Активность основных карбоксипептидаз при действии нейролептиков
Рассмотрение острого введения диазепама и галоперидола на активность карбоксипептидазы Н, фенилметилсульфонилфторид-ингибируемой карбоксипептидазы и карбоксипептидазы М в головном мозге, надпочечниках и семенниках крыс через различные промежутки времени.
| Рубрика | Биология и естествознание |
| Вид | диссертация |
| Язык | русский |
| Дата добавления | 15.12.2008 |
| Размер файла | 647,7 K |
Отправить свою хорошую работу в базу знаний просто. Используйте форму, расположенную ниже
Студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в своей учебе и работе, будут вам очень благодарны.
Введение галоперидола (1 мг/кг) в течение 7 дней привело к уменьшению активности аминопептидазы N в стриатуме и коре больших полушарий, что, в свою очередь, вызвало уменьшение накопления фрагментов (тирозин и гли-гли-фен-мет), образующихся при действии фермента на мет-энкефалин [199].
Тир-гли-гли - производное энкефалина, полученное при действии энкефалиназы. Острое воздействие агонистов Д2-рецепторов вызвало повышение содержания трипептида в стриатуме крыс. Этот эффект был блокирован галоперидолом, в то время как, просто инъекция галоперидола не изменила уровень тир-гли-гли. Однако хроническое потребление нейролептика привело к увеличению содержания фрагмента энкефалина в стриатуме, возможно, путем активации энкефалиназы [199, 213].
Нейтральная эндопептидаза 24.11, как известно, использует в качестве субстратов ряд нейропептидов, включая энкефалины и нейротензин. Хроническая обработка галоперидолом (1 мг/кг/день, 12 дней) увеличила активность фермента в аккумбентном ядре. Более высокие дозировки практически не повлияли на активность нейтральной эндопептидазы 24.11. активность фермента в гипоталамусе не изменилась при введении галоперидола [198].
Острое воздействие галоперидола привело к повышению уровня каталитической единицы цАМФ-зависимой киназы в стриатуме [321].
Grigoriants и соавт. обнаружили увеличение уровня мРНК КП Н при введении его в течение 14 и 21 дня в дозе 2 мг/кг в промежуточной и задней долях гипофиза на 90 - 110% [158]. Введение бромокриптина в течение 1 - 5 дней привело к снижению уровня мРНК прогормонконвертазы 2, КП Н и пептидилглицин-б-амидирующей монооксигеназы в промежуточной доле гипофиза, потребление галоперидола вызвало обратный эффект [253].
Уровень мРНК аминопептидазы N, нейтральной эндопептидазы 24.11 и прогормонконвертаз 1 и 2 в хвостатом ядре и фронтальной коре мозга крысы не изменился после 7-дневного потребления галоперидола (1 мг/кг). Авторы предполагают, что возможно большую роль в модуляции деятельности пептидаз играет трансляция мРНК или встраивание белка в мембрану [329].
Каликреиноподобный фермент относится к семейству аргининовых эндопептидаз. В опытах in vivo введение бромокриптина и галоперидола вызвало соответственно уменьшение и увеличение уровня мРНК фермента в промежуточной, но не в передней доле гипофиза самцов крыс [266, 268].
Таким образом, психолептики вызывают изменение активности ряда протеолитических ферментов. Это, в свою очередь, ведет к изменению уровня многих регуляторных пептидов, обеспечивающих основные и побочные эффекты препаратов.
1.2.2. Карбоксипептидаза Н
Карбоксипептидаза Н (КП Н, энкефалинконвертаза, карбоксипепти-даза Е, КФ 3.4.17.10) впервые была выделена и охарактеризована в 1982 г. Fricker L.D. и Snyder S.H. из хромаффинных гранул надпочечников [147].
КП Н широко представлена в тканях человека, быка, крысы, мыши, акулы, шпорцевой лягушки, ската-удильщика, моллюска Aplysia [143, 149, 280, 297, 311] и обладает сходным региональным распространением, физико-химическими и каталитическими свойствами.
Высокая активность КП Н была обнаружена в гормонпродуцирующих клетках гипофиза [128, 145, 181, 190, 197], - и -клетках поджелудочной железы [111, 119, 157], хромафинных клетках надпочечников [147, 148, 149, 175, 311], более низкая - в пептидергических нейронах гипоталамуса, стриатума, гиппокампа, среднего мозга, больших полушарий и мозжечка [15, 148, 149, 308]. При этом в гипоталамусе высокая активность КП Н обнаружена в медиальном возвышении, супраоптическом, паравентрикулярном и супрахиазматическом ядрах [220]. В гиппокампе фермент обнаружен в пирамидальных клетках и во внутренней части молекулярного слоя зубчатой извилины. КП Н также обнаружена в центральных нейронах миндалины [219]. Имеются сведения о наличии активности КП Н в водянистой жидкости глаза человека [251], в плаценте [26]. Таким образом, тканевое распределение активности этой карбоксипептидазы в целом соответствует распределению нейропептидов [26].
В клетке КП Н локализована, в основном, в секреторных гранулах, в структурных элементах эндоплазматического ретикулума и комплекса Гольджи, содержащих биологически активные пептиды - АКТГ [128, 175], гормон роста [103], пролактин [103], инсулин [114], глюкагон [159], энкефалины [147, 148], вазопрессин [282], окситоцин [247], вещество Р [104], атриальный натрийуретический фактор [220].
Ген КП Н был клонирован и секвенирован [60, 225, 277]. Транскрипция КП Н осуществляется с единственного сайта транскрипции [245, 304]. мРНК КП Н состоит из 2100 нуклеотидов [137]. Полный ген охватывает приблизительно 50000 оснований и состоит из девяти экзонов, каждый из которых содержит кодирующие белок области [190].
Уровни мРНК КП Н и активности КП Н в мозге и тканях в целом коррелируют между собой [81]. Наивысшие уровни мРНК КП Н обнаружены в пирамидальных клетках гиппокампа, в передней и промежуточной долях гипофиза, эпендимных клетках боковых желудочков мозга, базолатеральной миндалине, супраоптическом и паравентрикулярном ядрах. Средние уровни мРНК КП Н у крыс обнаружены в таламусе, медиальном коленчатом ядре, коре мозжечка и промежуточной оливе. Наименьшие уровни выявлены в гранулярном клеточном слое гиппокампа, латеральном гипоталамусе, бледном шаре и в ретикулярной формации ножки мозга [221]. Высокая экспрессия мРНК КП Н отмечена в паравентрикулярном и супраоптическом ядрах гипоталамуса - местах преимущественного синтеза окситоцина и вазопрессина [86]. мРНК КП Н и ферментативная активность обнаружена также в клонах эндокринных клеток - AtT-20, GH-3, GH4C1 и неэндокринных - L, 3T3, SK-HEP-1, HEK293, COS, C127 [124, 188], а также в культуре астроцитов [198].
