21

Федеральное агентство по образованию

Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования

Пущинский государственный университет

Учебный центр микробиологии и биотехнологии

На правах рукописи

Качаев Заур Мозырович

МАГИСТЕРСКАЯ ДИССЕРТАЦИЯ

“Идентификация генов биосинтеза эктоина у метилотрофной бактерии Methylarcula marina”

Направление подготовки магистра (020200 Биология)

Магистерская образовательная программа

(Микробиология и вирусология)

«Работа допущена к защите»:

Научный руководитель, д.б.н., профессор ________ Ю.А. Троценко

Руководитель магистерской образовательной программы,

д.б.н., профессор _________ А.А. Леонтьевский

Пущино, 2010 г.

Оглавление

Список сокращений

Введение

Глава 1. Галофильные микроорганизмы

1.1 Осмоадаптация

1.2 Гиперосмотический шок

1.3 Спектр совместимых растворимых веществи их распространение у микроорганизмов

Глава 2. Биосинтез эктоина и гидроксиэктоина

2.1 Гены и ферменты биосинтеза эктоина и гидроксиэктоина

Глава 3. Осмоадаптация аэробных метилотрофных бактерий. Экспериментальная часть

Глава 4. Материалы и методы исследования

4.1 Культивирование бактерий

4.2 Получение бесклеточных экстрактов и определение концентрации белка

4.3 Определение активности диаминобутиратацетилтрансферазы.

4.4 Выделение и анализ осмопротекторов

4.5 Молекулярно-биологические методы

4.6 Определение и анализ последовательностей нуклеотидов

4.7 Клонирование и экспрессия генов

4.8 Выделение и очистка белков

4.9 Определение физико-химических свойств ферментов

Результаты и обсуждение

Глава 5. Идентификация и характеристика генов биосинтеза эктоина у метилотрофной бактерии Methylarcula marina

5.1 Накопление эктоина у M. marina

5 2 Идентификация генов, кодирующих ферменты биосинтеза эктоина у M.marina

5.3 Интеграция генов биосинтеза эктоина из M. marina в негалофильный штамм Methylobacterium extorquens AM1

Глава 6. Характеристика рекомбинантной ДАБ-ацетилтрансферазы

6.1 Клонирование, очистка и первичная характеристика рекомбинантной ДАБ-ацетилтрансферазы

Выводы

Список литературы

Список сокращений

ask - ген, кодирующий аспартаткиназу (Ask)

ectA - ген, кодирующий ДАБ-ацетилтрансферазу (EctA)

ectB - ген, кодирующий ДАБ-аминотрансферазу (EctB)

ectC - ген, кодирующий эктоинсинтазу (EctC)

ectD - ген, кодирующий эктоингидроксилазу (EctD)

His - гистидин

Ni²⁺-NTA - Ni²⁺- нитроацетат агароза

SDS - додецилсульфат натрия

АТФ - аденозин-5'-трифосфат

БСА - бычий сывороточный альбумин

ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография

ДАБ - диаминобутират

ДАБАцТ - ДАБ-ацетилтрансфераза

ДТНБ - 5,5'-дитиобис-(2-нитробензоат)

ДТТ - 1,4-дитиотриетол

ИПТГ - изопропил-1-тио-в-D-галактопиранозид

КоА - коэнзим А

НАД(Ф)⁺ - никотинамидадениндинуклеотид(фосфат), оксиленный

НАД(Ф)Н - никотинамидадениндинуклеотид(фосфат), восстановленный

ОРС - открытая рамка считывания

п.н. - пары нуклеотидов

ПААГ - полиакриламидный гель

ПЦР - полимеразная цепная реакция

Трис-НСl - трис(гидроксиметил)аминометанхлорид

ТХУ - трихлоруксусная кислота

ФЕП - фосфоенолпируват

ФМС - феназинметосульфат

ФМСФ - фенилметансульфонилфторид

Х-Gal - 5-бром-4-хлор-3-индолил-в-D-галактозид

ЦТК - цикл трикарбоновых кислот

ЭДТА - этилендиаминтетраацетат

Введение

Актуальность проблемы. Микроорганизмы, существующие в условиях высокой солености, для поддержания осмотического равновесия между клеткой и внешней средой накапливают в клетках неорганические ионы или низкомолекулярные органические соединения - осмолиты или осмопротекторы. Стратегию осмоадаптации, связанную с аккумуляцией органических осмопротекторов - веществ, совместимых с основными метаболическими процессами в клетках, реализуют многие умеренно галофильные прокариоты. Среди них недавно обнаружены аэробные метилотрофные бактерии, выделенные из (гипер)соленых и щелочных водоемов (Khmelenina et al., 1999; Kalyuzhnaya et al., 2001; Doronina et al., 2003), использующие в качестве источников углерода и энергии метан (метанотрофы) или его окисленные и замещенные производные (метилобактерии). Установлено, что аэробные галофильные метилотрофы накапливают циклическую иминокислоту эктоин (1,4,5,6-тетрагидро-2-метил-4-пиримидин карбоксилат), глутамат и сахарозу (Khmelenina et al., 1999).

Биосинтез эктоина, широко распространенного в микробном мире осмопротектора, у гетеротрофных галофильных бактерий начинается реакцией трансаминирования L-аспартилполуальдегида с последующим ацетилированием образующегося L-2,4-диаминобутирата (ДАБ) и завершается циклизацией N-ацетил-L-2,4-ДАБ в эктоин (Galinski, 1995). В последние годы предпринимаются попытки детального изучения свойств ферментов и генов этого биохимического пути, что обусловлено практическими задачами получения эктоина, перспективного биопротектора, используемого в медицине и косметике, а также в научной практике в качестве водоудерживающего средства и стабилизатора биомолекул и целых клеток.

Специфические ферменты, катализирующие реакции биосинтеза эктоина - ДАБ-ацетилтрансфераза (EctА), ДАБ-аминотрансфераза (EctB) и эктоинсинтаза (EctС), частично охарактеризованы у Halomonas elongata (Ono et al., 1999), а так же у метанотрофной бактерии Methylomicrobium alcaliphilum 20Z (Reshetnikiov et. al., 2006). Гены, кодирующие эти ферменты, идентифицированы у ряда гетеротрофных, автотрофных галофильных прокариот и метилотрофных бактерий, установлено расположение данных генов в одном опероне ectABC. Однако соответствующие сведения о свойствах ферментов и организации генов биосинтеза эктоина у галотолерантной метилотрофной альфа-протеобактерии Methylarcula marina отсутствуют. В связи с вышеизложенным представлялось актуальным провести исследование ферментов и генов биосинтеза эктоина у M. marina для выявления степени сходства и/или возможных отличий от других бактерий.

Цель и задачи исследования. Цель данной работы - идентификация генов биосинтеза эктоина у метилотрофной альфа-протеобактерии Methylarcula marina. Для достижения указанной цели были поставлены и решались следующие задачи:

Идентифицировать гены биосинтеза эктоина у M. marina, провести их филогенетический анализ.

