалансовану розчином, який містить 0,1 % ТФО та 20 % 1-пропанолу. Навантаження на сорбент може досягати 40 мг сумарного білку на 1 мл носія. Після нанесення розчину білку, колонку промивають початковим розчином ТФО і 1-пропанолу до показання спектрофотометром значень, рівних значенням базової лінії за довжини хвилі 280 нм. Сорбовані білки піддають елююванню в градієнті концентрації 1-пропанолу (від 20 % до 50 %) за довжини хвилі 280 нм. Фракції, що містять цільовий білок за результатами аналізу на обернено-фазній колонці С18, об'єднують.

Розчин цільового білку наносять на колонку BPG 200/500 (розмір колонки 20?30 см) (JE Healthcare, USA), заповнену гелем Sephadex G-25 Fine (JE Healthcare, USA) та збалансовану розчином 10 мМ NaOH. Елюювання проводять в ізократичному режимі за довжини хвилі 280 нм. В отриманій фракції білку визначають концентрацію за допомогою обернено-фазної хроматографії на колонці С18.

Вихід готового продукту з 1 г цільового білку, отриманого при екстракції на першому етапі з тілець включення, становить 0,3 цільового білку. Чистота білку не менше 98 %. Матеріальний баланс промислового процесу очищення ІФН-?-1b вказаний в табл. 3.2.3.1 [33].

Таблиця 3.2.3.1. Матеріальний баланс основних стадій промислового процесу очистки ІФН-?-1b [33]

Стадії очистки ІФН-?-1b	Вихід ІФН-?-1b, г	Вихід ІФН-?-1b, %	Хроматографічна чистота ІФН-?-1b, %	Вміст
				Білків E. coli нг/мгбілку	Ендотоксинів Од./мгбілку
Екстракція білку з 150 г тілець включення	5	100	60-70	>100	>250
ВЕРХ на С4, YMC	4	80	65-75	90-100	50-250
Розчинення білку в 1% лаураті натрію	4	80
Ренатурація	2,8	70
Очистка білку фенолом	2,5	50	70-75	20-60	2-5
ВЕРХ на С18, YMC	1,4	28	96-98	5-10	?1

Основним терапевтичним ефектом ІФН-?-1b противірусна та імуномоделююча активність, зниження частоти загострення розсіяного склерозу з ремітуючим протіканням на одну третину і зменшення кількості нових ділянок ураження головного мозку. Крім того, знижується частота загострень при вторинно-прогресуючому протіканні розсіяного склерозу і зменшується вираженість атрофії головного мозку. Препарати на основі ІФН- ?-1b відомі під назвами: Екставіа, Бетаферон, Авонекс та ін. [33-34].



ВИСНОВОК

Інтерферони - група низькомолекулярних білків, які володіють рядом спільних біологічних властивостей, головною з яких є здатність при контакті з клітинами викликати в них стійкість до вірусних інфекцій. Інтерферони хребетних і, також, людини розділяють на три групи: ?-, або лейкоцитарні, ?-, або фібробластні, та ?- , або імунні (продукуються Т-лімфоцитами).

Інтерферони викликають стан несприйнятливості до широкого спектра вірусних інфекцій, що індукується у всіх клітинах, які мають рецептори до інтерферонів. Вони індукують як локальні, так і системні противірусні реакції в інших клітинах. Крім того, інтерферони володіють ще двома важливими властивостями: пригнічують поліферацію клітин (і, таким чином, потенційно є протипухлинним засобом) і модулюють імунну систему.

За використання лейкоцитарної технології виготовлення інтерферону, створюють певну систему вірус-клітина крові (лейкоцити або фібробласти). При цьому лейкоцити інкубуються разом із вірусом (наприклад, вірус Сендай або вірус хвороби Ньюкасла), а в якості компонента поживного середовища слугує сироватка крові людини або бика (іноді - казеїн молока). Далі суміш очищують за допомогою хроматографічних методів і отримують достатньо концентрований препарат інтерферон. За цією технологією можна отримати 1мкг інтерферону з 1л донорської крові, що становить одну дозу. Недоліком даної технології є проблема очищення інтерферону від чужорідних антигенів (тобто, вірусного індуктора, білків алантоїсної рідини, включаючи овальбумін).