Отримані результати дозволили обґрунтувати підходи до проведення біотестування мінеральних вод з використанням люминесцирующих мікроорганізмів, що виключають вплив їх нормального компонентного складу на результати дослідження. Запропонована пробопідготовка включає послідовну дегазацію, диференційовану (залежну від вихідного сольового складу) мінералізацію і нормалізацію рН досліджуваних вод, що дозволяє відновити рівень світіння бактеріальних біосенсорів із збереженням їх чутливості до дії хімічних полютантів.

На даній основі розроблено та впроваджено методичні рекомендації "Методика експресного визначення токсичності питних бутильованих мінеральних вод за допомогою люмінесцентних бактеріальних біосенсорів" (затверджені 27.08.2007 р), призначені для використання фахівцями "Центру гігієни і епідеміології" і "Роспотребнадзора", що є реальним прикладом практичного використання даного виду біосенсорів.

2.2.3 Системи ферментів мікроорганізмів в якості промоторів

У системі біосенсорного моніторингу особливе місце займає контроль забруднення навколишнього середовища. Хоча існуючі методи фізико-хімічного аналізу дозволяють надійно і з високою точністю визначати якісний і кількісний склад цілого ряду екотоксикантів, вони не завжди можуть оцінити їх біодоступність і небезпеку для живих організмів. Відомо, що в грунтових екосистемах рухливість, біодоступність і, отже, токсичність хімічних сполук істотно залежить від форм їх знаходження і типу зв'язку з грунтом. При цьому в ряді випадків, аналіз екотоксикантів ускладнений необхідністю очищення екстрактів з грунтів перед інструментальним визначенням досліджуваних компонентів, що є досить трудомістким процесом, часто призводить до помилок в результатах аналізу. У зв'язку з цим, велика увага приділяється експресним методам аналізу, орієнтованим на швидкий попередній контроль небезпечного рівня забруднення або превалюючого токсичного ефекту. Поставлені завдання можуть бути досягнуті, насамперед, шляхом поєднання фізико-хімічних методів і сучасної біосенсорной технології.

Як правило, іони металів потрапляють в клітину неспецифічним шляхом, в результаті дифузії по осмотичного градієнту, створюваному мембраною клітини. Однак ряд металів входить в клітку більш повільно, специфічно, через певні транспортні канали і з витратою енергії АТФ. Щоб вижити в навколишньому середовищі, мікроорганізми виробили механізми стійкості до токсичного впливу металів. Так, може відбуватися зв'язування металів в цитоплазмі клітини з білками - металотіонеїнами, зв'язування іонів металів на зовнішній стороні мембрани клітини, відновлення іонів металів, щоб привести їх у менш токсичну форму, активний транспорт іонів металів з клітини. Можна модифікувати іони металів, щоб перевести їх в нерозчинну або менш токсичну форму.

Механізми стійкості мікроорганізмів до дії металів визначаються опероном, присутніми на плазмідах, транспозонах або хромосомах клітини. У багатьох випадках, такі оперони кодують ферменти, що забезпечують стійкість до близьких по біохімічному характеру дії металів. Попадання іонів металів в клітини індукує синтез ферментів, необхідних для забезпечення резистентності клітин до токсичної дії. Спираючись на існування механізмів резистентності, були розроблені численні специфічні тест-системи для оцінки вмісту іонів у навколишньому середовищі, наприклад, ртуті, хрому, кадмію, міді, алюмінію, сурми, нікелю, миш'яку.

Органічні сполуки є головними джерелами забруднення довкілля і вони стали основною мішенню для розвитку цільноклітинних біосенсорів. Багато бактеріальних видів здатні використовувати органічні сполуки як джерело вуглецю. Отже, ці мікроорганізми мають ферментні системи, що дозволяють метаболізувати органічні сполуки, і вони наразі використовуються для ліквідації наслідків забруднення навколишнього середовища нафтою та іншими вуглеводнями. Біодоступність екотоксикантів, чутливість і селективність розроблюваних тест-систем, механізми регуляції, активності та експресії необхідних для деструкції екотоксикантів ферментів, є основою розроблюваних тест-систем. Такі системи повинні включати промотор з системи ферментів, регулюючої розщеплення органіки, і репортерний білок. Створені з цією метою клітинні біосенсори виявилися експресними і набули широкої популярності.