Клонировать ген ectA, получить и охарактеризовать рекомбинантную ДАБ-ацетилтрансферазу.

Сконструировать плазмидную конструкцию, несущую ectABC гены под промотором метанолдегидрогеназы Pmax, для интеграции в хромосому негалофильной метилобактерии Methylobacterium еxtorquens AM1.

Измерить накопление эктоина в рекомбинантных клетках и в среде культивирования M. еxtorquens AM1.

Магистерская диссертация выполнена на базе ИБФМ им. Г.К. Скрябина РАН, в лаборатории радиоактивных изотопов под руководством д.б.н., проф. Троценко Ю.А.

Научная новизна. Установлено, что в ответ на увеличение солености среды изучаемый галотолерантная метилотрофная бактерия накапливает в клетках эктоин. Впервые определена полная нуклеотидная последовательность генов биосинтеза эктоина у метилотрофной бактерии Methylarcula marina, относящейся к классу б-Proteobacteria. Показано, что у M. marina гены, кодирующие ДАБ-ацетилтрансферазу (ectA), ДАБ-аминотрансферазу (ectB), эктоинсинтазу (ectC) и аспартаткиназу (ask), сцеплены и составляют оперон ectABC-ask.

Клонированием и экспрессией в Escherichia coli гена ectA из M. marina впервые получен гомогенный и частично охарактеризован препарат рекомбинантной ДАБ-ацетилтрансферазы. Полученные результаты создают основу для изучения регуляции биосинтеза эктоина на биохимическом и генетическом уровнях у M. marina .

Практическое значение работы. Проведенное расшифровка нуклеотидных последовательностей и организации ect-генов позволяет рационально манипулировать данным генетическим материалом с целью создания более эффективных штаммов-продуцентов эктоина на основе метанола.

Глава 1 Галофильные микроорганизмы

Микроорганизмы обитают в водной среде с различной степенью солености, от пресных и морских биотопов до гиперсолёных водоёмов с высокими концентрациями NaCl, вплоть до насыщения. По отношению к солености микроорганизмы разделяются на несколько физиологических групп.

Негалофилные микрооганизмы, обитающие в пресных и ультрапресных экосистемах, не нуждаются в NaCl и способны существовать в местах с крайне низким содержанием солей (?0.01%). К ним относится также симбиотрофная микрофлора, связанная с организмом человека, животных и растений. Угнетение их роста начинается обычно при концентрации NaCl около 3%. Галотолерантные микрооганизмы выдерживают более высокие концентрации и часто обитают в местах с меняющейся соленостью, например, в почве. Слабые галофилы оптимально растут при солености около 3.5% и, как правило, развиваются в узком диапазоне концентраций соли (2.5-5% NaCl). К слабым галофилам относят большинство морских микроорганизмов. Умеренные галофилы лучше всего растут на средах, содержащих 5-15% соли. Микроорганизмы, способные к росту в присутствии менее чем 0.1 М соли, относятся к факультативным галофилам. Умеренные галофилы обычно нуждаются не только в ионах Na⁺, но также в K⁺ и Mg²⁺. Экстремальные галофилы оптимально растут на среде, содержащей от 12-15% NaCl вплоть до насыщенных растворов. Примером могут служить “красные галофилы” - галобактерии и галококки.

Особую группу составляют галоалкалофилы, растущие при высоких концентрациях соды и сочетающие в себе свойства галофилов и алкалофилов. Типичными местами их обитания являются высокоминерализованные содовые озера.

Галофильные и галотолерантные микроорганизмы находятся во всех трёх доменах жизни: Археи, Бактерии и Эукариоты (Oren, 1999).

1.1 Осмоадаптация

Один из основных параметров всех экосистем - осмотический стресс. Вода свободно проникает через мембрану, и неадаптированные организмы быстро теряют воду в присутствии солей. Чистая вода имеет активность (б_w) равную 1, а растворы солей имеют значение б_w меньше 1 (б_w - отношение давления водяного пара над раствором к давлению над дистиллированной водой при испарении). Обитатели ультрапресных вод развиваются при водном потенциале 1, для морской воды этот потенциал равен 0.98, для гиперсоленых озер 0.75. Среды с повышенным содержанием сахара (б_w?0.61), благоприятны для развития ксерофильных организмов (грибы и дрожжи), в гиперсолёных местообитаниях, где доступность воды лимитируется высокими концентрациями солей, обычно NaCl, распространены, главным образом, прокариоты (Grant, 2004). Для своего существования клетки должны поддерживать тургор - равное или избыточное по отношению к окружающей среде осмотическое давление в цитоплазме.

Для достижения осмотического равновесия между клетками и окружающей средой микроорганизмы реализуют две различные стратегии. Первая стратегия предусматривает поддержание осмотического равновесия путём избирательного накопления в цитоплазме неорганических ионов (так называемый солевой тип осмоадаптации). Солевую стратегию используют две филогенетически удалённые группы микроорганизмов: аэробные экстремально галофильные археи семейства Halobacteriaceae и анаэробные галофильные бактерии порядка Haloanaerobiales, а также ацетогенные анаэробы (виды Halobacteroides, Sporohalobacter, Acetohalobium) и сульфатредукторы (Desulfovibrio halophilus, Desulfohalobium retbaense) (Zhilina and Zavarzin, 1990; Caumette et al., 1991; Galinski and Truper, 1994). Эти микроорганизмы аккумулируют в клетках неорганические ионы в высоких концентрациях, при этом преобладающим катионом является K⁺. В ходе эволюции ферменты и другие макромолекулы экстремальных галофилов модифицировались таким образом, чтобы эффективно функционировать при высоких внутриклеточных концентрациях солей. Адаптация ферментов заключаются в изменении их аминокислотного состава, при этом увеличение количества кислых и уменьшение количества гидрофобных аминокислот, которое компенсируется присутствием полярных аминокислот (серин и треонин), обусловливает наличие сильной гидратной оболочки вокруг белка (da Costa et al., 1998). Активность большинства ферментов экстремальных галофилов зависит от присутствия относительно высоких концентраций ионов K⁺ и/или Na⁺, необходимых для поддержания конформации белков. Таким образом, эти микроорганизмы зависят от постоянного присутствия высоких концентраций соли в окружающей среде (da Costa et al., 1998).

Zaccai и др. (1989) предложили модель стабилизации галофильных белков. Согласно данной модели третичная и четвертичная структура ферментов галофильных бактерий образует петли, содержащие отрицательно заряженные аминокислоты и выступающие за границы глобулы. В условиях высокой осмолярности катионы (К⁺) нейтрализуют отрицательные заряды на выступающих белковых петлях, что приводит к уменьшению отталкивания между аминокислотами белковой поверхности и усилению гидрофобных взаимодействий. Снижение концентрации соли ниже 0.5 М приводит к ослаблению конформации галофильных белков и разворачиванию белковой глобулы (Sleator and Hill, 2001).

