Идентификация микроводорослей Euglena glacilis и анализ их чувствительности к ингибирующим веществам

Зелёные водоросли широко распространены по всему миру. Большинство из них можно встретить в пресных водоёмах (представители харофитов и хлорофициевых), но немало солоноватоводных и морских форм (большинство представителей класса ульвофициевых). Среди них есть планктонные, перифитонные и бентосные формы. Есть зелёные водоросли, которые приспособились к жизни в почве и наземных местообитаниях. Их можно встретить на коре деревьев, скалах, различных постройках, на поверхности почв и в толще воздуха. Массовое развитие микроскопических зелёных водорослей вызывает "цветение" воды, почвы, снега, коры деревьев и т. д.

Существуют паразитические представители зелёных водорослей, большинство из которых в качестве хозяина имеют высшие растения.

· Отдел Euglenophyta - эвгленовые водоросли:

У эвгленовых форма тела варьирует от веретеновидной, овальной до плосколистовидной и игловидной. Передний конец тела более или менее закруглён, задний может быть вытянутым и заканчиваться заострённым отростком. Клетки могут быть спирально скручены. Длина клеток от 5 до 500 мкм и более.

Эвглениды имеют 1, 2, 3, 4 и 7 видимых жгутиков, за исключением небольшой группы безжгутиковых форм, а также прикрепленных организмов. Жгутики отходят от колбообразного впячивания на переднем конце клетки -- глотки (ампулы).

Светочувствительная система эвгленовых состоит из двух структур. Первый компонент -- это парафлагелларное тело (парабазальное вздутие), представляет собой вздутие при основании одного видимого жгутика и содержит синие светочувствительные флавины. Второй компонент системы -- глазок (стигма), расположенный в цитоплазме около резервуара напротив парафлагелларного тела.

Эвгленовым водорослям свойственно автотрофное и гетеротрофное (сапротрофное) питание. В последнем случае питательные вещества поступают в клетку в растворенном виде, всасываясь всей ее поверхностью (осмотрофный тип). Некоторые виды характеризуются также фаготрофным способом питания. Известны ауксотрофные представители эвглен, зависимые по витаминам В12 и В,.

Если эвглен долго культивировать в подходящей питательной среде в темноте, они могут утрачивать хлоропласты и неограниченно долго демонстрировать гетеротрофный тип питания, ничем не отличаясь в этом случае от простейших. Таким образом, эвглен можно считать простейшими с нестабильным наследованием хлоропластов.

Эвгленовые водоросли обитают в основном в пресных водах, предпочитая водоёмы с замедленным стоком и богатым содержанием органических веществ. Их можно обнаружить в прибрежье озёр и рек, в мелких водоёмах, включая лужи, на рисовых полях, на сырой почве. В почвах бесцветные представители встречаются на глубине 8-25 см. Окрашенные эвгленовые могут вызывать цветение воды, образуя на её поверхности плёнку зелёного или красного цвета.

В значительной степени эвгленовые водоросли реагируют на степень минерализации воды: чем она выше, тем беднее их качественный и количественный состав. Некоторые выдерживают высокую солёность воды.

Среди эвгленовых встречаются фотоавтотрофы, гетеротрофы (фаготрофы и сапротрофы) и миксотрофы. Только треть родов способны к фотосинтезу, а остальные -- фаготрофы и осмотрофы. Даже фотосинтезирующие эвгленовые способны к гетеротрофному росту. Большинство гетеротрофных форм -- сапротрофы, поглощающие растворённые в воде питательные вещества.

· Отдел Dinophyta - динофитовые водоросли:

Большинство представителей -- двусторонне-симметричные или асимметричные жгутиконосцы с развитым внутриклеточным панцирем.

Размножаются вегетативным, бесполым и половым способом.

Морские и пресноводные формы, планктон и бентос, иногда встречаются как симбионты растений, иногда -- паразиты ракообразных и червей. Могут вызывать цветение воды. Динофиты -- важная группа фитопланктона в морских и пресных водах. Их значение прежде всего определяется тем, что они занимают второе место после диатомей как продуценты первичной продукции в прибрежных морских водах, являются пищей для различных простейших, коловраток, рыб. Большинство динофит (около 90 % видов) обитают в морских водах.

- Подцарство Багряники (Rhodobionta):

· Отдел Rhodophyta - красные водоросли:

Обычно это довольно крупные растения, но встречаются и микроскопические. Среди красных водорослей имеются одноклеточные (крайне редко), нитчатые и псевдопаренхимные формы, истинно паренхимные формы отсутствуют. Ископаемые остатки свидетельствуют, что это очень древняя группа растений. Обычно это довольно крупные растения, но встречаются и микроскопические.

Для красных водорослей характерен сложный цикл развития, не встречающийся у других водорослей.

Отдел красных водорослей (Rhodophyta) включает виды, в клетках которых есть особый класс фотосинтетических пигментов - фикобилинов (фикоцианин и фикоэритрин), придающих им красную окраску (поэтому их называют багрянками). Эти вспомогательные пигменты маскируют цвет основного фотосинтетического пигмента - хлорофилла а. Преобладающим резервным веществом багрянок является крахмалоподобный полисахарид. Клеточные стенки этих водорослей содержат целлюлозу или другие полисахариды, погруженные в слизистый матрикс, который представлен, в свою очередь, агаром или карраги-наном. Эти компоненты делают красные водоросли гибкими и скользкими на ощупь. Некоторые багрянки откладывают в клетках карбонат кальция, что придает им жесткость. Такие формы играют важную роль в формировании коралловых рифов.

Красные водоросли не имеют жгутиков, большинство ведет неподвижный образ жизни в прикрепленном к камням или другим водорослям состоянии.

В Баренцевом море красные водоросли -- типичные представители прибрежной бентосной растительности.

Некоторые виды красных водорослей употребляются в пищу. Из красных водорослей также получают гелеобразующее вещество агар-агар [2].

