Идентификация микроводорослей Euglena glacilis и анализ их чувствительности к ингибирующим веществам

На основе теоремы Кэмпбелла, линейно связывающей интенсивность потока со средним значением и дисперсией пуассоновского процесса, и выражения (19), можно утверждать:

, (29)

, (30)

где K_M и K_D - коэффициенты пропорциональности [11].

1.4 Механизмы подавления подвижности клеток

1.4.1 Биоэнергетика клеток и ее связь с подвижностью микроорганизмов

Живая клетка избегает прямого использования энергии внешних ресурсов для совершения полезной работы. Она сначала превращает их в одну из трех конвертируемых форм энергии ("энергетических валют"), а именно: в АТФ, протонный или натриевый потенциал, которые затем расходуются для осуществления различных энергоемких процессов.

Любая живая клетка обеспечивает свои энергетические потребности за счет внешних ресурсов. Как ресурсы, так и потребности отличаются большим разнообразием. Ресурсами могут служить свет (для зеленых растений и некоторых бактерий) и многочисленные питательные вещества, расщепляющиеся в клетке до менее энергетически ценных конечных продуктов. Что касается потребностей, то они складываются из различных энергоемких процессов, необходимых для совершения отдельных видов полезной работы клетки и организма. Даже у простейших живых существ, каковыми являются бактерии, таких процессов насчитывается несколько десятков. Поэтому неудивительно, что живая клетка располагает особой "энергетической валютой", играющей роль посредника между процессами запасания энергии и ее траты. Долгое время считалось, что единственным типом такой "валюты" служат так называемые высокоэнергетические химические соединения, а среди них прежде всего аденозинтрифосфат (АТФ). Однако последние работы биоэнергетиков опровергли эту догму. Оказалось, что клетка располагает не одним, а тремя типами "энергетической валюты". Наряду с АТФ такую роль выполняют протонный и натриевый потенциалы на биологических мембранах.

В результате этого учеными были сформулированы три закона биоэнергетики. Кратко их суть сводится к следующим положениям:

Первый закон биоэнергетики:

Живая клетка не использует "впрямую" внешние ресурсы для получения энергии, необходимой для обеспечения внутренних процессов. Клетка "конвертирует" энергию внешних ресурсов в одну из трех внутренних "энергетических валют": в АТФ, натриевый или протонный (водородный) потенциал, которые затем расходуются для осуществления различных энергоемких процессов.

Второй закон биоэнергетики:

Живая клетка в результате эволюции приобрела способность использовать как минимум две "энергетических валюты": водорастворимую (АТФ) и связанную с мембраной -- натриевый или водородный потенциал.

Третий закон биоэнергетики:

"Энергетические валюты" клетки могут превращаться одна в другую. Поэтому получения хотя бы одной из них за счет внешних ресурсов достаточно для поддержания жизнедеятельности.

В наиболее эволюционно продвинутой животной клетке имеются все три вида "энергетической валюты" -- это увеличивает ее способность к выживанию и выполнению ответственных функций в организме.

Функции клеточного дыхания

Функции, возлагаемые на процесс легочного дыхания, тоже достаточно разнообразны. В упрощенном виде они могут быть разбиты на четыре группы:

- запасание "энергетической валюты" в конвертируемой форме АТФ или протонного потенциала;

- выделение энергии в виде тепла;

- образование веществ, необходимых клетке для ее существования;

- удаление веществ, наличие которых во внутренней среде клетки нежелательно [12].

Нескончаемый поток энергии в клетке, поток энергии от одной клетки к другой или от одного организма к другому и составляет сущность жизни. Живые клетки обладают сложными и эффективными системами для превращения одного вида энергии в другой. Превращения энергии происходят главным образом в двух структурах -- в хлоропластах, имеющихся у зеленых растений, и в митохондриях, имеющихся в клетках как растений, так и животных. Изучением превращений энергии в живых организмах занимается биоэнергетика.

В живом мире различают три основных вида превращения энергии:

1. Лучистая энергия солнечного света улавливается имеющимся в зеленых растениях зеленым пигментом хлорофиллом и превращается в процессе так называемого фотосинтеза в химическую энергию, которая используется для синтеза из двуокиси углерода и воды углеводов и других сложных молекул. Энергия солнечного света, представляющая собой одну из форм кинетической энергии, превращается таким образом в один из типов потенциальной энергии. Химическая энергия запасается в молекулах углеводов и других питательных веществ в форме энергии связей между входящими в их состав атомами.

2. Химическая энергия углеводов и других молекул превращается в процессе клеточного дыхания в биологически доступную энергию макроэргических фосфатных связей. Такого рода превращения энергии осуществляются в митохондриях.

