Исследование меристематическиих клеток корешков проростков Allium cepa L

Размещено на http://www.allbest.ru

Размещено на http://www.allbest.ru

Реферат

Дипломная работа

Ключевые слова: водный экстракт куколок китайского дубового шелкопряда, митотическое деление, Allium-тест, патология митоза

Объект исследования: меристематические клетки корешков проростков Allium cepa L.

Предмет исследования: действие гидрофильных компонентов куколок китайского дубового шелкопряда на цитогенетические и морфометрические параметры тест-объекта Allium cepa L. в норме и при стрессе.

Цель работы: изучить влияние различных концентраций водного экстракта куколок китайского дубового шелкопряда на цитогенетические и морфометрические параметры в клетках корневых меристем Allium cepa L. в норме и после радиоактивного облучения.

Результаты исследования: Установлено, что наиболее оптимальными концентрациями ВЭКШ, действующими на исследуемые цитогенетические параметры, являются 0,001 и особенно 0,0001 мл исходного ВЭКШ в 100 мл воды. Минимальная исследуемая концентрация ВЭКШ была наиболее близка к физиологическим условиям по параметрам: длительность фаз митоза, патология митоза, спектр патологий митоза.

Также установлено, что тестируемое хроническое радиоактивное облучение луковиц способствует повышению показателя «патология митоза без учета профаз».

Использование ВЭКШ снижало обсуждаемый показатель в 1,5-5,0 раз. Несомненна эффективная концентрация ВЭКШ опытного варианта I-о6.

Содержание

Введение

1. Обзор литературы

1.1 Использование антиоксидантов и их влияние на геном клеток

1.2 Растительная тест-система Allium cepa

1.3 Митотическое деление клеток

1.4 Патология митоза

1.5 Нарушение митотической активности клеток

1.6 Способы облучения растений

2. Объект, программа и методика исследований

2.1 Объект и программа исследований

2.2 Методика исследований

3. Результаты исследований и их обсуждение

3.1 Цитогенетические и морфометрические параметры A.cepa L. в норме

3.1.1 Морфологические параметры Allium cepa L

3.1.2 Продолжительность фаз митоза в корневой системе Allium cepa L

3.1.3 Патология митоза

3.1.4 Уровень и спектр патологий митоза

3.2 Цитогенетические и морфометрические параметры A.cepа L. после радиоактивного облучения

3.2.1 Морфологические параметры Allium cepa L

3.2.2 Митотический индекс

3.2.3 Продолжительность фаз митоза в корневой системе Allium cepa L

3.2.4 Патология митоза

Заключение

Список использованных источников

Введение

Среди источников биологически активных веществ, используемых в растениеводстве, до настоящего времени не применяли препараты из гемолимфы куколок китайского дубового шелкопряда, хотя по химическому составу гемолимфа может быть использована для получения высокоэффективных стимуляторов роста. Ранее было обнаружено ингибирующее действие водного экстракта куколок шелкопряда (ВЭКШ) на образование in vivo активных форм кислорода и галогенов в нейтрофилах, что свидетельствует об его антиоксидантном действии [1]. Выявлен состав гемолимфы и водного экстракта куколок шелкопряда, содержащий комплекс аминокислот, углеводов, микроэлементов и антиоксидантов, который оптимален для функционирования эукариотических клеток. Установлено общее количество свободных аминокислот в жидком содержимом куколок дубового шелкопряда, которое составляет 14-16 г/л; в том числе обнаружены следующие незаменимые аминокислоты (М±m, ммоль/л): треонин (10,28±0,272), гистидин (10,26±0,367), лизин (8,66±0,586), валин (8,16±0,193), лейцин (4,76±0,133), изолейцин (4,34±0,145), фенилаланин (1,04±0,070), метионин (0,67±0,083) [1].

Однако следует принять во внимание, что антиоксиданты, в зависимости от концентрации и других факторов, могут проявлять либо антиоксидантное действие, либо прооксидантное, либо вообще не проявлять какого-либо эффекта на интенсивность накопления активных форм кислорода и скорость реакций свободнорадикального окисления, и тем самым на общее состояние организма и его адаптивность.

Цель работы: изучить влияние различных концентраций водного экстракта куколок китайского дубового шелкопряда на цитогенетические и морфометрические параметры в клетках корневых меристем Allium cepa L. в норме и после радиоактивного облучения.

Актуальность работы: всестороннее изучение влияния водного экстракта куколок китайского дубового шелкопряда имеет огромное значение при выявлении морфометрических и цитогенетических параметров различных растений, так как в составе гемолимфы и водного экстракта куколок шелкопряда содержится комплекс аминокислот, углеводов, микроэлементов и антиоксидантов, который оптимален для функционирования эукариотических клеток, как в оптимальных условиях, так и при стрессе.

1. Обзор литературы

1.1 Использование антиоксидантов и их влияние на геном клеток растений

Выявлено, что значительное негативное влияние на биохимические процессы в организмах высших организмов оказывают особые химические частицы, называемые "свободными радикалами". Свободные радикалы представляют собой чрезвычайно активные образования (молекулы, а точнее частицы, имеющие неспаренные электроны), образующиеся в процессе жизнедеятельности организма, а также при воздействии неблагоприятных факторов окружающей среды (радиация, загрязненная атмосфера, химические соединения и т.п.). Такие молекулы стремятся отнять электрон у других "полноценных" молекул, вследствие чего "пострадавшая" молекула сама становится свободным радикалом развивается разрушительная цепная реакция, губительно действующая на живую клетку. Негативное действие свободных радикалов проявляется в ускорении старения организма, в ослаблении иммунной системы и других защитных функций. Эти нарушения связаны, прежде всего, с повреждением клеточных мембран. Свободные радикалы могут также проявлять мутагенные свойства, связанные с нарушением структуры молекул ДНК и рибосомной РНК, вызывая изменения наследственной информации и ослабляя жизненные силы организма. В процессе эволюции клетки живых организмов выработали многочисленные свойства и функции, которые помогают им выживать в естественных условиях. И одним из таких широко распространенных природных соединения являются антиоксиданты, которые часто вырабатывают самими организмами. Спектр биологического действия антиоксидантов весьма разнообразен и обусловлен в основном их защитными функциями, выраженными в способности нейтрализовать негативное действие свободных радикалов. К числу наиболее известных антиоксидантов относятся токоферолы, каротиноиды, аскорбиновая кислота. Мощным антиоксидантным действием обладают также природные соединения растительного происхождения, объединенные под общим название - флавоноиды [2-7].

