Исследование меристематическиих клеток корешков проростков Allium cepa L

Выше рассматривались основные эффекты действия излучений на клетку. Необходимо отметить, что физиологическое действие радиации на клеточном уровне изучено еще очень мало. Несомненно, что нарушения обмена веществ в клетках, мембранах и других структурных элементах клетки приводят к нарушению всего механизма регуляторных физиологических функций клетки, проявляющемуся в ее реакции на внешние условия, в прохождении фаз и стадий роста и развития клетки. Наиболее изученным радиобиологическим эффектом, как уже отмечалось, является нарушение физиологической функции митоза. Более изучено физиологическое действие излучений на уровне целого многоклеточного организма.

Прежде всего, отметим, что у растений нет каких либо органов, которые были бы избирательно чувствительны к радиации. Хотя и могут быть местные локальные радиационные нарушения тех или иных тканей или органов многоклеточного организма, однако организм реагирует на любое действие ионизирующих излучений как единое целое [34-38].

1.6 Способы облучения растений

Радиобиологические эффекты у растений, как, впрочем, и у всех живых существ, зависят не только от значения дозы, но и от способа, посредством которого эта доза сообщалась организму.

Различают следующие способы облучения:

- острое однократное облучение, когда организм получает дозу за сравнительно короткий промежуток времени. При определенной длительности облучения радиобиологический эффект не зависит от мощности дозы радиации. Такой интервал и называют «коротким», длительность его зависит от физиологического состояния организма;

- острое фракционированное облучение, при котором доза накапливается за счет нескольких, в простейшем случае двух, фракций доз. Если фракции доз равны между собой, то говорят об эквивалентном фракционировании, а в противном случае о неэквивалентном фракционировании дозы. Интервалы между последовательными фракциями доз могут быть равными между собой либо различаться. Использование разных типов фракционированного облучения оказывается очень эффективным приемом в изучении радиобиологических процессов в живом организме;

- пролонгированным облучением называют способ радиационного воздействия, при котором организм получает дозу облучения за период, существенно превышающий интервал, названный выше «коротким».

Пролонгированное облучение может быть фракционированным и нефракционированным. При фракционированном пролонгированном облучении можно варьировать значение фракции дозы, интервалов между фракциями дозы, продолжительность облучения для каждой фракции дозы.

Хроническим называют непрерывное облучение, когда мощность дозы сохраняется постоянной либо изменяется на протяжении всей жизни организмов. Такому облучению в малых дозах растения подвергаются в природной среде за счет естественных радиоактивных элементов и космического излучения.

Облучение от инкорпорированных радионуклидов обычно имеет характер пролонгированного накопления дозы.

Кроме приведенных выше характеристик условий облучения, связанных преимущественно со временем накопления дозы, различают равномерное и неравномерное, гетерогенное облучение организма.

В первом случае любая часть растения получает одинаковую дозу радиации, во втором - разные дозы. Иногда облучают только отдельные органы растения. При одной и той же дозе облучения радиобиологические эффекты могут оказаться различными, что зависит от способа облучения. В опытах с растениями не всегда достаточно полно учитывались условия облучения (это относится к опытам, главным образом, начального периода развития радиобиологии растений), поэтому результаты их подчас оказывались несопоставимыми.

Вместе с тем, прослеживая связь между способом облучения и характером радиобиологической реакции, можно получать ценную информацию о механизмах формирования радиационного синдрома у растений.

Гибель облученных растений может наступать в разное время после облучения. Поэтому выживаемость растений следует проводить в определенное время и указывать, на какой день после облучения оценивалась доля сохранившиеся растений. В случае хронического облучения эффект оценивают на определенный момент после начала облучения [35].

2. Объект, программа и методика исследований

2.1 Объект и программа исследований

Объектом исследований являются меристематические клетки корешков проростков Allium cepa L.

Программа исследований включала следующие этапы:

1. Проращивание луковиц в тестируемых растворах. Измерение длины корней, подсчет числа корней на луковице и определение морфологических изменений корней, фиксация материала для цитогенетического анализа.

2. Микроскопирование препаратов, статистическая обработка результатов, анализ влияния различных концентраций водного экстракта куколок китайского дубового шелкопряда на изменение цитогенетических параметров у Allium cepa L. в норме и после радиоактивного облучения.

2.2 Методика исследований

Биотестирование различных концентраций ВЭКШ выполняли с помощью Allium-теста [34].

Были выполнены две серии экспериментов.

Первая серия - использовали луковицы лука, хранившиеся в нормальных условиях. Цель работы - выявление оптимальных концентраций ВЭКШ на позитивный рост и развитие луковиц.

Вторая серия - использовали луковицы, предварительно подвергшиеся хроническому облучению. В исследованиях использовали луковицы лука посевного (Allium cepa L., сорт «Штуттгартен», диаметром 2,0-2,5 см). Хроническое облучение луковиц проводили на установке УОГ-1 с источником излучения цезий-137 (мощность дозы 0,339 мк Гр/с). Луковицы облучали в течение 74 суток до суммарной дозы 5,71 Гр. Предполагается, что облучение в такой дозе может подавлять рост и развитие растений лука. Проращивание выполняли спустя 1-3 суток после облучения.