3. Превращение энергии, происходящее при использовании клеткой химической энергии этих фосфатных связей для работы: механической работы -- при мышечном сокращении, электрической работы -- при передаче нервного импульса, осмотической работы -- при передвижении молекул против градиента концентраций, химической работы -- при синтезе молекул в процессе роста. Часть энергии при этом теряется, рассеиваясь в форме тепла. Растения и животные выработали в процессе эволюции весьма эффективные преобразователи энергии для осуществления этих процессов, а также весьма тонкие регуляторные системы, дающие клетке возможность приспосабливаться к изменениям окружающих условий.

Микроорганизмы движутся посредством жгутиков. Источником энергии для вращения служит не АТФ, а электрическое поле или ионный градиент на внутренней мембране бактериальной клетки [13].

1.4.2 Разобщители клеточного дыхания и окислительного фосфолирования

Окислительное фосфолирование, синтез АТФ из аденозиндифосфата и неорганического фосфата, осуществляющийся в живых клетках, благодаря энергии, выделяющейся при окислении орг. в-в в процессе клеточного дыхания. В общем виде О.ф. и его место в обмене в-в можно представить схемой в соответствии с рисунком 6:

Рисунок 6 - Схема окислительного фосфолирования

АН₂ - орг. вещества, окисляемые в дыхательной цепи (так называемые субстраты окисления, или дыхания);

АДФ - аденозиндифосфат;

Р - неорганические фосфат.

Поскольку АТФ необходим для осуществления многих процессов, требующих затраты энергии (биосинтез, совершение механической работы, транспорт веществ и др.), О.ф. играет важнейшую роль в жизнедеятельности аэробных организмов. Образование АТФ в клетке происходит также благодаря другим процессам, например в ходе гликолиза и разложения типов брожения, протекающих без участия кислорода. Их вклад в синтез АТФ в условиях аэробного дыхания составляет незначительную часть от вклада О.ф. (окисление 5%).

У животных, растений и грибов О.ф. протекает в специализированных субклеточных структурах-митохондриях в соответствии с рисунком 7; у бактерий ферментные системы, осуществляющие этот процесс, находятся в клеточной мембране.

Рисунок 7 - Упрощенная схема митохондрии: 1 - внутренняя мембрана; 2 - наружная мембрана; 3 - межмембранное пространство; 4 - матрикс; 5 - кристы.

Митохондрии окружены белково-фосфолипидной мембраной. Внутри митохондрий (в т. наз. матриксе) идет ряд метаболических процессов распада пищевых в-в, поставляющих субстраты окисления АН₂ для О.ф. Наиб. важные из этих процессов -трикарбоновых кислот цикл и т. называемое -окисление жирных к-т (окислит. расщепление жирной к-ты с образованием ацетил-кофермента А и к-ты, содержащей на 2 атома С меньше, чем исходная; вновь образующаяся жирная к-та также может подвергаться окислению). Интермедиаты этих процессов подвергаются дегидрированию (окислению) при участии ферментов дегидрогеназ; затем электроны передаются в дыхательную цепь митохондрий-ансамбль окислительно-восстановительных ферментов, встроенных во внутреннюю митохондриальную мембрану. Дыхательная цепь осуществляет многоступенчатый экзэргонический перенос электронов (сопровождается уменьшением свободной энергии) от субстратов к кислороду, а высвобождающаяся энергия используется расположенным в той же мембране ферментом АТФ-синтетазой, для фос-форилирования АДФ до АТФ. В интактной (неповрежденной) митохондриальной мембране перенос электронов в дыхательной цепи и фосфорилирование тесно сопряжены между собой. Так, напр., выключение фосфорилирования по исчерпании АДФ либо неорганического фосфата сопровождается торможением дыхания (эффект дыхательного контроля). Большое число повреждающих митохондриальную мембрану воздействий нарушает сопряжение между окислением и фосфорилированием, разрешая идти переносу электронов и в отсутствие синтеза АТФ (эффект разобщения) [13].

Рисунок 8 - Схема хемиосмотического механизма окислительного фосфолирования: ДЦ - дыхательная цепь, АН₂ - субстраты дыхания. Заштрихованный фрагмент внутр. Митохондриальной мембраны в разрезе.

Механизм О.ф. можно представить схемой: Перенос электронов (дыхание) А~В>АТФ>А~В. В-высокоэнергетические интермедиат. Предполагалось, что А~В - химические соединения с макроэргической связью, напр. фосфорилированный фермент дыхательной цепи (хим. гипотеза сопряжения), или напряженная конформация к.-л. белка, участвующего в О.ф. (конформационная гипотеза сопряжения). Однако эти гипотезы не получили экспериментального подтверждения. Наибольшим признанием пользуется хемиосмотическая концепция сопряжения, предложенная в 1961 П. Митчеллом (за развитие этой концепции в 1979 ему присуждена Нобелевская премия). Согласно этой теории, свободная энергия транспорта электронов в дыхательной цепи затрачивается на перенос из митохондрий через митохондриальную мембрану на ее наружную сторону ионов Н⁺ в соответствии с рисунком 8 (процесс 1). В результате на мембране возникает разность электрических потенциалов и разность хим. активностей ионов Н⁺ (?рН) (внутри митохондрий рН выше, чем снаружи). В сумме эти компоненты дают трансмембранную разность электрохимических потенциалов ионов водорода между матриксом митохондрий и внешней водной фазой, разделенными мембраной [14]:

(31)

Где R-универсальная газовая постоянная,

T_абс. - температура,

F- число Фарадея.