КП Н является гликопротеином и состоит из одной полипептидной цепи [15, 114, 140, 220, 245]. Фермент синтезируется в виде неактивного зимогена, состоящего из 476 аминокислотных остатков, с Mr 75000 [240, 277, 306], который превращается в активную форму под действием трипсиноподобных ферментов в ходе созревания секреторных везикул [134, 160]. Сначала образуется неактивная форма с Mr 65000 [176, 177], которая превращается в активные формы с Mr 52000 - 53000 и 55000 - 57000 [134, 160, 255]. Отличия в Mr этих форм не зависят от степени гликозилирования [134, 255, 257]. Форма с Mr 55000 - 57000 отличается от формы с Mr 52000 - 53000 наличием N-концевого сигнального пептида [255]. Обе формы существуют и в растворимом, и в связанном с мембранами виде [134, 160]. Имеются сведения о том, что мембранная форма КП Н (57000) связана с эндоплазматическим ретикулумом и элементами комплекса Гольджи, а растворимая форма КП Н (54000) - с секреторными гранулами [159]. За связывание фермента с мембранами отвечает C-концевая амфифильная последовательность, которая присутствует только у мембраносвязанной формы [140]. Она состоит из 21 остатка чередующихся гидрофобных и гидрофильных аминокислот. Активность растворимой формы фермента в расчёте на молекулу фермента выше, чем мембраносвязанной [136, 141]. Соотношение между растворимой и мембраносвязанной формами изменяется по мере созревания секреторных везикул [178]. Активность растворимой и мембраносвязанной форм КП Н в разных клетках и тканях различно. В частности, в клетках линий RIN 1046-38 и RIN 1046-44 75% зрелой КП Н обнаружено в мембраносвязанной форме [134]. С другой стороны, в передней и задней долях гипофиза 70% всей активности КП Н представлено растворимой формой [255].
Фермент проявляет максимальную активность при рН 5,6-6,0, что соответствует рН внутри секреторных гранул [137, 148, 149, 247]. КП Н сильно активируется ионами Со2+ (в 5 - 10 раз) и в меньшей степени - ионами Ni2+ (в 2 - 3 раза), полностью ингибируется ионами Cu2+, Cd2+ и ЭДТА. Ионы других двухвалентных металлов (Zn2+, Ca2+, Mg2+) не влияют на его активность [147, 148, 149]. Ионы Zn2+ полностью восстанавливают активность КП Н после ингибирования его действия 1 мМ раствором ЭДТА, при добавлении ионов Со2+ и Ni2+ активность фермента значительно повышалась, а Ca2+ и Mg2+ активность фермента не восстанавливали [15]. Ионы Ca2+ влияют на агрегацию и высвобождение белка из секреторных везикул [161, 242, 305]. Таким образом, карбоксипептидаза Н - это металлозависимый фермент, в активном центре которого находится ион Zn2+ [15]. Реагенты на сульфгидрильные группы HgCl2 и N-этилмалеимид существенно ингибируют активность фермента [144]. 2-меркаптоэтанол, каптоприл и ФМСФ не оказывают заметного влияния на активность КП Н [15, 220]. Карбоксипептидаза Н содержит SH-группу(ы) и является тиолзависимым цинк-металлоферментом [15]. Активность КП Н ингибируется CuCl2, HgCl2, р-хлормеркурфенилсульфатом, АПМЯК, ЭДТА, 1,10-фенантролином и 2-меркаптометил-3-гуанидилэтилтиопропановой кислотой [123, 149, 175, 181]. Наиболее эффективными ингибиторами являются ГЭМЯК и ГПЯК с Ki 8,8 и 7,5, соответственно [114, 144, 280, 311]. Активность фермента существенно снижается при добавлении рилизинг-фактора лютеинизирующего гормона, вещества Р, тиреотропин-рилизинг фактора, вазопрессина, окситоцина, Met- и Leu-энкефалина, АКТГ [180, 259, 282].
КП Н обладает, практически, абсолютной специфичностью по отношению к пептидным субстратам с С-концевыми основными аминокислотами [26, 27, 123, 326]. КП Н хорошо отщепляет остатки -Lys и -Arg от природных и синтетических субстратов. 125I-Met-энкефалин-Arg6, 125I-Met-энкефалин-Lys6 [19], АКТГ-Lys15-Lys16-Arg17, Arg8-вазопрессин-Gly-Lys-Arg являются природными субстратами исследуемого фермента [175, 181, 282]. Для определения активности КП Н разработано множество методов, наиболее часто используемым является флюорометрический метод Friker и Snyder с использованием таких субстратов как дансил-Phe-Ala-Arg и дансил-Phe-Leu-Аrg [144, 149, 311]. О-кумароил-Phe-Ala-Arg [45], даларгин [47], Leu5-энкефалин [47], [3Н]-бензоил-Phe-Leu-Arg, [3Н]-бензоил-Phe-Ala-Arg [278, 308], 125I-acetyl-Tyr-Ala-Arg, гиппурил-Arg [143] и другие также были предложены в качестве субстратов для определения активности КП Н.
У мышей линии fat/fat единичная точечная мутация Ser202 на Pro в гене, кодирующем КП Н, приводит к нарушению созревания регуляторных пептидов: инсулина [186], холецистокинина [203], пронейротензина и промеланоцитстимулирующего гормона [102, 283], тириолибирина [246], проэнкефалина [139], а также изменяет деятельность опиоидных рецепторов [88, 139]. Кроме того, нарушается внутриклеточный транспорт гормонов гипофиза через конститутативный путь [246, 293]. Это приводит к многочисленным эндокринным нарушениям, включая гиперинсулинемию и бесплодие [110, 216, 307].
Следует отметить, что внешнее воздействие способно быстро изменять уровень мРНК КП Н. Увеличение концентрации мРНК КП Н в гипоталамусе наблюдается при увеличении содержания окситоцина и вазопрессина [86], в ганглионарных клетках сетчатки глаза уровень мРНК КП Н повышается сразу после смены условий освещенности [288].
В клетках GH4C1 (из переднего гипофиза крысы, продуцирующих пролактин) 50 мМ раствор KCl увеличивает секрецию КП Н и пролактина в 10 раз, а 100 мМ тиреотропин-рилизинг фактор - в 2 - 3 раза [145]. Кроме того, эстрадиол (1 нМ), инсулин (300 нМ) и фактор роста эпидермиса (10 нМ) увеличивают внутриклеточный уровень КП Н в 2 раза по сравнению с контролем. Km при этом не изменяется, но увеличивается Vmax [145].
Rodriguez и соавт. обнаружили, что действие дексаметазона на клетки AtT-20 снижает уровень мРНК КП Н и ПОМК примерно на 30% [277]. С другой стороны, прибавление кортикотропин-рилизинг фактора к клеткам, которые подвергались воздействию дексаметазона, вызывает 2 - 3-х кратное увеличение уровня мРНК КП Н и ПОМК [277]. Авторы считают, что уровни мРНК ПОМК и КП Н согласованно регулируются кортикотропин-рилизинг фактором и стероидными гормонами. При действии кортикотропин-рилизинг фактора на клетки AtT-20, не подверженные действию дексаметазона, происходит возрастание активности КП Н [223].
При хроническом прибавлении дексаметазона, кортикостерона, кортикотропин-рилизинг фактора, соматостатина к клеткам линии AtT-20/D16v уровень мРНК КП Н и активность КП Н не изменяются [223, 318].
При внутрибрюшинном введении дексаметазон и гидрокортизон (в дозах 1 и 100 мг на кг массы тела, соответственно) снижают активность растворимой и мембраносвязанной формы КП Н в гипофизе, гипоталамусе и стриатуме крыс, но динамика влияния во времени отличается [19]. В изученные интервалы (0,5, 4 и 24 часа после инъекции) дексаметазон сильнее подавляет активность в начальный период, тогда как действие гидрокортизона более выражено через 24 часа после введения. In vitro дексаметазон и гидрокортизон не оказывают влияния на активность КП Н [19]. Авторы [19] предполагают, что снижение активности КП Н in vivo происходит за счет снижения синтеза мРНК КП Н.
