Идентификация микроводорослей Euglena glacilis и анализ их чувствительности к ингибирующим веществам

Лимитирующее действие биогенов в континентальных водоемах: в реках и озерах содержание в воде биогенов зависит от минерального состава пород в бассейне и от активности редуцентов. Освещенность зависит от географической широты и от прозрачности воды (в реках и водохранилищах вода обычно мутная). Неглубокие равнинные реки обычно содержат много биогенов, такие воды называются эутрофные. Глубокие озера на кристаллических породах обычно содержат мало биогенов, такие воды называются олиготрофные. Промежуточное положение занимают мезотрофные воды. Активность редуцентов зависит от температуры и содержания кислорода. Поэтому в северных водоемах с отложениями торфа биогены находятся в связанном состоянии - такие воды называются дистрофные. Таким образом, продуктивность водорослей в реках и озерах колеблется в широких пределах, но, в целом, возрастает по мере продвижения к экватору.

Эвтрофикация водоемов. При повышении содержания биогенов в воде происходит эвтрофикация водоемов - значительное повышение продуктивности. Существует антропогенная и естественная (неантропогенная) эвтрофикация.

Антропогенная эвтрофикация водоемов вызывается: сбросами биогенов (в первую очередь, фосфатов), изменением гидрологического режима (скорость течения воды в водохранилищах замедляется; при падении уровня озер происходит мобилизация биогенов из донных отложений), смывом поверхностного слоя почвы и т.д. Антропогенная эвтрофикация водоемов приводит, как правило, к нарушению биологического равновесия: изменяется альгофлора (видовой состав водорослей), изменяется плотность популяций водорослей. Резко возрастает плотность популяций миксотрофных видов. Плотность популяций зеленых водорослей снижается. В дальнейшем при отмирании этих видов снижается содержание кислорода, повышается содержание сероводорода. Кроме того, ряд водорослей выделяет токсины, прямо убивающие гидробионтов.

Неантропогенная эвтрофикация наблюдается при изменении направления морских течений, при сезонном изменении освещенности и температуры. Печально известны "красные приливы" (бурное размножение пирофитовых водорослей), которые приводят к накоплению токсинов в тканях моллюсков и других гидробионтов. Это приводит к массовой гибели этих организмов и к пищевым отравлениям населения, употребляющего в пищу эти организмы [4].

Водоросли водных местообитаний:

1) Планктонные водоросли:

Планктон - это совокупность организмов, населяющих толщу воды континентальных и морских водоемов и не способных противостоять переносу течениями (т.е. как бы парящих в воде). В состав планктона входят фито-, бактерио- и зоопланктон.

Фитопланктоном называют совокупность свободноплавающих в толще воды мелких, преимущественно микроскопических растений, основную массу которых составляют водоросли. Фитопланктон населяет только эвфотическую зону водоемов (поверхностный слой воды с достаточной для фотосинтеза освещенностью).

Планктонные водоросли обитают в самых разнообразных водоемах - от маленькой лужи до океана. Их нет лишь в водоемах с резко аномальным режимом, в том числе в термальных (при температуре воды выше +80° С и заморных (зараженных сероводородом) водоемах, в чистых приледниковых водах, не содержащих минеральных питательных веществ, а также в пещерных озерах. Суммарная биомасса фитопланктона невелика по сравнению с биомассой зоопланктона (соответственно 1,5 и более 20 млрд. т), но из-за быстрого размножения его продукция в Мировом Океане составляет около 550 млрд. тонн в год, что почти в 10 раз больше суммарной продукции всего животного населения океана.

Фитопланктон - основной продуцент органического вещества в водоемах, за счет которого существуют водные гетеротрофные животные и некоторые бактерии. Фитопланктон является начальным звеном большинства пищевых цепей в водоеме: им питаются мелкие планктонные животные, которыми питаются более крупные. Поэтому в районах наибольшего развития фитопланктона обильны зоопланктон и нектон.

Состав и экология отдельных представителей водорослевого фитопланктона в разных водоемах чрезвычайно разнообразны. Общее число видов фитопланктона во всех морских и внутренних водоемах достигает 3000.

Обилие и видовой состав фитопланктона зависит от комплекса рассмотренных выше факторов. В связи с этим видовой состав планктонных водорослей в разных водоемах (и даже в одном и том же водоеме, но в разное время года) не одинаков. Он зависит от физического и химического режима в водоеме. В каждый сезон года преобладающее развитие получает одна из групп водорослей (диатомовые, синезеленые, золотистые, эвгленовые, зеленые и некоторые другие), причем нередко господствует всего один вид той или иной группы. Особенно это выражено в пресноводных водоемах. Во внутренних водоемах существует гораздо большее разнообразие экологических условий по сравнению с морскими водоемами, что определяет и значительно большее разнообразие видового состава и экологических комплексов пресноводного фитопланктона по сравнению с морским. Одной из существенных особенностей пресноводного фитопланктона является обилие в нем временно планктонных водорослей. Ряд видов, которые принято считать типично планктонными, в прудах и озерах имеют донную или перифитонную (прикрепление к какому-либо предмету) фазу в своем развитии.

Морской фитопланктон состоит в основном из диатомовых и динофитовых водорослей. Хотя морская среда на значительных пространствах относительно однородна, в распределении морского фитопланктона однородности не наблюдается. Различия по видовому составу и численности нередко выражены даже на сравнительно небольших акваториях морских вод, но особенно четко они отражаются в крупномасштабной географической зональности распределения. Здесь проявляется действие основных факторов среды: солености воды, температуры, освещенности и содержания питательных веществ.

Планктонные водоросли обычно имеют специальные приспособления к обитанию в толщи воды во взвешенном состоянии. У одних видов это разного рода выросты и придатки тела - шипы, щетинки, роговые отростки, перепонки, парашюты; другие образуют полые или плоские колонии и обильно выделяют слизь; третьи накапливают в своем теле вещества, удельный вес которых меньше удельного веса воды (капли жира у диатомовых и некоторых зеленых водорослей, газовые вакуоли у синезеленых). Эти образования гораздо сильнее развиты у морских фитопланктеров, чем у пресноводных. Еще одним из таких приспособлений являются мелкие размеры тела планктонных водорослей.