Второй тип осмоадаптации, характерный для большинства умеренно галофильных и галотолерантных микроорганизмов, связан с накоплением специфических низкомолекулярных органических веществ - осмолитов (или совместимых растворимых веществ). Эти низкомолекулярные вещества хорошо растворимы в воде и не несут заряда при физиологических значениях pH. Кроме этих общих свойств, совместимые растворимые вещества галофилов имеют мало общего в своей химической структуре. Некоторые из них более эффективны в качестве осмопротекторов, чем другие (Galinski, 1995).

У микроорганизмов с несолевым типом осмоадаптации внутриклеточные макромолекулы не подвергаются специфической модификации и, следовательно, чувствительны к высокой внутриклеточной концентрации соли. Такой тип осмоадаптации не предполагает значительных генетических, ферментативных и структурных изменений и поэтому обеспечивает более гибкий способ адаптации клеток к осмотическим колебаниям. Возможно, по этой причине механизм, связанный с накоплением органических веществ, имеет широкое распространение в микробном мире (Galinski, 1995).

Осмолиты не только поддерживают клеточный тургор, но также защищают макромолекулы от ингибирующего действия неорганических ионов или органических молекул (Galinski and Truper, 1994). Существует несколько возможных объяснений стабилизирующего действия совместимых растворимых веществ. Модель Bull и Breese (1974) предполагает увеличение поверхностного натяжения воды осмолитами. Сольватация белков (с более низким поверхностным натяжением) энергетически более выгодна, поскольку основная масса воды гидратирует белок, снижая при этом высокое поверхностное натяжение на белковой молекуле.

Возможно, важную роль играет стерическое несоответствие. В отличие от воды, которая, благодаря своим небольшим размерам, полярности и водородному потенциалу, способна заполнить почти любую белковую поверхность, большинство органических осмолитов - большие и жесткие молекулы. Третье, и, возможно, наиболее простое объяснение заключается в существовании сил отталкивания между осмолитом и некоторыми функциональными группами на белковой глобуле. Независимо от механизма стабилизации, термодинамический эффект действия осмолитов на клеточные структуры одинаков и приводит не только к солеустойчивости, но также к устойчивости к другим стрессовым факторам, таким как замораживание, нагревание, высушивание (Sleator and Hill, 2001).

1.2 Гиперосмотический шок

Начальная фаза осмоадаптации: первичный ответ. При осмотическом шоке поглощение ионов К⁺ является первичным ответом как грамположительных (Г⁺), так и грамотрицательных (Г^-) бактерий. Для поддержания электронейтральности при увеличении осмолярности у E. coli вслед за накоплением К⁺ увеличивается биосинтез и накопление глутамата как противоиона, причем при быстром увеличении осмолярности среды синтез глутамата осуществляется с минутной задержкой (McLaggan et al., 1994). У Bacillus subtilis при гиперосмотическом шоке повышение внутриклеточного пула К⁺ сопровождается накоплением большого количества пролина. Но природа противоиона для пролина у B. subtilis еще не доказана (Kempf and Bremer, 1998; Wood et al., 2001).

По сравнению с Г^-, для Г⁺ бактерий характерны более высокий внутриклеточный пул аминокислот, в котором большая часть приходится на глутамат, и более высокая концентрация К⁺ (около 1 М) в клетках даже в отсутствии осмотического стресса. Это коррелирует с высоким тургорным давлением (20 бар у Г⁺ бактерий и 3-10 бар у Г^- бактерий) (Poolman and Glaasker, 1998). Различия в составе цитоплазмы у Г⁺ и Г^- бактерий в отсутствии осмотического стресса отражаются на их реакции на гиперосмотический стресс: Г⁺ бактериям выгодней накапливать осмопротекторы (пролин или глицинбетаин), чем электролитную пару К⁺-глутамат (Sleator and Hill, 2001).

При гиперосмотическом шоке бактерии теряют воду посредством её диффузии аквапорины. Затем происходит быстрое накопление ионов К⁺ через тургор-чувствительные транспортные системы, которые достаточно хорошо охарактеризованы у E. coli (Sleator and Hill, 2001), значительно меньше информации имеется относительно К⁺-транспортных систем у других бактерий (Nakamura et al., 1998a; Nakamura et al., 1998b; Kawano et al., 1999; 2000; Murata et al., 1996; Holtmann et al., 2003; Kraegeloh et al., 2005).

Вторичный ответ: накопление осмопротекторов. Избыток положительного заряда в цитоплазме галотолерантных Proteobacteria, создаваемый избытком ионов К⁺, не компенсируется ионами хлора, как у Halobacteriaceae и Haloanaerobiales, но полностью сбалансирован органическими анионами, синтезируемыми de novo или поступающими из среды. В качестве противоионов К⁺, кроме глутамата, могут выступать его производные - -глутамилглутамин и восстановленный глутатион (Galinski, 1995). Максимальный уровень К⁺-глутамата (?400 мМ) найден у Г^- бактерий при солености среды 0.5 М NaCl (Galinski, 1995). Увеличение концентрации соли выше этого уровня является пусковым механизмом для вторичного ответа, а именно, для накопления осмопротекторов.

1.3 Спектр совместимых растворимых веществи их распространение у микроорганизмов

Спектр совместимых растворимых веществ, обнаруженных у прокариот и эукариот, весьма широк и разнообразен (Roberts, 2004; 2005). Термин “совместимые растворимые вещества” был предложен для соединений, которые не ингибируют метаболические процессы, но защищают клетку и клеточные компоненты в условиях водного стресса (Brown, 1976). Этот термин применим к органическим осмолитам, которые предохраняют макромолекулы от ингибирующего действия неорганических ионов или органических молекул. Некоторые органические вещества могут также защищать клетки и макромолекулы при замораживании-оттаивании, высушивании и воздействии высокой температуры (da Costa et al., 1998). Так, например, в опытах in vitro показано, что эктоин стабилизирует лактатдегидрогеназу и другие ферменты при воздействии высушивания, высокой и низкой температуры. Благодаря этим свойствам, осмолиты могут использоваться в косметике и биотехнологии (Ventosa and Nieto, 1995).

Осмопротекторы относятся к различным классам органических соединений, специфических для разных групп галофильных и галотолерантных микроорганизмов. Проведенный скрининг осмопротекторов у более чем 200 галофильных изолятов, включая цианобактерии (Reed et al., 1984), аноксигенные фототрофные бактерии (Truper and Galinski, 1986), аэробные хемогетеротрофы, протеобактерии - и -подклассов (виды рода Halomonas, Vibrio, Pseudomonas), актиномицеты (виды Actinopolyspora, Nocardiopsis), бациллы и родственные виды Staphylococcus и Salinicoccus, умеренно галотолерантные виды Brevibacterium и Corynebacterium (Bernard et al., 1993; Frings et al., 1993), позволил разделить эти соединения на следующие основные группы (Galinski, 1995):

полиолы (глицерин, арабит, манит), сахара и их производные (сахароза, трегалоза и глюкозилглицерин);

цвиттерионные соединения и бетаины (глицинбетаин);

аминокислоты (пролин, глутамин и глутамат);

N-ацетилированые диаминокислоты (ацетилорнитин, ацетиллизин);

амидные производные глутамата (N-карбамоилглутамиламид);

эктоины (эктоин, гидроксиэктоин);

метилированые сульфосоединения (диметилсульфониопропионат), накапливающиеся у цианобактерий и морских водорослей.