Однако огромный поток неблагоприятных внешних факторов различного происхождения приводит к ситуации, когда защитные механизмы самого организма на разных уровнях структуризации уже не в состоянии нейтрализовать образование агрессивных частиц, нарушающих скорость свободнорадикального окисления липидов мембран клеток, что в конечном итоге приводит к повреждению нуклеиновых кислот и/или хромосом. Поэтому важной и актуально задачей является активный поиск соединений, обладающих антиоксидантными, антимутагенными и иными полезными свойствами.

Новые антиоксиданты должны характеризоваться максимально широким действием на свободнорадикальное окисление, с возможно более специфичным действием на определенные звенья этого процесса (перекисное окисление липидов, окислительная модификация белков, повреждение нуклеиновых кислот и т.д.).

Поиск антиоксидантов может проводиться по двум основным направлениям. Первое - это синтез новых соединений с выраженной антиоксидантной активностью, низкой токсичностью и минимальным проявлением побочных явлений. Второе - это поиск антиоксидантов среди широко используемых в медицинской практике лекарственных средств различных фармакологических групп, либо выявление таких соединений в природе [1, 3].

Следует обратить внимание на то обстоятельство, что антиоксиданты в зависимости от концентрации и других факторов могут проявлять либо антиоксидантное (защитное) действие, либо прооксидантное (проявление высокой токсичности, нежелательных побочных явлений), либо вообще не проявлять какого-либо эффекта на интенсивность накопления активных форм кислорода и скорость реакций свободнорадикального окисления.

Китайский дубовый шелкопряд (Antheraea pernyi G.-M.) издавна культивируется для изготовления натуральных шелковых тканей. В последнее время куколка шелкопряда рассматривается как исходное сырье для получения различных лечебных, косметических средств, пищевых продуктов (масла, приправы) и применяться в качестве кормовых добавок для домашних животных, птицы, рыбы [1, 8].

Куколка шелкопряда - это природный объект, содержащий биологическую жидкость, между стадиями двух эукариотических организмов - гусеницы и бабочки. Очевидно, что в этой жидкости должен содержаться оптимальный для синтеза белков эукариотического организма спектр аминокислот. Кроме того в жидкости куколок шелкопряда должны присутствовать молекулы, предохраняющие гемолимфу от окислительного стресса и инфицирования.

Установлено, что при фракционировании содержимого куколок на сефадексе G-25 получают три пика веществ, поглощающих ультрафиолет при длинах волн 260 и 280 нм. При диск-электрофорезе содержимого куколок китайского дубового шелкопряда выделяется 8 фракций белков, четко делящихся на три группы по электрофоретической подвижности белков.

Разделение методом тонкослойной хроматографии на силикагеле выявило наличие нескольких флуоресцирующих компонентов гемолимфы. Количественная реакция указывает на наличие дигидроксихинонов. Концентрация свободных низкомолекулярных продуктов, содержащих сульфгидрильные группы оказалась низкой ~ 10^-6 М. В гемолимфе куколок присутствуют водо- и жирорастворимые витамины (особенно большое количество аскорбиновой кислоты). Общее количество свободных аминокислот в жидком содержимом куколок китайского дубового шелкопряда составляет 14-16 г/л, в том числе обнаружены (М±m, ммоль/л) глутамин (19,07±1,886), аланин (18,33±2,601), глицин (17,15±0,907), серин (13,13±1,711), треонин (10,28±0,272), гистидин (10,26±0,367), лизин (8,659±0,586), валин (8,162±0,193), пролин (5,586±0,409), лейцин (4,763±0,133), аспарагиновая кислота (4,700±0,561), изолейцин (4,337±0,145), тирозин (2,530±0,230), цитрулин (2,152±0,141), фенилаланин (1,043±0,070), таурин (0,976±0,112), глутаминовая кислота (0,899±0,081), метионин (0,672±0,083), бета-аланин (0,511±0,029), этаноламин (0,227±0,016), орнитин (0,044±0,004). Методом высокоэффективной жидкостной хроматографии не выявлены аминокислоты аспарагин, цистеин и триптофан. По сравнению со спектром свободных аминокислот растений в жидком содержимом куколок содержится больше глицина, лизина, гистидина, пролина и глутамина, а также снижено содержание глутаминовой кислоты и фенилаланина. Аминокислотный состав куколок близок к биологически полноценным белкам молока [9-13].

В 2007 году был описан антиоксидантный эффект гемолимфы куколок китайского дубового шелкопряда [1, 14].

Оказалось, что антиоксидантный эффект гемолимфы куколок шелкопряда существенно превышает антиоксидантную активность гемолимфы виноградных улиток (Helix pomatia L.). При вычислении ингибирования образования активных форм кислорода (АФК) установлено, что гемолимфа куколок китайского дубового шелкопряда эффективнее гемолимфы виноградных улиток в системе люминол + HCl в 200 раз, люминол + миелопероксидаза хрена + Н₂О₂ в 200 раз, генерации АФК нейтрофилами при адгезии в 700 раз, генерации АФК нейтрофилами при действии хемотаксического пептида f Met-Leu-Phe в 300 раз и генерации АФК нейтрофилами при действии латекса в 4000 раз. Следовательно, уникальное антиоксидантное действие гемолимфы шелкопряда наблюдается при степени ее разбавления на несколько порядков более высокой, чем у виноградных улиток.

В аминокислотный состав гемолимфы куколок дубового шелкопряда входят тирозин и таурин. Эти аминокислоты являются типичными физиологичными субстратами миелопероксидазы (МПО) и выявляются в фаголизосомах нейтрофилов, где осуществляется внутриклеточная деструкция патогенного материала при инфекционном заражении. Было показано, что богатые тирозином пептиды и белки могут связываться с активным центром МПО и ингибировать пероксидазную и галогенирующую активность фермента в отношении других субстратов. Вероятно, механизм антиоксидантного и антимикробного действия гемолимфы куколок также включает связывание компонентов гемолимфы с реакционным центром МПО, что приводит к ингибированию ее активности [15-22].