1.2.2 Способы выделения микроводорослей и их идентификации

Выделение микроводорослей в культуру с помощью традиционных методов является хорошо изученной процедурой. Впервые методы выделения водорослей были описаны еще в конце XIX века М.Бейеринком и П.Миквелом. Все водоросли условно можно разделить на две группы. В первую группу входят виды, в английском языке часто называемые "weeds", которые легко выделяются и культивируются. Ко второй группе относятся виды, которые достаточно сложно выделяются и плохо культивируются. Поэтому не удивительно, что организмы из экстремальных и необычных местообитаний менее многочисленны в коллекциях культур, чем те, которые обитают в пресных водоемах, почвах и возле морских побережий.

Часто первым шагом на пути к успешной изоляции водорослей из их природной среды являются комплексные данные об их среде обитания. Например, для прибрежных морских водорослей важными факторами являются температура и соленость воды. Для океанского фитопланктона, кроме этих факторов, важны качество воды и токсичность металлов. Пресноводные водоросли, отобранные в весенне-летне-осеннее время, часто менее чувствительны к температуре, но подвержены влиянию рН среды. Полярные водоросли и водоросли снега очень чувствительны к высоким температурам, в то время как протисты горячих источников чувствительны к более холодным температурам. Водоросли, обитающие в кислых или засоленных местообитаниях, требуют специальных питательных сред. Для наземных или почвенных водорослей факторы окружающей среды менее значимы.

Для успешного культивирования необходимы и знания таксономии. Для выращивания диатомовых водорослей необходим кремний, эвгленовых - аммоний, некоторые виды (например, Chrysochromulina) нуждаются в селене. Миксотрофные виды (например, некоторые динофлагелляты и золотистые водоросли) нуждаются в добавлении источников питания для бактерий, бесцветные фаготрофы (например, Pfiesteria) могут требовать эукаритотических источников питания.

Следующим важным фактором, который нужно учитывать при культивировании, является уничтожение загрязнителей, особенно тех, которые могут конкурировать с нужным видом. Среди методов выделения водорослей наиболее распространенными являются изоляция с помощью разведения, изоляция отдельных клеток с помощью микропипеток, изоляция при помощи агара и др. Конечный этап выделения требует создания условий для дальнейшего роста водорослей. Иногда желаемый вид растет на начальных стадиях изоляции, но потом погибает после нескольких пересевов на свежую среду. Это является показателем того, что питательная среда лишена специфических элементов или органических веществ, недостаток которых сразу не проявляется. К сожалению, исследователь узнает об этом слишком поздно, когда оригинальный изолят уже погиб. Организм может подавляться отходами жизнедеятельности, что отравляет его среду обитания, приводя к гибели. В природе эти отходы обычно нейтрализуются другими организмами.

Отбор образцов

Методы культивирования иногда являются критическими точками при проведении экспериментальных работ, так как поврежденные или мертвые клетки приводят к неудаче. Если нужный вид хорошо известен, и если его собирали и изучали ранее, исследователь будет вооружен багажом знаний, который позволит ему успешно культивировать эти водоросли.

Образцы, отобранные на глубине, могут быть чувствительны к изменению давления, света или температуры. Образцы, отобранные в чистые контейнеры и хранимые при постоянной температуре, часто обеспечивают сохранение жизнеспособности водорослей, в то время как концентрированные среды для отбора образцов оказываются непригодными. Ученый должен потратить много времени, чтобы выделить несколько клеток нужного ему вида. Наконец, если отбор проб ведется в местообитании, сведения об особенностях которого отсутствуют, или если вид неизвестен, исследователь может использовать целый комплекс методов для выделения и культивирования.

Природные образцы часто содержат мелких животных. Эти животные могут быстро поедать и уничтожать водоросли. Более крупные животные (например, коллемболы, ресничные черви и др.) и нежелательные колониальные водоросли могут быть удалены путем фильтрации. Отверстия фильтра должны пропускать водоросли и задерживать животных. Для удаления ненужных организмов эффективно проводить фильтрацию сразу же после сбора образцов. Таким же образом, если образец содержит большое количество более мелких нежелательных организмов, таких как бактерии и другие водоросли, путем фильтрации можно собрать нужные водоросли, которые остаются на поверхности фильтра.

Время является важным фактором во время выделения водорослей. Некоторые организмы быстро погибают, даже спустя один или несколько часов после сбора образцов. Выделение этих организмов должно проводиться очень быстро. Когда образцы обогащаются, некоторые виды очень быстро размножаются, но могут внезапно погибнуть. В этих случаях рекомендуется следить за состоянием культуры через 1-2 дня. Наконец, некоторые организмы, которые не обнаруживаются во время сбора образцов, появляются спустя недели или даже месяцы.

Другим аспектом фактора времени является изменение условий существования вида. Успешный рост выделенных клеток зависит от условий или состояния клеток во время сбора образцов.

Во время сбора образцов другим важным фактором является соблюдение условий стерильности. Грязная посуда, сети, фильтры и другие приспособления для отбора образцов могут содержать устойчивые стадии других организмов, особенно цисты, которые могут привести к загрязнению. Это особенно важно, если исследователь пытается собрать пробы с неизвестными организмами, потому что загрязнитель можно легко принять за вид, обитающий в естественных условиях.

Среды, используемые при выделении водорослей

Выбор подходящей среды является важным условием для успешного культивирования водорослей. Поэтому перед началом выделения самое пристальное внимание следует уделить выбору среды для культивирования. Одиночные клетки широко распространенных организмов (таких, как Chlorella, диатомовые водоросли) хорошо растут после непосредственного помещения в готовую среду. Однако многие другие водоросли погибают в питательных средах. Слишком высокая концентрация солей является основной причиной неудачных попыток культивирования многих видов. Поэтому при выделении водорослей лучше всего использовать очень разбавленные среды. Для улучшения роста через неделю после начала культивирования в разбавленную среду нужно добавить необходимое количество питательных веществ. На разных стадиях роста культура требует разного количества питательных веществ, поэтому необходимо осуществлять постоянный мониторинг состояния культуры. После достижения необходимой скорости роста культуру можно поддерживать на обычных питательных средах.