Эти исследования привели к ряду важных обобщений:

1. Синтезируемые de novo полиолы, такие как глицерин, арабит, инозит, часто накапливаются у галофильных и галотолерантных грибов, устойчивых к солям растений, но не обнаружены у галофильных бактерий.

2. Все “совместимые вещества”, синтезируемые или транспортируемые из среды, накапливаются в концентрациях, превышающих 500 мМ, и являются полярными, хорошо растворимыми молекулами, не несущими суммарного заряда.

3. Заряженные аминокислоты, такие как глутамат, -глутамат, бетаинглутамат и другие, не накапливаются в очень больших количествах (более 400 мМ).

Осмолиты могут быть разделены на основании затрачиваемой клеткой энергии для их биосинтеза (Oren, 1999). При этом наиболее энергетически выгодным является биосинтез глицерина, эктоина и глицин-бетаина, наименее выгоден синтез сахарозы и трегалозы. Многие бактерии способны накапливать одновременно ряд осмопротекторов, при этом преобладание того или иного осмолита во многом определяется энергетическим статусом клетки и доступностью источника азота.

Все вышеперечисленные группы осмолитов можно разделить на три химические категории: 1) анионные растворимые вещества, 2) незаряженные растворимые вещества и 3) цвиттерионые растворимые вещества. В таблице 1 приведены распространенные у микроорганизмов совместимые растворимые вещества.

		Распространение у микроорганизмов	литература
Анионные органические осмолиты, содержащие карбоксильную группу
б-Глутамат		E. coli; Halomonas elongata; Methanohalophilus portucalensis; Methanobacterium thermoautotrophicum; Natronococcus occultus; Halobacterium sp.NRC-1 и H. salinarum; Erwinia chrysanthemi а также многие галотолерантные бактерии и метаногены	Roberts, 2004 Goude et al., 2004
в-Глутамат		Methanothermococcus thermolithotrophicus; Methanocaldococcus jannaschii; Methanotorris igneus; Nocardiopsis halophila, у всех видов Nocardiopsis, Thermotoga neapolitana и T. maritime	Galinski and Truper,1994; da Costa et al., 1998; Martin et al., 1999
Глутаматбетаин		Calothrix sp. N181	Mackay et аl., 1984 Roberts, 2004
б-Гликозил-глицерат		Agmenellum quadruplicatum; Stenotrophomonas maltophilia; Methanohalophilus portucalensis Erwinia chrysanthemi	Roberts, 2004 Goude et al., 2004
б-Маннозил-глицерат		Dehalococcoides ethenogenes; Methanothermus fervidus; Pyrococcus furiosus; Rhodothermus marinus и R. obamensis; Methanohalophilus portucalensis; Thermus thermophilus; Dehalococcoides ethenogenes; Rubrobacter xylanophilus; Aeropyrum pernix; Pyrococcus sp.; Thermococcus sp.; Archaeoglobus fulgidus	Empadinhas et al., 2004 Santos and da Costa, 2002 Martins et all., 1999; Goncalves et all., 2003 Lamosa et all., 1998; Neves et all., 2005
Анионные органические осмолиты, содержащие фосфатные или сульфатные группы
Ди-мио-инозит-1,1'-дифосфат		Archaeoglobus fulgidus; Methanotorris igneus; Pyrococcus furiosus и P. woesei; Pyrodictium occultum; Thermotoga maritima	Martin et al., 1999; Roberts, 2004 Santos and da Costa, 2002 Martins et all., 1997 Martins et all., 1996
б-Диглицерин- фосфат		Archaeoglobus fulgidus	Martins et all., 1997 Goncalves et all., 2003
Цикло-2,3-дифосфоглицерат		Methanobacterium thermoautotrophicum; Methanopyrus kandleri; Methanothermus fervidus	Martins et all., 1997
Сульфотрегалоза		Natronococcus occultus; Natronobacterium sp.	Desmarais et al., 1997
Незаряженные органические осмолиты
Гликозил-глицерин		Морские и пресноводные цианобактерии: Synechocystis sp., Microcystis firma; фототрофные эубактерии: Rhodobacter sulfidophilum; Pseudomonas mendocina и P. рseudoalcaligenes; Stenotrophomonas sp.	Reed et al., 1986 Galinski, 1995; da Costa et al., 1998
б-маннозил-глицерамид		Rhodothermus marinus и R. obamensis	Silva et al., 1999
Трегалоза		Pyrobaculum aerophilum; Sulfolobus solfataricus и S.ambivalens; Thermoproteus tenax; Thermoplasma acidophilum; Actinopolyspora halophila; Scytonema species cемейства Thiocapsa, Thiocystis, Chromatium, а также Azotobacter chroococcum, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Rhizobium meliloti, Chromohalobacter israelensis; Desulfovibrio halophilus; Rhodothermus obamensis; Narialba magadii T. Thermophilus; Sinorhizobium meliloti	Galinski, 1995; da Costa et al., 1998 Page-Sharp et al., 1999 Nunes et all., 1995; Elbein et all., 2003 Goufii et all., 1999
Сахароза		Synechocystis sp., Anabaena sp., Phormidium autumnale; Scytonema species; Chroococcidiopsis sp. Sinorhizobium meliloti	Reed et al., 1986; Hershkovitz et al., 1991; Page-Sharp et al., 1999; Desplats et all., 2005.
N-карбамоил-L-глутамин-1-амид		Ectothiorhodospira marismortui	Oren et al., 1991.
N-б-ацетил-глутаминил-глутаминамид		Sinorhizobium meliloti; Rhizobium leguminosarum; Pseudomonas aeruginosa; пурпурные сульфобактерии Rhizobium meliloti, P. fluorescens, P. aeruginosa, P. putida, P. mendocina	Smith and Smith, 1989; D'Souza-Ault et al., 1993; Kets et al., 1996.
Манносахароза		Agrobacterium tumefaciens	Smith et al., 1990
Цвиттерионые органические осмолиты
Глицинбетаин		Thioalkalivibrio versutus; Actinopolyspora sp.; Actinopolyspora halophila; Halorhodospira halochloris; Methanohalophilus portucalensis FDF1; Methanosarcina thermophila; Methanothermobacter marburgensis; Synechococcus sp. DUN52, B. subtilis E. coli, Staphylococcus xylosus Sinorhizobium meliloti, Halomonas elongata Methanobacterium thermoautotrophicum Marburg Ectothiorhodospira halochloris, Actinopolyspora halophila, галотолерантный фототроф Aphanothece halophytica Methanohalophilus portucalensis; Listeria monocytogenes	Lai et al., 1991 Boch et al., 1996, Osteras et al., 1998, Canovas et al., 2000, Nyyssola et al., 2000, Waditee et al., 2003 Bayles et all., 2000
Эктоин		Sporosarcina pasteurii; Bacillus pasteurii; Marinococcus halophilus; Brevibacterium epidermis, B. linens; Thioalkalimicrobium aerophilum; Vibrio cholerae и V.costociola; Chromohalobacter israelensis и C. salexigens; Halorhodospira halochloris; Halomonas elongata H. israelensis, H. variabilis; метилотрофы: Methylomicrobium alcaliphilum, Mm. keniense, Mm. buryatense; Methylophaga alcalica и M. natronica, Methylarcula terricola и M. marina; и многие галотолерантные бактерии	Canovas et al., 1997; Wohlfarth et al., 1990 Khmelenina et al., 1999 Doronina et all., 2000; Doronina et all., 2003a, b
Гидроксиэктоин		Halomonas elongata; Chromohalobacter salexigens; Nocardiopsis halophila; N. dassonvillei; Micrococcus halobius; Marinococcus halophilus, Marinococcus sp. M52; Brevibacterium casei, B. iodinum, B. linens, Streptomyces chrysomallus, S. griseolus; Salibacillus salexigens	Roberts, 2004 Frings et al., 1993 Severin et al., 1992
Nе-ацетил-в-лизин		Methanothermococcus thermolithotrophicus; Methanosarcina thermophila, M. mazei Go1, M. acetivorans. M. barkeri; Meyhanococcus jannaschii и M. maripaludis; Methanohalophilus portucalensis FDF1; Halobacillus halophilus Methanosarcina thermophila, Methanogenium cariaci, Methanohalophilus sp. и Methanococcus sp. Sporosarcina halophila, Planococcus citreus	Pfluger et al., 2003 Martin et al., 1999; Roberts, 2004 da Costa et al., 1998
в-глутамин		Methanohalophilus portucalensis FDF1	Roberts, 2004
Пролин		B. subtilis и Planococcus citreus, Azospirillum brasilense некоторых видов Staphylococcus и Salinicoccus	Kempf et all., 1998 Miller et all., 1996
Диметил-сульфонио-пропионат		Морские водоросли; поглощается из среды E. Coli, S. typhimurium	Galinski, 1995; Welsh, 2000 Cosquer et. al., 1999; Pichereau et al., 1998
Пипиколиновая кислота		Brevibacterium ammoniagenes, Sinorhizobium meliloti	Gouesbet et al., 1992 Gouffi et al., 2000
Карнитин		Поглощаются из среды: E. coli, Lactobacillus plantarum, Listeria monocytogenes, Pediococcus halophilus, Brevibacterium linens, Pseudomonas aeruginosa, Listeria monocytogenes	Sleator, Hill, 2001 Kets et al., 1994 Bayles et all., 2000 Jebbar et al., 1998