Субстратная специфичность, оптимум рН, клеточное и субклеточное распределение, совместная локализация фермента и биологически активных пептидов, свидетельствуют о вовлечении КП Н в процессинг многих нейропептидов, таких как окситоцин, вазопрессин, нейротензин, меланоцитстимулирующий гормон, вещество Р, энкефалины и др. [149, 175, 181, 259, 282, 283]. Показано, что КП Н вовлекается в определение агрессивности [30], устойчивости к стрессу [29], предрасположенности к потреблению этанола [31], в развитие физической зависимости от этанола [6, 30, 31] in vivo. Кроме того, изменение уровня мРНК КП Н и активности фермента под действием галоперидола [158, 219], глюкокортикоидов [19, 223, 277, 318] in vivo обуславливают интерес к изучению активности КП Н в условиях изменения функционирования медиаторных систем при введении галоперидола и диазепама.
1.2.3. Карбоксипептидаза М
Карбоксипептидаза М (КП М, КФ 3.4.17.2) была обнаружена Skidgel и соавторами в цитоплазматических мембранах периферических тканей и мозга [302].
Фермент широко распространен в человеческой плаценте, почках, легких [303], периферических нервах, головном мозге [241], желтом теле [333], гранулярных клетках растущих и незрелых фолликулов [333], эндотелиальных клетках кровеносных сосудов [289], лейкоцитах [116], Активность карбоксипептидазы М в нервной ткани на порядок ниже, чем в плаценте, а в периферических нервах выше, чем в головном мозге [241]. В мозге фермент обнаружен в клетках глиии, а также в комплексе с миелином и миелинформирующими клетками [241].
КП М является гликопротеином с Mr 62000 [118, 301]. Фермент представлен одной полипептидной цепью и связан с плазматической мембраной при помощи остатка гликозил-фосфатидилинозитола [118, 301]. При воздействии трипсина и фосфолипазы С КП М переходит в растворимую форму за счет удаления остатка гликозил-фосфатидилинозитола [118, 300]. Этот процесс возможен и in vivo, так как фермент обнаружен в моче и амниотической жидкости [300]. При химическом дегликозилировании образуется полипептид с Mr 48000, который состоит из 439 аминокислотных остатков [295, 303]. Аминокислотная последовательность фермента на 41% идентична КПN и КП Н, на 15% - КПВ и КПА. Многие остатки активного центра соответствуют таковым КПА и КПВ, но перекрестной реакции с антисыворотками к другим КП фермент не дает [303, 315].
Максимальная активность КП М отмечается при рН 7,0. В активном центре фермента находится ион Zn2+ [301]. Ионы Со2+ повышают активность КП М в 1,5 - 2 раза, причем степень активации возрастает при снижении рН [118]. Действие фермента ингибируется ионами Cd2+, о-фенантролином, 2-меркаптометил-3-гуанидилэтилтиопропановой кислотой и ГЭМЯК [118, 301]. HgCl2, ФМСФ, апротинин, каптоприл и фосфорамидон не влияют на его активность [120, 301].
КП М отщепляет остатки только основных аминокислот, причем в отсутствие ионов Со2+ предпочтительней отщепляет аргинин, а в присутствии Со2+ - лизин. Фермент в большей степени проявляет эстеразную активность, чем пептидазную [118, 301]. In vitro КП М отщепляет остатки аргинина и лизина с С-конца Met5-энкефалин-Arg6, Met-энкефалин-Lys6, Leu5-энкефалин-Arg6, брадикинина, динорфина А1-13 [120, 271, 301], фактора роста эпидермиса [189, 300], анафилотоксинов С3а, С4а и С5а [265], различных синтетических пептидов [118, 302].
Считают, что карбоксипептидаза М участвует в инактивации или модулировании активности пептидных гормонов до или после их взаимодействия с рецепторами, вовлекается в процессы клеточного роста и дифференциации. В связи с этим представляет интерес изучение активности КП М при введении галоперидола и диазепама.
1.2.4. ФМСФ-ингибируемая карбоксипептидаза
ФМСФ-ингибируемая карбоксипептидаза была впервые описана в растворимой фракции серого вещества головного мозга котов [22]. Поскольку фермент полностью ингибируется ФМСФ, он был назван ФМСФ-ингибируемой карбоксипептидазой [22].
ФМСФ-ингибируемая КП найдена во всех отделах мозга и практически во всех тканях и органах крыс. Наибольшая активность фермента отмечена в надпочечниках, яичниках, семенниках, гипофизе, обонятельных луковицах [9]. В гипофизе активность была в 1,6 раза меньше, а в семенниках - в 2,5 раза меньше, чем в надпочечниках [53, 54]. В порядке снижения активности фермента отделы головного мозга можно расположить следующим образом: гипофиз, обонятельные луковицы, большие полушария, гипоталамус, стриатум, мозжечок, гиппокамп, четверохолмие [16, 23, 53, 54]. В отделах мозга, богатых телами нейронов, активность фермента выше, чем в проводящих путях [16, 23].
ФМСФ-ингибируемая карбоксипептидаза имеет Mr 100000 - 110000, проявляет максимальную активность при рН 6,0 - 6,5 [22, 26, 27]. При нейтральных и слабощелочных значениях pH фермент инактивируется, но стабилизируется NaCl [26, 27]. ФМСФ-ингибируемая КП, по-видимому, не является металлозависимой карбоксипептидазой, т.к. не ингибируется ЭДТА и ГЭМЯК [9, 19]. Активность фермента полностью подавляется ингибитором сериновых протеиназ - ФМСФ и реагентом на сульфгидрильные группы - ПХМБ. Иодацетамид снижает активность действия фермента примерно в 2 раза. ЭДТА, 2-меркаптоэтанол, N-этилмалеимид, ионы Со2+ не изменяют активность ФМСФ-ингибируемой КП [22, 25, 26].
ФМСФ-ингибируемая КП представлена в мозге как в растворимой форме, так и в комплексе с мембранами субклеточных структур [9]. Согласно данным тонкослойной хроматографии фермент отщепляет аргинин от Leu5-энкефалин-Arg6 и дансил-Phe-Leu-Arg, причем сродство фермента к дансил-Phe-Leu-Arg в несколько раз выше, чем к дансил-Phe-Ala-Arg (Кm для гидролиза дансил-Phe-Leu-Arg 48 мкМ, дансил-Phe-Ala-Arg - 96 мкМ) [22, 25, 26].
Тканевое и региональное распределение ФМСФ-ингибируемой КП коррелирует с распределением нейропептидов и секретируемых белков [9, 33, 201]. Вместе с тем следует отметить, что в отделах головного мозга распределение активности фермента несколько не совпадает с распределением биологически активных пептидов в целом [201]. Наиболее высокая активность ФМСФ-КП обнаружена в эндокринных тканях, синтезирующих стероидные гормоны: яичниках, надпочечниках, семенниках [54]. В надпочечниках, где синтезируется большое число энкефалинов, активность ФМСФ-КП в 8 - 9 раз выше, чем активность КП Н. Кроме того, сродство ФМСФ-КП к дансил-Phe-Leu-Arg значительно выше, чем сродство КП Н [9]. Это позволяет предположить, что ФМСФ-ингибируемая КП как и КП Н участвует в процессинге нейропептидов, и вероятно, наиболее предпочтительным эндогенным субстратом для ФМСФ-ингибируемой КП является проэнкефалин (энкефалин- Leu5-Arg6).