Прежде чем приступить к характеристике разнообразных питательных сред, следует рассмотреть универсальные требования, предъявляемые к ним:

- питательная среда должна содержать достаточные количества биогенных, макро- и микроэлементов в составе тех веществ, которые используются данными микроорганизмами. При этом следует учитывать тип питания микроорганизмов;

- для инкубирования ауксотрофных микроорганизмов среда должна содержать необходимые факторы роста;

- среда должна содержать достаточное количество воды, чтобы все вещества в ее составе были в растворенном состоянии. Следует также учитывать потребность культивируемого микроорганизма к степени влажности, активности воды;

- среда должна характеризоваться определенными для данного микроорганизма значением pH и, по возможности, обладать высокой буферной емкостью, поскольку в процессе роста культуры микроорганизмов выделяют продукты обмена (чаще кислые), способные сильно изменить рН;

- среда должна быть стерильной.

Природные образцы часто лишены одного или более питательных веществ, однако в природе водоросли выживают, так как жизнедеятельность бактерий и гибель организмов восполняет этот дефицит. В отобранном образце это восполнение уменьшается или совсем прекращается, и этот питательный стресс может вызвать гибель нужного вида. Таким образом, для некоторых видов небольшое обогащение может продлить жизнь здоровых клеток водорослей, необходимых для выделения культуры. Обогащение полевых образцов может быть эффективным для океанических видов, когда отбор проб ведется на корабле, особенно во время длительных путешествий. В этих случаях добавление очень небольшого количества питательной среды или раствора солей позволяет культуре сохраниться до конца путешествия. Однако обогащение может быть вредным для водорослей в зависимости от места культивирования. Например, если нужный вид является редким и не может конкурировать с более широко распространенными видами, обогащение может снизить численность этого вида. В этом случае лучше не обогащать образец. Обогащенную культуру лучше хранить в специальном шкафу для инкубации, проверяя состояние нужного вида. После получения хорошо растущей культуры выделяют этот вид. Если водоросль хорошо растет в обогащенной культуре, это облегчает е? выделение.

Для подбора оптимального вещества для обогащения можно провести следующий эксперимент. В 10 пробирок нужно поместить по 10мл среды, и в каждую из пробирок добавить разные добавки (нитраты, фосфаты, силикаты, аммоний, железо и т.д.). Кроме того, можно попытаться смешать разные добавки. Затем в каждой из пробирок можно будет обнаружить различные организмы, в зависимости от того, какие добавки эти организмы предпочитают. Более того, в некоторых пробирках можно будет обнаружить организмы, не обнаруженные в среде до обогащения.

В каком количестве нужно обогащающие добавки? Хотя ответ на этот вопрос зависит от образца и среды, в целом ответ будет таков: "не очень много". Максимальное количество добавки - столько же, сколько содержится в обычной среде, содержащей этот компонент, минимум - одна тысячная доля этого количества. Добавление аммония особенно полезно для видов, нуждающихся в этом компоненте (например, для Aureoumbra). В некоторых случаях (например, для Aureococcus) концентрации аммония свыше 20мкммоль являются летальными. Таким образом, эти два вида водорослей, так похожие друг на друга во многих отношениях, различаются по своей потребности в питательных веществах.

Выборочное культивирование является разновидностью обогащенного культивирования для специальных целей. Если целью является выделение микроводорослей, которые могут расти при высоких концентрациях углекислого газа, тогда среды обогащают углекислым газом. Таким же образом могут быть составлены селективные культуры и по отношению к другим факторам (высокая и низкая температура, свет, соленость, рН). Специальные физические условия могут оказать сильное воздействие на рост культур. Например, некоторые бентосные диатомеи, особенно крупные Pinnularia, лучше развиваются при наличии осадка, по которому они могут двигаться и расти.

1) Выделение клеток с помощью микропипетки:

Этот метод является наиболее распространенным методом выделения водорослей. В этом методе используется микропипетка Пастера или стеклянный капилляр. Для этого пипетку Пастера нагревают в пламени спиртовки, вытягивают с помощью пинцета и ломают.

После некоторой практики эта процедура становится быстрой и легкой. Пипетку следует держать в одной руке, в другой руке следует держать пинцет, придерживая наконечник. Пипетки следует слегка покручивать, обеспечивая ее размягчение в точке плавления. Когда нагреваемый участок расплавится, пипетку двигают в пламени и постепенно вытягивают для получения тонкой трубочки. Если пипетку растягивать быстро и делать это в пламени горелки, то получается очень тонкая ниточка. Некоторые исследователи предпочитают работать с прямыми пипетками и затем загибать у них кончик. Изогнутый кончик удобен для того, чтобы достать водоросли из глубокой емкости, но прямой наконечник удобен для того, чтобы поместить водоросль в каплю воды. После вытягивания кончика пипетки его следует остудить в течение пары секунд. Затем пинцетом нужно найти участок в самом тонком месте, лучше всего перед изгибом вниз. Затем легким движением нужно сломать пипетку и отломанный конец выбросить. Если конец пипетки получился зубчатым, надо повторить всю процедуру, так как неровный конец не позволит захватить нужную клетку.

Некоторые исследователи делают сразу несколько микропипеток, в то время как другие предпочитают делать пипетку непосредственно перед использованием. Использованную ранее пипетку можно снова использовать для получения новых стерильных наконечников, при условии, что вода не попала в пипетку при предыдущем использовании. При повторном использовании пипетки, погружаемой в морскую воду, на стенках часто образуются микроскопические корки из соли.

Целью изоляции с помощью микропипетки является захват клетки водоросли из образца, перенесение клетки без повреждения в стерильную каплю, новый захват клетки, и перенесение клетки в новую стерильную каплю. Этот процесс повторяется до тех пор, пока одиночная клетка водоросли, свободная от других протист, может быть перенесена в среду для культивирования в соответствии с рисунком 2.