Величина обычно составляет около 0,25 В, причем основная часть (0,15-0,20 В) представлена электрической составляющей . Энергия , выделяющаяся при движении протонов внутрь митохондрий по электрическому полю в сторону меньшей их концентрации в соответствии с рисунком 8 (процесс 2) используется АТФ-синтетазой для синтеза АТФ. Т_обр., схему О.ф., согласно этой концепции, можно представить в следующем виде:

Перенос электронов (дыхание)> >АТФ

Сопряжение окисления и фосфорилирования через позволяет объяснить, почему О.ф., в отличие от гликолитического ("субстратного") фосфорилирования, протекающего в растворе, возможно лишь в замкнутых мембранных структурах, а также почему все воздействия, снижающие электрическое сопротивление и увеличивающие протонную проводимость мембраны, подавляют ("разобщают") О.ф. Энергия , помимо синтеза АТФ, может непосредственно использоваться клеткой для других целей - транспорта метаболитов, движения (у бактерий), восстановления никотинамидных коферментов и др.

В дыхательной цепи имеется несколько участков, которые характеризуются значит. перепадом окислительно-восстановительного потенциала ?Е и сопряжены с запасанием энергии (генерацией ). Таких участков, называющих пунктами или точками сопряжения, обычно три: убихинон-редуктазное звено (?Е~0,35-0,4 В), убихинол: цитохром-c-редуктазное звено (?Е~0,25 В) и цитохром-с-оксидазный комплекс (?Е~0,6 В) - пункты сопряжения 1, 2 и 3 соотв. В соответствии с рисунком 9. Каждый из пунктов сопряжения дыхательной цепи может быть выделен из мембраны в виде индивидуального ферментного комплекса, обладающего окислительно-восстановительной активностью. Такой комплекс, встроенный в фосфолипидную мембрану, способен функционировать как протонный насос [14].

Рисунок 9 - Упрощенная схема расположения пунктов сопряжения в цепи дыхательных ферментов; НАДН - восстановленная форма кофермента никотинамидадениндинуклеотида.

Обычно для характеристики эффективности О.ф. используют величины Н⁺/2е или q/2e, указывающие сколько протонов (либо электрических зарядов) переносится через мембрану при транспорте пары электронов через данный участок дыхательной цепи, а также отношение Н⁺/АТФ, показывающее, сколько протонов нужно перенести снаружи внутрь митохондрий через АТФ-синтетазу для синтеза 1 молекулы АТФ. Величина q/2e составляет для пунктов сопряжения 1, 2 и 3 соответственно 3-4, 2 и 4. Величина Н⁺/АТФ при синтезе АТФ внутри митохондрий равна 2; однако еще один Н⁺ может тратиться на вынос синтезированного АТФ 4 из матрикса в цитоплазму переносчиком адениновых нуклеотидов в обмен на АДФ 3 . Поэтому кажущаяся величина Н⁺/АТФ_наружн равна 3.

В организме О.ф. подавляется многими токсичными веществами, которые по месту их действия можно разделить на три группы:

1) ингибиторы дыхательной цепи, или т. наз. дыхательные яды;

2) ингибиторы АТФ-синтетазы. Наиболее распространенные ингибиторы этого класса, употребляемые в лабораторных исследованиях, - антибиотик олигомицин и модификатор карбоксильных групп белка дициклогексилкарбодиимид;

3) так называемые разобщители О.ф. Они не подавляют ни перенос электронов, ни собственно фосфорилирование АДФ, но обладают способностью уменьшать величину на мембране, благодаря чему нарушается энергетическое сопряжение между дыханием и синтезом АТФ. Разобщающее действие проявляет большое число соединений самой разнообразной химической структуры. Классические разобщители - вещества, обладающие слабыми кислотными свойствами, способные проникать через мембрану как в ионизованной (депротонированной), так и в нейтральной (протонированной) формах. К таким веществам относят, напр., 1-(2-дицианометилен)гидразино-4-трифтор-метоксибензол, или карбонилцианид-n-трифторметокси-фенилгидразон, и 2,4-динитрофенол (соотв. формулы I и II; показаны протонированные и депротонированные формы) в соответствии с рисунком 10.

Рисунок 10 - Разобщителеи окислительного фосфолирования (2,4 - динитрофенол)

Двигаясь через мембрану в электрическое поле в ионизованной форме, разобщитель уменьшает ??; возвращаясь обратно в протонированное состоянии, разобщитель понижает ?рН в соответствии с рисунком 11. Таким образом, такой "челночный" тип действия разобщителя приводит к уменьшению.