52

Глава 2 Биосинтез эктоина и гидроксиэктоина

Эктоин как осмоактивное вещество впервые обнаружен Э. Галинским у фототрофной пурпурной бактерии Ectothiorhodospira halochloris (Galinski et al., 1985). По химической структуре эктоин может быть классифицирован как частично гидратированная иминокислота (1,4,5,6-тетрагидро-2-метил-4-пиримидин карбоксилат).

Накопление эктоина показано для различных галофильных и галотолерантных Г⁺ и Г эубактерий, включая виды Nocardiopsis, Brevibacterium и Marinococcus, а также Halomonas, Pseudomonas и Vibrio (табл.1). Интересно отметить, что негалофильные эубактерии накапливают эктоин, транспортируя его из среды в гиперосмотических условиях (Jebbar et al., 1992, 2005; Peter et al., 1998, Malin and Lapidot, 1996).

2.1 Гены и ферменты биосинтеза эктоина и гидроксиэктоина

Путь биосинтеза эктоина, является ответвлением в пути синтеза аминокислот аспартатного семейства. В этом пути аспартат--полуальдегид (AПA) превращается в L-2,4-диаминобутират (ДАБ) с участием ДАБ-аминотрансферазы, ДАБ ацетилируется в N-ацетил-2,4-диаминобутират (АДАБ) при участии ДАБ-ацетилтрансферазы. Циклизация АДАБ в эктоин катализируется эктоинсинтазой (Peters et al., 1990). Данный путь подтверждён энзиматически для фототрофа Ectothiorhodospira halochloris (Peters et al., 1990), гетеротрофов Halomonas elongata (Canovas et al., 1998), Halobacillus dabanensis (Zhao et al., 2006), Bacillus pasteurii (Kuhlmann and Bremer, 2002) и морской бактерии Marinococcus halophilus (Louis and Galinski, 1997) (Рис. 1).

У Brevibacterium linens (Bernard et al., 1993), Brevibacterium epidermis DSM 20659 (Onraedt et al., 2004), Brevibacterium sp. (Nagata et al., 1998), Streptomyces parvulus (Inbar and Lapidot, 1988) путь биосинтеза эктоина начинается с глутамата. Кроме аспартата и глутамата, в качестве предшественника может использоваться аспарагин, как показано для Streptomyces griseus и Streptomyces clavuligerus (Malin and Lapidot, 1996).

Гены биосинтеза эктоина охарактеризованы у грамположительных умеренно галофильных бактерии Marinococcus halophilus (Louis and Galinski, 1997), Bacillus pasteurii (Kuhlmann and Bremer, 2002), Halobacillus dabanensis (Zhao et al., 2006), грамотрицательных бактерий Chromohalobacter salexigens (ранее Halomonas elongata DSM 3043) (Canovas et al., 1997) и Halomonas elongata (Canovas et al., 1998) и расположены в одном опероне ectABC, где ген ectА кодирует L-2,4-ДАБ-ацетилтрансферазу, а гены ectВ и ectС кодируют L-2,4-ДАБ-аминотрансферазу и L-эктоинсинтазу, соответственно. Таким образом, путь биосинтеза эктоина достаточно консервативен в отношении ферментов и организации ect-генов.

52

Рис. 1. Путь биосинтеза эктоина и гидроксиэктоина у галотолерантных бактерий (по Peters et al., 1990; Galinski, 1995; Ventosa et al., 1998). EctA - ДAБ-ацетилтрансфераза, EctB - ДAБ-аминотрансфераза, EctC - эктоинсинтаза и EctD - эктоингидроксилаза.

Биосинтез гидроксиэктоина осуществляется непосредственным гидроксилированием эктоина эктоингидроксилазой (EctD). К настоящему моменту ген ectD идентифицирован у Streptomyces chrysomallus (Prabhu et al., 2004), Chromohalobacter salexigens (Garcia-Estepa et al., 2006) и Salibacillus salexigens (Bursy et al., 2007).

Возможно, существует также альтернативный путь, в котором N-ацетил-ДАБ превращается в гидроксиэктоин через 3-гидрокси-N-ацетил-ДАБ без участия эктоина (Canovas et al., 1999). Но этот путь энзиматически не подтвержден.