Рисунок 2 - Использование пипетки для удаления нежелательных организмов.

В левой и средней части рисунка показано, как удаляются нежелательные организмы, при этом в правой части рисунка показано, что нужный организм остается в стерильной капле

Для организмов с прочной клеточной оболочкой даже многоэтапная процедура изоляции не страшна, однако выделяя водоросли с нежной оболочкой, нужно всегда помнить об осторожности.

При выделении водорослей необходимо использовать микроскоп. Образец, содержащий нужный вид, может быть перенесен в стеклянную или пластиковую чашку, планшету или любой другой контейнер. Стерильная капля воды должна быть подготовлена до начала процесса выделения. Иногда рекомендуется помещать каплю на агар для уменьшения испарения, однако это не всегда необходимо. Кроме того, агар не прозрачен, как стекло или пластик, и очень мелкие клетки на нем трудно разглядеть. Стерильная капля может состоять из стерильной морской, озерной или речной воды, или питательной среды. Водоросли должны выживать в капле, не испытывая стресса. Например, пресноводные водоросли погибают в морской воде или концентрированной питательной среде.

2) Выделение клеток с использованием агара:

Посев штрихом:

Выделение водорослей на агаровых чашках также является одним из старейших и распространенных методов. Этот способ предпочтителен для выделения многих коккоидных и большинства почвенных водорослей. Популярность метода объясняется не только его легкостью, но и тем, что аксеничные культуры могут быть получены без использования других процедур. Для успеха этого метода водоросли должны растить на агаре. Некоторые флагелляты (например, Heterosigma, Pelagomonas, Peridinium) не растут на агаре, другие (например, Chlamydomonas, Pavlova, Synura, Tetra-selmis) растут очень хорошо. Коккоидные клетки обычно очень хорошо растут на агаре, за некоторыми исключениями (например, Aureococcus, Au-reoumbra). Большинство диатомовых водорослей и некоторые криптофиты тоже хорошо растут на агаре. В большинстве случаев концентрация агара не является определяющим фактором, она может колебаться от 0,8% до 1,5-2%. Некоторые водоросли растут на "мокром" агаре (с концентрацией 0,3-0,6%), однако большинство водорослей все же хуже растут на влажных агаризованных поверхностях. Агар также является хорошей средой для роста грибов и бактерий. Полевые образцы с существенным грибным загрязнением могут принести много неприятных сюрпризов, так как грибы растут очень быстро, образуя спорангии и споры, затрудняя выделение водорослей. Для удаления нитей можно использовать фильтры и органические вещества. Если рост грибов наблюдается в чашках Петри, то их лучше сразу выбросить, не открывая. Наоборот, бактерии часто образуют маленькие ограниченные колонии, и одновидовые культуры можно получить, если их аккуратно перенести с поверхности твердой среды. Исключение составляют бактерии из образцов бентоса, отобранные в тропиках, поскольку они часто содержат бактерии, которые "растворяют" участки на поверхности агара.

Выделение водорослей методом "штриха" аналогично методикам, используемым для изоляции бактерий. Микробиологической петлей берут небольшое количество образца, который потом распределяют по поверхности среды, используя одну из нескольких методик.

Сначала штрихи содержат большое число водорослей, однако по мере движения петли число клеток уменьшается до одиночных клеток. После посева водорослей чашки инкубируют до начала роста колоний. Время инкубации варьирует от нескольких дней для почвенных и пресноводных водорослей до нескольких месяцев для океанических видов. Затем колонии, образованные потомками отдельных клеток, выделяют в культуру.

Колонии можно отделить с поверхности агара при помощи микропипетки или нихромовой (платиновой) микробиологической петли. Микропипетку обычно используют в сухих условиях. Если пипетка "загружена" стерильной жидкостью, то небольшое количество жидкости может рассеяться по колонии. Когда конец микропипетки коснется колонии, некоторое число клеток попадает в пипетку. Затем микропипетку нужно быстро опустить в сосуд с питательной средой или в другую чашку Петри. Клетки следует осторожно выдуть из пипетки. Водоросли можно также посеять штрихом на другую агаровую чашку. Если клетки были выделены из отдельных клеток с соблюдение правил стерильности, постепенно можно получить чистую аксеничную культуру.

Культивирование водорослей внутри агара:

Некоторые водоросли не растут на поверхности агара, но очень хорошо растут внутри него. Впервые эту методику использовал М.Бейеринк, однако он использовал вместо агара желатин. К.Скиннер применял интересную модификацию этого метода: он наливал агар в пробирки с водорослями, а потом, после инкубации, разбивал пробирки и доставал колонии водорослей. Е.Прингшейм обобщил историю методики выращивания внутри агара.

Позднее эту методику стали использовать для выращивания океанских пикопланктоновых видов. Для получения погруженных в агар колоний клетки из полевого образца или обогащенной культуры смешивают с жидким агаром и потом разливаются в чашки Петри. Агар должен быть прохладным - чуть выше температуры застывания - для предотвращения чрезмерного нагревания водорослей. Для этих целей лучше использовать агар с низкой температурой застывания. После этого чашки нужно остудить. Затем колонии нужно инкубировать при нужной температуре и освещенности до появления колоний водорослей. Потом можно выделить нужные водоросли с помощью микропипетки и поместить в жидкую питательную среду. Хотя с помощью этой методики можно поддерживать культуру достаточно длительное время, все же в большинстве случаев способ выращивания клеток внутри агара используется для выделения культуры.

Методика автоматизированного распыления:

Этот способ может использоваться для посева водорослей в чашки Петри. Методика может варьировать, однако суть метода состоит в распылении суспензии клеток водорослей с помощью специальных устройств. Для достижения лучших результатов эту процедуру лучше проводить в стерильном боксе, чтобы бактерии и грибы не попали в чашку. После инкубирования клеток выросшие колонии водорослей переносят в жидкую питательную среду.