Перед началом эксперимента луковицы A. cepa выдерживали при 4⁰ С для активизации и синхронизации процесса прорастания на протяжении двух недель [35]. В эксперименте на каждый вариант использовали в трех повторностях по 12 репчатых луковиц сорта «Штуттгартен», диаметром 2,0-2,5 см. Предварительно у луковиц удалили внешние чешуи и коричневую нижнюю пластинку, а затем поместили в 20-мл пробирки, наполненные дистиллированной водой. Проращивание луковиц проводили при комнатной температуре 20-25⁰ С при естественном освещении. Через 48 часов отобрали на каждую повторность по 10 наиболее развитых луковицы, и поместили их на 24 часа в тестируемые растворы ВЭКШ (таблица 1).

Для приготовления маточного водного раствора экстракта и последующих разведений использовали дистиллированную воду. Маточный водный раствор экстракта куколок китайского дубового шелкопряда получали в соответствии с авторским свидетельством СССР № 1787439А1 (Трокоз В.А., Лотош Т.Д., Абрамова А.Б. и др.). Нормирование исходного ВЭКШ проводили по сумме свободных аминокислот путем разведения до концентрации 550 мг/л. Такой экстракт использовали для приготовления 6 вариантов разведений экстракта. В качестве основного контроля использовали дистиллированную воду (к1), и дополнительного контроля - водопроводную воду (к2). Выбор дистиллированной воды обоснован в работе [36].

Таблица 1 ? Тестируемые концентрации водного экстракта

Концентрация экстракта на 100 мл воды, мл	Номер варианта опыта
10,0	о1
1,0	о2
0,1	о3
0,01	о4
0,001	о5
0,0001	о6

Воду и растворы для обеспечения аэрации меняли каждые 24 часа. Через 72 часа культивирования (от начала проращивания) выполняли фиксацию корешков в растворе Карнуа, в течение 24 часов, в холодильнике. Фиксацию корешков проводили с 8 до 9 часов [37]. Для фиксации отрезали от каждой из 10 луковиц кончики корешков длиной не более 1,0 см (игнорируя самые длинные и самые короткие корешки). Хранили материал в холодильнике до приготовления препаратов. Давленые препараты для цитогенетического анализа, окрашенные ацетогематоксилином, изготавливали по общепринятой методике [38].

Анализировали по 10-30 проростков в варианте. В каждом препарате учитывали все клетки на стадиях интерфазы, профазы, метафазы, анафазы и телофазы. Для выявления стадии митоза, на которой происходит митотический блок, подсчитывали относительную продолжительность фаз митоза. Возможность ингибирующего либо стимулирующего эффектов ВЭКШ оценивали с использованием метафазного и ана-телофазного метода учета перестроек хромосом в клетках корневых меристем лука. Патологию митоза (ПМ) подсчитывали как отношение числа клеток с нарушениями митоза к общему числу делящихся клеток [29] и классифицировали отдельно для каждого корешка по И.А. Алову с незначительной модификацией [39]. Наряду с аберрациями (мостами и фрагментами), учитывали прочие цитогенетические нарушения, не связанные с повреждениями хромосом: отставание хромосом в метафазе или при расхождении к полюсам делящихся клеток, их слипание, асимметричное расположение веретена деления. Для получения более точной оценки по критерию «патология митоза» вычисляли их частоту без учета профаз. Также подсчитывали число клеток с микроядрами, отмечая их количество в клетке и размеры. Просмотр препаратов осуществляли на микроскопе Leica Gallen III при увеличении 600. По каждому варианту было просмотрено более 20 000 клеток.

После определения оптимальных концентраций ВЭКШ (таблица 2) в первой серии экспериментов, выполнили вторую серию экспериментов с использованием облученных луковиц. Этапы и содержание работы - аналогично вышеизложенному.

Таблица 2 - Схема второй серии экспериментов

Варианты опыта с облучением	Н2О	о1 (10 мл в 100 мл Н2О)	о3 (0,1 мл в 100 мл Н2О)	о6 (0,001 мл в 100 мл Н2О)
луковицы	к	к-о1	к-о3	к-о6
луковицы облученные	I-к	I-о1	I-о3	I-о6

Статистическую обработку полученных результатов исследований проводили на персональном компьютере с помощью программ Statistica 6.0 с расчетом выборочной средней и стандартной ошибки среднего.

Для сравнения выборок по митотической активности, доли клеток на стадиях митоза и по патологиям митоза использовали t-критерий Стьюдента.

3. Результаты исследований и их обсуждение

3.1 Цитогенетические и морфометрические параметры Allium cepa L. в норме

китайский дубовый шелкопряд клетка

3.1.1 Морфометрические параметры Allium cepa L

Корневые меристемные клетки содержат определенные энзимы, выполняющие роли оксидаз, которые способствуют превращению многих немутагенных веществ в мутагенные. Эта система активации позволяет обнаружить те химические вещества, которые усиливают свой негативный эффект в процессе метаболизма. Ростовые процессы луковиц Allium cepa включают в себя большое количество клеточных метаболизмов: это деление клеток, прежде всего корневой меристемы, а на следующей фазе роста - листовой меристемы, растяжение клеток, их дифференциация и т.д. Мы исследовали влияние различных концентраций экстракта на морфологические параметры растений лука.

Параметр «число корней на луковице» характеризуется довольно значительным уровнем изменчивости, от 20 до 32 %. Среднее число корней на луковице равнялось 18-23 (рисунок 1), независимо от состава водных растворов, на которых проводили проращивание.

Рисунок 1 - Зависимость длины корней Allium cepa L. от концентрации водного экстракта куколок китайского дубового шелкопряда

При оценке средней длины корней пучка не установлено существенных различий между большинством опытных и обоими контрольными вариантами. Большая часть корней развивалась с одинаковой интенсивностью и спустя 72 часа роста их длина составила 9,0-10,1 мм.