Помимо активных форм кислорода и хлора чрезвычайно высокой реакционной способностью и токсичным действием в отношении биосистем обладают активные формы азота, в первую очередь, пероксинитрит ONOO^-, образование которого также имеет место при воспалении и при действии ксенобиотиков. Хемилюминесцентным методом удалось показать, что компоненты гемолимфы взаимодействуют с ONOO^-. Cубстратом нитрования в гемолимфе куколок, по-видимому, является тирозин, продуктом реакции - нитротирозин.

В опытах in vitro показано, что уровень восстановленного глутатиона в эритроцитах, подвергнутых действию окислителя (1 мМ tBOOH) в присутствие гемолимфы, был на 38 % выше, нежели в отсутствие протектора. Еще более выраженным антиоксидантным эффектом обладала гемолимфа шелкопряда, непосредственно извлеченная из куколки. Гемолимфа более чем на 65 % ингибировала процесс генерирования продуктов пероксидного окисления липидов в эритроцитах в присутствии 2 мМ tBOOH. Известно, что индуцируемое органическим пероксидом окислительное повреждение эритроцитов связано с генерацией алкоксильного и пероксильного радикалов в реакции окислителя с оксигемоглобином.

Можно предположить, что компоненты гемолимфы непосредственно взаимодействуют с образующимися радикалами либо ингибируют процессы их образования [23-26].

Установлено, что ни водный экстракт куколок тутового шелкопряда ни его фракции не оказали цитотоксического действия на культуру клеток нормальных фибробластов человека.

Таким образом, показано, что гидрофильные компоненты гемолимфы куколок дубового шелкопряда обладают антиоксидантным эффектом, взаимодействуют с системами антимикробной защиты, предохраняют мембраны клеток от пероксидного окисления липидов эукариотических клеток. Все вышеизложенное позволяет предложить использование водного экстракта куколок дубового шелкопряда или его фракций для оптимизации функционирования эукариотических клеток, в частности растительных клеток [1, 27-29].

Гомометаболические насекомые с полным превращением характеризуются тем, что у них между личиночной и взрослой стадиями происходит внезапная и резкая трансформация. Ювенильная личинка (гусеница) по мере роста претерпевает серию линек. Процесс линьки инициируется в мозге, нейросекреторные клетки которого в ответ на нервный, гормональный или средовый сигналы выделяют проторакотропный гормон (ПТТГ) - пептидный гормон с молекулярной массой 40 кДа, стимулирующий образование экдизона клетками проторакальной железы. С участием гидроксилазной системы периферических тканей экдизон превращается в активную форму - экдистерон. Развитие личинок до метаморфозной линьки контролирует ювенильный гормон, образуемый в прилежащих телах. В присутствии ювенильного гормона стимулирования экдизоном линька завершается переходом личинки в новый возраст. У личинок последнего возраста синтез ювенильного гормона постепенно прекращается и его содержание падает ниже порогового уровня. Это событие инициирует синтез экдизона и его превращение в экдистерон. Такой гормональный фон переводит клетки на путь, ведущий к окукливанию.

Личинка последнего возраста трансформируется в куколку. Куколка не питается, а живет за счет энергии пищи, потребляемой личинкой. В куколке происходят процессы гистолиза и гистогенеза. Гистолиз - разрушение подлежащих замене в ходе метаморфоза тканей и органов личинки, которое осуществляется при помощи автолиза, лиоцитоза и фагоцитоза. Содержимое куколки как бы возвращается к дифференцированному состоянию яйца. Гистолизу подвергаются все системы организма личинки, кроме нервной, половой, а также спинного сосуда. В дальнейшем гистолиз сменяется гистогенезом, конечной целью которого является построение из образовавшейся жидкой массы новых, имагинальных органов. Важную роль при гистогенезе также играют имагинальные зачатки - группы клеток, из которых возникают те или иные ткани и органы. Таким образом, в голометаболических личинках имеются две популяции клеток: личиночные клетки, функционирующие на ювенильных стадиях, и имагинальные клетки, собранные в кластеры, ждущие сигнала, чтобы приступить к дифференцировке [30]. Кроме того в гемолимфе обнаруживаются 5 типов циркулирующих гемоцитов: прогемациты (стволовые клетки), плазматоциты и три типа специализированных клеток [31, 32].

Ранее было показано, что реакции изолированных клеток на действие гидрофильных компонентов куколок дубового шелкопряда зависят от типа клеток и дозы экстракта: малые дозы стимулируют антиоксидантный эффект нейтрофилов, а относительно высокие дозы активируют фагоцитоз макрофагами и модулируют метаболизм и функции тканевых лимфоцитов [33].

1.2 Растительная тест - система Allium cepa

Allium-test - это растительная тест-система для оценки мутагенного, митозмодифицируещего и токсического эффектов факторов химической и физической природы на основе растения Allium cepa - лук репчатый (сорт «Штуттгартен»).

В Allium-test используются корешки проростков репчатого лука Allium cepa, который впервые предложен Шведской Королевской Академией Наук как стандартный тест-объект.

Биотест разработан более 70 лет назад А. Леваном в 1938 и использовался для изучения эффекта влияния колхицина, получив много внимания в это время. В настоящее время термин Allium-test используется на ряду с постоянно увеличивающимся числом объектов и при этом продолжает оставаться одним из наилучших тест-объектов для анализа генотоксичности различных факторов. После А. Левана разработкой биотестирования с помощью лука обыкновенного занимался шведский ученый Dr. Geirid Fiskesjo в 80-х годах [9].

В современных исследованиях Allium cepa L. считается эталонным растительным тест-объектом для анализа мутагенности, митотоксичности и токсичности различных факторов. Наряду с Allium-test используются и другие тест-объекты (среди растений наиболее часто горох Pisum sativum и бобы Vicia faba).