Цільноклітинні бактеріальні генетично модифіковані біосенсори, являють собою експресний, недорогий і чутливий засіб для вивчення екологічного стану навколишнього середовища. Сучасні тест-системи дозволяють проводити визначення зазвичай без екстракції ферментних і репортерних білків з клітки, що дає вагомі переваги для роботи в польових умовах на "живий" системі. В даний час застосування цільноклітинних біосенсорів розширюється в не тільки в галузі біотехнології, але і в медицині при діагностиці, фармакології, харчовій та хімічній промисловості, в наукових дослідженнях при вивченні регуляції транскрипції генів, у функціональній геноміки, мікробної екології in situ. За допомогою цільноклітинних біосенсорів можна оцінити токсичність металів, загальну токсичність і генотоксичность, мутагенний і канцерогенний потенціал антибіотиків, багатьох лікарських і знову синтезованих органічних і неорганічних сполук. Можна вивчати метаболізм цілих організмів і мікроорганізмів, долю препаратів, що застосовуються для захисту рослин від шкідників, пестицидів і фунгіцидів. Модифікації промоторів мікроорганізмів і інші генетичні маніпуляції, дозволяють збільшити чутливість визначення аналітів. Хоча слід зазначити, що застосування природних, чи не модифікованих промоторів, дозволяє оцінити вплив екотоксікантов найбільш адекватно [37, 41].

Висновок

У ході виконання курсової роботи були розглянуті нанотехнології з використанням мікроорганізмів та продуктів їх життєдіяльності. Можна зробити певні висновки про значення даних технологій, рівень їх розвитку на даний момент та перспективи подальшого дослідження.

Визначили, що мікроорганізми в біонанотехнології використовуються переважно в двох напрямках: виготовлення наноматеріалів і здійснення певних логічних операцій в якості нанокомп'ютерів, наносенсорів і їх складових. Використання живих об'єктів мікросвіту зумовлене рядом переваг перед класичною нанотехнологією.

Властивості матеріалів, отриманих за допомогою мікроорганізмів, перевершують аналогічні синтетично вироблені матеріали: отримані структури високо організовані у нано-, мікро- і макромасштабах, часто в ієрархічному порядку, зі складною наноархітектурою, і в кінцевому підсумку складають безліч матеріалів із широким спектром властивостей. Вони одночасно є ''розумною'', динамічною, складною, здатною до самовідновлення і багатофункціональною системою. На відміну від штучних засобів продукування наноматеріалів, використання мікроорганізмів позбавляє проблеми енергетичного забезпечення процесу, а велика швидкість розмноження організмів збільшує його продуктивність.

Біологічні нанокомп'ютери дуже дешеві у виробництві, не потребують настільки стерильної атмосфери, як при виробництві напівпровідників. Особливою перевагою біонаномашин є біосумісність, можливість активно брати участь в біологічних сигнальних каскадах. Вони створені для роботи в специфічному середовищі і позбавляють проблеми пристосування механізму до жорстких біохімічних і біофізичних умов. Переваги використання цільноклітинних біосенсорів пов'язані з їх високою специфічністю, селективністю і швидкістю дії. Принциповою особливістю їх використання є здатність оцінити не тільки біодоступність аналіту, а й фізіологічне значення отриманих даних.

"Лідерами” серед об'єктів мікробіології в нанотехнології є вірус тютюнової мозаїки, бактеріофаг М13 та E. coli.

Проте вищезазначені переваги здебільшого компенсуються занадто складним технологічним процесом, неможливістю використання за межами лабораторії, економічною невигідністю і обмеженістю набору процесів. З огляду на опрацьовані результати досліджень можемо зробити висновок, що біонанотехнологія з використанням мікроорганізмів потребує подальшого розвитку для розробки нових методів і оптимізації існуючих.

Список літератури

1. Fischlechner M. Donath E. Viruses as building blocks for materials and devices // Angew. Chem. Int. Ed. Engl. - 2007. - Т.46, №18. - С.3184-3193.

2. E. Dujardin, C. Peet, G. Stubbs Organization of metallic nanoparticles using tobacco mosaic virus templates // Nano Lett. - 2003. - Т.3, №3. - С.413-417.

3. M. Knez, A. M. Bittner, F. Boes Biotemplate synthesis of 3-nm nickel and cobalt nanowires // Nano Lett. - 2003. - Т.3, №8. - С.1079 - 1082.