Достоверное превышение контрольного значения в к1 (при р<0,01) отмечали в варианте о4. Коэффициент вариации составил 25-38 % в вариантах: к1, к2, о1, о3. В остальных опытных вариантах отмечали изменчивость на уровне средней величины 16-19 %. Данные результаты свидетельствуют о снижении спектра изменчивости по параметру «длина корней пучка» при обработке луковиц низкими концентрациями экстракта.

Спустя 12 суток культивирования выполняли измерение длины всех корней на луковице. При анализе данного параметра дополнительно проводили ранжирование корней по длине, и в дальнейшем также работали с массивом, который включал результаты по 10 самым длинным корням. При вычислении корреляции между параметрами «длина всех корней на луковице» и «длина 10 самых длинных корней на луковице» было установлено, что коэффициент корреляции равен 0,99, что свидетельствует о сильной корреляционной зависимости.

В период окончательной оценки наблюдали значительный рост корней в контрольном варианте 2, где проращивание проводили на водопроводной воде. Можно предположить, что луковицы начинают испытывать недостаток в макро-и микросолях при культивировании свыше 3-4 суток. В остальных опытных вариантах с применением экстракта не наблюдали достоверных различий по сравнению с контролем. Следует подчеркнуть, что дальнейшее культивирование луковиц в течении еще дополнительных 8 суток не привело в опытных вариантах к увеличению параметра «средняя длина корней». Хотя, несомненно, рост корней в длину имел место. Однако, по-видимому, существенного прироста по длине корней не наблюдали по той причине, что в этот период происходило прорастание новых корней, и это нивелировало разницу по средней длине корней.

По морфологии все корни были определены как нормальные. Отмечали только незначительное изменение цвета корней в варианте о1. Они были более интенсивно окрашены в бежевый цвет, чем в других вариантах. Практически во всех вариантах наблюдали отдельные луковицы с корнями розоватого цвета. По-видимому, эта индивидуальная реакция конкретного генотипа.

Таким образом, при исследовании различных концентраций водного экстракта куколок китайского дубового шелкопряда на развитие луковиц Allium cepa не установлено негативных воздействий на изучаемые морфологические параметры.

3.1.2 Продолжительность фаз митоза в корневой меристеме Allium cepa L

Изучение распределения клеток по стадиям митоза показало, что наибольшее их число, как в контрольных вариантах, так и в опытных, приходится на метафазу (27,2±2,9-51,0±6,8 %), доля клеток на стадиях ана- и телофазы суммарно составила 34,3±3,6-41,2±4,8 %, на стадии профазы - 11,1±2,1-35,4±4,0 % (рисунок 2).

Рисунок 2 - Относительная продолжительность фаз митоза в корневой меристеме Allium cepa под действием ВЭКШ

Расчет различных типов митотического индекса и определение долей делящихся клеток необходимы для регистрации времени прохождения клетками различных стадий митоза, в том числе выявления возможной задержки клеток на какой-либо стадии вследствие повреждения собственных структур под действием внешних или внутренних факторов любой природы.

Известно, что продолжительность разных стадий митоза в физиологических условиях неодинакова. Наиболее продолжительны стадии, связанные с процессами синтеза: профаза и телофаза. Стадии митоза, во время которых происходит движение хромосом, обычно осуществляются быстро. При сопоставлении прохождения фаз митоза в текущем эксперименте установлено, что наиболее близки к оптимальным условиям роста для меристематических клеток корней водные растворы, используемые в контроле 2 и вариантах опыта о5 и о6 (см. рисунок 2).Применение дистиллированной воды в контроле 1 изменяет темп прохождения клетками профазы в сторону ее сокращения, а метафазы - в сторону удлинения в сравнении с общепринятой нормой.

В зависимости от того, на какие синтетические процессы клеточного цикла влияют разные концентрации экстракта, происходит остановка клеточного деления на определенной стадии митоза (см. рисунок 2). Так, по сравнению с контролем 2 концентрации экстракта в вариантах опыта о1, о2, о3, о4 вызывали митотический блок на стадии метафазы, и концентрации экстракта в вариантах опыта о1, о2, о4, о5, о6 - на стадии телофазы.

3.1.3 Патология митоза

Поскольку многие соединения, индуцирующие или ингибирующие митотическую активность, часто способствуют возникновению мутаций в анализируемых тест-системах, мы исследовали способность ВЭКШ в различных концентрациях стимулировать или подавлять протекание патологических процессов в клетках корневой меристемы лука.

Установлено, что все тестируемые концентрации ВЭКШ не вызывают достоверное повышение показателя патологии митоза по сравнению с контролем 1. Причем, определение корреляционных отношений между ПМ с учетом профазы и ПМ без учета профазы выявило высокое положительное значение, равное 0,97. В сравнении с контролем 2 процент клеток с регистрируемой патологией митоза не изменяется в вариантах опыта о1, о2, о5, о6 и возрастает с 1,9±0,3 до 5,1±0,5-6,3±0,8 % в вариантах о3, о4, что фактически находится в пределах нормального значения уровня спонтанного мутирования: 2-5 % [40-45].

Данные, представленные на рисунке 3, свидетельствуют о том, что ВЭКШ в исследуемых концентрациях не оказывает существенного негативного влияния на значения ПМ. Низкое число патологий митоза в опытных вариантах позволяет предположить проявление высокой адаптивности у исследуемого объекта, возможно, в результате действия ВЭКШ.