Данный метод является простым, экономичным, краткосрочным и достаточно чувствительным для определения «мутаген» или «не мутаген» фактор, «цитотоксичен» или «не цитотоксичен».

Allium-test рекомендован для исследования практически любых химических, физических и биологических факторов. По мере синтеза новых веществ, тест получает новые рекомендации, что делает его одним из наиболее популярных.

Allium-test рекомендован экспертами как стандарт в цитогенетическом мониторинге окружающей среды, так как результаты, полученные на данном тесте, показывают корреляцию с тестами на других организмах: водорослях, растениях, насекомых, в том числе и млекопитающих и человеке.

Рекомендован в качестве альтернативы генотоксикологическим тестам на лабораторных животных (в том случае если для одних и тех же исследуемых веществ наблюдается одинаковый результат в данном тесте и тестах на животных, то есть если показана корреляция).

Данный метод не требует знания кариотипа и идентификации типов повреждений хромосом, является простым, экономичным и достаточно чувствительным для определения «мутаген» или «не мутаген» фактор.

Метод позволяет регистрировать хромосомные мутации типа делеций и транслокаций, следствием которых является наличие мостов и фрагментов в ана- и телофазе. Метод позволяет выявить изменение поведения хромосом на веретене деления. Allium-test идеально подходит для проведения микроядерного теста.

Известный и распространённый тест Эймса по чувствительности и достоверности результатов значительно уступает Allium-test при оценке загрязнений. Кроме того Allium-test был рекомендован для тестирования образцов различных наноматериалов, тогда как тест Эймса оказался неприемлемы, в связи с ложноотрицательными результатами.

Исследование мутагенных свойств наночастиц диоксида титана на корневых меристемах Allium cepa и лимфоцитах человека показало, что оба теста проявляют сходную чувствительность к данному веществу.

Allium cepa L. в качестве тест объекта широко применяется для оценки генетического потенциала химических соединений, природных и сточных вод.

Лук имеет 16 хорошо прокрашиваемых хромосом (2n=16). Продолжительность клеточного цикла составляет примерно 17,8 часа. Митотический индекс может колебаться в разных корнях одного и того же растения, но усреднённые данные являются достаточно устойчивыми. Продолжительность митоза в разных тканях корня Allium cepa одинакова и не меняется по длине корня. Соотношение различных фаз митоза не зависит от времени фиксации.

Наиболее часто применяется анализ частоты хромосомных аберраций в ана-телофазе митоза (ана-телофазный тест). В этом тесте регистрируются хромосомные мутации типа делеций и транслокаций, а также нарушения веретена деления по частоте отставания хромосом, многополюсных и асимметричных митозов. Ана-телофазный метод с использованием лука в качестве тест-объекта рекомендован в качестве тест-объекта природных сред. При сравнении мутагенной активности химических загрязнителей, определённых в других токсикогенетических тестах с ана-телофазным методом установлено, что чувствительность его высока и составляет 82 %.

Однако учёт только хромосомных аберраций может привести к занижению реального генотоксического эффекта, например, по следующим причинам. Во-первых, эти методы не позволяют регистрировать генные мутации, которые возникают значительно чаще хромосомных. Во вторых, хромосомные мутации выявляются, как правило на фоне высокой митотической активности меристематических клеток. Повышенная токсичность факторов среды может вызывать снижение количества делящихся клеток за счёт задержки клеточного цикла в точках контроля, либо гибели части клеток, следовательно при этом искусственно снизится и частота регистрируемых хромосомных повреждений.

В настоящее время термин Allium-test используется наряду с постоянно увеличивающимся числом объектов и при этом продолжает оставаться одним из наилучших тест-объектов для анализа генотоксичности различных факторов.

Растительные тест-системы получают всё большее распространение при оценке мутагенного загрязнения окружающей среды. Это обусловлено целым рядом преимуществ растений как индикаторов генотоксичности различных факторов, так и сигнальных объектов при генетическом мониторинге за состоянием окружающей среды [1, 14].

1.3 Митотическое деление клеток

Митоз (от греч. Mitos - нить), называемый также кариокинезом, или непрямым делением клеток, является универсальным механизмом деления клеток. Митоз следует за G2-периодом и завершает клеточный цикл.

Он длится 1-3 часа и обеспечивает равномерное распределение генетического материала в дочерние клетки. Митоз включает 4 основные фазы: профазу, метафазу, анафазу и телофазу.

Митоз - это один из фундаментальных процессов онтогенеза. Митотическое деление обеспечивает рост многоклеточных эукариот за счёт увеличения популяций клеток тканей.

В результате митотического деления клеток меристем увеличивается количество клеток тканей растений. Дробление оплодотворённого яйца и рост большинства тканей у животных также происходит путём митотических делений.

На основании морфологических особенностей митоз условно подразделяется на стадии: профазу, прометафазу, метафазу, анафазу, телофазу. Первые описания фаз митоза и установление их последовательности были предприняты в 70-80-х годах XIX века. В конце 1870-х годов немецкий гистолог Вальтер Флемминг для обозначения процесса непрямого деления клетки ввёл термин «митоз».

Продолжительность митоза в среднем составляет 1-2 часа. Митоз клеток животных, как правило, длится 30-60 минут, а растений - 2-3 часа. За 70 лет в теле человека суммарно осуществляется порядка 10¹⁴ клеточных делений [34].

Первые неполные описания, касающиеся поведения и изменения ядер в делящихся клетках, встречаются в работах учёных начала 1870-х годов.

В работе русского ботаника Руссова, датируемой 1872 годом, отчётливо описаны и изображены метафазные и анафазные пластинки, состоящие из отдельных хромосом.

Годом позже немецкий зоолог Г.А. Шнейдер ещё более отчётливо и последовательно, но, конечно, не совсем полно описал митотическое деление на примере дробящихся яиц прямокишечной турбеллярии Mesostomum. В его работе, в сущности, описаны и проиллюстрированы в правильной последовательности основные фазы митоза: профаза, метафаза, анафаза (ранняя и поздняя). В 1874 году московский ботаник И.Д. Чистяков также наблюдал отдельные фазы клеточного деления в спорах плаунов и хвощей. Несмотря на первые успехи ни Руссову, ни Шнейдеру, ни Чистякову не удалось дать чёткое и последовательное описание митотического деления.