Обнаружено, что ФМСФ-КП вовлекается в развитие алкогольной зависимости [17], в ответ на различные стрессирующие воздействия [5], поэтому представляет интерес изучение активности этого фермента при модуляции ГАМК- и дофаминергических систем.
Таким образом, данные препараты изменяют деятельность пептидергических систем. Введение психолептиков приводит к изменению уровня регуляторных пептидов в тканях. Для понимания динамики процессов, происходящих в пептидергической системе при введении психолептиков, необходима информация о процессах синтеза и деградации регуляторных пептидов [11, 21]. Карбоксипептидазы участвуют в конечных стадиях обмена пептидов [21, 30]. Поэтому изучение активности КП Н, ФМСФ-КП и КП М при введении галоперидола и диазепама представляет значительный интерес, как для уточнения биологической роли самих ферментов, так и для понимания механизмов функционирования пептидергических систем мозга.
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Материалы исследования
Опыты проводили на самцах лабораторных белых беспородных крыс массой 200-250 г. Животных содержали в стандартных условиях вивария.
При изучении острого влияния психолептиков на активность КП Н, КП М и ФМСФ-КП in vivo диазепам вводили внутрибрюшинно в физрастворе в дозе 5 мг/кг веса, галоперидол - 2 мг/кг веса. Контрольные животные получали равное количество физраствора. Крыс декапитировали под наркозом через 0,5, 4, 24 и 72 часа после введения препаратов. При изучении хронического влияния психолептиков вышеуказанные дозы препаратов вводились в течение 10 дней. Через 1 и 3 суток после воздействия животных декапитировали. Для исследования влияния препаратов на КП Н, КП М и ФМСФ-КП in vitro гомогенаты тканей инкубировали с психолептиками в течение 60 мин при 4?С. Концентрации препаратов соответствовали дозам при введении in vivo.
После декапитации извлекали гипофиз, гипоталамус, четверохолмие, мозжечок, стриатум, гиппокамп, большие полушария, надпочечники и семенники. Ткани очищали от оболочек и кровеносных сосудов, высушивали фильтровальной бумагой.
Для определения активности основных карбоксипептидаз ткани взвешивали, а затем гомогенизировали в стеклянном гомогенизаторе с тефлоновым пестиком в 10 мМ натрий-ацетатном буфере (рН=5,6), содержащем 50 мМ NaCl в соотношении 1:100 (вес:объем).
В качестве специфических ингибиторов применяли ФМСФ (”Serva”, США) и ГЭМЯК (Serva”, США). В качестве субстратов использовали дансил-фен-ала-арг и дансил-фен-лей-арг (синтезированы к.х.н. Калихевичем В.Н.). В работе использовали трис-HCl (“Serva”, США) и ацетат натрия (“Merck”, Германия), все остальные реактивы были отечественного производства с квалификацией ”ХЧ” и ”ОСЧ”.
2.1.1. Схема эксперимента
2.2. Методы исследования
2.2.1. Метод определения активности карбоксипептидазы Н
Активность КП Н определяли модифицированным методом Fricker L.D. и Snyder S.H. [148].
Для определения активности фермента к 150 мкл (в случае опытной пробы) или 140 мкл (в случае контрольной пробы) 50 мМ натрий-ацетатного буфера, содержащего 50 мМ NaCl (рН 5,6), добавляли 50 мкл гомогената ткани. В контрольные пробы, кроме того, добавляли 10 мкл 25 мкМ водного раствора ГЭМЯК. Пробы преинкубировались 8 мин при 37оС. Реакцию начинали прибавлением 50 мкл предварительно нагретого до 37°С 210 мкМ дансил-фен-ала-арг, приготовленного на воде (конечная концентрация в реакционной смеси составляла 42 мкМ). Далее пробы инкубировали 60 мин при 37оС. Реакцию останавливали прибавлением 50 мкл 1М раствора соляной кислоты.
Для экстракции продукта реакции - дансил-фен-ала - к пробам приливали 1,5 мл хлороформа и встряхивали в течение 60 сек. Для разделения фаз пробы центрифугировали 10 мин при 1000 об/мин. Измерение флюоресценции хлороформной фазы проводили на флюориметре ФМЦ-2 в кювете толщиной 1 см при ex=360 нм и em=530 нм. В качестве стандарта использовали 1 мкМ раствор дансил-фен-ала в хлороформе.
Активность КП Н определяли как разность в накоплении продукта реакции в пробах, не содержащих и содержащих ГЭМЯК, и выражали в нмоль дансил-фен-ала образовавшегося за 1 мин инкубации в пересчете на 1 мг белка.
2.2.2. Метод определения активности карбоксипептидазы М
Определение активности КП М проводится по выше изложенной схеме, но в качестве буфера используется 200 мМ трис-HCl, рН 7,4 [148].
2.2.3. Метод определения активности ФМСФ-ингибируемой карбоксипептидазы
Активность ФМСФ-ингибируемой карбоксипептидазы определяли флюориметрическим методом [148]. Контрольные пробы содержали 140 мкл 50 мМ натрий-ацетатного буфера, содержащего 50 мМ NaCl (рН 5,6), 10 мкл 25 мМ раствора ФМСФ, приготовленного на этиловом спирте (конечная концентрация ФМСФ в реакционной смеси составляла 1 мМ) и 50 мкл гомогената. В опытные пробы вносили 150 мкл буфера и 50 мкл гомогената.
Дальнейшее определение активности ФМСФ-ингибируемой карбоксипептидазы проводилось так же, как и для КП Н, с той лишь разницей, что вместо дансил-фен-ала-арг в качестве субстрата использовали 50 мкл 210 мкМ дансил-фен-лей-арг. Активность фермента определяли как разность в накоплении продукта дансил-фен-лей в пробах, несодержащих и содержащих ФМСФ. Активность выражали в нмоль дансил-фен-лей образовавшегося за 1 мин инкубации в пересчете на 1 мг белка.
Количество белка в пробах определяли по методу Lowry и соавт. [217].
2.2.4. Статистическая обработка результатов исследования
Достоверность отличий между средними определяли с использованием t-критерия Стьюдента [37]. Корреляционный и дисперсионный анализы проводили с помощью программы Statgraphics (версия 3.0) (“STSC, Inc.” США) в режимах Simple Correlation, One-Way ANOVA и Multifactor ANOVA. Принадлежность подгрупп животных к разным гомогенным группам оценивали с помощью Multiple range analysis (Statgraphics (версия 3.0) (“STSC, Inc.” США)). Принадлежность экспериментальных (временных) подгрупп к разным гомогенным группам проводили только в случае достоверности критерия Фишера. При этом оценивали количество гомогенных групп, образуемых экспериментальными подгруппами, с уровнем достоверности р<0,05. Баллы подгруппам присваивали на основании их принадлежности к разным гомогенным группам по мере увеличения среднего. При этом минимальный балл получала временная подгруппа с минимальным средним, максимальный балл - временная подгруппа с максимальным средним, а дробный балл (1,5) получали подгруппы, входящие одновременно в две гомогенные группы. На основании присвоенных баллов судили о динамике изменения активности ферментов.