2) Нейстонные водоросли:

Совокупность морских и пресноводных организмов, обитающих у поверхностной пленки воды, прикрепляющихся к ней или передвигающихся по ней называется нейстоном. Нейстонные организмы обитают как в мелких водоемах (прудах, заполненных водой ямах, небольших заливах озер), так и в крупных, в том числе в морях. В отдельных случаях они развиваются в таком количестве, что покрывают воду сплошной пленкой.

В состав нейстона входят одноклеточные водоросли, входящие в состав разных систематических групп (золотистые, эвгленовые, зеленые, отдельные виды желтозеленых и диатомовых). Некоторые нейстонные водоросли имеют характерные приспособления для существования у поверхности воды (например, слизистые или чешуйчатые парашюты, удерживающие их на поверхностной пленке).

3) Бентосные водоросли:

К числу бентосных (донных) водорослей относятся водоросли, приспособленные к существованию в прикрепленном или неприкрепленном состоянии на дне водоемов и на разнообразных предметах, живых и мертвых организмах, находящихся в воде.

Преобладающими бентосными водорослями континентальных водоемов являются диатомовые, зеленые, синезеленые и желтозеленые многоклеточные (нитчатые) водоросли, прикрепленные или неприкрепленные к субстрату.

Основные бентосные водоросли морей и океанов - бурые и красные, иногда зеленые макроскопические прикрепленные слоевищные формы. Все они могут обрастать мелкими диатомовыми, синезелеными и другими водорослями.

В зависимости от места произрастания, среди бентосных водорослей различаются: 1) эпилиты, растущие на поверхности твердого грунта (скалы, камни); 2) эпипелиты, населяющие поверхность рыхлых грунтов (песок, ил); 3) эпифиты, живущие на поверхности других растений; 4) эндолиты, или сверлящие водоросли, внедряющиеся в известковый субстрат (скал, раковин молллюсков, панцирей ракообразных); 5) эндофиты и 6) паразиты, поселяющиеся в слоевищах других водорослей (эндофиты имеют нормальные хлоропласты, а паразиты таковых не имеют); 7) эндосимбионты, обитающие в клетках других организмов, беспозвоночных или водорослей; 8) эпизоиты, обитающие на некоторых донных животных.

Иногда водоросли, растущие на предметах, введенных в воду человеком (суда, плоты, буи) относят к перифитону. Выделение этой группы обосновывается тем, что входящие в ее состав организмы (водоросли и животные) живут на предметах движущихся или обтекаемых водой. Кроме того, эти организмы удалены от дна и, следовательно, находятся в условиях иного светового и температурного режимов, а также в других условиях поступления биогенных веществ. Возможность произрастания бентосных водорослей в конкретных местообитаниях определяется как абиотическими, так и биотическими факторами. Среди последних существенную роль играет конкуренция с другими водорослями и присутствие животных, питающихся водорослями (морских ежей, брюхоногих моллюсков, ракообразных, рыб). Воздействие биотических факторов приводит к тому, что отдельные виды водорослей растут далеко не на всякой глубине и не во всяких водоемах с подходящим световым и гидрохимическим режимом.

К абиотическим факторам относятся свет, температура, а также содержание в воде биогенных и биологически активных веществ, кислорода и неорганических источников углерода. Очень важна скорость поступления этих веществ в слоевище, что находится в зависимости от концентрации веществ и скорости движения воды.

Бентосные водоросли, растущие в условиях движения воды, получают преимущества по сравнению с водорослями, растущими в малоподвижных водах. Один и тот же уровень фотосинтеза может быть достигнут у них при меньшей освещенности, что способствует росту более крупных слоевищ; движение воды предотвращает оседание на скалы и камни илистых частиц, которые мешают закреплению зачатков водорослей, а также смывает с поверхности грунта питающихся водорослями животных. К тому же, несмотря на то, что при сильном течении или сильном прибое происходит повреждение слоевищ водорослей или отрыв их от грунта, движение воды все же не препятствует поселению микроскопических водорослей и микроскопических стадий крупных водорослей. Поэтому места с интенсивным движением воды (в морях это проливы с течениями, прибрежные участки прибоя, в реках - камни на перекатах) отличаются пышным развитием бентосных водорослей.

Влияние движения воды на развитие бентосных водорослей особо ощутимо в реках, ручьях, горных потоках. В этих водоемах выделяется группа бентосных организмов, предпочитающих места с постоянным течением. В озерах, где не бывает сильных течений, основное значение приобретает волновое движение. В морях волны также оказывают значительное влияние на жизнь бентосных водорослей, в частности на их вертикальное распределение.

В северных морях на распространение и численность бентосных водорослей оказывает влияние лед. Заросли водорослей могут быть уничтожены (стерты) движением ледников. Поэтому, например, в Арктике многолетние водоросли легче всего найти у берега среди валунов и выступов скал, препятствующих движению льда.

Интенсивному развитию бентосных водорослей способствует также умеренное содержание в воде биогенных веществ. В пресных водах такие условия создаются в неглубоких прудах, в прибрежной зоне озер, в речных заводях, в морях - в мелких заливах. Если в таких местах существует достаточное освещение, твердые грунты и слабое движение воды, то создаются оптимальные условия для жизни фитобентоса. При отсутствии движения воды и ее недостаточном обогащении биогенными веществами, бентосные водоросли растут плохо.

4) Водоросли горячих источников:

Водоросли, выдерживающие высокие температуры, называются термофильными. В природе они поселяются в горячих источниках, гейзерах и вулканических озерах. Нередко они обитают в водах, которые кроме высокой температуры характеризуются повышенным содержанием солей или органических веществ (сильно загрязненные горячие сточные воды заводов, фабрик, электростанций или атомных станций).