Рисунок 3 - Патология митоза в корневой меристеме Allium cepa под действием ВЭКШ

3.1.4 Уровень и спектр патологий митоза

Спектр патологии митоза включал такие типы патологий как асимметричное расположение веретена деления, забегание и отставание хромосом в анафазе митоза, обособление единичных хромосом и группы хромосом в метафазе, мосты в анафазе и телофазе, то есть наиболее общие типы митотических нарушений. Выявлено, что в результате действия ВЭКШ при большинстве тестируемых концентраций сужается спектр различных патологий митоза по сравнению с контрольными вариантами в меристематических клетках корешков лука. Тот факт, что исходный опытный материал в контроле 1 и в контроле 2 характеризуется определенным спектром патологий митоза и показывает достаточно высокий уровень по каждому регистрируемому типу, свидетельствует об особенностях партии луковиц, которую использовали в опыте (таблица 3).

Таблица 3 ? Уровень и спектр патологий митоза в корневой меристеме Allium cepa под действием ВЭКШ

Вари- анты опыта	Асимметричное расположение веретена деления	Отставание и забегание хромосом в анафазе, обособление хромосом	Мосты	Фрагмен-тация хромосом	Микроядра
к1	39,3±4,0	52,0±5,1	5,9 ±0,4	2,8 ±0,7	0,02±0,008
к2	39,8±4,1	44,3±4,1*	6,8 ±0,7	9,1± 0,8**	0
о1	35,0±4,2	65,0±7,1*	0	0	0
о2	37,8±4,0	62,2±5,6*	0	0	0,03±0,009
о3	40,0±4,2	57,4±5,0	2,6 ±0,4*	2,0± 0,40	0,01±0,001*
о4	22,3±2,1**	77,7±8,6**	0	0	0,01±0,001*
о5	25,0±2,0*	68,8±5,9**	2,1± 0,3*	4,1± 0,4	0,03±0,009
о6	28,6±2,5*	71,4±6,8**	0	0	0
Примечание: *Р<0,05; **Р <0,01

В данном эксперименте довольно высокую долю среди патологий митоза составляет асимметричное расположение митотического веретена, как в контрольных, так и в опытных вариантах.

В контрольных вариантах и в вариантах опыта о1, о2, о3 значения данного признака колеблются от 35,0±4,2 до 40,0±4,2 %, в вариантах о4, о5, о6 отмечено достоверное снижение значений до 22,3±2,1?28,6±2,5 % (Р<0,05). Следует подчеркнуть, что деление клетки нуждается не только в событиях, которые происходят в точной временной последовательности, но и в точном их расположении в месте деления. Чтобы гарантировать, что дочерние клетки получат одинаковые наборы ДНК, место деления должно разделять пополам митотическое веретено с определенной ориентацией.

Выявлено, что меристематические клетки корешков лука в контрольных вариантах содержат мосты, которые составляют 5,9±0,4?6,8±0,7 от всех патологий митоза. Действие экстракта существенно снижает величину встречаемости мостов в клетках до 2,6±0,4 % либо 0. Хромосомные и хроматидные мосты являются обычно следствием фрагментации хромосом, что прослеживается по нашим данным (см. табл. 3). Образование мостов приводит к генотипической разнородности дочерних клеток, а также нарушает течение завершающих стадий деления и задерживает цитокинез. Тестируемые концентрации экстракта, по-видимому, нивелируют негативные процессы, имеющие место при клеточном делении.

Поступление в межклеточное пространство и меристематические клетки повышенного количества комплекса аминокислот, углеводов, микроэлементов и антиоксидантов в результате использования ВЭКШ, по-видимому, замедляет метаболические процессы в связи с перестройкой, что и индуцировало увеличение числа клеток (Р<0,05; Р<0,01) с повреждениями в области кинетохора, у которых регистрировалось отставание и забегание хромосом в анафазе, обособление хромосом.

Образование микроядер происходит вследствие фрагментации или отставания отдельных хромосом, вокруг которых в телофазе формируется ядерная оболочка, параллельно образованию оболочки вокруг основных дочерних ядер. Новообразованные микроядра либо сохраняются в клетке в течение всего дальнейшего клеточного цикла вплоть до очередного деления, либо подвергаются пикнозу, разрушаются и выводятся из клетки.

В эксперименте обнаружено незначительное число микроядер как в контроле 1, так и в ряде вариантов опыта (от 0,01±0,001 % до 0,03±0,009 %), что, однако является тревожным моментом, поскольку их присутствие служит индикатором начала патологических процессов и нестабильности генома [45].

На основании данных таблицы следует отметить, что наиболее грубые патологии митоза (мосты, фрагментация хромосом, микроядра) не были выявлены при использовании ВЭКШ в максимальной и минимальной концентрациях, соответственно, 10 мл и 0,0001 мл ВЭКШ на 100 мл воды.

3.2 Цитогенетические и морфометрические параметры Allium cepa L. после радиоактивного облучения

3.2.1 Морфометрические параметры Allium cepa L

Ростовые процессы луковиц Allium cepa включают в себя большое количество клеточных метаболизмов: это деление клеток, прежде всего корневой меристемы, а на следующей фазе роста - листовой меристемы, растяжение клеток, их дифференциация и т.д.

В ходе работы исследовали влияние различных концентраций экстракта на морфологические параметры растений лука и влияние облучения на цитогенетические и морфометрические параметры лука. Доза облучения луковиц равнялась 5,71 Гр.