В 1875 году вышли работы, содержащие более детальные описания митозов. О. Бючли дал описание цитологических картин в дробящихся яйцах круглых червей и моллюсков и в сперматогенных клетках насекомых.

Э. Страсбургер исследовал митотическое деление в клетках зелёной водоросли спирогиры, в материнских клетках пыльцы лука и в материнских споровых клетках плауна. Ссылаясь на работу О. Бючли и основываясь на собственных исследованиях, Э. Страсбургер обратил внимание на единство процессов клеточного деления в растительных и животных клетках.

К концу 1878 - началу 1879 года появились подробные работы Шлейхера и В. Флемминга. В своей работе в 1879 году Шлейхер предложил термин «кариокинез» для обозначения сложных процессов клеточного деления, подразумевая перемещения составных частей ядра. Вальтер Флемминг впервые для обозначения непрямого деления клетки ввёл термин «митоз», который впоследствии стал общепринятым. Также Флеммингу принадлежит окончательная формулировка определения митоза как циклического процесса, завершающегося разделением хромосом между дочерними клетками [29].

В 1880 г. О.В. Баранецкий установил спиральное строение хромосом. В ходе дальнейших исследований были развиты представления о спирализации и деспирализации хромосом во время митотического цикла.

В начале 1900-х годов хромосомы были идентифицированы в качестве носителей наследственной информации, что в дальнейшем дало объяснение биологической роли митоза, заключающейся в образовании генетически идентичных дочерних клеток [13].

В 1970-х годах началась расшифровка и детальное изучение регуляторов митотического деления, благодаря серии экспериментов по слиянию клеток, находящихся на разных этапах клеточного цикла. В тех опытах, когда клетку в М-фазе объединяли с клеткой, находящейся в любой из стадий интерфазы (G₁, S или G₂), интерфазные клетки переходили в митотическое состояние (начиналась конденсация хромосом и распадалась ядерная оболочка).

В итоге был сделан вывод, что в цитоплазмемитотической клетки присутствует фактор (или факторы), стимулирующий митоз, или, иначе, М-стимулирующий фактор (МСФ, от англ. M-phase-promoting factor, MPF).

Впервые «фактор стимуляции митоза» был открыт в зрелых неоплодотворенных яйцах шпорцевой лягушки, находящихся в М-фазе клеточного цикла. Цитоплазма такого яйца, инъецированная в ооцит, приводила к преждевременному переходу в М-фазу и к началу созревания ооцита (первоначально сокращение MPF означало Maturation Promoting Factor, что переводится как «фактор, способствующий созреванию»). В ходе дальнейших экспериментов были установлены универсальное значение и вместе с тем высокая степень консервативности «фактора стимуляции митоза»: экстракты, приготовленные из митотических клеток весьма разнообразных организмов, при введении в ооциты шпорцевой лягушки переводили их в М-фазу.

В ходе последующих исследований выяснилось, что фактор, стимулирующий митоз, представляет собой гетеродимерный комплекс, состоящий из белка циклина и зависимой от циклина протеинкиназы. Циклин является регуляторным белком и обнаруживается у всех эукариот. Его концентрация периодически возрастает в течение клеточного цикла, достигая максимума в метафазе митоза. С началом анафазы наблюдается резкое сокращение концентрации циклина, вследствие его расщепления с помощью сложных белковых протеолитических комплексов - протеосом. Зависимая от циклина протеинкиназа представляет собой фермент (фосфорилазу), модифицирующий белки за счёт переноса фосфатной группы от АТФ на аминокислоты серин и треонин. Таким образом, с установления роли и структуры основного регулятора митотического деления начались исследования тонких регуляторных механизмов митоза, которые продолжаются до настоящего времени [35].

Выработка единой типологии и классификации митозов осложняется целым спектром признаков, которые в различных комбинациях создают разнообразие и неоднородность картин митотического деления. При этом отдельные варианты классификации, разработанные применительно к одним таксонам, являются неприемлемыми в отношении других, поскольку не учитывают специфики их митозов. Например, отдельные варианты классификации митозов, свойственных животным или растительным организмам, оказываются неприемлемыми для водорослей.

Одним из ключевых признаков, лежащих в основе различных типологий и классификаций митотического деления, является поведение ядерной оболочки. Если образование веретена и само митотическое деление протекает внутри ядра без разрушения ядерной оболочки, то такой тип митоза называют закрытым. Митоз с распадом ядерной оболочки, соответственно, называется открытым, а митоз с распадом оболочки только на полюсах веретена, с образованием «полярных окон» - полузакрытым.

Ещё одним характерным признаком является тип симметрии митотического веретена. При плевромитозе веретено деления билатерально симметрично либо асимметрично и состоит, как правило, из двух полуверетён, располагающихся в метафазе-анафазе под углом друг к другу. Для категории ортомитозов характерна биполярная симметрия веретена деления, а в метафазе зачастую наблюдается различимая экваториальная пластинка.

В рамках обозначенных признаков наиболее многочисленным является типичный открытый ортомитоз, на примере, которого ниже рассматриваются принципы и стадии митотического деления. Данный тип митоза характерен для животных, высших растений и некоторых простейших [35-37].

Профаза начинается с конденсации хромосом, которые становятся видимыми в световой микроскоп как нитевидные структуры. Каждая хромосома состоит из двух параллельно лежащих сестринских хроматид, связанных в области центромеры. Ядрышко и ядерная оболочка к концу фазы исчезают (последняя распадается на мембранные пузырьки, сходные с элементами ЭПС, а поровый комплекс и ламина диссоциируют на субъединицы). Кариоплазма смешивается с цитоплазмой.