3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
3.1. Активность карбоксипептидазы Н в тканях крыс в норме и при действии психолептиков
3.1.1. Распределение активности карбоксипептидазы Н в тканях интактных крыс
Данные о распределении активности КП Н, полученные в ходе исследования, представлены в таблице 1.
Таблица 1. Активность КП Н у интактных животных (нмоль продукта, образовавшегося за 1 мин инкубации на 1 мг белка, М m, n = 7-8)
|
Отделы мозга, органы |
КП Н M±m |
|
|
Гипофиз |
1,36±0,18 |
|
|
Гипоталамус |
0,29±0,02 |
|
|
Четверохолмие |
0,30±0,02 |
|
|
Мозжечок |
0,18±0,01 |
|
|
Стриатум |
0,21±0,01 |
|
|
Гиппокамп |
0,26±0,02 |
|
|
Большие полушария |
0,23±0,01 |
|
|
Надпочечники |
0,13±0,01 |
|
|
Семенники |
0,06±0,01 |
Максимальная активность КП Н обнаружена в гипофизе, где синтезируются пептидные гормоны. В остальных отделах мозга активность фермента в 5-6 раз ниже, чем в гипофизе (по убыванию): четверохолмие, гипоталамус, гиппокамп, большие полушария, стриатум и мозжечок. В надпочечниках и семенниках активность фермента в 10-20 раз ниже по сравнению с гипофизом. Такое распределение активности коррелирует с распределением биологически активных пептидов в отделах мозга [201].
3.1.2. Влияние физиологического раствора на активность карбоксипептидазы Н в тканях крыс
3.1.2.1. Влияние однократного введения физиологического раствора на активность карбоксипептидазы Н в тканях крыс. Введение физиологического раствора вызывало уменьшение активности КП Н в гипофизе через 0,5 часа - на 69%, через 4 часа - на 52% и через 24 часа - на 35% по сравнению с интактной группой (рис. 1). Активность исследуемого фермента снижалась через 0,5 часа в гипоталамусе и мозжечке на 28%, в стриатуме на 29% относительно нормы. Вероятно, это связано с особенностями воздействия внутрибрюшинной инъекции физраствора, при которой в организм поступает дополнительное количество жидкости. Понижение активности КП Н может способствовать ускорению высвобождения жидкости из организма благодаря уменьшению образования вазопрессина [41]. В четверохолмии, гиппокампе, надпочечниках и семенниках изменения активности КП Н при внутрибрюшинном введении физраствора не обнаружено.
Рис. 1. Активность КП Н в тканях крыс при введении диазепама (по оси Y - активность фермента в нмоль субстрата образовавшегося за 1 мин инкубации в пересчете на 1 мг белка) (M ± m; n = 5?6; * - р < 0,05, ** - р < 0,01, *** - р < 0,001 относительно нормы; + - р < 0,05, ++ - р < 0,01, +++ - р < 0,001 относительно контроля).
Рис. 1 (продолжение). Активность КП Н в тканях крыс при введении диазепама.
3.1.2.2. Влияние хронического введения физиологического раствора на активность карбоксипептидазы Н в тканях крыс. Хроническое введение физиологического раствора вызывало повышение активности карбоксипептидазы Н в большинстве исследуемых отделах и тканях через сутки после воздействия и разнонаправленные изменения в отдельных отделах головного мозга через 3 суток (рис. 1).
В гипоталамусе активность КП Н увеличивалась через сутки после воздействия на 79%, в четверохолмии - на 33%, в мозжечке - на 33%, в стриатуме - на 43%, в надпочечниках - на 69%, в семенниках - в 6 раз относительно интактных животных.
Через трое суток после хронического воздействия наблюдалось понижение активности исследуемого фермента в гипоталамусе на 24% и повышение активности в мозжечке на 55%, в гиппокампе - на 81%, в семенниках - в 3 раза по сравнению с нормой.
Введение физиологического раствора в течение 10 дней можно рассматривать в качестве стресса для животных. В связи с этим повышение активности карбоксипептидазы Н может быть связано с увеличением синтеза регуляторных пептидов при стрессе [51].
Для более полного понимания характера выявленных изменений активности основных карбоксипептидаз первичный экспериментальный материал был подвергнут дисперсионному анализу влияния времени после инъекции физраствора (табл. 2).
Зависимость активности КП Н от времени после инъекции наблюдалась во всех исследуемых отделах мозга и тканях за исключением больших полушарий. В гипофизе активность фермента снижалась через 0,5 часа после однократной инъекции физраствора и оставалась таковой до четырех часов, через 24 часа наблюдалось небольшое повышение активности КП Н, которое сохранялось до 72 часов после введения. Хроническое введение физиологического раствора не влияло на изменение активности через сутки после воздействия и немного повышало активность карбоксипептидазы Н через трое суток.
Табл. 2. Дисперсионный анализ влияния времени после инъекции физиологического раствора на активность КП Н в тканях самцов крыс (значения критерия Фишера FФ и баллы экспериментальных (временных) подгрупп).
|
Ткань |
FФ |
Временные подгруппы |
|||||||
|
норма |
0,5 ч. |
4 ч. |
24 ч. |
72 ч. |
1 сут. |
3 сут. |
|||
|
Гипофиз |
4,30** |
2 |
1 |
1 |
1,5 |
1,5 |
2 |
1,5 |
|
|
Гипоталамус |
9,70*** |
1,5 |
1 |
1,5 |
1,5 |
2 |
3 |
1,5 |
|
|
Четверохолмие |
1,77* |
1,5 |
1 |
1,5 |
1,5 |
1,5 |
2 |
1,5 |
|
|
Мозжечок |
7,96*** |
1 |
1 |
1 |
1 |
1 |
2 |
2 |
|
|
Стриатум |
4,14*** |
1 |
1 |
1 |
1 |
1 |
2 |
1,5 |
|
|
Гиппокамп |
5,24*** |
1 |
1 |
1 |
1 |
1 |
1 |
2 |
|
|
Большие полушария |
0,59 |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
|
|
Надпочечники |
8,22*** |
1 |
1 |
1 |
1 |
1 |
2 |
1 |
|
|
Семенники |
30,97*** |
1 |
1 |
1 |
1 |
1 |
3 |
2 |
В гипоталамусе и четверохолмии активность КП Н немного понижалась через 0,5 часа после острого введения физраствора, а через 4 часа повышалась до уровня нормы и оставалась таковой в четверохолмии до 72 часов, а в гипоталамусе до 24 часов. В гипоталамусе наблюдалось повышение активности фермента относительно нормы через 72 часа после однократной инъекции физиологического раствора. Хроническое введение физраствора вызывало значительное повышение активности карбоксипептидазы Н в гипоталамусе через сутки после воздействия и снижение до уровня нормы через трое суток. В четверохолмии введение физраствора в течение 10 дней приводило к небольшому повышению активности КП Н только через сутки после воздействия. Активность фермента в мозжечке, стриатуме, гиппокампе, надпочечниках и семенниках не изменялась в течение 72 часов после острого введения физраствора. Хроническое воздействие вызывало повышение активности карбоксипептидазы Н в мозжечке через 1 и 3 суток, в гиппокампе только через 3 суток после последней инъекции физраствора. В стриатуме активность фермента повышалась через сутки и немного снижалась через трое суток после хронического воздействия. Повышение активности КП Н в надпочечниках происходило через сутки, а через трое суток после хронического введения физиологического раствора наблюдалось снижение активности до уровня интактных животных. В семенниках активность карбоксипептидазы Н повышалась через 1 и 3 суток после хронического воздействия, но через сутки изменения были более выражены.