Параметр «число корней на луковице» характеризуется довольно значительным уровнем изменчивости, от 20 до 32 %. Среднее число корней на луковице равнялось 17-24, которое существенно зависит от состава водных растворов, на которых проводили проращивание (рисунок 4).



Рисунок 4 - Зависимость длины корней Allium cepa L. от концентрации водного экстракта куколок китайского дубового шелкопряда и влияния радиоактивного облучения

При оценке средней длины корней пучка наблюдаются некоторые различия между опытными и обоими контрольными вариантами. Корни развивались не совсем одинаково и спустя 72 часа роста их длина составила 9,0-14,0 мм.

Достоверное уменьшение контрольного значения к-к (при р<0,01) отмечали в варианте I-к. Также уменьшение показателей наблюдали в вариантах опыта I-о1, I-о3 и I-о6, по сравнению с вариантами к-о1, к-о3 и к-о6 соответственно.

Коэффициент вариации составил 32-51 % в вариантах к-к, к-о1, к-о3, I-о3, I-о6, в вариантах опыта I-к, к-о6, I-о1 коэффициент вариации увеличивается и составляет 62-67 %.

Спустя 12 суток культивирования выполняли измерение длины всех корней на луковице. При анализе данного параметра дополнительно проводили ранжирование корней по длине, и в дальнейшем также работали с массивом, который включал результаты по 10 самым длинным корням. При вычислении корреляции между параметрами «длина всех корней на луковице» и «длина 10 самых длинных корней на луковице» было установлено, что коэффициент корреляции равен 0,91, что свидетельствует о сильной корреляционной зависимости.

В период окончательной оценки наблюдали значительный рост корней в контрольном варианте к-к, где проращивание проводили на дистиллированной воде (см. рисунок 4).

Можно предположить, что луковицы начинают испытывать недостаток в макро- и микросолях при культивировании свыше 3-4 суток. Достоверное превышение контрольного значения I-к (при р<0,01) отмечали в варианте опыта I-о3. Дальнейшее культивирование луковиц в течение еще дополнительных 8 суток не привело в опытных вариантах к увеличению параметра «средняя длина корней».

В большинстве вариантов по морфологии были определены как нормальные, но в некоторых вариантах наблюдалось незначительное количество коротких, слаборазвитых корней (к-о3, I-о1, I-о6). Отмечали незначительное изменение цвета корней в варианте опыта I-к. Корни были окрашены в бежево-коричневый цвет, по сравнению с остальными корнями.

Таким образом, при исследовании различных концентраций водного экстракта куколок китайского дубового шелкопряда на развитие луковиц Allium cepa не установлено негативных воздействий на изучаемые морфологические параметры.

Луковицы, которые ранее были облучены, имеют более низкие показатели длины корней, что наблюдается во всех опытных вариантах, по сравнению с луковицами, находящимися в норме.

3.2.2 Митотический индекс

Анализ данных микроскопического исследования выявил, что при всех тестируемых концентрациях экстракта встречаются видимые изменения в размерах и морфологии меристематических клеток лука. При воздействии на корешки экстракта определяли единичные клетки большого размера и до 1 % интерфазных фрагментированных клеток. Последние были представлены в виде клеток, не содержащих генетический материал, т.е. это какая-то часть цитоплазмы в межклеточном пространстве, либо это отдельные компоненты цитоплазмы с обособленной частью материала ДНК. По-нашему мнению, химические соединения фрагментов клеток могут включаться в различные метаболические пути и тем самым выполнять позитивную роль, но фрагменты могут и чисто механически мешать дальнейшему делению близлежащих клеток.

Для многоклеточных организмов любое нарушение митотической активности клеток является потенциально опасным, поскольку может приводить к серьезным отклонениям от нормального роста и развития. Мы изучали способность экстракта влиять на пролиферирующую активность клеток корневой меристемы лука, используя показатели «митотический индекс» и «метафазно-профазный индекс». Результаты исследований суммированы на рисунке 5.

Рисунок 5 - Митотический индекс (МИ)

Из представленных данных видно, что средние значения МИ варьировали в опытных вариантах от 4,2±0,54 % до 7,7±0,82 % против 1,8±0,38 % в контроле I-к и 10±1,8 % в контроле к-к. Не установлено прямой зависимости между изменением величины МИ от уменьшения концентрации экстракта.

Во всех исследуемых опытных вариантах отмечали существенное снижение значения митотического индекса по сравнению с контролем к-к, когда использовали дистиллированную воду. С уменьшением концентрации экстракта у облученных луковиц митотический индекс уменьшается. На основе полученных данных также определяли изменчивость цитологических параметров (МИ, МПИ) для каждой исследуемой выборки.

Коэффициент корреляции между МИ с учетом профаз имеет значение равное 0,91. Существенно возрастает МПИ в варианте опыта к-о3, по сравнению с контролем к-к. В остальных вариантах МПИ практически не изменяется.

Таким образом, митотическая активность с учетом и без учета профаз в облученных луковицах, проращиваемых в растворах с экстрактом существенно возрастает в 3-4 раза по сравнению с контролем I-к.

3.2.3 Продолжительность фаз митоза в корневой меристеме Allium cepa L

Изучение распределения клеток по стадиям митоза показало, что наибольшее их число, как в контрольных вариантах, так и в опытных, приходится на профазу (41,6±3,8-61,8±4,0 %), доля клеток на стадиях ана- и телофазы суммарно составила 9,4±3,5-16,4±4,5 %, на стадии метафазы - 14,2±2,4-30,3±3,7 % (рисунок 6).