Центриоли мигрируют к противоположным полюсам клетки и дают начало нитям митотического (ахроматинового) веретена. В области центромеры образуются особые белковые комплексы - кинетохоры, к которым прикрепляются некоторые микротрубочки веретена (кинетохорные микротрубочки); показано, что кинетохоры сами способны индуцировать сборку микротрубочек и поэтому могут служить центрами организации микротрубочек. Остальные микротрубочки веретена называются полюсными, так как они протягиваются от одного полюса клетки к другому; лежащие вне веретена микротрубочки, расходящиеся радиально от клеточных центров к плазмолемме, получили наименование астральных или микротрубочек (нитей) сияния.

Метафаза соответствует максимальному уровню конденсации хромосом, которые выстраиваются в области экватора митотического веретена, образуя картину экваториальной (метафазной) пластинки (вид сбоку) или материнской звезды (вид со стороны полюсов). Хромосомы перемещаются в экваториальную плоскость и удерживаются в ней благодаря сбалансированному натяжению кинетохорных микротрубочек. Сестринские хроматиды к концу этой фазы разделяются щелью, однако удерживаются в области центромеры.

Анафаза начинается с синхронного расщепления всех хромосом на сестринские хроматиды (в области центромеры) и движения дочерних хромосом к противоположным полюсам клетки, которое происходит вдоль микротрубочек веретена со скоростью 0,2-0,5 мкм/мин. Сигнал к началу анафазы включает резкое (на порядок) повышение концентрации катионов кальция в гиалоплазме, выделяемого мембранными пузырьками, образующими скопления у полюсов веретена. Механизм движения хромосом в анафазе окончательно не выяснен, однако установлено, что в области веретена помимо актина имеются такие белки как миозин и динеин, а также ряд регуляторных белков. По некоторым наблюдениям, оно обусловлено укорочением (разборкой) микротрубочек, прикрепленных к кинетохорам. Анафаза характеризуется удлинением митотического веретена за счет некоторого расхождения полюсов клетки. Она завершается скоплением на полюсах клетки двух идентичных наборов хромосом, которые образуют картины звезд (стадия дочерних звезд). В конце анафазы благодаря сокращению актиновых микрофиламентов, концентрирующихся по окружности клетки (сократимое кольцо), начинает образовываться клеточная перетяжка, которая углубляясь, в следующей фазе приведет к цитотомии.

Телофаза - это конечная стадия митоза, в течение которой реконструируются ядра дочерних клеток и завершается их разделение. Вокруг конденсированных хромосом дочерних клеток из мембранных пузырьков (по другим данным, из ЭПС) восстанавливается кариолемма, с которой связывается формирующаяся ламина, вновь появляются ядрышки, которые образуются из участков соответствующих хромосом. Ядра клеток постепенно увеличиваются, а хромосомы прогрессивно деспирализуются и исчезают, замещаясь картиной хроматина интерфазного ядpa. Одновременно происходит углубление клеточной перетяжки, и клетки в течение некоторого времени остаются связанными суживающимся цитоплазматическим мостиком, содержащим пучок микротрубочек (срединное тельце). Дальнейшая перешнуровка цитоплазмы завершается формированием двух дочерних клеток. В телофазе происходит распределение органелл между дочерними клетками; равномерности этого процесса способствует то, что одни органеллы достаточно многочисленны (например, митохондрии), другие (подобно ЭПС и комплексу Гольджи) во время митоза распадаются на мелкие фрагменты и пузырьки.

Атипические митозы возникают при повреждении митотического аппарата и характеризуются неравномерным распределением генетического материала между клетками - анэуплоидией (от греч. аn - не, eu - правильное, ploon - складываю); во многих случаях цитотомия отсутствует, в результате чего формируются гигантские клетки. Атипические митозы характерны для злокачественных опухолей и облученных тканей. Чем выше их частота и чем значительнее степень анэуплоидии, тем более злокачественной является опухоль. Нарушение нормального митотического деления клеток может обусловливаться аномалиями хромосом, которые называют хромосомными аберрациями (от лат. Aberratio - отклонение). Вариантами хромосомных аберраций служат слипание хромосом, их разрыв на фрагменты, выпадение участка, обмен фрагментами, удвоение отдельных участков хромосом и др. Хромосомные аберрации могут возникать спонтанно, но чаще развиваются вследствие действия на клетки мутагенов и ионизирующего облучения.

Кариотипирование - диагностическое исследование с целью оценки кариотипа (набора хромосом) производится путем изучения хромосом в метафазной пластинке. Для кариотипирования получают культуру клеток, в которую вводят колхицин - вещество, блокирующее формирование митотического веретена. Из таких клеток извлекают хромосомы, которые далее окрашивают и идентифицируют. Нормальный кариотип человека представлен 46 хромосомами - 22 парами аутосом и двумя половыми хромосомами (XY у мужчин и XX у женщин). Кариотипирование позволяет диагностировать ряд заболеваний, связанных с хромосомными аномалиями, в частности, синдромы Дауна (трисомия 21-й хромосомы), Эдвардса (трисомия 18-й хромосомы), Патау (трисомия 13-й хромосомы), а также ряд синдромов, связанных с аномалиями половых хромосом - синдром Кляйнфельтера (генотип - XXY), Турнера (генотип - ХО) и другие [35].

Предполагается, что сложный митотический процесс высших организмов развивался постепенно из механизмов деления прокариот. Это предположение подтверждается тем, что прокариоты появились около миллиарда лет раньше первых эукариот. Кроме того, в митозе эукариот и бинарном делении прокариот принимают участие схожие белки.

Возможные промежуточные стадии между бинарным делением и митозом можно проследить у одноклеточных эукариот, у которых в ходе деления не разрушается ядерная оболочка. У большинства же других эукариот, в том числе растений и животных, веретено деления формируется вне ядра, а ядерная оболочка разрушается в течение митоза. Хотя митоз у одноклеточных эукариот ещё недостаточно изучен, можно предположить, что он произошёл от бинарного деления и в конечном счёте достиг того уровня сложности, который имеется у многоклеточных организмов.

У многих простейших эукариот митоз также остался процессом, связанным с мембраной, однако теперь уже не плазматической, а ядерной.

Основными регуляторными механизмами митоза являются процессы фосфорилирования и протеолиза.