Рисунок 11 - Схема рабочего цикла разобщителя "челночного" типа: ФКФ - 1-(2-дицианометилен) гидразино-4-трифтометоксибензол

Разобщающим действием обладают также ионофоры (напр., грамицидин), повышающие электропроводность мембраны в результате образования ионных каналов или вещества, разрушающие мембрану (напр., детергенты).

О.ф. открыто В. А. Энгельгардтом в 1930 при работе с эритроцитами птиц. В 1939 В. А. Белицер и Е. Т. Цыбакова показали, что О.ф. сопряжено с переносом электронов в процессе дыхания; к такому же заключению несколько позднее пришел Г. М. Калькар.

Как правило, разобщители - липофильные вещества, легко проходящие через липидный слой мембраны. Примерами разобщителей могут быть также некоторые лекарства, например дикумарол - антикоагулянт или метаболиты, которые образуются в организме, билирубин - продукт катаболизма, тироксин - гормон щитовидной железы. Все эти вещества проявляют разобщающее действие только при их высокой концентрации [14].

2. Экспериментальная часть

2.1 Материалы и оборудование

2.1.1 Микроорганизмы и питательные среды для культивирования микроорганизмов

Клетки микроводоросли Euglena glacilis из коллекции кафедры биотехнологии и биоэкологии, сточная вода, физиологический раствор, среда Лозино-Лозинского, стрептомицин.

Среда Лозино-Лозинского: к 1 дм³ дистилированной воды добавляли 0,1 г NaCl, 0,01 г KCl, 0.01 г MgSO₄, 0.01 г CaCl₂, 0.02 г NaHCO₃. Доводили рН среды до 7,0. Разливают в пробирки и стерилизуют при (121±2)°С в течение (15±1)мин. Среду можно хранить в холодильнике при 8°С в течение недели.

Стрептомицин: раствор стрептомицина концентрации 100 г/дм³ готовят путем внесения во флакон с 0,1 г антибиотика 1 см³ стерильной дистиллированной воды.

Физиологический раствор: В 1 дм³ дистиллированной воды растворяют 8,5 г хлористого натрия, разливают раствор в чистые пробирки по 100 см³ и стерилизуют при (121±2)°С в течение (20±2)мин.

Оборудование. Световой микроскоп "Биолам-2М" с фотонасадкой МФН-11, цифровая микрокамера, таймер с точностью отсчета 0,1 с, пробирки, пипетки, капилляры, предметные стекла, камера Горяева, чашки Петри.

2.1.2 Выделение чистых культур микроводорослей и их идентификация.

Метод Пастёра. Пользуясь жидкими питательными средами, можно выделить микроорганизмы из их смеси постепенным разбавлением культуры каким-либо стерильным раствором до тех пор, пока в одной капле останется одна клетка микроорганизма. В колбочки с небольшим количеством питательной среды высевают по одной капле разведенной культуры. В тех колбочках, где выросла одна колония (в виде пятна на дне), попала одна клетка и образовалась чистая культура. В качестве питательной среды для выделения микроводорослей Euglena glacilis используется среда Лозино-Лозинского, в ней содержится необходимый комплекс питательных микро- и макроэлементов, способствующий росту микроводорослей.

Систематических признаков у микроводорослей не так моного, и их определение связанно со значительными трудностями. Важными морфологическими признаками являются форма и размеры тела, число и длянна жгутиков, их расположение, наличие и отсутствие хролопластов, окраска и др. хроматофоры микроводорослей окрашиваются акридиновым оранжевым. Функциональное состояние водорослей на разных этапах очистки также оценивают при помощи акридинового оранжевого. Живые клетки микроводорослей окрашиваются в ярко-красный цвет, водоросли с угнетенным процессом фотосинтеза дают оранжево-розовую люминестенцию.

Зеленые формы Euglena glacilis становятся бесцветными при выращивании в темноте, но снова приобретают зеленую окраску на свету.

2.2 Методы анализа

2.2.1 Методы определения содержания микроводорослей

Подсчет клеток в счетных камерах:

Метод прямого подсчета клеток микроорганизмов в счетных камерах успешно применяют для определения общего количества микроорганизмов, содержащихся во взвесях (суспензиях).

Известны счетные камеры разных конструкций (Горяева, Фукс Розенталя, Петрова Хауссера, Тома Цейса и др.).

Метод количественного учета микроорганизмов с помощью счетных камер имеет ограничения применения, связанные с тем, что в счетных камерах проводится учет всех клеток микроорганизмов без их дифференциации на живые и мертвые клетки. Кроме того, счетные камеры могут быть использованы лишь для подсчета относительно крупных объектов - клеток водорослей, дрожжей, спор грибов, микроскопируемых при объективе от 8 до 40.