Предельные температуры, при которых удавалось находить термофильные водоросли, судя по разным источникам, колеблются от 52 до 84° С. Всего обнаружено около 200 видов термофильных водорослей, однако видов, живущих только при высоких температурах, среди них сравнительно немного. Большинство из них способно выдерживать высокие температуры, но обильнее развиваются при обычных температурах. Типичными обитателями горячих вод являются синезеленые, в меньшей степени - диатомовые и некоторые зеленые водоросли.

5) Водоросли снега и льда:

Водоросли снега и льда составляют подавляющее большинство организмов, поселяющихся на замерзших субстратах (криобиотопах). Общее число видов водорослей, обнаруженных на криобиотопах, достигает 350, но истинных криофилов, способных вегетировать только при температурах, близких к 0° С, значительно меньше: немногим более 100 видов. Это микроскопические водоросли из которых подавляющее большинство относится к зеленым водорослям (около 100 видов); несколькими видами представлены синезеленые, желтозеленые, золотистые, пирофитовые и диатомовые водоросли. Все эти виды обитают в поверхностных слоях снега или льда. Их объединяет способность выдерживать замерзание без нарушения тонких клеточных структур и затем, при оттаивании, быстро возобновлять вегетацию, используя минимальное количество теплоты. Лишь немногие из них имеют стадии покоя, большинство лишены каких-либо специальных приспособлений для перенесения низких температур.

Развиваясь в массовом количестве, водоросли способны вызывать зеленое, желтое, голубое, красное, коричневое, бурое или черное "цветение" снега и льда.

6) Водоросли соленых водоемов:

Эти водоросли вегетируют при повышенной концентрации в воде солей, достигающей 285 г/л в озерах с преобладанием поваренной соли и 347 г/л в глауберовых (содовых) озерах. По мере увеличения солености количество видов водорослей уменьшается, очень высокую соленость переносят лишь немногие из них. В крайне засоленных (гипергалинных) водоемах преобладают одноклеточные подвижные зеленые водоросли. Нередко они вызывают красное или зеленое "цветение" соленых водоемов. Дно гипергалинных водоемов иногда сплошь покрыто синезелеными водорослями. они играют большую роль в жизни соленых водоемов. Сочетание органической массы, образуемой водорослями, и большого количества растворенных в воде солей обуславливает ряд своеобразных биохимических процессов, свойственных этим водоемам. Например, хлороглея сарциноидная (Chlorogloea sarcinoides) из синезеленых, в огромных количествах развивающаяся в некоторых соленых озерах, а также ряд других массово растущих водорослей, участвуют в процессе образования лечебных грязей[5]

Для биологической индикации качества вод могут быть использованы практически все группы организмов, населяющие водоемы: планктонные и бентосные беспозвоночные, простейшие, водоросли, макрофиты, бактерии и рыбы. Каждая из них, выступая в роли биологического индикатора, имеет свои преимущества и недостатки, которые определяют границы ее использования при решении задач биоиндикации, так как все эти группы играют ведущую роль в общем круговороте веществ в водоеме. Организмы, которые обычно используют в качестве биоиндикаторов, ответственны за самоочищение водоема, участвуют в создании первичной продукции, осуществляют трансформацию веществ и энергии водных экосистем.

Наиболее разработанной оценкой степени загрязненности вод по индикаторным организмам является система сапробности. Метод учитывает относительную частоту встречаемости гидробионтов h (от 1 до 9 или от единичных экземпляров в поле зрения микроскопа и до очень частой встречаемости, когда их много в каждом поле зрения) и их индикационную значимость S. Для статистической достоверности результатов необходимо, чтобы в пробе содержалось не менее 12 видов индикаторных организмов одной зоны сапробности с . Индикаторные значимости S для соответствующих зон сапробности табулированы для многих организмов. По рассчитанной величине S можно судить о состоянии водоема. Заключение о степени загрязненности воды дают обычно по системе баллов от одного до шести.

Среди огромного разнообразия микроводорослей наиболее часто для оценки действия веществ применяются обитающие в планктоне водоросли отдела Chlorophyta, в то время как представители других отделов остаются малоизученными, что особенно касается бентосных микроводорослей.

Загрязнение морской воды является комплексным и, следовательно, оценку его характера и действия можно провести только с помощью биотестирования, которое средством получения принципиально новой информации о загрязнении. Одноклеточные водоросли, вследствие круглогодичной доступности и высокой чувствительности, широко применяются в качестве тест-объектов при биотестировании [6].

1.3 Методы наблюдения и описания подвижности микроводорослей

1.3.1 Изменение подвижности микроводорослей в присутствии антибиотиков

Проблема биологической подвижности является одной из ключевых проблем современной биофизики. Разнообразные типы подвижности присущи живым объектам на всех уровнях организации: от отдельных клеточных органелл до высокоорганизованной подвижности организмов в целом. При всей широте ее проявлений в основе любого движения в биологической системе лежит фундаментальный процесс преобразования энергии химических связей макроэргических молекул в механическую работу. Универсальность этого преобразования и его высокая эффективность, с одной стороны, а также очевидная значимость роли подвижности в функционировании биологических объектов, с другой стороны, - вызывают и поддерживают многолетний интерес к этой проблеме исследователей, специализирующихся не только в области биологии, но и в биофизике, биохимии и бионике.

Первые основополагающие результаты по изучению биологической подвижности были связаны с выяснением механизма мышечного сокращения в 40-х - 50-х годах нашего века. И только в последние десять лет наблюдается заметная интенсификация усилий по экспериментальному исследованию и теоретическому моделированию различных форм немышечной подвижности: от передвижения жгутиковых и ресничковых микроорганизмов до одной из наименее исследованных форм - подвижности протоплазмы внутри клетки.

Подвижность протоплазмы присуще практически всем растительным клеткам на разных стадиях их развития, а также ряду миксомицетов. Не случайно, что наиболее интенсивное течение протоплазмы свойственно клеткам больших размеров, таким как гигантские клетки водорослей, миксомицетам в стадии плазмодия и т.д. Это связано, по-видимому, с необходимостью более эффективного транспорта веществ внутри клетки таких размеров, чем это может быть обеспечено диффузионными процессами. Другая функция подвижности протоплазмы связана с передвижением микроорганизма в целом, что характерно, например, для плазмодия, амеб и даже некоторых видов водорослей (диатомовых).