Обратимые реакции фосфорилирования и дефосфорилирования обеспечивают протекание обратимых событий митоза, таких как сборка/распад веретена деления или распад/восстановление ядерной оболочки. Протеолиз лежит в основе необратимых событий митоза, таких как разделение сестринских хроматид в анафазе или разрушение митотических циклинов на поздних стадиях митоза.

Деление всех эукариотических клеток сопряжено с формированием специального аппарата клеточного деления.

Активная роль в митотическом делении клеток зачастую отведена цитоскелетным структурам. Универсальным как для животных, так и для растительных клеток является двухполюсное митотическое веретено, состоящее из микротрубочек и связанных с ними белков. Веретено деления обеспечивает строго одинаковое распределение хромосом между полюсами деления, в области которых в телофазе образуются ядра дочерних клеток.

Процесс митоза обеспечивает строго равномерное распределение хромосом между двумя дочерними ядрами, так что в многоклеточном организме все клетки имеют совершенно одинаковые (по числу и по характеру) наборы хромосом.

Хромосомы содержат генетическую информацию, закодированную в ДНК, и поэтому регулярный, упорядоченный митотический процесс обеспечивает также полную передачу всей информации каждому из дочерних ядер; в результате каждая клетка обладает всей генетической информацией, необходимой для развития всех признаков организма. В связи с этим становится понятно, почему одна клетка, взятая из полностью дифференцированного взрослого растения, может при подходящих условиях развиться в целое растение. Мы описали митоз в диплоидной клетке, но этот процесс протекает сходным образом и в гаплоидных клетках, например в клетках гаметофитного поколения растений [37].

1.4 Патология митоза

Патология митоза развивается при нарушении нормального течения митотического деления и зачастую приводит к возникновению клеток с несбалансированными кариотипами, следовательно, ведёт к развитию мутаций и анеуплоидии. Также в результате развития отдельных форм патологии наблюдаются хромосомные аберрации. Незавершённые митозы, прекращающиеся по причине дезорганизации или разрушения митотического аппарата приводят к образованию полиплоидных клеток. Полиплоидия и формирование многоядерных клеток возникают в случае нарушений механизмов цитокинеза. При значительных последствиях патологии митоза возможна гибель клетки. В нормальных тканях патология встречается в незначительных количествах. Условно различают патологию митоза функционального и органического типа. К функциональным нарушениям относят, например, гипореактивность вступающих в митоз клеток - снижение реакции на физиологические регуляторы, определяющие интенсивность пролиферации нормальных клеток. Органические нарушения возникают при повреждении структур, участвующих в митотическом делении (хромосомы, митотический аппарат, клеточная поверхность), а также при нарушении процессов, связанных с данными структурами (репликация ДНК, образование веретена деления, движение хромосом, цитокинез) [35].

На основании морфологических признаков и цитохимических нарушений митотического процесса выделяют три основных группы патологии митоза: патология, связанная с повреждением хромосом; патология, связанная с повреждением митотического аппарата; нарушение цитокинеза.

I. Патология митоза, связанная с повреждением хромосом:

1) Задержка митоза наблюдается при нарушениях репликации ДНК;

2) Раннее (преждевременное) разделение хроматид в профазе (в норме разделение хроматид происходит на рубеже перехода метафазы в анафазу). Обозначенная патология наблюдается, к примеру, при изменении осмотического давления в фибробластах кролика в культуре ткани или же при воздействии канцерогенов (бензопирена, метилхолантрена) на мышиные фибробласты;

3) Фрагментация и пульверизация хромосом возникает в опухолевых клетках, при вирусной инфекции, в результате воздействия на нормальные клетки ионизирующего излучения или мутагенов. Фрагменты могут быть одиночными, парными и множественными. Те из них, которые лишены центромерного участка, не участвуют в метакинезе, и, соответственно, не расходятся к полюсам деления в анафазе. При массовой фрагментации хромосом (пульверизация) большинство фрагментов также беспорядочно рассеиваются в цитоплазме и не участвуют в метакинезе.

В итоге часть фрагментов хромосом может попасть в одно из дочерних ядер, либо резорбироваться, либо образовать обособленное микроядро. Также отдельные фрагменты обладают способностью воссоединяться своими концами, причём подобные воссоединения носят случайный характер и приводят к хромосомным аберрациям;

4) Хромосомные и хроматидные мосты являются следствием фрагментации хромосом. При воссоединении фрагментов содержащих центромер образуется дицентрическая хромосома, которая в ходе анафазы растягивается между противоположными полюсами деления, образуя мост. Хромосомный (обычно двойной) мост возникает в результате воссоединения фрагментов хромосом, каждый из которых образован двумя хроматидами с центромерой. Хроматидный (обычно одиночный) мост возникает в результате воссоединения двух фрагментов отдельных хроматид с центромерой.

К концу анафазы - в начале телофазы мосты обычно быстро рвутся в результате чрезмерного растягивания дицентрических фрагментов хромосом. Образование мостов приводит к генотипической разнородности дочерних клеток, а также нарушает течение завершающих стадий деления и задерживает цитокинез;

5) Отставание хромосом в метакинезе и при расхождении к полюсам возникает при повреждении хромосом в области кинетохора. Поврежденные хромосомы пассивно «дрейфуют» в цитоплазме и в итоге либо разрушаются и элиминируются из клетки, либо случайным образом попадают в одно из дочерних ядер, либо образуют отдельное микроядро. Отставание хромосом наблюдалось в культурах ткани опухолевых клеток, а также в экспериментах, в ходе которых кинетохоры хромосом облучались микропучком ультрафиолетовых лучей;

6) Образование микроядер происходит вследствие фрагментации или отставания отдельных хромосом, вокруг которых в телофазе формируется ядерная оболочка, параллельно образованию оболочки вокруг основных дочерних ядер. Новообразованные микроядра либо сохраняются в клетке в течение всего дальнейшего клеточного цикла вплоть до очередного деления, либо подвергаются пикнозу, разрушаются и выводятся из клетки;

7) При нерасхождении хромосом сестринские хроматиды не разъединяются с началом анафазы и вместе отходят к одному из полюсов, что приводит к анеуплоидии;

8) Набухание и слипание хромосом наблюдается в опухолевых клетках и при воздействии токсических доз различных митотических ядов. Вследствие набухания хромосомы теряют свои нормальные очертания и слипаются, превращаясь в комковатые массы. Расхождения хромосом не происходит и клетки в таком состоянии зачастую погибают.