Рисунок 6 - Относительная продолжительность фаз митоза в корневой меристеме Allium cepa под действием ВЭКШ и радиоактивного облучения

Расчет различных типов митотического индекса и определение долей делящихся клеток необходимы для регистрации времени прохождения клетками различных стадий митоза, в том числе выявления возможной задержки клеток на какой-либо стадии вследствие повреждения собственных структур под действием внешних или внутренних факторов любой природы.

Известно, что продолжительность разных стадий митоза в физиологических условиях неодинакова. Наиболее продолжительны стадии, связанные с процессами синтеза: профаза и телофаза. Стадии митоза, во время которых происходит движение хромосом, обычно осуществляются быстро.

При сопоставлении прохождения фаз митоза в текущем эксперименте установлено, что наиболее близки к оптимальным условиям роста для меристематических клеток корней водные растворы, используемые в варианте и вариантах опыта к-к, к-о1, к-о3 (см. рисунок 6).

В зависимости от того, на какие синтетические процессы клеточного цикла влияют разные концентрации экстракта, происходит остановка клеточного деления на определенной стадии митоза.

Наибольшее количество клеток на стадии метафазы наблюдается в вариантах опыта к-о6, I-о3, I-о6, на стадии телофазы в вариантах опыта к-о3, I-к, I-о3 и наибольшее количество клеток на стадии анафазы наблюдалось в вариантах к-о6, I-к, I-о1.

Контроль к-к имеет более высокие значения стадий митоза, чем контрольный вариант I-к, луковицы которого были подвержены облучению радиацией.

В вариантах опытов I-o1, I-o3, I-o6 число клеток в стадии профазы уменьшается, по сравнению с вариантами к-o1, к-o3, к-o6 соответственно.

Таким образом, наличие экстракта в растворах независимо от концентрации, при прорастании облученных луковиц, практически не влияет на относительную продолжительность фаз митоза.

В варианте I-к продолжительность профазы по сравнению с опытными вариантами длиннее, что свидетельствует об адаптивных процессах в популяциях клеток.

3.2.4 Патология митоза

В ходе работы исследовали способность ВЭКШ в различных концентрациях стимулировать или подавлять протекание патологических процессов в клетках корневой меристемы лука.

Установлено, что наибольшая патология митоза наблюдается в варианте опыта I-к, по сравнению с контролем к-к. Причем, определение корреляционных отношений между ПМ с учетом профазы и ПМ без учета профазы выявило высокое положительное значение, равное 0,95.

В сравнении с контролем к-к процент клеток с регистрируемой патологией митоза почти не изменяется в вариантах опыта к-о1, к-о6 и снижается в варианте к-о3, что фактически находится в пределах нормального значения уровня спонтанного мутирования: 2-5 % [40-45]. По сравнению с вариантом I-к патология митоза значительно уменьшается в варианте I-о6.

Данные, представленные на рисунке 7, свидетельствуют о том, что ВЭКШ в исследуемых концентрациях не оказывает существенного негативного влияния на значения ПМ.

Низкое число патологий митоза в опытных вариантах позволяет предположить проявление высокой адаптивности у исследуемого объекта, возможно, в результате действия ВЭКШ.



Рисунок 7 - Патология митоза в корневой меристеме Allium cepa под действием ВЭКШ и радиоактивного облучения

Следует отметить, что мы не отслеживали патологии митоза на стадии профазы, поскольку при рутинной окраске их нельзя выявить. Поэтому для получения более точного анализа результатов эксперимента необходимо учитывать патологию митоза без учета профаз. Установлено позитивное влияние ВЭКШ, которое снижало обсуждаемый показатель в 1,5-5,0 раз. Несомненна эффективная концентрация ВЭКШ опытного варианта I-о6.

Заключение

При исследовании различных концентраций ВЭКШ на развитие луковиц A. cepa не установлено негативных воздействий на изучаемые цитогенетические параметры (доля клеток на определенной стадии митоза, патология митоза, уровень и спектр патологий митоза, частота встречаемости клеток с микроядрами).

ВЭКШ в исследуемых концентрациях не оказывает существенного негативного влияния на значения ПМ, которое колеблется от 2,12 до 6,25 %, что фактически находится в пределах нормального значения уровня спонтанного мутирования. Выявлено, что в результате действия ВЭКШ при большинстве тестируемых концентраций сужается спектр различных типов патологий митоза в меристематических клетках корешков лука в сравнении с контрольными вариантами.

Установлено, что наиболее оптимальными концентрациями ВЭКШ, действующими на исследуемые цитогенетические параметры, являются 0,001 и особенно 0,0001 мл исходного ВЭКШ в 100 мл воды. Минимальная исследуемая концентрация ВЭКШ была наиболее близка к физиологическим условиям по параметрам: длительность фаз митоза, патология митоза, спектр патологий митоза.

Также установлено, что тестируемое хроническое радиоактивное облучение луковиц способствует повышению показателя «патология митоза без учета профаз». Использование ВЭКШ снижало обсуждаемый показатель в 1,5-5,0 раз. Несомненна эффективная концентрация ВЭКШ опытного варианта I-о6.

Список использованных источников

1 Антиоксидантная активность куколок китайского дубового шелкопряда / А.А. Чиркин [и др.] // Ученые записки УО «ВГУ им. П.М. Машерова»: сборник научных статей. - Витебск: «Изд-во УО «ВГУ им. П.М. Машерова», 2007. ? С. 248 - 265.

