Активность основных карбоксипептидаз при действии нейролептиков

Рис. 3 (продолжение). Активность ФМСФ-ингибируемой КП в тканях крыс при введении диазепама.

Рис. 3 (продолжение). Активность ФМСФ-ингибируемой КП в тканях крыс при введении диазепама.

3.2.2.2. Влияние хронического введения физиологического раствора на активность ФМСФ-ингибируемой КП в тканях крыс. Хроническое введение физраствора приводило к повышению активности ФМСФ-КП через сутки после воздействия в гипофизе на 66%, в четверохолмии - на 61%, в мозжечке - в 2,7 раза, в гиппокампе - в 3,5 раза, в больших полушариях - на 87%, в семенниках - в 2 раза (рис. 3). В стриатуме и надпочечниках через сутки после воздействия наблюдалось понижение активности фермента в 2 и 1,6 раза соответственно относительно интактных животных. В гипоталамусе статистически значимых отличий не обнаружено.

Через трое суток после хронического введения физиологического раствора наблюдалось повышение активности ФМСФ-ингибируемой КП в гипофизе в 2,2 раза, в мозжечке - в 3 раза, в стриатуме - в 4,5 раза, в гиппокампе - в 2,3 раза, в семенниках - в 4 раза относительно интактных животных. В надпочечниках активность фермента понижалась на 40% по сравнению с нормой. В гипоталамусе, четверохолмии и больших полушариях через трое суток после воздействия активность ФМСФ-КП не отличалась от таковой у интактной группы.

Таким образом, хроническое введение физиологического раствора вызывало изменения активности ФМСФ-ингибируемой КП практически во всех исследуемых отделах мозга и тканях, что согласуется с данными об участии ФМСФ-КП в ответе организма на стресс [5]. Статистически значимая временная динамика изменения активности ФМСФ-ингибируемой КП наблюдалась во всех исследуемых тканях и отделах мозга (табл. 6).

В гипофизе наблюдалось небольшое повышение активности ФМСФ-ингибируемой КП через 0,5 часа, понижение через 4 часа и повышение до прежнего уровня через 24 часа, которое сохранялось до 72 часов после острого введения физиологического раствора. Хроническое воздействие вызывало постепенное повышение активности фермента в гипофизе в течение трех суток. Активность ФМСФ-КП в гипоталамусе, четверохолмии, больших полушариях, мозжечке, стриатуме и надпочечниках постепенно повышалась до 72 часов после однократной инъекции физраствора. Через сутки после хронического введения в гипоталамусе наблюдалось небольшое снижение, а через трое суток повышение активности относительно нормы. В четверохолмии хроническое воздействие физиологического раствора вызывало повышение активности ФМСФ-КП, причем наиболее выраженное через сутки. Активность фермента в мозжечке значительно повышалась относительно нормы после хронического введения физраствора. В стриатуме введение физраствора в течение 10 дней приводило к небольшому снижению активности ФМСФ-ингибируемой КП через сутки и повышению через трое суток. Однократная инъекция физиологического раствора вызывала небольшое повышение активности ФМСФ-КП в гиппокампе через 4 часа, которое сохранялось до 72 часов. Хроническое воздействие приводило к повышению активности фермента в гиппокампе и больших полушариях через 1 и 3 суток.

Таблица 6. Дисперсионный анализ влияния времени после инъекции физиологического раствора на активность ФМСФ-ингибируемой КП в тканях самцов крыс (значения критерия Фишера F_Ф и баллы экспериментальных (временных) подгрупп).

В надпочечниках хроническое введение физраствора приводило к небольшому снижению активности ФМСФ-ингибируемой КП относительно нормы. Постепенное повышение активности фермента в течение трех суток происходило в семенниках после хронического воздействия физраствора.

Таким образом, однократная инъекция физиологического раствора приводила к повышению активности ФМСФ-ингибируемой КП, которое сохранялось в течение 72 часов. Значительное повышение активности фермента наблюдалось и при хроническом введении физраствора.