Ферменты биосинтеза эктоина. Ферменты биосинтеза эктоина были очищены из H. elongata и частично охарактеризованы (Ono et al., 1999). 2,4-ДAБ-аминотрансфераза является гомогексамером с молекулярной массой субъединицы 44 кДа. ДAБ-аминотрансфераза является пиридоксальфосфат-зависимым ферментом, и требует присутствия ионов К⁺ для активности и стабильности, что обусловлено возможным наличием в белке специфических связывающих участков для этого иона. Зависимость от калия установлена для многих ферментов галофильных архей и эубактерий (Toney et al., 1995). ДАБ-аминотрансфераза H. elongata специфична к L-глутамату как донору аминогрупп, рН_opt - 8.6-8.7, К_м для L-глутамата 9.1 мМ, для D,L-аспартатполуальдегида 4.5 мМ. Изоэлектрическая точка рI = 6.2.

В настоящее время превращение аспартатполуальдегида в ДАБ известно у нескольких не синтезирующих эктоин бактерий - Xanthomonas sp. и Acinetobacter baumannii (Ikai and Yamamoto, 1997; Rao et al., 1969). ДАБ-аминотрансфераза из А. baumannii участвует в биосинтезе компонента клеточной стенки -1,3-диаминопропана. Этот фермент также специфичен к аспартатполуальдегиду как акцептору аминогрупп и L-глутамату как донору аминогрупп, обладает сходными с ферментом из H. elongata значениями рН оптимума, Км для ДАБ и 2-оксоглутарата (Ikai and Yamamoto, 1997). Однако, в отличие от ферментов из H. elongate и А. baumannii, ДАБ-аминотрансфераза из Xanthomonas sp., использует L-аланин как донор аминогрупп (Rao et al., 1969).

ДАБ-ацетилтрансфераза из H. elongata была очищена в 400 раз, однако в гомогенном состоянии фермент получить не удалось вследствие его нестабильности. Кинетические константы также не определены. Молекулярная масса фермента, определенная гель фильтрацией, составила около 45 кДа (Ono et al., 1999).

Эктоинсинтаза была очищена до гомогенного состояния в присутствии 1 мМ ДАБ и 2 М NaCl в качестве стабилизаторов. Фермент является гомодимером с молекулярной массой субъединицы 19 кДа, но в буфере с высокой осмолярностью (0.5 М NaCl), использовавшемся при гель-фильтрации, активность фермента не найдена. Поэтому неясно, действительно ли нативная эктоинсинтаза имеет молекулярную массу 35 кДа и является гомодимером, или имела место неспецифическая агрегация мономеров в присутствии высокой концентрации соли. Анализ аминокислотного состава эктоинсинтазы выявил повышенное содержание L-аспартата и L-глутамина. Фермент весьма специфичен к AДAБ, по-видимому, N-ацетильная группа в -положении не участвует в циклизации молекулы. Изоэлектрическая точка фермента (рI) составила 4.2 - 4.4. Предполагается, что лимитирующим звеном биосинтетической последовательности эктоина является синтез ДАБ с участием ДАБ-аминотрансферазы. Это подтверждает факт отсутствия ДАБ в клетках H. elongata KS3 (Ono et al., 1998).

Все три фермента пути синтеза эктоина у H. elongatа имеют близкие параметры для проявления максимальной активности: рН 8.2 - 9.0, t = 15 - 20?С и 0.4 - 0.5 М NaCl. Тем не менее, ДАБ-аминотрансфераза более активна в присутствии 0.01 - 0.5 М KCl, чем при тех же концентрациях NaCl (Ono et al., 1999). Оптимальные концентрации соли для активности трёх ферментов ниже, чем предполагалось исходя из галотолерантности H. elongata DSM2581, что, очевидно, связано с относительно низкой внутриклеточной концентрацией свободных ионов. Так, внутриклеточный уровень Na⁺ в клетках галофильных эубактерий Vibrio costicola и Brevibacterium sp., растущих в присутствии высокой концентрации NaCl, составлял 0.04 - 0.2 М (Gilboa et al., 1991; Nagata et al., 1995).

Недавно эктоингидроксилаза была очищена из Salibacillus salexigens и частично охарактеризована (Bursy et al., 2007). Фермент представляет собой мономер (М.м. 34 кДа) с оптимумами рН и температуры 7.5 и 32°C, соответственно. Эктоингидроксилаза S. salexigens является 2-оксоглутарат-зависимым ферментом и требует присутствия молекулярного кислорода в реакционной смеси. В активный центр эктоингидроксилазы входит одна молекула Fe(II), поэтому авторы отнесли данный белок к суперсемейству негемсодержащих Fe(II)- и 2-оксоглутарат-зависимых диоксигеназ (EC 1.14.11). Максимальная активность фермента составила 13.8 Е/мг, K_м для эктоина и 2-оксоглутарата составили 3.5 ± 0.2 и 5.2 ± 0.2 мM, соответственно (Bursy et al., 2007).

Глава 3 Осмоадаптация аэробных метилотрофных бактерий

Аэробные метилотрофные бактерии используют метан (метанотрофы), его окисленные или замещенные производные (метилобактерии) в качестве источников углерода и энергии. Большинство коллекционных культур метанотрофов до конца 80-х годов были представлены нейтрофильными негалофильными штаммами, растущими при pH 6.5-7.5 и низкой солености (менее 0.5% NaCl). Исключение составляли морские метанотрофы, растущие при солености до 3% NaCl (Гальченко и др., 1986).

Первый солезависимый метанотроф Methylomicrobium pelagicum был выделен из Саргассова моря (Sieburth et al., 1987), но вскоре утерян, позднее, из образцов ила щелочных озер Тувы удалось выделить галотолерантный алкалофильный метанотроф Methylomicrobium alcaliphilum 20Z, оптимально растущий при рН 9.0 в присутствии 4% NaCl с верхней границей галотолерантности при 9% NaCl (Хмеленина и др., 1996). Из гиперсоленого (14% NaCl) озера Сасык-Сиваш был выделен умеренно галофильный нейтрофильный метанотроф Methylomicrobium modestohalophilum 10S, растущий при pH 5.5-8.5 и солености от 0.2 до 9% (Калюжная и др., 1998), а также Methylohalobius crimeensis, устойчивый к 15% NaCl (Heyer et al., 2005), из содовых озер Южного Забайкалья были выделены пять штаммов облигатных метанотрофов Methylomicrobium buryatense, которые являются алкалотолерантыми галофилами (штаммы 4G, 5G и 6G) или галотолерантными факультативными алкалофилами (штаммы 7G и 5B) (Калюжная и др., 1999; Kalyuzhnaya et al., 2001; 2008).