Выделение водорослей методом перемещения через агар:

Агаровые чашки могут быть использованы для отделения нитчатых водорослей от эпифитов в качестве одного из этапов процесса выделения. Существует много различных вариаций этой методики. Обычно при использовании данного метода исследователи изготавливают из пипетки Пастера крючок, и с помощью этого крючка протаскивают нить через агар. Для более крупных нитей используется металлический крючок. Затем очищенная нить помещается в жидкую питательную среду или в чашку с агаром.

Метод разбавления:

Метод разбавления используется уже в течение многих лет, он эффективен для организмов, которые содержатся в образце в большом количестве, но неэффективен для редко встречающихся организмов. Целью метода разбавления является помещение клеток в пробирку, колбу или "гнездо" пластиковой планшеты с последующим получением одноклеточных изолятов в соответствии с рисунком 3. Если знать приблизительную концентрацию клеток, то можно легко вычислить необходимое разведение, чтобы небольшой объем раствора (например, одна капля, 50 мкл, 1мл) содержал одну клетку. Если приблизительная концентрация клеток неизвестна и не может быть быстро вычислена, то можно приготовить серию разбавленных растворов, уменьшая концентрацию от разведения к разведению в 10 раз. В большинстве случаев пятое или шестое разведение имеет необходимую концентрацию клеток (так, например, если в шестом разведении одна капля содержит одну клетку, то концентрация в первоначальном растворе была 106 клеток *мл^-1).

Рисунок 3 - Иллюстрация метода разбавления.

Аликвота берется из емкости с полевым образцом (слева) и помещается в пробирки, содержащие стерильную среду. После перемешивания, одна аликвота берется из пробирки и распределяется в планшету, содержащую стерильную среду, вторая аликвота добавляется в средние гнезда. После перемешивания процесс повторяется (распределение в гнезда и добавление в пробирки справа). Каждый цикл заключается в разбавлении природного образца и увеличивает возможность выделения отдельных клеток

Метод разбавления является наиболее распространенным методом, используемым при культивировании случайных видов из полевых образцов, особенно если целью исследователя является открытие новых видов. Применяются различные варианты этой методики. Во-первых разведение может проводится в питательной среде , дистиллированной воде (для пресноводных организмов), морской воде (для морских организмов), отфильтрованной воде из полевого образца, или комбинации из этих растворов. Питательная среда может содержать все соли, необходимые для выделения широко распространенных организмов, или же быть очень разбавленной для редких видов. Во-вторых, усилия исследователей могут быть направлены на концентрации, при которых возможно выделение отдельных клеток (10, 50, 100 попыток). Обычно делают большое количество пробирок из последнего разведения, принимая во внимание, что в некоторых пробирках клетки могут погибнуть, другие могут содержать несколько видов, а в следующих водоросли вообще могут отсутствовать. В-третьих, в некоторые пробирки могут быть добавлены микроэлементы (например, аммоний, селен), если целью является выделение видов, которые нуждаются в этих добавках. Таким же образом можно инкубировать водоросли при разной температуре и освещенности. При помощи этой методики редко удается получить аксеничные культуры, так как бактерии более многочисленны, чем водоросли.

3) Разделение водорослей центрифугированием и осаждением:

Разделение водорослей на основе силы тяжести может быть эффективным для разделения организмов, различающихся по размерам. Для этого используют два метода: центрифугирование и осаждение. Сила тяжести, возможно, чаще используется для концентрации нужных организмов, чем для получения одновидовых культур. Целью этой процедуры является отделение более крупных и тяжелых клеток от более мелких клеток и бактерий. Легкая фильтрация в течение короткого времени может использоваться для очистки диатомовых водорослей и динофлагеллят от более мелких клеток. Эту процедуру можно повторять до полной очистки культуры. Для быстро плавающих динофлагеллят этот процесс нужно проводить очень быстро, так как водоросли могут уплыть обратно в жидкость. Кроме того, сильное центрифугирование может повредить клетки, особенно нежные организмы со стрекательными клетками. Сила и скорость центрифугирования зависит от вида водоросли и определяется эмпирически. Центрифугирование с использованием градиента плотности (например, силикатных солей) также может использоваться для разделения лабораторных культур (Reardon et al., 1979).

Метод осаждения применяется для разделения неподвижных крупных или тяжелых клеток. Образец слегка встряхивается и помещается в пробирку, колбу, цилиндр или другой сосуд для осаждения. Осаждение проводят до тех пор, пока бoльшая часть нужных клеток не осядет на дно, в то время как более мелкие клетки будут оставаться в растворе. После этого верхняя часть раствора сливается. Этот процесс можно повторять до получения нужного результата.

Как центрифугирование, так и осаждение эффективны для концентрации крупных клеток, однако с помощью этих методов трудно получить одновидовые культуры или выделить отдельные клетки. Для этих целей нужно комбинировать центрифугирование и осаждение с другими методами (фильтрацией, изоляцией клеток с помощью микропипеток и т.д.).

4) Выделение с использованием фитотаксиса:

Фототаксис может быть использован для выделения флагеллят. Этот метод эффективен, если образец содержит один доминирующий вид флагеллят, обладающий фототаксисом. Если таких видов несколько, то процесс выделения отдельных видов затрудняется. Для этого метода необходима установка, включающая источник света. Самая простая установка представляет собой трубку со стерильной средой, на одном конце которой находится образец с водорослями, а на другом - источник света. После того как клетки продвинутся на достаточное расстояние в стерильную жидкость, они могут быть отделены с помощью микропипетки и помещены в стерильный сосуд. Для усовершенствования процесса выделения было предложено специальное устройство, состоящее из колбы со встроенным рукавом. Схема этого устройства изображена в соответствии с рисунком 4.