В качестве примера можно привести камеру Горяева, которая внешне представляет собой толстое предметное стекло, разделенное поперечными бороздками, образующими три поперечно расположенные плоские площадки в соответствии с рисунком 12а. Средняя площадка продольным прорезом разделена пополам, причем на каждой половине нанесена квадратная сетка. Две боковые площадки расположены на 0,1 мм выше средней, они служат для притирания покровного стекла в соответствии с рисунком 12б.

Сетка разделена на определенное число больших и маленьких квадратов, по-разному сгруппированных. Постоянной величиной во всех сетках является маленький квадрат АВСD в соответствии с рисунком 12в, сторона которого равна 1/20 мм, площадь его - 1/400 мм?, а объем при высоте камеры 1/10 мм - 1/4000 мм? или 1/4000000 мл. Так называемый большой квадрат АВСD состоит из 16 малых квадратиков. Камера Горяева имеет площадь 9 мм?, объем камеры 9 мм? и разбита на 225 больших квадратов (15 рядов по 15 больших квадратов в каждом ряду) [15].

Заполнение камеры и подсчет клеток:

Каплю взвеси наносят капилляром или пипеткой на сетку камеры и сверху накрывают чистым покровным стеклом. Жидкость под покровным стеклом должна равномерно без пузырьков распределиться по всей сетки, не выступая в желобок между стенками. Большими пальцами покровное стекло плотно притирают к боковым площадкам камеры до появления картины интерференции (колец Ньютона). Заполненную камеру помещают на предметный столик микроскопа и через 2 минуты микроскопируют с объективом от 8 до 40 (в поле зрения должны быть отчетливо видны как квадратики, так и клетки микроорганизмов). Подвижные клетки перед заполнением камеры убивают нагреванием или 0,5%-ным раствором формалина.

а - вид сверху; б - вид сбоку; в - вид при малом увеличении; h - высота камеры

Рисунок 12 - Счетная камера Горяева

Обычно просчитывают количество клеток в пяти больших квадратах (т. е. в 80 малых), расположенных по диагонали. Учитывают все клетки, размещенные внутри квадрата и на пограничных линиях, если они большей частью лежат внутри квадрата. Клетки, разделенные пограничной линией пополам, считают только на двух из четырех границ квадрата, а клетки, лежащие большей своей половиной вне данного квадрата, совсем не учитывают. Количество клеток в 1 мл исследуемой суспензии вычисляют по [15] формуле:

(31)

где М - количество клеток в 1 мл суспензии;

a - среднее количество клеток в квадрате сетки;

h - высота камеры, мм;

S - площадь квадрата сетки, мм?;

10? - коэффициент перевода см? в мм?;

n - коэффициент разведения исследуемой суспензии [15].

2.2.2 Методы определения подвижности клеток

Получаем растворы антибиотика стрептомицина (1000-0,1 ед./см³).

Проводят измерение скорости движения клеток E.gracilis в контрольном образце и в образце с химическим веществом. В приготовленные растворы вносят культуру микроводоросли в экспоненциальной стали роста в соотношении 9: 1 и выдерживают на протяжении 15 мин, после чего образец вводят в капилляры. Заполненные капилляры помещают в объект микрометра, фиксируют зажимами и наблюдают под микроскопом с объективом 20?. Измеряют с помощью секундомера время пробега клеток в капиллярах между двумя фиксированными метками шкалы объект микрометра в поле зрения микроскопа.

Для увеличения точности и воспроизводимости показаний измерения проводят на 10 клетках микроводоросли, усредняя полученные результаты.

При визуальном наблюдении движения клеток под микроскопом определяют среднее время прохождения клетками E.gracilis фиксированного расстояния (0,5 мм). В варианте с цифровой камерой регистрируют треки движения микроорганизмов и определяют пути, пройденные клетками, по шкале объект микрометра за фиксированный интервал времени.

Абсолютное значение скорости движения клеток микроводоросли рассчитывают из следующего соотношения [15]:

, (32)

где l - путь пробега, мм;

t - время пробега клеток между фиксированными метками, с.

Среднее значение скорости находят по [15] формуле 33:

, (33)

где n - число наблюдаем клеток микроводоросли.

Среднеквадратичную ошибку среднего определяют по следующей формуле [15]:

, (34)

2.2.3 Методы определения жизнеспособности клеток

Для анализа жизнедеятельности микроорганизмов используются термограммы. Различают дифференциальную и интегральную термограммы.

Под дифференциальной термограммой понимают зависимость мощности тепловыделении образца от времени наблюдения.

Интегральная термограмма отражает общее количество тепла, выделенного к определенному моменту, как функцию времени. Микрокалориметр непосредственно регистрирует дифференциальную термограмму, и затем рассчитывается интегральная термограмма.

Тепловыделение может быть обусловлено физико-химическими, биохимическими, микробиологическими процессами. В последнем случае термограмма отражает энергетический обмен микроорганизмов с окружающей средой в процессе жизненного цикла популяции клеток.