Таким образом, однократная инъекция физиологического раствора вызывала снижение активности карбоксипептидазы Н только в гипофизе, гипоталамусе и четверохолмии, в то время как хроническое воздействие повышало активность фермента во всех исследованных тканях. Другими словами длительное воздействие вызывало более выраженные изменения активности фермента.
3.1.3. Активность карбоксипептидазы Н в тканях крыс при введении диазепама
3.1.3.1. Влияние однократного введения диазепама на активность карбоксипептидазы Н в тканях крыс. Однократное введение диазепама вызывало снижение активности карбоксипептидазы Н в гипофизе через 24 и 72 часа на 59 и 39% по сравнению с соответствующими значениями контроля (рис. 1). В гипоталамусе активность исследуемого фермента через 4, 24 и 72 часа была ниже, чем у контрольных животных, на 33, 27 и 36% соответственно. Снижение активности карбоксипептидазы Н на 38% наблюдалось в надпочечниках через 72 часа после воздействия. Полученные результаты согласуются с представлениями о стресс-протективном действии диазепама [51] путем ингибирования гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой системы и уменьшения секреции и образования АКТГ при его введении [263, 290]. Диазепам понижал активность КП Н в четверохолмии через 4 и 24 часа в 1,3 раза, через 72 часа в 1,5 раза относительно соответствующих значений контроля. Активность карбоксипептидазы Н в больших полушариях через 4 часа составляла 81%, через 24 часа - 72% и через 72 часа - 65% от соответствующих значений контрольной группы. В мозжечке активность фермента изменялась через 4, 24 и 72 часа после введения диазепама: она снижалась по сравнению с контрольными животными на 25, 28 и 39% соответственно. Активность КП Н в гиппокампе была меньше, чем у контроля в 1,4 раза через 4, 24 и 72 часа. На основе полученных данных можно предположить, что уменьшение уровня холецистокининов под действием бензодиазепинов [24] вызвано снижением активности КПН. Кроме того, по данным ряда ученых [126, 285] вещество Р вовлекается в модуляцию стресса и его уровень повышен у пациентов с депрессивными расстройствами. Понижение уровня этого пептида в гиппокампе при введении диазепама [95] можно быть связано с понижением активности КПН. В семенниках активность КП Н снижалась в 2,3 раза относительно контроля через 72 часа после инъекции диазепама. В половых железах самцов синтезируются энкефалины, холецистокинины и другие биологически активные пептиды [195, 260], в обмене которых участвует карбоксипептидаза Н, поэтому снижение активности фермента может влиять на уровень пептидов в семенниках. Однократная инъекция диазепама не влияла на активность КП Н только в стриатуме.
3.1.3.2. Влияние хронического введения диазепама на активность карбоксипептидазы Н в тканях крыс. Введение диазепама в течение 10 дней вызывало снижение активности КП Н во всех исследуемых тканях за исключением гиппокампа и больших полушарий через сутки после воздействия (рис. 1). Наибольшие изменения активности фермента обнаружены в периферических тканях: в надпочечниках - в 7 раз и семенниках - в 6,5 раз относительно контрольной группы. В гипофизе активность карбоксипептидазы Н уменьшалась в 4 раза, в гипоталамусе - в 2,5 раза, в мозжечке - на 58%, в стриатуме - на 47% и в четверохолмии - на 42% по сравнению с соответствующими значениями контроля. Таким образом, хроническое введение диазепама приводило к таким же изменениям активности КП Н, как и при остром воздействии препарата. Диазепам, вводимый в течение 10 дней, вызывал ингибирование гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой и гипоталамо-гипофизарно-гонадной систем, а также отделов, отвечающих за двигательную активность животных. Через трое суток после хронического введения диазепама снижение активности КП Н обнаружено в отделах с высоким содержанием опиоидных пептидов: в гиппокампе в 1,6 раза и в надпочечниках в 3 раза относительно контрольных животных (рис. 1). Таким образом, хроническое введение диазепама вызывало наибольшие изменения активности карбоксипептидазы Н через сутки после воздействия. Статистически значимая временная динамика изменения активности КП Н наблюдалась в гипофизе, гипоталамусе, четверохолмиях, мозжечке, гиппокампе, больших полушариях, надпочечниках и семенниках (табл. 3).
В гипофизе наблюдалось снижение активности карбоксипептидазы Н относительно нормы как после однократного, так и после хронического введения диазепама. Острое воздействие вызывало снижение активности фермента в гипоталамусе через 0,5 часа; через 4 часа наблюдалось небольшое повышение активности КП Н, которое сохранялось на протяжении 72 часов, а также после хронического воздействия.
Табл. 3. Дисперсионный анализ влияния времени после инъекции диазепама на активность КП Н в тканях самцов крыс (значения критерия Фишера FФ и баллы экспериментальных (временных) подгрупп).
|
Ткань |
FФ |
Временные подгруппы |
|||||||
|
норма |
0,5 ч. |
4 ч. |
24 ч. |
72 ч. |
1 сут. |
3 сут. |
|||
|
Гипофиз |
6,18*** |
2 |
1 |
1 |
1 |
1 |
1 |
1 |
|
|
Гипоталамус |
3,16** |
2 |
1 |
1,5 |
1,5 |
1,5 |
1,5 |
1,5 |
|
|
Четверохолмие |
4,17** |
2 |
1 |
1 |
1 |
1 |
1,5 |
1,5 |
|
|
Мозжечок |
12,29*** |
2 |
1,5 |
1 |
1,5 |
1 |
1,5 |
3 |
|
|
Стриатум |
1,71 |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
|
|
Гиппокамп |
5,99*** |
1,5 |
1 |
1 |
1 |
1 |
2 |
2 |
|
|
Большие полушария |
3,92** |
2 |
1,5 |
1 |
1 |
1 |
1,5 |
1,5 |
|
|
Надпочечники |
12,61*** |
3 |
2,5 |
1,5 |
2 |
2 |
1 |
1 |
|
|
Семенники |
29,63*** |
1 |
1 |
1 |
1 |
1 |
1 |
2 |
В четверохолмии активность фермента снижалась через 0,5 часа после инъекции диазепама и сохранялась на этом уровне до 72 часов. Хроническое введение диазепама вызывало только небольшое снижение активности КП Н относительно нормы через 1 и 3 суток. Активность карбоксипептидазы Н в мозжечке постепенно снижалась до 4 часов, через 24 часа немного повышалась и опять снижалась через 72 часа после острого воздействия диазепама. Небольшое снижение активности фермента в мозжечке происходило через сутки после хронического введения диазепама, через трое суток активность КП Н значительно повышалась относительно нормы. В гиппокампе наблюдалось небольшое понижение активности карбоксипептидазы Н после однократной инъекции диазепама и повышение активности после хронического введения препарата. Активность КП Н в больших полушариях снижалась в течение 4 часов после однократной инъекции диазепама и до 72 часов сохранялась на этом уровне. Небольшое повышение активности фермента в больших полушариях происходило после хронического введения препарата. В надпочечниках инъекция диазепама вызывала постепенное снижение активности КП Н до 4 часов, затем небольшое повышение через 24 часа, которое сохранялось до 72 часов. Препарат, вводимый в течение 10 дней, вызывал значительное снижение активности фермента в надпочечниках через 1 и 3 суток после воздействия. В семенниках повышение активности карбоксипептидазы Н наблюдалось только через трое суток после хронического введения диазепама.