Рисунок 4 - Установка для выделения водорослей на основе: a - флагелляты, обладающие способностью к фототаксису, засасываются через конец пипетки и затем перемещаются через отверстия в пипетке. Конец пипетки ломается в месте, указанном стрелкой и выбрасывается, а водоросли из пипетки переносят в стерильную питательную среду; b - флагелляты, не способные к фототаксису, концентрируются с помощью яркого света в узком рукаве колбы (слева) и остаются там после выливания в результате закрывания отверстия рукава стеклянным шариком

Образец и стерильные шарики помещаются в колбу, рядом с которой устанавливается источник света. После того, как подвижные клетки водорослей вследствие фототаксиса заплывают в рукав, колба наклоняется так, что шарики закрывают рукав, в то время как оставшаяся жидкость выливается.

Более сложный метод предполагает использование специально сконструированной микропипетки, отделяющей флагелляты от других организмов. Часть наконечника пипетки ломается и выбрасывается, а клетки, которые заплывают выше уровня пипетки, попадают затем в специальный сосуд. Некоторые неподвижные клетки водорослей (например, Myxosarci-na) могут двигаться через агар к источнику света. После миграции отдельные клетки можно собрать и перенести в сосуд для дальнейшего культивирования.

6) Специальные методы выделения водорослей:

Выделение пикопланктона:

Ультрапланктон (?5мкм) и пикопланктон (?2мкм) из-за своих мелких размеров представляют трудности при выделении. Самым простым методом изоляции мелких водорослей является выделение методов штриха на агаре. Крошечные пресноводные водоросли достаточно легко выделяются на агаре. Сложнее выделить океанские виды, однако для этих случаев имеются специальные модификации этого способа. Океанские виды можно также выделить методом разведения, однако таким образом не всегда удается выделить одиночные клетки.

Для изоляции пикопланктона можно использовать и традиционную методику выделения с помощью микропипетки. Для очищения клеток от разнообразных частиц необходимо иметь чистую каплю воды. Это особенно важно для морских водорослей, так как в морской воде содержится большое число различных примесей. Разбавленная почвенная вытяжка, рекомендованная Е.Прингшеймом, подходит для выделения не только крупных пресноводных организмов, но и для изоляции пикопланктона, если из нее предварительно будут удалены все частицы. Частицы могут также образовываться на поверхности стекла при автоклавировании. Стеклянная посуда иногда создает некоторые проблемы при выделении пикопланктона. Для предотвращения образования частиц в жидкости (например, морской воде, почвенной вытяжке или питательнойсреде) существует два простых метода. Одним из методов может быть фильтрация с помощью фильтра с отверстиями диаметром 0,2мкм. Другой метод заключается в том, что морской воде или питательной среде дают отстояться в течение 1-3 дней, после чего надосадочную жидкость аккуратно отбирают с помощью пластиковой пипетки.

При выделении пикопланктона следует соблюдать условия стерильности, и ни в коем случае не допускать попадания пыли в используемую посуду и материалы. Перед использованием посуды ее необходимо обработать кислотой, а затем несколько раз сполоснуть бидистиллированной или деионизированной водой. Посуду лучше стерилизовать в сухожаровом шкафу при температуре 250?С в течение 3ч. При автоклавировании возможно образование микрочастиц на поверхности сосуда, которые затем переходят в раствор. Лучше всего использовать предварительно стерилизованную посуду, потому что ее поверхность не содержит частиц. Для этой цели очень хорошо подходят стерильные чашки Петри. Частицы могут образовываться также при стерилизации микропипетки в пламени. При выделении водорослей частицы копоти могут попасть в каплю с водорослями и затруднить их выделение. Таким образом, усилия исследователей должны быть направлены на предотвращение попадания любых микрочастиц в раствор с водорослями, потому что эти микрочастицы очень трудно отличить от пикопланктона.

При выделении пикопланктона освещение является критическим моментом. При работе с бинокулярной лупой освещение по методу темного поля предпочтительнее проходящего света. При темнопольной иллюминации крошечные клетки отражают свет таким образом, что их можно увидеть при увеличении ?2 (рекомендуется использовать большее увеличение). В жидкости клетки водоросли могут переворачиваться, и даже маленькая вспышка света, исходящая от хлоропласта при вращении клетки позволяет отличить клетку водорослей от бактерий или других клеток. С помощью микропипетки можно захватить клетки и поместить в стерильную каплю. Очень важным моментом является использование маленькой капли, так как очень маленькую клетку трудно найти в большой капле. Необходимо работать очень быстро, так как маленькая капля может быстро испариться. С помощью инвертированного микроскопа можно легче выделить клетку.

Крошечные клетки часто бывают более чувствительными к компонентам питательной среды, и после успешного выделения клетка водорослей может погибнуть в питательной среде. Для океанских видов их лучше всего поместить в каплю морской воды на несколько дней. После появления признаков нормального роста водоросли можно перенести в питательную среду.

Выделение водорослей, прикрепленных к субстрату:

Некоторые организмы сильно прикрепляются к поверхности, и во избежание повреждения клеток при их изоляции, необходимо работать очень осторожно. При выделении таких необычных водорослей следует использовать и неординарные методы изоляции. Например, обработка ультразвуком или более сильное перемешивание в данном случае не подходят, так как клетки могут затеряться, что сделает невозможным их дальнейшее выделение. Наиболее простым способом выделения таких водорослей является смыв струей воды из микропипетки. После смыва клетки следует быстро захватить, сполоснуть и поместить в среду для культивирования.

Некоторые прикрепленные водоросли (например, динофлагелляты) прикрепляются так сильно, что их невозможно отделить от субстрата с помощью струи воды. Существует другой метод выделения таких водорослей в культуру. Он основан на том, что некоторые водоросли, такие как Amphi-dinium restudo Herdman и Spiniferodinium, образуют подвижные клетки, но, к сожалению, период образования новых подвижных клеток сравнительно короток. При использовании данной методики обогащенные культуры изучаются несколько раз в течение одного дня, чтобы заметить начало образования новых, еще не прикрепившихся к субстрату клеток. Некоторые бентосные динофлагелляты образуют подвижные клетки через несколько часов после начала светлого периода суток. В этот период у исследователя появляется шанс для выделения таких клеток с помощью микропипетки.