II. Патология митоза, связанная с повреждением митотического аппарата:

1) Задержка митоза в метафазе характерна для всей группы патологий митоза, связанных с повреждением митотического аппарата;

2) Рассеивание хромосом в метафазе происходит в результате повреждения или полной дезорганизации митотического аппарата;

3) Многополюсный митоз связан с аномалией репродукции центриолей, что ведет к формированию дополнительных полюсов и веретен деления. В итоге хромосомы распределяются неравномерно между дочерними ядрами, что в свою очередь ведет к образованию анеуплоидных клеток с несбалансированным набором хромосом;

4) Моноцентрический анафазамитоз связан с нарушением разделения центриолей. При этом формируется лишь один полюс, от которого расходятся нити единственного полуверетена. В итоге моноцентрический митоз приводит к полиплоидизации;

5) Асимметричный митоз характеризуется непропорциональным развитием противоположных полюсов деления, что приводит к неравномерному распределению хромосом между дочерними ядрами, то есть к анеуплоидии. В результате асимметричный митоз приводит к образованию микроклеток и гигантских клеток с гипо- и гиперплоидными ядрами;

6) Трехгрупповая метафаза и метафаза с полярными хромосомами характеризуется наличием в метафазе помимо основной экваториальной пластинки ещё двух групп или отдельных («полярных») хромосом в области полюсов деления клетки. Хромосомы сохраняются вблизи полюсов веретена из-за отставания в процессе метакинеза, а не из-за преждевременного расхождения. Причинами отставания могут служить повреждения кинетохора или дезорганизация отдельных хромосомальных нитей, участвующих в движении отстающих хромосом;

7) Полая метафаза представляет собой кольцевое скопление хромосом в экваториальной пластинке вдоль периферии клетки.

III. Патология митоза, связанная с нарушением цитотомии

Различают две группы патологии митоза, связанные с нарушением цитотомии: раннюю цитотомию, берущую начало ещё в анафазе; либо наоборот, запаздывание или полное отсутствие цитотомии, в результате чего формируются двуядерные клетки, либо образуется одно полиплоидное ядро [36].

1.5 Нарушение митотической активности клеток при облучении

Нарушение митотической активности клеток зависит от вида излучения и его энергии. Радиобиологический эффект излучений разного вида и неодинаковой энергии, но в одной и той же поглощенной дозе может быть различным.

Биохимическая природа радиационного нарушения в митозе клеток пока неизвестна. Предполагается, что в результате нарушения обмена веществ в клетке накапливаются метаболиты, ингибирующие деление клетки [38]. Например, есть данные, что накопление АТФ тормозит митоз. Установлено, что при облучении нарушается обмен нуклеиновых кислот. По-видимому, эти нарушения также ответственны за торможение или блокаду митоза клеток. Однако убедительных доказательств о связи между радиационным нарушением синтеза ДНК и торможением митоза еще нет.

Установлено, что облучение клеток на стадии интерфазы митоза приводит к замедлению процесса и даже его полной остановке. Однако митотические последствия облучения имеют ритмический характер: после уменьшения числа митозов митотическая активность или восстанавливается или даже усиливается, затем наступает новый спад ее и новое возвращение к норме или стимуляция и т.д. Объяснение этого эффекта весьма дискуссионно. По крайней мере, с внешней стороны, в этом процессе наблюдаются признаки, столь характерные для физиологической реакции торможения и возбуждения биологической системы. Пострадиационное (после облучения) уменьшение митотической активности клеток имеет еще ряд закономерностей. Время наступления минимума митотической активности клеток, длительность и степень торможения митоза зависят от биологической специфики облучаемых клеток, от дозы излучения и в определенных пределах от мощности дозы излучения. Митотическая радиоустойчивость также значительно различается для разных клеток. У дрожжей митотическая активность нарушается при дозах около 1000 рад, а у растительных и животных организмов при дозе 50 рад. Падение митотической активности в эпидермисе мыши обнаруживается уже при облучении в дозе около 5 рад.

Вообще следует отметить, что пострадиационное нарушение митотической активности весьма чувствительный тест на биологическое действие радиации. Другим морфологическим эффектом, наблюдаемым в клетках после облучения, являются повреждения хромосом (слипание, образование комков, набухание). Такое действие излучения на хромосомы называют диффузным, так как оно не локализовано, а распространяется на всю хромосому. Предполагается, что диффузное действие излучения на хромосому объясняется какими-то нарушениями в белковой части нуклеопротеидов. Как правило, это действие обратимо: деление клеток продолжается, и образование комков хромосом при последующих делениях не возобновляется. Однако могут быть и необратимые диффузные нарушения хромосом, приводящие к смерти клетки. Наблюдаются и другие повреждения хромосом локальные, ограничивающиеся одним или несколькими участками хромосом. Такие морфологические изменения хромосом называются аберрациями. Можно указать два типа хромосомных аберраций: поломки или разрывы хромосом и соединение фрагментов разных хромосом. Если нарушенная хромосома восстанавливает свое первоначальное состояние, то такой процесс называется реституцией. Соединение фрагментов хромосом приводит к появлению структурно новой хромосомы. Имеющиеся данные показывают, что разрывы хромосом являются следствием не только прямого поражения хромосом ионизирующими частицами, но главным образом следствием косвенного действия через радиационнохимические эффекты.

О косвенном действии излучения на появление хромосомных аберраций свидетельствует кислородный эффект. Установлено, что с увеличением дозы облучения число хромосомных аберраций увеличивается. Наблюдается также зависимость числа хромосомных аберраций от мощности дозы излучения. Облучение в одной дозе, но при большей мощности дозы вызывает больше аберраций, чем при облучении меньшей мощности дозы.

Хромосомные аберрации могут приводить к разным последствиям: нарушению обмена веществ, задержанию митоза, появлению морфологически видоизмененных клеток и новых генотипов. Крайним случаем является гибель клетки.