Таким образом, однократное введение диазепама вызывало понижение активности карбоксипептидазы Н относительно интактных животных, а хроническое воздействие приводило к разнонаправленным изменениям в изучаемых тканях.
3.1.4. Активность карбоксипептидазы Н в тканях крыс при введении галоперидола
3.1.4.1. Влияние однократного введения галоперидола на активность карбоксипептидазы Н в тканях крыс. Введение галоперидола не повлияло на активность КП Н в четверохолмии, стриатуме, гиппокампе и больших полушариях. В семенниках достоверное снижение активности приблизительно в 2 раза по отношению к контролю наблюдалось через 24 и 72 часа после воздействия (рис. 2). Известно, что инъекция галоперидола вызывает повышение секреции гонадотропина [273, 276], влияющего на уровень половых стероидов, которые в свою очередь снижают активность карбоксипептидазы Н [47]. В гипоталамусе и мозжечке активность фермента через 0,5 часа была выше, чем у контрольной группы на 57 и 46% соответственно. Наблюдалось повышение активности КП Н в гипофизе через 0,5 часа в 2 раза и через 4 часа на 74% в сравнении с контролем. В надпочечниках значение исследуемого параметра было в 1,6 раза выше, чем у контрольных животных, через 4 часа и в 1,4 раза через 72 часа после инъекции галоперидола. Таким образом, галоперидол в дозе 2 мг/кг вызывал достоверные изменения активности КПН в отделах гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой системы. При этом повышение активности в гипоталамусе наблюдалось уже через 0,5 часа, в гипофизе - через 0,5 и 4 часа, в надпочечниках - через 4 и 72 часа после инъекции. При введении галоперидола отмечается повышение уровня ПОМК в промежуточной доле гипофиза [103] и усиление секреции гормонов гипофиза [49, 98, 273, 287]. Сопоставление этих данных с результатами нашей работы позволяет предположить, что КПН участвует в реализации эффекта галоперидола.
Рис. 2. Активность КП Н в тканях крыс при введении галоперидола (по оси Y - активность фермента в нмоль субстрата образовавшегося за 1 мин инкубации в пересчете на 1 мг белка) (M ± m; n = 5?6; * - р < 0,05, ** - р < 0,01, *** - р < 0,001 относительно нормы; + - р < 0,05, ++ - р < 0,01, +++ - р < 0,001 относительно контроля).
Рис. 2 (продолжение). Активность КП Н в тканях крыс при введении галоперидола.
3.1.4.2. Влияние хронического введения галоперидола на активность карбоксипептидазы Н в тканях крыс. Хроническое введение галоперидола вызывало понижение активности КП Н во всех исследуемых тканях и отделах мозга за исключением больших полушарий через сутки после воздействия (рис. 2).
Наибольшие изменения активности фермента обнаружены в надпочечниках (в 2,2 раза), в гипоталамусе (в 2 раза), в гипофизе и семенниках (в 1,9 раза) по сравнению с контролем. В стриатуме наблюдалось снижение активности карбоксипептидазы Н через сутки после воздействия на 37%, в мозжечке - на 36%, в четверохолмии - на 40%, в гиппокампе - на 30% относительно контрольной группы. По сравнению с однократным введением галоперидола хроническое воздействие вызывало снижение активности КП Н в большинстве исследуемых отделах мозга. Карбоксипептидаза Н локализована преимущественно в везикулах секреторных клеток, в результате опустошения которых при хроническом воздействии галоперидола высвобождаются как пептиды, так и молекулы фермента. Следовательно, обнаруженное снижение активности КП Н может быть обусловлено уменьшением числа активных молекул фермента в секреторных везикулах.
Через трое суток после хронического воздействия зафиксировано уменьшение активности КП Н в отделах мозга (в четверохолмии - на 25%, в гиппокампе - в 3 раза) и повышение в периферических тканях (в надпочечниках - на 38%, в семенниках - на 33%) (рис. 2). Разнонаправленные изменения активности фермента могут быть связаны с эффектом отмены препарата и восстановлением эндокринных функций мозга.
Таким образом, через сутки после хронического воздействия наблюдалось понижение активности КП Н в большинстве исследуемых тканях, а через трое суток - разнонаправленные изменения в периферических тканях, четверохолмии и гиппокампе.
Дисперсионный анализ влияния времени после инъекции галоперидола выявил статистически значимые отличия в динамике изменений активности карбоксипептидазы Н в гипофизе, мозжечке, гиппокампе, надпочечниках и семенниках (табл. 4).
В гипофизе активность карбоксипептидазы Н через 0,5 часа после однократной инъекции галоперидола немного понижалась и оставалась на этом уровне до 24 часов; к 72 часам наблюдалось дальнейшее снижение активности фермента. После хронического введения препарата активность фермента незначительно снижалась относительно нормы.
Таблица 4. Дисперсионный анализ влияния времени после инъекции галоперидола на активность КП Н в тканях самцов крыс (значения критерия Фишера FФ и баллы экспериментальных (временных) подгрупп).
|
Ткань |
FФ |
Временные подгруппы |
|||||||
|
норма |
0,5 ч. |
4 ч. |
24 ч. |
72 ч. |
1 сут. |
3 сут. |
|||
|
Гипофиз |
2,36* |
2 |
1,5 |
1,5 |
1,5 |
1 |
1,5 |
1,5 |
|
|
Гипоталамус |
1,34 |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
|
|
Четверохолмие |
1,22 |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
|
|
Мозжечок |
6,83*** |
1 |
1 |
1 |
1 |
1 |
1 |
2 |
|
|
Стриатум |
1,77 |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
|
|
Гиппокамп |
3,03** |
2 |
2 |
1,5 |
1,5 |
2 |
1,5 |
1 |
|
|
Большие полушария |
1,80 |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
|
|
Надпочечники |
3,93*** |
1,5 |
1 |
1,5 |
1 |
1 |
1 |
2 |
|
|
Семенники |
8,99*** |
1,5 |
1,5 |
1,5 |
1 |
1 |
2 |
3 |
Повышение активности КП Н в мозжечке происходило только через 3 суток после хронического введения галоперидола. В гиппокампе небольшое снижение активности фермента наблюдалось через 4 часа после инъекции препарата, которое сохранялось до 24 часов; к 72 часам активность КП Н повышалась до значений интактных животных. Хроническое введение диазепама вызывало снижение активности карбоксипептидазы Н в гиппокампе, причем через трое суток изменение было более выражено. В надпочечниках активность фермента немного понижалась через 0,5 часа, через 4 часа возвращалась к значениям нормы, через 24 часа опять понижалась и оставалась таковой до 72 часов после однократного введения диазепама. Хроническое воздействие вызывало понижение активности КП Н в надпочечниках через сутки и повышение через 3 суток. В семенниках небольшое понижение активности карбоксипептидазы Н происходило только через 24 часа после однократной инъекции галоперидола и сохранялось до 72 часов. После хронического введения препарата активность фермента в надпочечниках повышалась, причем через трое суток повышение было больше, чем через сутки.