Первые галофильные метилобактерии были выделены из морских проб и представлены видами рода Methylophaga: М. marina, M. thalassica (Janvier et al., 1985), M. sulfidovorans (de Zwart et al., 1996), M. limanica (Доронина и др., 1997). Методом in situ гибридизации было показано широкое распространение бактерий рода Methylophaga в морских образцах (Janvier et al., 2003). Из лимана Азовского моря и засоленной почвы г. Алушта были выделены в чистые культуры умеренно галофильные метилобактерии, оптимально растущие в присутствии 3-6% NaCl, и рН 7.5-8.5 и классифицированные как виды нового рода Methylarcula: M. marina и M. terricola (Doronina et al., 2000). Из содовых озер Южного Забайкалья и Монголии были также выделены два В₁₂-зависимых изолята метилобактерий, оптимально растущих в присутствии 3-6% NaCl, рН 7.0-11.0 и температуре 25-29°С, идентифицированых как новые алкалофильные виды рода Methylophaga: М. alcalica и M. natronica (Doronina et al, 2003 a,b).

Исследования цитобиохимических особенностей солезависимых метанотрофов и метилобактерий показали, что у них реализуются различные механизмы осмоадаптации. У гало(алкало)фильных метилотрофов при повышении осмолярности измененяется химический состав мембран, в частности, возрастает относительное содержание отрицательно заряженного фосфатидилглицерина и понижение доли ФЭА (Khmelenina et al., 1999). В фосфолипидном пуле клеток метилобактерий в ответ на повышение солености возрастают уровни фосфатидилглицерина и кардиолипина на фоне снижения доли фосфатидилэтаноламина (Троценко и др., 2007). Подобный солезависимый ответ на повышение солености типичен для многих грамотрицательных галофильных и галотолерантных эубактерий (Imhoff and Thiemann, 1991). Известно, что отрицательно заряженный фосфатидилглицерин, а также цвиттерионный фосфатидилхолин обладают стабилизирующим действием на мембраны, формируя мембранный бислой, способствующий избирательной диффузии катионов. Таким образом, у метилотрофов реализуется общий для бактерий «пассивный» механизм поддержания ионного гомеостаза. У солезависимых метанотрофов рода Methylomicrobium, кроме того, выявлены дополнительные поверхностные гликопротеиновые слои (S-слои), полностью покрывающие клеточную стенку бактерий. Придавая клеточному конверту бактерий дополнительную прочность, что особенно актуально в случае изменяющегося осмотического давления среды, эти регулярные поверхностные структуры, возможно, также участвуют в осмоадаптации. Наряду с повышением ригидности клеточных конвертов все изученные солезависимые метилотрофы синтезируют низкомолекулярные осмопротекторные соединения.

Методом ЯМР в клетках исследованных галофильных и галотолерантных метанотрофов и метилобактерий выявлено присутствие эктоина, сахарозы и глутамата (Khmelenina et al., 1999; Троценко и др., 2007). Пул этих соединений увеличивался с повышением солености среды культивирования, причем внутриклеточная концентрация эктоина у Mm. alсaliphilum 20Z достигала 1.4 М, глутамата - 0.4 М в пересчете на внутриклеточную воду. Очевидно, противоионом для глутамата служит К⁺, поскольку их концентрации в цитоплазме были эквимолярны. Суммарное внутриклеточное содержание всех осмопротекторов у исследованных штаммов полностью уравновешивало осмолярность среды (Doronina et al., 2003 a,b).

Метилобактерии рода Methylophaga при росте на средах с низкими концентрациями NaCl (2-3%) накапливают только глутамат, а при увеличении солености среды до 10-12% основным осмопротектором является эктоин. Кроме того, у M. murata внутриклеточные концентрации глутамата и эктоина возрастали при снижении температуры культивирования.

Установлено, что последовательность реакций биосинтеза эктоина у метилотрофов идентична таковой у галофильных гетеротрофов и начинается реакцией трансаминирования L-аспартилполуальдегида с последующим ацетилированием образующегося L-2,4-диаминобутирата (ДАБ) и завершается циклизацией N-ацетил-L-2,4-ДАБ в эктоин. Эти реакции катализируются ДАБ-ацетилтрансферазой, ДАБ-аминотрансферазой, эктоинсинтазой (Рис.2). Полная нуклеотидная последовательность генов биосинтеза эктоина была определена у Mm. alcaliphilum 20Z, M. alcalica и M. thalassica. Показано, что у данных бактерий гены синтеза эктоина организованы в четырехгенный оперон ectABCask, в состав которого входит дополнительный ген аспартаткиназы (ask) (Reshetnikov et al., 2006; Решетников, 2006). Гены ectABC метанотрофа Mm. alcaliphilum 20Z были амплифицированы и клонированы в плазмиду pHSG575. Клетки E. coli, трансформированные полученной плазмидой, накапливали эктоин и росли в присутствии 4% NaCl, что доказывает участие генов ectABC в биосинтезе эктоина (Reshetnikov et al., 2006).

52

Рис. 2. Путь биосинтеза эктоина и аминокислот аспартатного семейства у бактерий (Louis and Galinski, 1997)

У Mm. аlcaliphilum 20Z, M. alcalica и M. thalassica гены биосинтеза эктоина сцеплены и составляют оперон ectABC-ask, в состав которого входит дополнительный ген аспартаткиназы (ask) (Рис З.). Наличие дополнительного гена ask, возможно, обеспечивает относительно независимый от основного метаболизма контроль синтеза предшественника эктоина - аспартилфосфата (Reshetnikov et al., 2006; Троценко и др., 2007).

Сравнение транслированных аминокислотных последовательностей белков EctА, EctB и EctС показало, что у метанотрофа Mm. alcaliphilum 20Z эти белки имеют большеe сходство с соответствующими белками из метилобактерий M. alcalica и M. thalassica (75-85% гомологии) и низкое сходство (36-63%) с соответствующими ферментами из других галофильных бактерий. Причем ферменты биосинтеза эктоина метилотрофных бактерий формируют единые кластеры на соответствующих филогенетических деревьях, включающих ферменты гетеротрофных галлофилов (Решетников, 2006).

52

Рис. 3. Организация генов биосинтеза эктоина. ectA - ДАБ-ацетилтрансфераза, ectB - ДАБ-аминотрансфераза, ectC - эктоинсинтаза, ectD - эктоингидроксилаза и ask - аспартаткиназа.

Достаточно высокое сходство нуклеотидных последовательностей генов ectА, ectB и ectС позволило выдвинуть гипотезу о высокой консервативности пути биосинтеза эктоина и распространении ect-генов среди бактерий посредством латерального переноса (Kuhlman and Bremer, 2002).

Способ получения эктоина реализован фирмой «Biomol» (Германия) с использованием гетеротрофной бактерии Halomonas elongata на среде с глюкозой, L-аминокислотами и 12%-ным NaCl. Умеренно галофильные метанотрофы при росте на среде с 6% NaCl способны накапливать до 20% эктоина, т.е. выше, чем у гетеротрофных продуцентов, растущих при 12% NaCl (Хмеленина с соавт., 2000; Khmelenina et al., 1999). Это позволяет рассматривать галофильные метилотрофы как потенциальные продуценты эктоина. Причины различий в уровнях осмопротектора могут быть в генетически детерминированных регуляторных механизмах биосинтеза эктоина. Так, синтез эктоина у галофильных метанотрофов происходит через биохимический путь, близкий таковому у гетеротрофных галофильных бактерий (Решетников и др., 2004; Reshetnikov et al., 2006). У Mm. alcaliphilum 20Z организация генов биосинтеза эктоина существенно отличается, поскольку они составляют четырехгенный кластер, включающий дополнительный ген аспартаткиназы. Это предполагает присутствие у облигатного метанотрофа специфической изоформы аспартаткиназы, которая, по-видимому, обеспечивает относительно независимый от основного конструктивного метаболизма синтез предшественников эктоина - аспартилфосфата и аспартилполульдегида.