4. M13 Virus-Enabled Synthesis of Titanium Dioxide Nanowires for Tunable Mesoporous Semiconducting Networks / Po-Yen Chen, Xiangnan Dang, Matthew T., Courchesne N. D., Jifa Qi, Md Nasim Hyder, Belcher A. M., Hammond P. T. // Chem. Mater., - 2015. - T.27, №5. - С.1531-1540.

5. UIC News Center [Електронний ресурс]: Tiny bio-robot is a germ suited-up with graphene quantum dots // Режим доступу: http://news. uic.edu/tiny-bio-robot-is-a-germ-suited-up-with-graphene-quantum-dots.

6. S-layers: principles and applications / U. B. Sleytr, B. Schuster, E. Egelseer, D. Pum // FEMS Microbiology Reviews. - 2014. - Т.38,№5. - С.823-864. 2009. - T.168, №1. - 207-216.

7. Absorption, steady-state fluorescence, fluorescence lifetime, and 2D self-assembly properties of engineered fluorescent S-layer fusion proteins of Geobacillus stearothermophilus / Kainz B., Steiner K., Moller M., Pum D., Schдffer C., Sleytr U. B., Toca-Herrera J. L. // Biomacromolecules. - Т.11. - С. 207-214.

8. Geobacter sulfurreducens conductive pili as biological nanowires and uses thereof [Текст]: патент UMA 05-09/Derek R. Lovley; власник патенту University of Massachusetts, Amherst. - US Patent №7,498,155; опубл.3.03.09, - 6 с.

9. Способ очистки теплотехнического оборудования от накипи [Текст]: патент / Богомолов В.Н., Звенигородский В. П.; власник патенту Богомолов В.Н. - РФ № 2213922; опубл.10.10.2003, - 2с.

10. Sarikaya М. Biomimetics: Materials fabrication through biology. PNAS. - 1999. - Т.96, №25. - С.14183-14185.

11. Synthesis of yeast-assisted Co₃O₄ hollow microspheres-A novel biotemplating technique / Li Yang, W. Guan, Bo Bai, Qing Xu, Yun Xiang // Journal of Alloys and Compounds. - 2010. - Т.504, №L. - C.10-13.

12. Virus-based toolkit for the directed synthesis of magnetic and semiconducting nanowires / Mao C., Solis D.J., Reis B.D., Kottmann S.T., Sweeney R.Y., Hayhurst A., Georgiou G., Iverson B., Belcher A.M. // Science. - 2004. - Т.213, №7. - С.5655.

13. Virus-enabled synthesis and assembly of nanowires for lithium ion battery electrodes / Nam K.T., Kim D.W., Yoo P.J., Chiang C.Y., Meethong N., Hammond P.T., Chiang Y.M., Belcher A.M. // Science. - 2006. - T.885, №8. - С.5775.

14. Ordering of quantum dots using genetically engineered viruses / Lee S.W., Mao C., Flynn C.E., Belcher A.M. // Science. - 2002. - Т.296, №5. - С.5569.

15. Галаганова Е.Н. Методы получения наноматериалов из микроорганизмов и их применение // Электронный журнал: Молодежный научно-технический вестник. - 2013. - Т.68.

16. Беззубов С.И., Воробьева Н.А., Ефимов А.А. Мать - природа в помощь // Нанометр. - 2010. - T.54, №2. - С.121-134.

17. Two-stage photobioreactor process for the metabolic insertion of nanostructured germanium into the silica microstructure of the diatom Pinnularia sp. / C. Jeffryes, T. Gutu, Jun Jiao, G. L. Rorrer // Materials Science and Engineering. - 2008. - Т.28. - С.107-118.

18. Silver-based crystalline nanoparticles, microbially fabricated / T. Klaus, R. Joerger, E. Olsson, C. - G. Granqvist // PNAS. - 1999. - Т. 1986, №77. - С.5331-5345.

19. Guimaraez A.P. Principles of nanomagnetism / Guimaraez A.P. - Berlin, Heidelberg: Springer, 2009. - 221с. ?

20. Нанобіологія, біоміметика та природні наноструктури / Чекман І.С., Сімонов I.В., Нагорна О.О., Шаторна В.Ф. // Нанонаука, нанобіологія, нанофармація - К.: Полишграф плюс, 2012. - С.160-173.