Если перечисленные выше методы не дают нужного результата, могут быть предприняты более решительные попытки к их выделению. Рассмотрим пример отделения водорослей, прикрепленных к пластиковому субстрату (например, чашки Петри или пластиковые тарелки). В этом случае нежелательный материал может быть удален вокруг нужной клетки с помощью тонкой кисточки для рисования (для удаления более крупных частиц) или микропипетки (для удаления более мелких частиц). Далее, используя бритву или скальпель, осторожно вырезают часть сосуда вокруг клетки и переносят кусочек пластика вместе с содержащимися клетками в новый сосуд для культивирования.

Выделение аэрофильных водорослей:

Аэрофильные эпифитные водоросли растут на субстратах, находящихся в воздушной среде (например, коре деревьев, листьях, камнях и почве, зданиях и т.д.). Разнообразие водорослей, обитающих на этих субстратах, удивляет. Например, Дж.Фоерстер обнаружил 77 родов в лесах Пуэрто-Рико, другие альгологи выделили 91 вид микроорганизмов (в основном водорослей), обитающихна гигантском водяном жуке Lethocerus. Наиболее изученной группой водорослей являются почвенные водоросли, хотя водоросли, обитающие на других субстратах, тоже довольно хорошо исследованы. Образцы отбирают путем соскабливания, разделения на кусочки и т.д. Способы выделения таких водорослей также разнообразны, но чаще всего используется метод обогащенных культур и метод непосредственного выделения. Существует интересная методика выделения аэрофильных водорослей, основанная на погружении водяного жука прямо в питательную среду. При непосредственном выделении клетки могут быть помещены на поверхность агара, а колонии, образовавшиеся позже из этих одиночных клеток, могут быть помещены в среду для культивирования.

Водоросли, обитающие на поверхности водоемов ("seafoam"), занимают положение между субаэриальными и аэриальными водорослями. Их можно отбирать с помощью ножа или ложки, затем поместить в стерильный пластиковый пакет, а затем в лабораторных условиях культивировать с использованием классических методов. Такие накопительные культуры являются источником многочисленных водорослей, преимущественно пресноводных.

Аэриальные водоросли изучены меньше, чем субаэриальные. Так, например, П.Смит выделил 44 вида водорослей в Ралегхе (Северная Каролина). Методы отбора образцов аэриальных водорослей без загрязнения подробно описаны в статье Х.Шлихтинга с соавторами.

Выделение эпифитов после обработки ультразвуком:

Эпифитные водоросли, обитающие на более крупных водорослях или других организмах, достаточно трудно выделить с помощью микропипетки. Если попытаться соскоблить эпифиты, то можно повредить их клетки. В этом случае наиболее оптимальным вариантом является обработка ультразвуком. Этот способ позволяет нужным клеткам водорослей перейти в раствор, из которого их можно легко выделить.

Выделение водорослей, живущих в песке:

Песок является обычным субстратом для сообществ эпипелона. В песке обитают два вида водорослей: флагелляты, которые свободно плавают среди песчинок и водоросли, которые растут, прикрепляясь к песчинкам. Первые намного легче выделить, чем последние, так как песчинки помимо водорослей могут содержать и другие прикрепленные организмы.

Рассмотрим метод выделения водорослей, свободно плавающих среди песчинок. Во время сбора образцов верхний слой песка собирается с помощью стеклянной пробирки, бутылки с широким горлышком или маленьким совком. Ф.Раунд предложил помещать песок и воду в чашки Петри, а затем собирать клетки водорослей, поднявшиеся наверх, с помощью микропипетки, или позволять им расти на плавающих покровных стеклах. Стекла потом извлекаются с помощью пинцета и потом исследуются с помощью микроскопа. В случае обогащенных культур покровные стекла помещаются в чашки Петри со стерильной средой, покрываются парафильмом и инкубируются.

Существует другой метод выделения. Небольшое количество песка помещают в прозрачную пластиковую чашку с крышкой, куда добавляют необходимое количество питательной среды. Потом чашку наклоняют таким образом, чтобы песчинки оказались на одной стороне. Когда песок осядет, чашку снова переворачивают в нормальное положение. На другой стороне чашки устанавливают преграду для песка (например, палочки для еды) таким образом, чтобы образовалась своеобразная камера для культивирования. Затем с помощью бинокулярной лупы изучают клетки и отделяют нужные для дальнейшего культивирования.

М.Хоппенрат отделял прикрепленные к песку динофлагелляты, помещая замерзшую морскую воду на фильтр (с диаметром пор 0,45 мкм). По мере таяния жидкость проходит через песок и вымывает водоросли. Этот метод представляет собой модификацию, предложенную Г.Ухлингом.

Выделение водорослей из грязи является более трудной задачей, потому что грязь не оседает на дно. Для выделения водорослей можно использовать метод прикрепления к покровным стеклам и метод разведения. Выделение с помощью микропипетки возможно только при сильном разбавлении грязи.

Выделение цист из осадков:

Осадочные образцы содержат большое количество разрушенных органических остатков, что препятствует выделению водорослей. Для выделения флагеллят осадки могут обогащаться питательными веществами и инкубироваться на свету для прорастания цист. После прорастания цист водоросли могут быть выделены с помощью методов, описанных выше. В свою очередь цисты могут быть отделены от осадков с помощью нескольких методов. В этом случае концентрированные цисты могут быть собраны, промыты, а затем отдельные цисты могут быть помещены в контейнер для дальнейшей изоляции.

В некоторых случаях при прорастании цист происходит изменение плоидности (например, диплоидные цисты делятся митотически, производя гаплоидные клетки). Если важно выделить каждую гаплоидную клетку (например, при изучении полового размножения), применение в дальнейшем метода обогащенных культур невозможно. В этом случае необходимо изолировать каждую цисту путем пересадки в отдельный сосуд для культивирования (например, в пластиковую планшету) для того, чтобы можно было отслеживать процесс прорастания. Наблюдение ведут через каждые 1-2 часа. После прорастания цист четыре гаплоидные клетки должны быть выделены индивидуально и перенесены в культуру. Штамм водоросли, полученный из этих одноклеточных изолятов, должен содержать как женские, так и мужские клеточные линии.