Таким образом, наиболее значимые изменения активности карбоксипептидазы Н относительно интактных животных наблюдались при хроническом введении галоперидола.
3.2. Активность ФМСФ-ингибируемой карбоксипептидазы в тканях крыс в норме и при действии психолептиков
3.2.1. Распределение активности ФМСФ-ингибируемой карбоксипептидазы в тканях интактных крыс
Полученные данные о распределении активности ФМСФ-ингибируемой КП представлены в таблице 5.
Таблица 5. Активность ФМСФ-ингибируемой КП у интактных животных (нмоль продукта, образовавшегося за 1 мин инкубации на 1 мг белка, М m, n = 7-8)
|
Отделы мозга, органы |
ФМСФ - ингибируемая КП, M±m |
|
|
Гипофиз |
0,44±0,05 |
|
|
Гипоталамус |
0,15±0,01 |
|
|
Четверохолмие |
0,13±0,01 |
|
|
Мозжечок |
0,16±0,01 |
|
|
Стриатум |
0,14±0,01 |
|
|
Гиппокамп |
0,13±0,01 |
|
|
Большие полушария |
0,16±0,01 |
|
|
Надпочечники |
0,77±0,06 |
|
|
Семенники |
0,11±0,01 |
Максимальная активность ФМСФ-ингибируемой КП зарегистрирована в надпочечниках, в гипофизе активность ниже на 42%. В этих отделах синтезируются нейропептиды и гормоны пептидной природы. Активность в остальных отделах мозга приблизительно одинакова и составляет 20% от активности в надпочечниках. В семенниках активность исследуемого фермента в 4 раз ниже, чем в гипофизе.
3.2.2. Активность ФМСФ-ингибируемой КП в тканях крыс при введении физиологического раствора
3.2.2.1. Влияние однократного введения физраствора на активность ФМСФ-ингибируемой КП в тканях крыс. Инъекция физиологического раствора вызывала повышение активности ФМСФ-ингибируемой КП во всех изученных тканях и отделах мозга (рис. 3). В гипофизе активность исследуемого фермента увеличивалась через 0,5 часа на 41%, через 24 часа на 48% и через 72 часа на 52% по сравнению с интактной группой. Введение физраствора вызывало повышение активности ФМСФ-ингибируемой КП в четверохолмии через все исследуемые промежутки времени примерно в 1,5 раза относительно нормы. Активность фермента в гипоталамусе возросла через 0,5, 4, 24 и 72 часа на 47, 40, 67 и 93% соответственно по сравнению с нормой. В мозжечке активность ФМСФ-ингибируемой КП повышалась через все исследуемые промежутки времени на 31, 37, 44 и 62% относительно интактных животных. Через 4 и 24 часа после инъекции физраствора наблюдалось повышение активности исследуемого фермента в гиппокампе на 46 и через 72 часа на 69% по отношению к норме. В надпочечниках активность ФМСФ-ингибируемой КП повышалась через 4, 24 и 72 часа на 30, 44 и 60% соответственно. В стриатуме активность фермента через 0,5 и 4 часа была на 36%, через 24 часа на 57%, через 72 часа на 93% больше, чем у интактной группы. Инъекция физиологического раствора вызывала повышение активности ФМСФ-ингибируемой КП в больших полушариях через все промежутки времени на 31, 37, 50 и 94% относительно нормы. В семенниках активность фермента была выше через 0,5, 4 и 72 часа после введения физраствора на 73, 45 и 36% соответственно, чем у интактных животных. Если рассматривать инъекцию физраствора как кратковременный стресс, то повышение активности ФМСФ-ингибируемой КП может быть связано с повышением уровня синтеза энкефалинов и эндорфинов при воздействии стресса [51].
Рис. 3. Активность ФМСФ-ингибируемой КП в тканях крыс при введении диазепама (по оси Y - активность фермента в нмоль субстрата образовавшегося за 1 мин инкубации в пересчете на 1 мг белка) (M ± m; n = 5?6; * - р < 0,05, ** - р < 0,01, *** - р < 0,001 относительно нормы; + - р < 0,05, ++ - р < 0,01, +++ - р < 0,001 относительно контроля).
Подобные документы
Изучение влияния пирроксана на активность основных карбоксипептидаз в нервной ткани крыс позволило выяснить, что так как при воздействии активность КПН и ФМСФ-КП изменяется однонаправлено, то оба фермента обладают сходной биологической функцией.
курсовая работа [64,5 K], добавлен 15.12.2008Механизм образования активных форм регуляторных пептидов. Метод определения активности ангиотензинпревращающего фермента. Исследование активности карбоксипептидазы N в сыворотке крови онкологических больных при химиотерапевтическом воздействии.
дипломная работа [74,0 K], добавлен 25.06.2009Влияние тестостерона и прогестерона на активность карбоксипептидаза Н и ФМСФ-ингибируемой карбоксипептидаза в гипоталамо-гипофизарно-надпочечниково-гонадной системе самцов и самок мышей. Зависимость изменения активности ферментов от пола животного.
диссертация [87,6 K], добавлен 15.12.2008Опиоидные пептиды и физиолого-биохимические аспекты их действия. Обмен регуляторных пептидов. Ферменты обмена нейропептидов при стрессе. Схема введения предшественника лей-энкефалина. Тканевое распределение КПН, ФМСФ-ингибируемой КП и АПФ у самцов крыс.
диссертация [132,5 K], добавлен 15.12.2008История открытия Г-КСФ, их характеристики и классификация. Исследование локализации рецепторов Г-КСФ в головном мозге крысы на базе распределения CD 114 позитивных клеток для последующего применения в изучении расположения рецепторов в мозге человека.
дипломная работа [2,2 M], добавлен 19.06.2019Влияние различных доз токсиканта кадмия на активность АЛТ и АСТ в сыворотке крови и тканях потомства крыс, подвергшихся хроническому действию ионами кадмия в неонатальный период. Результаты поставленного эксперимента и его практическая значимость.
презентация [189,2 K], добавлен 27.10.2010Кадмий как химический элемент. Изучение влияния азотнокислого кадмия на активность аланинаминотрансферазы и аспартатаминотрансферазы в сыворотке крови и тканях органов у потомства белых крыс, подвергшихся токсическому действию в неонатальный период.
дипломная работа [228,4 K], добавлен 27.10.2010Биологическая роль нейропептидов и их обмен. Функционирование пептидэргических систем на разных стадиях эстрального цикла. Уровень нейропептидов на разных стадиях эстрального цикла. Ферменты обмена нейропептидов на разных стадиях эстрального цикла.
диссертация [315,8 K], добавлен 15.12.2008Исследование биологической роли ферментов в механизмах взаимодействия адренергической и пептидергической систем. Определение активности ферментов флюорометрическим методом. Изучение гипофиза, гипоталамуса, больших полушарий и четверохолмия самцов крыс.
статья [14,0 K], добавлен 01.09.2013Роль кремния и кремнийорганических соединений для живых организмов. Особенности функционирования кремнийсодержащих препаратов. Инсектицидное и инсекторепеллентное действие. Регулирование роста растений. Фунгистатическая и бактериостатическая активность.
курсовая работа [272,4 K], добавлен 13.12.2014