2 Симонян, А.В. Антиоксиданты в современном здравоохранении / А.В. Симонян // Медицинский вестник. - 2008. - № 16 (443). - С. 14 - 15.

3 Трокоз, В.А. Биологически активные продукты из дубового шелкопряда: аспекты использования с лечебно-профилактической целью / В.А. Трокоз, Т.Б. Аретинская, Н.В. Трокоз // Сборник тезисов 2 Всероссийской конференции по вопросам онкологии и анестезиологии мелких домашних животных. - Витебск: «Изд-во УО «ВГУ им. П.М. Машерова», 2006. - С. 21 - 28.

4 Бенсон, Дж. Хроматографический анализ аминокислот и пептидов на сферических смолах и его применение в биологии и медицине / Дж. Бенсон, Дж. Патерсон // Новые методы анализа аминокислот, пептидов и белков. - Мн., 1974. - С. 9 - 84.

5 Антиоксидантная активность куколок китайского дубового шелкопряда (Antheraea pernyi G.-M.) / А.А. Чиркин [и др.] // Ученые записки УО «ВГУ им. П.М.Машерова». - Витебск: Изд-во УО «ВГУ им. П.М. Машерова», 2007. - Том 6. - С. 248 - 265.

6 Химическая характеристика гемолимфы куколок китайского дубового шелкопряда, акклиматизированного в Витебской области / А.А. Чиркин [и др.] // Биологическое разнообразие Белорусского поозерья: современное состояние, проблемы использования и охраны / Матер, II междунар. конференции. - Витебск: ВГУ, 2008. - С. 19 - 21.

7 Использование куколок китайского дубового шелкопряда для эукологического мониторинга и метаболической терапии / А.А. Чиркин [и др.] // Экологическая антропология. - Минск: ИООО «Право и экономика», 2008. - С. 191 - 195.

8 Оценка цитотоксичности водного экстракта куколок дубового шелкопряда / А.А. Чиркин [и др.] // Молекулярная и биохимическая фармакология / Матер. междунар. научн. конф., посвященной 80-летию НАНБ. - Гродно: ГрГУ, 2008. - С. 83 - 84.

9 Fiskesjц, G. The Allium test. Methods in molecular biology. In vitro toxicity testing protocols / G. Fiskesjц. - New York: Nova Science Publishers, Inc. - 1995. - Vol. 43. - P. 119 - 127.

10 Fiskesjц, G. The Allium test for screening chemicals; evalution of cytological parameters. Plants for environmental studies / G. Fiskesjц. - New York: CRC Press LLC. - 1997. - P. 308 - 333.

11 Sabti, K. Allium test for air and water borne pollution control / K. Sabti. - Cytobios. - 1989. - Vol. 58. - P. 71 - 78.

12 Оценка фито- и цитотоксической активности соединений тяжелых металлов и алюминия с помощью корневой апикальной меристемы лука / А.И. Довгалюк [и др.] // Цитология и генетика. - 2001. - Т. 1. - № 1. - С. 3 - 9.

13 Mustafa, Y. Genotoxicity testing of quizalofop-P-ethyl herbicide using the Allium cepa anaphase-telophase chromosome aberration assay / Y. Mustafa // Caryologia. - 2008. - Vol. 61. - P. 45 - 52.

14 Rathore, H.S. A study on the cytological effects of myrobalan (fruit of Terminalia chebula) in Allium tests / H.S. Rathore // Ethnobotanical Leaflets. - 2006. - Vol. 10. - P. 92 - 97.

15 Rank, J. Genotoxicity testing of the herbicide Roundup and its active ingredient glyphosate is opropylamine using the mouse bone marrow micronucleus test, Salmonella mutagenicity test, and Allium anaphase-telophase test / J. Rank // Mutat. Res. - 1993. - № 300. - P. 29 - 36.

16 Phil, P.M. Antigenotoxic Potential of Terminalia chebula fruit (myrobalan) against cadmium in Allium test / P.M. Phil, H.S. Rathore // The Internet Journal of Toxicology. - 2007. - V. 4 (1). - P. 1 - 9.

17 Asita, O. Genotoxicity of Chlorpyrifos, Alpha-thrin, Efekto virikop and Springbok to onion root tip cells / O. Asita, R. Makhalemele // African Journal of Biotechnology. ? 2008. ? Vol. 7 (23). ? P. 4244 ? 4250.

18 Zakia, A. Cytological Effects of Certain Active Constituents of Peganum Harmala L. Effect of Harmol and Harmine Alkaloids on Mitosis of Allium cepa / A. Zakia // J. King Saud Univ. ? Vol. 4. ? Science (1). ? 1992. ? P. 37 ? 45.

19 Fiskesjo, G. The Allium test as a standard in environmental monitoring / G. Fiskesjo // Hereditas. - 1985. - V. 102. - P. 99 - 102.

20 Rathore, H.S. Prevention of Acetaminophen-Induced Mitodepression with Myrobalan (Fruit of Terminalia chebula) in Allium cepa Model / H.S. Rathore, P. Choubey // Iranian Journal of Pharmacology and Therapeutics. - 2005. - Vol. 4. - N 2. - P. 100 - 104.

21 Knoll, M.F. Effects of Pterocaulon polystachyum DG (Asteraceae) on onion (Allium cepa) root-tip cells / M.F. Knoll // Genetics and Molecular Biology. ? 2006. ? Vol. 29. ? P. 539 ? 542.