Так как различные процессы жизнедеятельности микроорганизмов сопровождаются выделением тепла, то мерой физиологической активности клеток с энергетической точки зрения может являться скорость их тепловыделения, которая отражает как интенсивность протекающих метаболических реакций, так и скорость размножения клеток.

В основе биокалориметрии, как и других косвенных инструментальных методов анализа живых организмов, лежит зависимость величины регистрируемого сигнала от численности и физиологической активности клеток в анализируемом объекте.

Для характеристики тепловыделения отдельного вида микроорганизмов может быть использована величина удельной теплопродукции клеток [16]:

, (35)

где q_i - мощность тепловыделения клеток i-го вида;

N_i - количество клеток i-го вида [16].

Перед тем как приступить к работе с прибором, его необходимо прогреть в течение 1ч. После чего установив параметры, необходимые для измерения можно приступить к измерениям. К прибору прилагаются две микрокюветы объемом 1 мл, которые заполняются раствором сравнения (дистиллированная вода) и суспензией, изучаемых микроорганизмов. Суспензию микроорганизмов готовят следующим образом: к полученной чистой культуре приливают физраствор. Медленно, круговыми движениями перемешиваем. Затем отбираем 0,5 мл и переливаем в микрокувету на 1 мл. В эту же кювету помещаем 0,5 мл среды Лозино-Лозинского. В другую кювету помещаем дистиллированную воду. Заполненные микрокюветы помещают в микрокалориметр и проводят измерения.

2.3 Результаты и их обсуждение

2.3.1 Описание выделения и идентификации микроводорослей

Выделение микроводорослей производилось из пробы сточной воды методам Пастера. Метод Пастера - последовательное разведение исследуемого материала в жидкой питательной среде до концентрации одной клетки в объеме. Исследуемый материал последовательно разводят в жидкой питательной среде: берут ряд пробирок с физиологическим раствором, исследуемый материал вносят в первую пробирку, перемешивают, из неё переносят во вторую и т.д. Проводили 5 разведений. В 4 разведении содержалась одна клетка микроводоросли Euglena gracilis. В качестве питательной среды использовали среду Лозино-Лозинского. Среду готовили следующим образом. К 1 дм³ дистилированной воды добавляли 0,1 г NaCl, 0,01 г KCl, 0.01 г MgSO₄, 0.01 г CaCl₂, 0.02 г NaHCO₃. Доводили рН среды до 7,0. Среду можно хранить в холодильнике при 8°С в течение недели. Выращивали микроводоросли при температуре 20°С и естественном освещении.

Зеленые формы выделенных организмов становятся бесцветными при выращивании в темноте, но снова приобретают зеленую окраску на свету.

2.3.2 Изучение влияния антибиотиков на подвижность микроводорослей

В качестве тест-объекта в работе использовали клетки микроводоросли Euglena gracilis из коллекции кафедры биотехнологии и биоэкологии БГТУ. Культивирование клеток микроводоросли осуществляли в среде Лозино-Лозинского при температуре 20°С и естественном освещении. Пересев культуры клеток в свежую среду осуществляли через каждые 3 суток для поддержания их в состоянии логарифмического роста. Определение количества клеток микроводоросли осуществляли в камере Горяева с помощью микроскопа. Подсчитанное количество клеток находилось в интервале 10³-10⁴ кл./мл.

В качестве антибиотиков использовали стрептомицин сульфат. Раствор стрептомицина концентрации 100 г/дм³ готовят путем внесения во флакон с 0,1 г антибиотика 1 см³ стерильной дистиллированной воды.

Измерение рН растворов выполняли на рН-метре-121. Значение рН для среды Лозино-Лозинского было 7,0.

Исследования проводились на образцах, искусственно загрязненных антибиотиками в диапазоне концентраций 0,0001-1000 ед./г. Для этого препараты антибиотиков вносили в подготовленный препарат содержащий водоросли Euglena gracilis.

Для наблюдения за подвижностью клеток микроводоросли Euglena gracilis использовали микроскоп производства БелОМО, обьект-микрометр, капилляры, зажимы, цифровой таймер с точностью отсчета 0,1 с. Для автомаизации измерений на окуляр микроскопа помещали фотонасадку с фотодиодом ФД-256. После усиления с помощью микросхемы К140УД8А сигнал регистрировался на самописце КСП-4.

В физиологический раствор (4 мл) добавляли 0,5 мл антибиотика соответствующей концентрации и 0,5 мл микроводоросли Euglena gracilis, выдерживали в течение 15 мин, заполняли капилляры и измеряли подвижность клеток с помощью микроскопа при увеличении 20x10. В качестве контроля использовали образцы с добавлением 0,5 мл чистой среды Лозина-Лозинского и 0,5 мл клеток. Для увеличения точности показаний измерения проводили на 9 клетках микроводоросли. Результаты обрабатывали статистически, используя программное обеспечение Microsoft Excel. Во время поиска пищи и при оптимальных условиях существования клетки микроводоросли совершают поступательные движения в разных направлениях. В присутствии ингибирующих веществ скорость поступательного движения клеток снижается. При воздействии токсичных веществ поступательный характер движения клеток изменяетсяна вращательный и они теряют жизнеспособность. Влияние ксенобиотиков на клетки Euglena gracilis характеризовали изменением относительного значения скорости:

(36)

где V_K - средняя скорость движения клеток в контрольном образце;

В - относительная подвижность клеток.