Несмотря на распространенность и внешнюю простоту проявления данного процесса, единого взгляда на механизмы создания течения протоплазмы в клетках того или иного вида в настоящее время не существует.

Исследование немышечной подвижности имеет не только фундаментальную, но и практическую ценность, связанную прежде всего с ролью подвижности протоплазмы в транспорте ассимилятов в растении. Одним из интересных практических приложений этих исследований может быть также биологическое тестирование загрязнения окружающей среды, в частности, водоемов [7].

Наиболее примитивные водоросли -- синезеленые -- не обладают способностью к активным движениям, а среди других одноклеточных водорослей преобладают активно подвижные. И хотя у одноклеточных растений есть настоящие прикрепленные формы (некоторые диатомеи), тем не менее как закономерный переход к прикрепленному образу жизни во взрослых стадиях онтогенеза растений связан с переходом от одно- к многоклеточное.

Споры бактерий и синезеленых водорослей служат лишь целям переживания неблагоприятного времени и поэтому не обладают активной подвижностью. У водорослей и грибов появляются также споры, специально служащие целям размножения, которые могут быть пассивно или, чаще, активно подвижными.

При исследовании стерилизации многоклеточных водорослей солоноватых вод в экспериментальных целях антибиотиками, сульфамидами и фунгицидами У.Шивер упоминает, что загрязнения стерильных низших водорослей диатомеями и синезелеными водорослями не наблюдается. Для подавления бактерий он также применял концентрации антибиотиков от 1000 до 10000ед/мл пеницилиллина и от 1,0 до 10,0мг/мл стрептомицина. Ширер допускает, что диатомеи были поражены фунгицидами, в то время как синезеленые водоросли пoгибли от высоких концентраций пеницилллина. Согласно Галловею и Крауссу, а также Палмеру и Малонею синезеленые водоросли уничтожаются даже очень низкими концентрациями антибиотиков. В качестве минимальной концентрации для Microcystis aeruginosa Шивер называет 2,0ppm пенициллина, а для Anabaena variabilis 0,1ppm пенициллина. Для зеленых низших водорослей потребовалось 1000ppm.

До сих пор в аквариумистике не было сведений о борьбе с сине-зелеными водорослями при помощи антибиотиков. Поэтому, чтобы установить возможность борьбы с сине-зелеными водорослями в густо засаженном аквариуме с рыбами при помощи пенициллина, было проведено испытание. Применялся пенициллин Г (бензилпенициллин-натрий) в 330-литровом аквариуме.

При концентрации пенициллина 1000ед/л заметного эффекта в подавлении роста сине-зеленых водорослей не наблюдалось. Применение 2000ед/л дало слабый эффект: распространение сине-зеленых водорослей приостанавливалось, наслоения окрашивались в серый цвет. Но уже через 3-5 дней они вновь начинали бурно расти. При концентрации пенициллина 5000ед/л сине-зеленым водорослям был причинен значительный ущерб. Наслоения стали грязно-серыми; они отпадали или свертывались и легко могли быть собраны трубкой. Этот процесс развивался медленно и достиг наибольшей силы через 4-6 дней. Через 10 дней все видимые наслоения сине-зеленых водорослей исчезли, но еще через 3-4 дня появились новые, которые бурно размножались. Только применение 10000ед/л указанного пенициллина позволило получить прочный результат. Сине-зеленые водоросли отмерли без остатка в течение 8 дней, они не появились и через 5 месяцев. В этот период не предпринимались никакие изменения в освещении и составе воды: впрочем, отпадавшие остатки сине-зеленых водорослей убирали. Свежую воду не добавляли. Этот опыт успешно был проведен и в других аквариумах.

На зеленые низшие водоросли указанная концентрация не оказала никакого влияния. Они продолжали размножаться, хотя и медленнее. Высшие водные растения и рыбы также не пострадали.

Так как вредное воздействие пенициллина высокой концентрации на сине-зеленые водоросли было известно, нужно было установить минимальную концентрацию для аквариума. Такая доза была установлена: 10000ед/л. При этом рекомендуется через 48час. добавить 2500ед. на 1л воды.

Таким образом была установлена пригодность пенициллина для борьбы с сине-зелеными водорослями, причем, в отличие от других препаратов, его можно применять с большей уверенностью, хотя, конечно, не в любом случае. Опыты по выявлению возможного сопротивления сине-зеленых водорослей при длительном применении пенициллина и разной чувствительности к антибиотикам различных видов низших водорослей, а также исследования эффективности различных антибиотиков в аквариумистике еще не проводились.

Для определения чувствительности микробов к антибиотикам существует ряд методов: метод последовательных разведений в жидкой питательной среде или питательном агаре, метод диффузии в агар (метод дисков, насыщенных антибиотиками) и ускоренные методы. Метод дисков прост, широко используется, но дает лишь качественный ответ. Более надежным и точным количественным методом является метод последовательных разведений антибиотиков в питательной среде в стандартных условиях опыта. В большинстве случаев корреляция данных лабораторных исследований с клиническими бывает достаточно полной, а терапия - эффективной при изучении в динамике не только клинического течения процесса, но и возможной смены возбудителя или его чувствительности к антибиотикам.

Концентрация антибиотиков в тканях и жидкостях организма, как и их антимикробная активность, относятся к основным параметрам, определяющим эффективность антибиотикотерапии. При ее изучении наиболее широко применяют микробиологические методы исследования, основанные на способности антибиотика задерживать рост тест-микроба. Среди микробиологических методов определения концентраций антибиотиков в жидкостях и тканях организма наибольшее распространение получили метод диффузии в агар и метод серийных разведений в жидкой питательной среде.