22 Akinboro, A. Cytotoxic and genotoxic effects of aqueous extracts of five medicinal plants on Allium cepa Linn. / A. Akinboro, A.A. Bakare // J. Ethnopharmacol. ? 2007. ? Vol. 112. - N 3. ? P. 470.

23 Solanke, P. An Evalution of the Genotoxic effects of seed decoction of Cassia tora L. (Leguminosae) in Allium cepa Model / P. Solanke // Ethnobotanical Leaflets. ? 2007. ? Vol. 11. ? P. 217 ? 223.

24 Kumar, L.P. G₂ studies of antimutagenic potential of chemopreventive agent curcumin in Allium cepa root meristem cells / L.P. Kumar, N. Paneerselvam // Facta Universitatis. - Series Medicine and Biology. ? 2008. ? Vol. 15. ? N 1. - P. 20 ? 23.

25 Artyukhov, V.G. Cytogenetic indices of English oak (Quercus robur L.) seminal progeny subject to radioactive radiation in the Chernobyl nuclear disaster and growing on territories with different levels of anthropogenic contamination / V.G. Artyukhov, V.N. Kalaev // 20 Years after Chernobyl Accident: past, present and future: Editors E.B. Burlakova, V.I. Naidich. - New York: Nova Science Publishers, Inc. - 2006. - P. 247 - 264.

26 Булдаков, Л.А. Радиоактивное излучение и здоровье / Л.А. Булдаков. - М.: Информ-Атом, 2003. - 165 с.

27 Райков, И.Б. Ядро простейших. Морфология и эволюция / И.Б. Райков. - Л.: Наука, 1978. - 328 с

28 Окада, Ш.А. Радиоционная биохимия клетки / Ш.А. Окада. - М.: Мир, 1974. - 407 с.

29 Алов, И.А. Цитофизиология и патология митоза / И.А. Алов. - М.: Медицина, 1972. ? 264 с.

30 Словарь-справочник энтомолога / С.П. Белошапкин [и др.]. - М.: Нива России, 1992. - 334 с.

31 Гилберт, С. Биология развития: в 3 т. / С. Гилберт, пер. с англ. - М.: Мир, 1995. - Т.3. - 352 с.

32 Радкевич, В.А. Экология листогрызущих насекомых / В.А. Радкевич. - Минск: Наука и техника, 1980. - 240 с.

33 Реакции изолированных клеток на действие гидрофильных компонентов куколок дубового шелкопряда / А.А. Чиркин [и др.] // Ученые записки УО «ВГУ им. П.М. Машерова». - 2009. - Т. 8. - С. 278 - 298.

34 Fiskesjo, G. The Allium test as a standard in environmental monitoring / G. Fiskesjo // Hereditas. - 1985. - V. 102. - P. 99 - 102.

35 Гудков, И.Н. Роль асинхронности клеточных делений и гетерогенности меристемы в радиоустойчивости растений / И.Н. Гудков, Д.М. Гродзинский // Механизмы радиоустойчивости растений. - Киев: Наукова думка, 1976. - С. 110 - 137.

36 Evseeva, T.I. Genotoxicity and cytotoxicity assay of water sampled from the underground nuclear explosion site in the north of the Perm region (Russia) / T.I. Evseeva // J. Environ. Radioactivity. - 2005. - Vol. 80. - P. 59 - 74.

37 Токсические и цитогенетические эффекты, индуцируемые у Allium cepa L. низкими концентрациями Cd и ²³²Th / Т.И. Евсеева [и др.] // Цитология и генетика. - 2005. ? № 5. ? С. 73 ? 80.

38 Справочник по ботанической микротехнике. Основы и методы / Р.П. Барыкина [и др.]. - М.: Изд-зо МГУ, 2004. - 312 с.

39 Калаев, В.Н. Цитогенетический мониторинг: методы оценки загрязнения окружающей среды и состояния генетического аппарата организма / В.Н. Калаев, С.С. Карпова. - Воронеж: ВГУ, 2004. - 80 с.

40 Захаров, В.М. Биотест: интегральная оценка здоровья экосистем и отдельных видов / В.М.Захаров, Д.М. Кларк. ? М.: Моск. отд-ние Междунар. фонда "Биотест", 1995. ? 68 с.

41 Толкачева, Т.А. Действие гидрофильных компонентов куколок шелкопряда на тест-объект Allium cepa L. / Т.А. Толкачева // Наука - образованию, производству, экономике: материалы XV (62) Рег. науч. - практ. конф. преподавателей, научных сотрудников и аспирантов, посвящ. 100-летию со дня основания УО «ВГУ имени П.М. Машерова», Витебск, 3-5 марта 2010 г. / Вит.гос. ун-т; редкол.: А.П. Солодков [и др.]. - Витебск, 2010. - С. 122 - 123.

42 Чиркин, А.А. Биологическая активность продуктов гистолиза / А.А. Чиркин. - Germany: Lambert Akademic Publishing, 2012. - 156 с.

43 Жизнеспособность клеток куколок дубового шелкопряда / А.А. Чиркин [и др.] // Вестн. Витебск.госуд.ун-та. - 2011. - № 1 (61). - С. 30 - 36.

44 Белковый и аминокислотный состав куколок китайского дубового шелкопряда / С.И. Денисова [и др.] // Вестн. Витебск. госуд. ун-та. - 2007. - № 1 (43). - С. 143 - 149.

45 Паушева, З.П. Практикум по цитологии растений / З.П. Паушева. - М.: Агропромиздат, 1988. - 272 с.

Размещено на Allbest.ru