Ингибирующий (IС50) эффект действия антибиотиков определяли величиной концентраций, которые соответствовали 50%-ному изменению относительной подвижности клеток. Порог обнаружения (Сmin) характеризовали величиной концентрации антибиотика, вызывавшей изменение относительной подвижности на 10%. Результаты исследований подвижности микроорганизмов Euglena gracilis в питательной среде в присутствии антибиотиков представлены в таблице 1 и на рисунке 13.

Чувствительность клеток микроводоросли Euglena gracilis к антибиотикам в искусственной питательной среде находилась в интервале 0,001-0,1 мг/л. На рисунке 13 приведен график изменения относительной подвижности клеток микроводоросли в зависимости от логарифма концентрации антибиотика стрептомицин сульфат. Как видно из рисунка, зависимость носит линейный характер и может быть описана уравнением

B=?a•lgC + b, (37)

где a, b - экспериментально найденные константы.

Сравнительный анализ подвижности микроводоросли Euglena gracilis в искусственной питательней среде показывает, что клетки сохраняют высокую чувствительность к антибиотикам и в сложных средах.

Таблица 1 - Влияние антибиотиков на подвижность микроводоросли Euglena gracilis

Вещество	Концентрация, ед./мл	В, %	Сmin, ед./мл	IC50, ед/мл
Контроль	-	100	-	-
Стрептомицин	1000	40	0,002	10
	100	45
	10	50
	1,0	55
	0,1	65

Рисунок 13 - Зависимость относительной подвижности клеток Euglena gracilis от логарифма концентрации антибиотика стрептомицин сульфат в питательной среде Лозино-Лозинского (Т= 20°С)

Процедура анализа антибиотиков предложенным методом значительно проще и быстрее, чем редуктазным методом. Это позволяет использовать данный метод для тестирования мясомолочной продукции. В изученной области концентрации антибиотиков клетки микроводоросли сохраняли жизнеспособность, следовательно действие антибиотиков на данные микроорганизмы носит ингибирующий, а не токсичный характер. При смене питательной среды клетки быстро восстанавливали исходную активность. Для оценки устойчивости микроводоросли Euglena gracilis к антибиотикам определяли значение IC₅₀ в искусственной питательной среде. Таким образом, в работе предложен быстрый, простой и чувствительный метод количественного определения антибиотиков в мясомолочной продукции, основанный на измерении подвижности клеток микроводоросли Euglena gracilis, позволяющий в течение 15-20 мин обнаружить присутствие антибиотиков в концентрации 0,001 ед./мл с относительной погрешностью 10%.

2.3.3 Анализ влияния разобщителей дыхания и синтеза АТФ на подвижность клеток

В качестве препарата разобщителя дыхания и синтеза АТФ была взята ацетилсалициловая кислота. Разобщители окислительного фосфорилирования, являясь амфипатическими, повышают проницаемость мембраны для протонов, тем самым снижая электрохимический потенциал и выключая АТФ-синтетазу по типу короткого замыкания.

Для определения влияния разобщителей дыхания и синтеза АТФ на микроводоросли были проведены измерения тепловыделения микроводоросли Euglena gracilis микрокалориметрическим методам. Испытывали действие разобщителей при концентрации клеток 10⁴ кл/мл. Суспензию микроорганизмов готовят следующим образом: к полученной чистой культуре приливают физраствор. Медленно, круговыми движениями перемешиваем. Затем отбираем 0,5 мл и переливаем в микрокувету на 1 мл. В эту же кювету помещаем 0,5 мл среды Лозино-Лозинского. Во втором опыте в кювету дополнительно капали ацетилсалициловую кислоту. Другая кювета оставалась пустой. Заполненные микрокюветы помещают в микрокалориметр и проводят измерения. В ходе эксперимента установили, что в присутствии разобщителей количество выделяющейся энергии увеличилось в среднем на 30%.

При измерении тепловыделения микроводоросли получены следующие результаты, которые приведены в таблице 2.

Таблица 2 - Тепловыделения микроводорослей

n	0	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
t	2	4	6	8	10	12	14	16	18	20	22
Q, мДж	0	49,4	96,6	134,8	161,8	185,4	203	217,7	229,9	241,3	250,9
S, мкВт	85,02	126,9	182,4	232,7	279,3	323,1	364,3	403,7	441,5	478	513,1

При измерении тепловыделения микроводоросли в присутствии разобщителей дыхания и синтезе АТФ получены следующие результаты, которые приведены в таблице 3.