В настоящее время созданы микробиологические системы, автоматизированной и полуавтоматизированной микробиологические, идентификации и оценки антибиотикоустойчивости, позволяющие существенно ускорить бактериологический анализ, повысить степень его точности. Имеются ускоренные физико-химические и химические методы (иммуноферментный, иммунофлюоресцентный и др.) изучения фармакокинетики антибиотиков, помогающие быстро оптимизировать схемы лечения, индивидуализировать их и повысить эффективность этиотропной терапии.

При выборе антибиотика должны использоваться сведения о минимальных подавляющих концентрациях для отдельных возбудителей болезни , которые могут быть разными как по отношению к виду микроба, так и к различным тканям (средам) организма больного. На практике терапевтическая активность достигается при назначении антибактериальных препаратов в дозах, обеспечивающих более высокий их уровень в средах преимущественного обитания возбудителей болезни.

1.3.2 Изменение жизнеспособности микроводорослей в присутствии ксенобиотиков

Ксенобиотики -- условная категория для обозначения чужеродных для живых организмов химических веществ, естественно не входящих в биотический круговорот. Как правило, повышение концентрации ксенобиотиков в окружающей среде прямо или косвенно связано с хозяйственной деятельностью человека. К ним в ряде случаев относят: пестициды, некоторые моющие средства (детергенты), радионуклиды, синтетические красители, полиароматические углеводороды и др. Попадая в окружающую природную среду, они могут вызвать повышение частоты аллергических реакций, гибель организмов, изменить наследственные признаки, снизить иммунитет, нарушить обмен веществ, нарушить ход процессов в естественных экосистемах вплоть до уровня биосферы в целом.

Ксенобиотики могут как подавлять, так и стимулировать рост микроводорослей.

Полихлорированые бифенилы, которые применяются как диэлектрические жидкости в трансформаторах и конденсаторах, смазки, как присадки к пестицидам, клеи, краски, способствуют фотосинтезу и клеточному делению при низких концентрациях, а при более высоких оказывают обратное действие. Накопление их у водорослей представляет двухстадийный процесс: за адсорбцией на поверхности следует поглощение клеткой за счет диффузии, а не активного транспорта. Десорбция происходит медленнее адсорбции, т.е. восстановление нормального состояния идет дольше, чем загрязнение. Многие полициклические углеводороды разрушаются солнечным светом, и имеются сведения, что это происходит активнее, когда вещества связанны с поверхностью водорослевых клеток.

В последнее время появились обзоры работ о влиянии на водоросли тяжелых металлов. Данные многих исследований противоречивы, и до сих пор нельзя сделать общего вывода относительно влияния тяжелых металлов на отдельные микроводоросли или их сообщества. Металлы снижают как разнообразие, так и продуктивность сообществ, причем сине-зеленые и диатомовые водоросли наименее уцстойчивы. Сравнив участки рек, загрязненные медью и свинцом, пришли к выводу, что видовой состав определяется уровнем загрязнения, а не конкретным металлом.

В местах многих горнорудных разработок под действием окисляющих серу бактерий возникают сильнокислые воды. Таким образом, с загрязнением тяжелыми металлами бывает связана кислотность и влияние этих двух факторов часто трудно разграничить. При низких значениях рН большинство тяжелых металлов находится в доступной для водорослей форме, поэтому они обычно токсичнее в кислой среде. Подкисление озер вызывает снижение числа и разнообразия видов, хотя биомасса и первичная продукция могут остаться прежними [8].

1.3.3 Метод микроскопического подсчета численности и подвижности микроводорослей

Собранный материал предварительно просматривают под микроскопом в живом состоянии в день сбора, чтобы отметить качественное состояние водорослей до наступления изменений, вызванных хранением живого материала или фиксацией проб (образование репродуктивных клеток, переход в пальмеллевидное состояние, разрушение клеток, колоний, потеря жгутиков и подвижности и т. д.). В дальнейшем собранный материал продолжают изучать параллельно в живом и фиксированном состоянии. Работа с живым материалом является необходимым условием успешного изучения водорослей, изменяющих при фиксации форму тела, форму и окраску хлоропластов, теряющих жгутики, подвижность или даже полностью разрушающихся в результате воздействия фиксаторов. Чтобы сохранить собранный материал живым, следует всячески оберегать его от перегрева, загрязнения фиксаторами, а к изучению приступать как можно скорее.

Водоросли в живом состоянии в зависимости от их размеров и других особенностей изучают с помощью бинокулярной стереоскопической лупы (МБС-1) или чаще с помощью световых, микроскопов различных марок с использованием разных систем окуляров и объективов, в проходящем свете или методом, фазового контраста, с соблюдением обычных правил микроскопирования.

Для микроскопического изучения водорослей готовят препараты: на предметное стекло наносят каплю исследуемой жидкости и накрывают ее покровным стеклом. Если водоросли обитают вне воды, их помещают в каплю водопроводной воды или оводненного глицерина. При длительном изучении препарата жидкость под покровным стеклом постепенно подсыхает, и ее следует добавлять. Для уменьшения испарения по краям покровного стекла наносят тонкий слой парафина.

При необходимости длительных наблюдений над одним и тем же объектом хороший результат дает метод висячей капли. На чистое покровное стекло наносят маленькую каплю исследуемой жидкости, после чего покровное стекло, края которого покрыты парафином, парафиновым маслом или вазелином, накладывают каплей вниз на специальное предметное стекло с лункой посередине так, чтобы капля не касалась дна лунки. Такой препарат можно изучать в течение нескольких месяцев, сохраняя его в перерывах между работой во влажной камере.

При изучении водорослей, имеющих монадную структуру, серьезной помехой служит их подвижность. Однако при подсыхании препарата движение постепенно замедляется и приостанавливается. Замедлению движения способствует также осторожное нагревание препарата или добавление вишневого клея. Подвижные водоросли рекомендуется фиксировать парами оксида осмия (IV) (при этом хорошо сохраняются жгутики), кристаллического иода (фиксация парами иода позволяет не только сохранить жгутики, но и окрасить крахмал, если он есть, в синий цвет, что имеет диагностическое значение), 40 %-го формальдегида, слабым раствором хлоралгидрата или хлороформом. Длительность экспозиции над парами фиксаторов устанавливают экспериментально, в зависимости от специфики объекта. Наиболее удобны для изучения слабо фиксированные препараты, в которых часть водорослей потеряла подвижность, а другие продолжают медленно двигаться. Препараты следует изучать немедленно после фиксации, так как в течении короткого периода времени водоросли (особенно лишенные клеточных оболочек) деформируются.