Из вышеизложенного логически следует необходимость расшифровки полной нуклеотидной последовательности и сравнительное изучение генов синтеза эктоина у M. marina. Это позволит оценить степень дивергенции ect-генов у различных изолятов и проследить эволюцию этого биосинтетического пути. Кроме того, необходимость понимания принципов организации и регуляции генов и ферментов биосинтеза эктоина у аэробных метилотрофов диктуется практическими задачами получения этого биопротектора, все более активно используемого в медицине, косметике и научной практике в качестве водоудерживающего средства, стабилизатора биомолекул и клеток.

Экспериментальная часть

Глава 4 Материалы и методы исследования

4.1 Культивирование бактерий

В работе использовали чистую культуру аэробной метилотрофной бактерии Methylarcula marina из коллекции лаборатории метилотрофии ИБФМ РАН. Methylarcula marina выращивали на среде “K” (табл. 2). Среду и раствор микроэлементов стерилизовали при 1 атм, 30 мин. Непосредственно перед засевом в качестве источника углерода вносили метиламин в конечной концентрации 1%. Культивирование проводили в колбах объёмом 750 мл, содержащих 200 мл среды. Инокулят добавляли в среду в соотношении 1:10 и встряхивали на роторной качалке (140 об/мин) при 26 °C.

Escherichia coli XL1-Blue, BL21(DE3) или S17-1 (штммы E. coli любезно предоставлены к.б.н. Ивашиной Т.В. ИБФМ РАН) выращивали при 37^oС на жидкой или агаризованной (1.5% агара “Difco”) средах “LB” (табл. 2) с разными концентрациями соли (0-5% NaCl) с добавлением при необходимости селективных антибиотиков: канамицина (Km) - 50 мкг/мл, ампициллина (Amp) - 100 мкг/мл или хлорамфеникола (Cm) - 25 мкг/мл.

Таблица 2. Питательные среды, использованные в работе.

	Компонент среды	Концентрация
“К”	КН2РО4 (NH4)2SO4 MgSO4?7H2O FeSO4?7H2O NaCl рН доводили до 7.4 Агар*	2.0 г/л 2.0 г/л 0.025 г/л 0.002 г/л 0.5 г/л 2%
“LB”	Бакто-триптон Дрожжевой экстракт NaCl КСl MgCl2?6H2O МgSO4?7H2O Глюкоза	20 г/л 5 г/л 0.584 г/л 0.186 г/л 2.03 г/л 2.463 г/л 3.6 г/л

4.2 Получение бесклеточных экстрактов и определение концентрации белка

Клетки в экспоненциальной фазе роста центрифугировали (30 мин при 6000 об/мин), дважды отмывали в буфере А (100 мМ трис-НCl, рН 8.0, содержащий 2.5 мМ MgCl₂ и 1.5% KCl) и ресуспендировали в том же буфере. Клетки разрушали на ультразвуковом дезинтеграторе MSE (Англия) мощностью 150 Вт при 20 Гц (3?1 мин с минутными перерывами) при охлаждении. Неразрушенные клетки отделяли центрифугированием при 4^oС (14000 об/мин в течение 30 мин).

Концентрацию белка определяли модифицированным методом Лоури (Schacterle, Pollack, 1973) с использованием БСА в качестве стандарта.

4.3 Определение активности диаминобутиратацетилтрансферазы

Диаминобутиратацетилтрансферазу (ДАБАцТ) (НФ 2.3.1.-). Активность фермента определяли при 20°С по образованию 5-тио-2-нитробензойной кислоты (е₄₁₂ = 13,6 мМ^-1 ?см^-1) в результате взаимодействия 5,5'-дитиобис-(2-нитробензойной кислоты) (ДТНБ) с сульфгидрильными группами КоASH, образующимися в ходе реакции (Srere, 1969). Реакционная смесь (1 мл) содержала (мкмоль): Тris-HCl буфер - 100, рН 8.0, ДТНБ -0.1, ацетил-КоА - 1, КCl - 200 и L-2,4-диаминобутират (ДАБ) - 10. За единицу активности (Е) ДАБАцТ принимали количество фермента, катализирующее образование 1 мкмоль КoASH за 1 мин. Активность фермента определяли на регистрирующем спектрофотометре “Shimadzu UV-160” (Япония) в кварцевой кювете с длиной оптического пути 10 мм. Активность фермента выражали как число наномолей образованой 5-тио-2-нитробензойной кислоты на 1 мг белка в мин.

4.4 Выделение и анализ осмопротекторов

Низкомолекулярные органические соединения экстрагировали из клеток, выросших при разной солёности среды (0 - 8% NaCl). 100-200 мг клеток (вес сырой биомассы) ресуспендировали в 2 мл метанола, выдерживали 1 ч при встряхивании. Суспензию центрифугировали 5 мин при 10000 об/мин. Супернатанты высушивали в вакуумном испарителе, ресуспендировали в 0.5 мл 0.01 М раствора малеиновой кислоты в D₂О (или в дионизованной воде, для анализа на ВЭЖХ) и анализировали методом протонного резонанса, используя ЯМР-спектрометр высокого разрешения WP 80SY (“Bruker Spectrospin”, Швейцария) с рабочей частотой 80 Мгц. Содержание внутриклеточных метаболитов в образцах определяли сравнением интенсивности сигналов протонов метаболитов с интенсивностью сигналов протонов малеиновой кислоты как внутреннего количественного стандарта (Khmelenina et al., 1999).

Экстракция и количественное определение эктоина. Эктоин экстрагировали из клеток, выросших без соли (Methylobacterium extorquens) и при разной солёности среды (0 - 8% NaCl), когда анализировали накопление эктоина у Methylarcula marina. 100-200 мг клеток (вес сырой биомассы) ресуспендировали в 2 мл метанола, выдерживали 1 ч при встряхивании. Суспензию центрифугировали 5 мин при 10000 об/мин. Супернатанты высушивали в вакуумном испарителе, ресуспендировали в дионизованной воде, для анализа на ВЭЖХ. Для количественного определения эктоина использовали модифицированный метод ВЭЖХ (Kuhlmann and Bremer, 2002). 20 мкл водного раствора образца наносили на колонку SGX NH₂ (3?150 мм, 5мкм; Чехия) и элюировали 80% ацетонитрилом (вода/ацетонитрил) со скоростью 1мл/мин. Регистрацию пиков проводили на УФ-детекторе (“LINEAR UVIS 200”, США) при 190 нм. В качестве стандарта использовали эктоин фирмы “Sigma”.