Таблица 3 - Тепловыделения микроводорослей в присутствии разобщителей дыхания и синтеза АТФ

n	0	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
t	2	4	6	8	10	12	14	16	18	20	22
Q, мДж	0	64,2	125,6	166,4	209,1	239,6	365,4	291,2	298,7	310,9	326,1
S, мкВт	108,6	162,3	237,12	300,2	363,1	415,3	476,3	527,7	573,2	622,1	664,2

Для анализа жизнедеятельности микроорганизмов используем термограммы: дифференциальную в соответствии с рисунком 14 и интегральную в соответствии с рисунком 15.

Рисунок 13 - Графическая зависимость выделенного тепла от времени измерения



Рисунок 14 - Графическая зависимость мощности теплового потока от времени измерения

Заключение

В данной курсовой работе были изучены методы выделения и идентификации микроводорослей и проанализирована их чувствительность к ингибирующим веществам. Для этого были выделены чистые культуры микроводорослей Euglena gracilis, определили их общее количество в камере Горяева, которое составляет 10³-10⁴кл/мл и провели эксперименты по влиянию антибиотиков на подвижность Euglena gracilis. Установлено что действие антибиотика стрептомицина носит ингибирующий, а не токсичный характер при малых концентрациях. Так же был проведен анализ влияния разобщителей дыхания и синтеза АТФ на подвижность клеток и установлено, что в присутствии такого разобщителя, как ацетилсалициловая кислота, выделяется в среднем на 30% больше энергии.

Список использованных источников

1 Гофман, В.Р. Экологические аспекты безопасности продовольственного сырья и продуктов питания: Учебное пособие / В.Р. Гофман.- Челябинск: ЮУрГУ, 2004.- 551 с.

2 Горбунова, Н.П. Альгология: Учебное пособие для вузов по специальности "Ботаника" / Н.П, Горбунова.- Минск: Высшая школа, 1991.- 256 с.

3 Гайсина, Л.А. Современные методы выделения и культивирования водорослей: учебное пособие / Л.А. Гайсина, А.И. Фазлутдинова, Р.Р. Кабиров.- Уфа: БГПУ, 2008.- 152 с.

4 Вассер, С.П. Водоросли. Справочник / С.П. Вассер, Н.В. Кондратьева, Н.П. Масюк.- Киев: Наук. думка, 1989.- 608 с.

5 Федоров, А.А. Жизнь растений. Том 3. Водоросли и лишайники / А.А. Федоров [и др.]; под ред. А.А. Федорова.- Москва: Просвещение, 1977.- 487 с.

6 Мелехова,О.П. Биологический контроль окружающей среды: биоиндикация и биотестирование: учеб. пособие для студ. высш. учеб. заведений / О.П. Мелехова [и др.]; под ред. О.П.Мелеховой и Е.И. Егоровой.- Минск: Издательский центр "Академия", 2007.- 288 с.

7 Метод биотестирования по данным электрической реакции клеток харовых водорослей / В.М. Юрин [и др] // Методы биотестирования вод: Сб.ст. Черноголовка.-1988 - С. 33-37

8 Саут, Р. Основы альгологии / Р. Саут, А.Уиттик.- Москва: Мир, 1990.- 597 с.

9 Пашкевич, М.А. Экологический мониторинг: Учебное пособие / М.А. Пашкевич, В.Ф. Шуйский.- Санкт-Петербург: СПб, 2002.- 89 с.

10 www.microhunter.ru

11 Захаров, И.С. Система аппаратурного исследования структуры популяции Текст. / A.B. Завгородний, И.С. Захаров // Материалы XII Всероссийской конференции по проблемам науки и высшей школы.- Санкт-Петербург, 2008. - С. 271-272

12 Скулачев, В.П. Энергетика биологических мембран / В.П. Скулачев.- Минск: Наука, 1989.- 288 с.

13 Скулачев, В.П. Биоэнергетика. Мембранные преобразования энергии / В.П. Скулачев.- Минск: Высшая школа, 1989.- 256 с.

14 Рэкер, Э. Биоэнергетические механизмы. Новые взгляды / Э.Рэкер.- Минск: Мир, 1979.- 186 с.

15 Игнатенко, А.В. Сенсорный контроль качества пищевых продуктов. Лабораторный практикум: учеб. пособие для студентов специальностей "Физико-химические методы и приборы контроля качества продукции", "Товароведение и экспертиза товаров" / А.В. Игнатенко. - Минск: БГТУ,2008. - 186 с.

16 Игнатенко, А.В. Микробиологические, органолептические и визуальные методы контроля качества пищевых товаров. Микрокалориметрия: Лабораторный практикум / А.В. Игнатенко, Н.В. Гриц. - Мн: БГТУ, 2003. - 114 с.

Размещено на Allbest.ru