Количественному учету могут подвергаться только количественные пробы фитопланктона и фитобентоса. Данные о численности водорослей являются исходными для определения их биомассы и пересчета других количественных показателей (содержания пигментов, белков, жиров, углеводов, витаминов, нуклеиновых кислот, зольных элементов, интенсивности дыхания, фотосинтеза и т. д.) на одну клетку или на единицу биомассы. Численность водорослей может быть выражена в количестве клеток, ценобиев, колонии, отрезков нитей определенной длины и др.

Подсчет численности водорослей осуществляют на специальных счетных стеклах (разграфленных на полосы и квадраты), на поверхность которых штемпель-пипеткой определенного объема (большей частью 0,1 см³) наносят каплю воды из тщательно перемешанной исследуемой пробы. При отсутствии счетного стекла можно пользоваться обычным предметным стеклом при условии перемещения его на столике микроскопа с помощью препаратоводителя. Если нет штемпель-пипетки, используют обычную градуированную пипетку, отрезав нижнюю оттянутую ее часть, чтобы сделать входное отверстие шире. Для учета численности водорослей применяют также счетные камеры Нажотта объемом 0,01 см³, "Учинскую" (0,02 см³) и др. Можно пользоваться также камерами, применяемыми для подсчета форменных элементов крови - Горяева, объемом 0,9 мм³, Фукса-Розенталя и др. При использовании камер Горяева и Фукса-Розенталя покровное стекло тщательно притирают к боковым поверхностям предметного счетного стекла до появления колец Ньютона, а затем заполняют камеру каплей исследуемой пробы с помощью пипетки. В зависимости от количества организмов в исследуемой пробе можно просчитывать либо все, либо часть дорожек (квадратов) на поверхности счетного стекла. Необходимо обязательно проводить повторные подсчеты нескольких (не менее трех) капель из одной и той же пробы, каждый раз отбирая пипеткой образец для подсчета после тщательного взбалтывания пробы.

1) Расчет численности фитопланктона.

При исследовании количественных проб фитоплактона (или культуральной суспензии водорослей) пересчет численности организмов на 1 л воды производят по [9] формуле:

N=n*k(A/a)*v*(100/V), (1)

где N - количество организмов в 1 л воды исследуемого водоема (культуральной жидкости);

k - коэффициент, показывающий во сколько раз объем счетной камеры меньше 1 см³;

n - количество организмов, обнаруженных на просмотренных дорожках (квадратах);

А - количество дорожек (квадратов) на счетной пластинке (в камере);

А - количество дорожек (квадратов). на которых производился подсчет водорослей;

V - первоначальный объем отобранной пробы (см³);

V - объем сгущенной пробы (см³).

2) Расчет численности бентоса и перифитона.

При изучении количественных проб фитобентоса, в которых обычно преобладают сравнительно крупные организмы, пользуются преимущественно штемпель-пипеткой объемом 0,1 см³. Расчет численности водорослей в пробах бентоса и перифитона ведут на 10 см² поверхности субстрата по [9] формуле:

N=n*10*v/S*10, (2)

где N - количество организмов на 10 см² поверхности субстрата;

n - число организмов в просчитанной капле воды объемом 0,1 см³;

V - объем пробы (см³);

S - площадь сечения трубки в микробентометре (для бентосных проб) или площадь поверхности субстрата, с которого смыты водоросли (для проб обрастании) (см²).

Количественное содержание водорослей в пробах наиболее полно отражают показатели их биомассы, которые определяют с помощью счетно-объемного, весового, объемного, разнообразных химических (радиоуглеродного, хлорофиллового и др.) методов.

Для определения биомассы водорослей счетно-объемным методом необходимо располагать данными об их численности в каждой конкретной пробе для каждого вида отдельно и их средних объемах (для каждого вида из каждой конкретной пробы). Существуют разные методы определения объема тела водорослей. Наиболее точным считается стереометрический метод, при использовании которого тело водоросли приравнивается к какому-нибудь геометрическому телу или комбинации таких тел, после чего объемы их вычисляют по известным в геометрии формулам на основании линейных размеров конкретных организмов. Иногда пользуются готовыми, вычисленными ранее средними объемами тела для разных видов водорослей, которые приводятся в работах многих авторов. Относительную плотность по воде пресноводных водорослей принимают обычно за 1,0-1,05. Биомассу рассчитывают для каждого вида отдельно, а затем суммируют. Счетно-объемный метод определения биомассы широко используют в практике гидробиологических исследований при изучении количественных соотношений различных компонентов биоценозов, закономерностей распределения водорослей в различных биотопах одного и того же водоема или в разных водоемах, сезонной и многолетней динамики развития водорослей и др.

При интенсивном развитии водорослей можно пользоваться весовым методом. При этом исследуемую пробу фильтруют через предварительно высушенный и взвешенный бумажный фильтр (параллельно через контрольные фильтры фильтруют дистиллированную воду). Затем фильтры взвешивают и сушат в сушильном шкафу при 100°С до постоянной массы. На основании полученных данных вычисляют сухую и сырую массу осадка. В дальнейшем путем сжигания фильтров в муфельной печи можно определить содержание в осадке органических веществ.

Недостатки этого метода заключаются в том, что он дает представление лишь о суммарной массе всех взвешенных в пробе органических и неорганических веществ, живых организмов и неживых примесей, животного и растительного происхождения. Вклад представителей отдельных таксонов в эту суммарную массу можно лишь приблизительно выразить в массовых долях после подсчета под микроскопом их соотношения в нескольких полях зрения.

Наиболее полное представление о биомассе водорослей можно получить, сочетая несколько разных методов исследования [9].