21. Controlled cobalt doping of magnetosomes in vivo / S. Staniland, W. Williams, N. Telling // Nat. Nanotechnol. - 2008. - Т.3, №3. - С.158-162.

22. Niemeyer C. M. Immuno-PCR: high sensitivity detection of proteins by nucleic acid amplification / C. M. Niemeyer, M. Adler, R. Wacker // Trends Biotechnol. - 2005. - Т.23, №4. - С. 208-216. ?

23. Magneto immuno-PCR: a novel immunoassay based on biogenic magnetosome nanoparticles / R. Wacker, B. Ceyhan, P. Alhorn [et al.] // Biochem. Biophys. Res.commun. - 2007. - Т.357, №2. - С.391-396. ?

24. Seeman N. C. Nucleic Aacid Junctions and Lattices // Journal of Theoretical Biology. - 2003. - T.99. - C.237-247.

25. Бронштейн И.Б. Молекулярная биология. - 1999. - Т.23. - С.1553-1557.

26. Topological transformations of synthetic DNA knots // Biochemistry. - 1995. - T.34. - C.673-682.

27. Digital memory device based on tobacco mosaic virus conjugated with nanoparticles / R. J. Tseng, C. Tsai, Liping Ma, J. Ouyang, C. S. Ozkan, Yang Yang // Nature Nanotechnology. - 2006. - T.1. - C.72 - 77.

28. Tseng R. J. Polyaniline nanofiber/gold nanoparticle nonvolatile memory // Nano Lett. - 2005. - Т.5. - С.1077-1080.

29. Третьяков Ю.Д. Нанотехнология. Азбука для всех // М.: Физматлит. - 2009. - 368с.

30. Silva-Rocha R., Lorenzo V. Mining logic gates in prokaryotic transcriptional regulation networks // FEBS letters. - 2008. - T.582, №8. - С.1237-1244.

31. Biotemplated Magnetic Nanoparticle Arrays / J. M. Galloway, J. P. Bramble, A. E. Rawlings, G. Burnell, S.D. Evans, S.S. Staniland // Small7 - T.8, №2. - С. 204-208.

32. Fabrication of Quantum Dots Embedded Lipid Tubules by Membrane Tubulation Protein / Tanaka M., Critchley K., Matsunaga T., Evans S., Staniland S. // Small. - 2012. - T.8, №10. - С.1590-1595.

33. Engineering modular and orthogonal genetic logic gates for robust digital-like synthetic biology / B. Wang, R. Kitney, N. Joly, M. Buck // Nature Communications. - T.508, №2. - 2011. - С.1516-1537

34. Modular, Multi-Input Transcriptional Logic Gating with Orthogonal LacI/GalR Family Chimeras / D. L. Shis, F. Hussain, S. Meinhardt, L. Swint-Kruse, M. R. Bennett // Synth. Biol. - T.9, №3. - 2014. - С.645-651

35. Горленко В.А., Кутузова Н.М., Пятунина С.К. Научные основы биотехнологии. Нанотехнологии в биологии. - М.: Наука, 2013. - 264 c

36. G. K. Knopf, A. S. Bassi Smart Biosensor Technology. - CRC Press, 2006. - 664с.

37. Лавриненко И.А., Лавриненко В.А. Бактериальные биосенсоры и их применение в экологическом мониторинге. - Новосибирск, 2009. - 132с.

38. Каримов И.Ф. Использование люминесцирующих бактерий при оценке фагоцитарный активности нейтрофилов: Автореф. дис. канд. биол. наук: 03.00.07; 14.00.36. - Пермь, 2009. - 17с.

39. Алешина Е.С. Использование люминесцирующих микроорганизмов для биотестирования минеральных вод: Дис. канд. биол. наук: 03.00.07. - Оренбург, 2008. - 182с.

40. Использование бактериальной биолюминесценции для тестирования токсичности воды при ее очистке от ПАВ / Кацев А.М., Стародуб Н.Ф., Левковец И.А., Гончарук В.В., Клименко Н.А., Вакуленко В.Ф. // Химия и технология воды - 2003. - Т.25, № 6 - С.594 - 602.

41. Левковець І.А. Розробка інструментальних аналітичних біотестів та вивчення їхніх основних характеристик при визначенні токсичності об'єктів довкілля: Автореф. дис. на здобуття наук. ст. канд. біол. наук: 03.00.20. - Київ, 2005. - 18с.

Размещено на Allbest.ru