Выделение водорослей, обитающих в проточных водоемах:

Некоторые виды, особенно растущие в проточной воде, для нормального роста требуют движения воды (то есть они погибают при выращивании в обычных сосудах). Для культивирования таких водорослей необходимо использовать специальные вращающиеся сосуды (например, производства Bellco., Inc.) в комплекте с необходимым оборудованием для создания движения. Таким же образом можно поместить сосуд для культивирования в специальное устройство для создания движения воды.

Таким образом, выделение водорослей представляет некоторые сложности для начинающих исследователей, однако при наличии достаточной практики можно быстро получить необходимые навыки. Во многих случаях изобретательность может облегчить этот процесс как в хорошо оборудованной лаборатории, так и полевых условиях. Наличие необходимого оборудование позволяет сделать процесс выделения водорослей более легким и успешным. При выделении таких водорослей оборудование может потребоваться в любой момент, поэтому все необходимые материалы нужно хранить в стерильном состоянии.

Удаление диатомовых водорослей с помощью диоксида германия:

Диатомовые водоросли могут создавать проблемы для ученых, пытающихся их выделить. Диатомеи растут очень быстро, и их бурный рост тормозит развитие других водорослей. В большинстве случаев добавление диоксида германия в образец, накопительную культуру или выделенную культуру, загрязненную диатомовыми водорослями, ведет к гибели большинства или всех диатомовых водорослей. Германий замещает кремний в биохимических реакциях, что приводит к их гибели. Для большинства других водорослей (за исключением красных водорослей) высокие концентрации германия не являются токсичными. Эффект диоксида германия достигается при его концентрации от 1 до 10 мг/л. Токсичность диоксида германия во многом определяется и временем внесения. При получении накопительных культур диоксид германия лучше всего добавлять сразу же. Если добавлять диоксид германия уже после развития диатомовых водорослей, для удаления диатомей понадобится больше времени.

Удаление синезеленых водорослей с помощью антибиотиков:

Сине-зеленые водоросли могут также мешать развитию других групп водорослей. К счастью, сине-зеленые водоросли можно эффективно удалить с помощью антибиотиков, так как они являются прокариотами. Однако одни антибиотики более эффективны, другие менее. Но в большинстве случаев методом проб и ошибок можно найти нужную комбинацию антибиотиков, а также рассчитать необходимые концентрации [3].

1.2.3 Использование микроводорослей для оценки качества водных сред

Водоросли как древнейшие фотоавтотрофные организмы во многом определили современный облик биосферы: первичный свободный кислород на Земле создан водорослями в процессе фотосинтеза, водоросли подготовили условия для создания почвы и заселения суши высшими растениями и животными. В настоящее время водоросли продолжают участвовать в поддержании постоянного состава атмосферы, в первичных почвообразовательных процессах. Водоросли остаются основным поставщиком органического вещества в водоемах.

Существует множество экологических групп водорослей. Исходной средой обитания для водорослей является водная. Водоросли составляют основную часть фитопланктона, фитобентоса, перифитона. Фитопланктон - растения, обитающие в толще воды; фитобентос - растения, обитающие на дне водоемов; перифитон (обрастатели) - растения, обитающие на разнообразных субстратах: на других организмах, скальных породах, гидротехнических сооружениях и т.д. Многие виды водорослей заняли переходные среды обитания, однако не утратили полностью связей с водной средой: аэрофиты (обычно населяют зону прибоя - супралитораль), почвенные водоросли, троглобионты (обитатели пещер), криофиты (населяют поверхность льда и снега), симбионты и паразиты.

В экосистемах водоросли играют роль продуцентов органического вещества. Валовая первичная продукция всего Мирового океана примерно в 2-3 раза меньше, чем валовая продукция суши. Чистая первичная продукция гидросферы составляет примерно 50% от валовой (в разных экосистемах колеблется от 0 до 90%).

Для того, чтобы валовая первичная продуктивность водорослей превышала их затраты на дыхание, необходимо наличие целого ряда факторов: достаточная освещенность, достаточно высокая температура, достаточно высокое содержание неорганических веществ: кислорода, углекислого газа, элементов минерального питания. Однако некоторые факторы являются наиболее главными - ограничивающими, или лимитирующими. Лимитирующими факторами для развития водорослей являются свет и вещества-биогены (фосфаты и нитраты).

Лимитирующее действие света в Мировом океане: в вертикальном разрезе по отношению к количеству света водоемы делятся на 3 зоны: эуфотическую, дисфотическую и афотическую. Только в эуфотической зоне (до 40...180 метров) валовая первичная продукция водорослей превышает их затраты на дыхание. В более глубоких слоях воды водоросли могут существовать за счет миксотрофного питания.

Лимитирующее действие света в континентальных водоема: в реках и озерах доступность света определяется прозрачностью воды. Прозрачность воды падает при наличии взвешенных неживых частиц, а также при массовом размножении самих водорослей.

Лимитирующее действие биогенов в Мировом океане: чистая первичная продуктивность водорослей в низких широтах достигает максимума в экосистемах шельфов, эстуариев, коралловых рифов. Эти воды насыщены биогенами: фосфатами и нитратами. Освещенность высокая в течение всего года. В открытом океане в низких широтах валовая первичная продукция водорослей, несмотря на высокую освещенность, очень низкая из-за недостатка биогенов - примерно в 20 раз ниже, чем в районах рифов. В высоких широтах, то есть в холодных субполярных водах обычно биогены имеются в достаточном количестве. Это связано с перемешиванием придонных и поверхностных вод из-за отсутствия температурного градиента, а также с выносом придонных вод на поверхность путем апвеллинга. В условиях полярного лета валовая первичная продукция водорослей очень высокая, а в период полярной зимы водоросли или отмирают, или переходят на гетеротрофное питание.