1.3.4 Метод цифровой фотосъемки. Фотография может стать памятью микроскопа

Для ученого она служит незаменимым инструментом, позволяющим регистрировать все, что хоть на секунду появится перед его глазами в бесконечно малом мире под окуляром микроскопа. Для фотографа же мир малых величин открывает неожиданную красоту. В увеличенных фотоизображениях знакомых вещей возникают неожиданные сочетания линий, форм и красок: симметрическое строение крошечных бутонов, сложная фактура поверхности щепки, переливчатая расцветка головы стрекозы.

Ученый пользуется союзом микроскопа с фотоаппаратом в чисто научных целях, хотя многие увеличенные изображения прекрасны сами по себе. Мир малых величин зачастую хрупок и недолговечен: крошечные ростки быстро вянут, зажатые между двумя стеклышками живые клетки гибнут, атомы так неуловимы, что для фотографирования их приходится увеличивать в миллионы раз. Фотография позволяет увековечить все эти мимолетности прежде, чем они исчезнут. Кроме того, фотоснимок все присутствующие могут рассматривать одновременно, а в микроскоп, как правило, они должны глядеть по очереди. Для подробного изучения и анализа изображений с ними должны знакомиться и ученые, и учителя, и ученики. Только фотография способна предоставить им эту возможность.

Фотосъемка с увеличением, независимо от того, кем она выполняется - фотографами-любителями для собственного удовольствия или учеными в научных целях - делится на две категории: макрофотосъемка и микрофотосъемка. Граница между этими видами фотографирования с увеличением расплывчата и, в общем, определяется размерами фотографируемого объекта, характером применяемого оборудования и назначением снимка. Микрофотосъемку не следует путать с микрофильмированием, то есть получением микрофильмов - уменьшенных во много раз фотокопий.

Макрофотосъемка - это фотографирование мелких объектов, обычно рассматриваемых в лупу, с увеличением в 10-30 раз. Роль лупы выполняет фотообъектив, который примерно во столько же раз увеличивает, скажем, крошечную ракушку, делая видимым ее строение. Иногда используются добавочные насадочные линзы, но к помощи микроскопа при макросъемке не прибегают (то есть 1 сантиметр изображения на светочувствительном материале фотоаппарата соответствует 2 -- 0,05 сантиметрам объекта).

Макросъёмка -- это принцип формирования увеличенного изображения.

Объектив создаёт действительное увеличенное изображение объекта съёмки на любом светочувствительном материале -- фотоплёнка, фотопластинка, фотобумага, киноплёнка или на электронном устройстве (матрица цифрового фотоаппарата или видеокамеры, видикон телевизионной камеры).

Теоретически макросъёмка может быть произведена любым съёмочным аппаратом, однако конструктивные особенности конкретной модели могут сильно препятствовать этому.

Микрофотосъемка - это фотографирование объектов с увеличением от 10 раз и до предельного максимума, когда снимаются объекты, видимые лишь в сильнейшие микроскопы, увеличивающие в миллионы раз. Чтобы передать светочувствительной пленке увеличенное изображение, оптическая система микроскопа используется вместо объектива фотоаппарата. Иногда же фотоаппарат просто присоединяют к микроскопу и фотографируют, не удаляя фотообъектива.

В научных исследованиях нередко применяются сложные крупногабаритные микрофотоустановки. В одних для получения увеличенных изображений используются световые волны, в других - пучки электронов или ионов. Но среди самых интересных микрофотографий есть немало и таких, которые сделаны с помощью обыкновенных "биологических" микроскопов, хорошо известных многим поколениям школьников. Даже дешевые модели таких оптических микроскопов стоящие 25 долларов или меньше, несмотря на относительную примитивность, можно приспособить для микрофотографии.

Большинство таких устройств позволяет получать темные изображения на светлом фоне (метод светлого поля) или светлые изображения на темном фоне (метод темного поля) и открывать совершенно неожиданные особенности строения объектов. Неожиданные цветовые эффекты дает освещение поляризованным светом, в особенности при микросъемке некоторых минералогических и биологических образцов.

Снимки такого рода производят странное, смущающее глаз впечатление. На них лишь изредка можно уловить масштаб увеличения. Фотография, вдобавок, позволяет увеличивать полученные изображения вторично. Начальное увеличение передается на фотопленку через микроскоп. Если этого недостаточно, полученный снимок можно еще раз увеличить с помощью обыкновенного фотолабораторного оборудования. Если сфотографировать, скажем, нейлоновое волокно с увеличением в 100 раз, а полученный снимок увеличить еще в 10 раз, то конечный результат даст тысячекратное увеличение.

Способность фиксировать изображения, невидимые невооруженным глазом - бесценный вклад фотографии в науку. Недаром Роберт Кох, знаменитый немецкий бактериолог, еще в 1870-х годах убеждал коллег отказаться от зарисовок и пользоваться микрофотографией. "Зарисовки микроскопических объектов редко бывают во всем схожи с оригиналом, - говорил он. - Почти всегда они гораздо красивее". Кох был прав только в первой части своего утверждения. Микрофотография показала, что по части художественных способностей природа даст любому ученому сто очков вперед [10].

1.3.5 Математическое описание влияния ингибиторов на подвижность микроводорослей

Микроводоросли совершают непрерывное движение, состоящее из ряда прямолинейных перемещений с некоторой средней скоростью v_инф под случайным углом. Клетки в световом потоке проецируются в виде эллипсов длиной b и шириной а.

В соответствии с рисунком 5 показан измерительный преобразователь, функционирование которого основано на измерении прошедшего потока.

ЛФП периодически преобразует световой поток в электрический сигнал (один кадр), который можно представить в виде столбца U(i) матрицы напряжений U(i,j), где i - номер фотоприёмника (ФП), а j - номер кадра.

Рисунок 5 - Структурная схема измерительного преобразователя: 1 - точечный источник света; 2 - собирающая линза; 3 - диафрагма; 4 - клетка, формирующая тень на поверхности линейки фотоприёмников; 5 - линейка фотоприёмников; 6 - кювета с исследуемой средой; 7 - исследуемая среда.

Параметры сигнала ЛФП отражают концентрацию подвижных клеток и их динамику. Каждая клетка имеет проекцию под случайным углом на плоскости ЛФП. Некоторые проекции попадают на ЛФП. Данное событие обозначим А. Вероятность события А - Р(А), определяется согласно решению задачи Бюффона [11]:

, (3)

где d - ширина кюветы с исследуемой взвесью;

- сумма длины проекции клетки и расстояния, проходимого ею за время между кадрами [с] при средней линейной скорости м/с [11].

, (4)

где К_лин - безразмерный коэффициент линейности движения.

Процесс движения N микроводорослей в ИП формирует поток событий А со средним числом М пересечений за время экспозиции. С учётом (3,4) запишем:

(5)

где С - концентрация микроводорослей, моль/дм³;

w - толщина кюветы, м;

- высота контролируемого объёма, м;

- среднее число событий А на единицу длины ЛФП и единицу концентрации, 1/(м•м^-3 );

K_DET - безразмерный коэффициент детерминированности движения (для учёта отклонения от модели Бюффона в случае направленного движения, когда распределение углов движения клетки неравномерно).

При условии пересечение проекций клетки и ЛФП будет длиться несколько кадров, в течение [с].

Величина Q среднего числа событий А получена по аналогии с формулой Литтла, применяемой в теории массового обслуживания [11].

(6)

где K_Q - коэффициент пропорциональности, м.

Линейная зависимость Q(C) получена без учёта наложений проекций клеток на один и тот же участок ЛФП. Наложение двух проекций приводит к появлению нелинейности, для учёта которой введён коэффициент K_over [11]:

 (7)

где - разрешающая способность системы выделения проекций клеток на ЛФП.

Тогда с учётом (5-7) запишем:

(8)

Для определения количества и координат проекций клеток на ЛФП необходимо провести их детектирование, конечным результатом которого является построение матрицы событий , где [11]:

, (9)

Среднее число проекций на ЛФП за время определяется выражением:

, (10)

где Н и L - номера верхнего и нижнего фотоприёмников n_H и n_L соответственно;

Z - число кадров.

Формирование случайного процесса. Столбец выходных напряжений элементов ЛФП U(i) формируется в соответствии с выражением [11]:

(11)

где P(i) - среднее значение транзитивной составляющей падающего светового потока на поверхность i-го ФП за время экспозиции , Вт/м²;

А_ФП - площадь ФП, м ;

S() - чувствительность ЛФП, В/(Вт-с).

Величина транзитивной составляющей светового потока отражает наличие проекции клетки на ФП. При размерах ФП, сравнимых с размером клетки, экстинкция может быть охарактеризована долей потока, на которую уменьшается падающий поток и выражена формулой [11]:

, (12)

где P₀ - мощность потока, падающего на клетку,

P_tr(x, m,) - транзитивная доля мощности потока, прошедшая через клетку, улавливаемая ФП под телесным углом после рассеяния падающего потока клеткой с относительным показателем преломления m и коэффициентом дифракции x. Дифракционная составляющая при рассеянии на малых углах и при размерах фотоприемника, сравнимых с размерами клетки, не способна существенно изменить интенсивность прошедшего потока. Общее выражение для светового потока Р^ФП, падающего на фотоприёмник, определяется выражением [11]:

, (13)

где P_N - аддитивный шум светового потока.

Учтём возможную статическую неравномерность освещённости элементов ЛФП путём перехода к нормированным величинам. Учитывая выражения (12, 13), имеем:

, (14)

где - отношение величин шумового и падающего потоков.

Принимая, что максимальное значение на выходе каждого фотоприёмника соответствует, согласно выражениям (11, 14) запишем:

, (15)

где - средний за время кадра коэффициент ослабления потока взвесью,

) - коэффициент шума выходного напряжения фотоприёмника.

Матрица является математическим представлением случайного импульсного процесса пространственно-временного распределения экстинкции взвеси.

Функция полезного сигнала. Эмпирически было выявлено, что сигнал, формируемый при движении проекции клетки по ЛФП, может быть аппроксимирован двумерным гауссовым импульсом [11]:

, (16)

где i₀ - номер ФП, соответствующий центру проекции клетки;

j₀ - номер кадра, соответствующий минимуму освещённости в центре проекции;

- параметры импульса по координате, В;

- временной параметр импульса.

Сигнал от проекции клетки на одном кадре имеет форму импульса Гаусса, и сигнал одного ФП при пересечении проекции и ЛФП во времени также имеет вид импульса Гаусса.

На основании канонического представления сигнала в виде импульсного случайного процесса [11]:

, (17)

где V_k - случайные величины;

f(i) - неслучайная функция.

На основании данных о виде функции было обосновано применение метода вейвлет-декомпозиции для выделения полезного сигнала. Базисом разложения был выбран вейвлет "мексиканская шляпа", который имеет участок, по форме схожий с функцией импульса Гаусса.

Матрица событий , отражающая координату клеток, получена на основании преобразования столбцов матрицы см. (15), методом вейвлет-декомпозиции с последующим сравнением полученных величин относительно порогового значения у_пор.

Используя выражение (10), получаем среднее число проекций на ЛФП.

Определение информативного параметра динамики движения клеток. Среднее число событий Q при установленном пороговом значении, является функцией от, что позволяет получить новый параметр, отражающий динамику движения популяции. Учитывая, что определяет параметр импульса Гаусса, см. (18), можно меняя у_пор выявить различия Q при разных.

Составляя систему из двух уравнений для разных у_пор с учётом (8, 10, 16) получим величину , которая связана с:

, (18)

Формирование информативного параметра концентрации клеток. Сигнал (15) является случайным импульсным процессом, состоящим из двумерных гауссовых импульсов, появляющихся с интенсивностью (6) [11]:

, (19)

Эта интенсивность пропорциональна концентрации, см. (5). Зависимость (8) числа событий от концентрации клеток нелинейная. Это связано с потерей импульсов при наложении. Рассмотрение параметров сигнала, учитывающих это явление позволит получить линейную зависимость в широком диапазоне концентраций.