3.2.3. Активность ФМСФ-ингибируемой КП в тканях крыс при введении диазепама

3.2.3.1. Влияние однократного введения диазепама на активность ФМСФ-ингибируемой КП в тканях крыс. Введение диазепама вызывало достоверные изменения активности ФМСФ-ингибируемой КП во всех изученных тканях (рис. 3). В гипофизе через 4 и 72 часа активность фермента была ниже на 24 и 49% соответственно, чем у контроля. Через 24 и 72 часа в гипоталамусе наблюдалось снижение активности ФМСФ-ингибируемой КП на 32 и 55% относительно соответствующих значений контрольных животных. Через 24 и 72 часа наблюдалось понижение активности по сравнению с контролем в мозжечке на 13 и 31% соответственно. В стриатуме активность ФМСФ-ингибируемой КП через 24 часа была ниже на 23% и через 72 часа - на 37%. Известно, что введение диазепама вызывает понижение уровня мет-энкефалина в стриатуме [237]. В наших исследованиях изменения активности КПН в стриатуме не были обнаружены, но произошло понижение активности ФМСФ-КП. Отсюда можно предположить, что ФМСФ-ингибируемая КП участвует в обмене энкефалинов в стриатуме, предшественники которых являются более предпочтительными субстратами для ФМСФ-ингибируемой КП [9, 26].

В больших полушариях через 24 и 72 часа наблюдалось понижение активности ФМСФ-ингибируемой КП на 25 и 35%. Соответственно на 15, 19 и 43% была ниже активность фермента в четверохолмии через 4, 24 и 72 часа после инъекции диазепама. В надпочечниках зафиксировано снижение активности ФМСФ-ингибируемой КП через 4, 24 и 72 часа на 25, 19 и 33% относительно соответствующих значений контроля. В гиппокампе снижение исследуемого параметра по сравнению с контрольными животными наблюдалось через 4 и 24 часа на 21% и через 72 часа на 27%.

Понижение активности фермента в семенниках через 0,5 часа после воздействия на 63% и через 72 часа на 33% может быть связано с увеличением уровня тестостерона под действием диазепама [48, 123].

Таким образом, понижение активности данного фермента может быть одним из механизмов снижения уровня ряда регуляторных пептидов при введении диазепама.

3.2.3.2. Влияние хронического введения диазепама на активность ФМСФ-ингибируемой КП в тканях крыс. Через сутки после хроническое введение диазепама наблюдалось снижение активности ФМСФ-ингибируемой КП в гипофизе на 45%, в мозжечке на 58%, в гиппокампе в 2,5 раза, в больших полушариях на 30% по сравнению с контрольной группой (рис. 3). В стриатуме активность фермента через сутки после воздействия повышалась в 2,4 раза, в надпочечниках - на 67%, в семенниках - в 2,7 раза по отношению к контролю. В гипоталамусе и четверохолмии статистически значимых изменений не обнаружено.

Хроническое введение диазепама приводило к снижению активности ФМСФ-КП через трое суток после воздействия в гипофизе на 53%, в мозжечке на 45%, в стриатуме в 3 раза, в гиппокампе в 1,5 раза относительно контрольных животных (рис. 3). Повышение активности фермента зафиксировано в гипоталамусе на 70%, четверохолмии на 56% и надпочечниках на 65% по сравнению с контролем.

Таким образом, введение диазепама в течение 10 дней вызывало разнонаправленные изменения активности ФМСФ-ингибируемой КП во всех исследуемых отделах мозга и тканях относительно контрольных животных. Полученные данные позволяют предположить, что фермент участвует в обмене регуляторных пептидов при хроническом введении диазепама.

Дисперсионный анализ влияния времени после инъекции диазепама на активность ФМСФ-ингибируемой КП показал, что статистически значимая динамика изменения активности фермента наблюдалась в гипофизе, гипоталамусе, четверохолмии, мозжечке, гиппокампе и семенниках (табл. 7).

Таблица 7. Дисперсионный анализ влияния времени после инъекции диазепама на активность ФМСФ-ингибируемой КП в тканях самцов крыс (значения критерия Фишера F_Ф и баллы экспериментальных (временных) подгрупп).

В гипофизе наблюдалось повышение активности ФМСФ-ингибируемой КП через 0,5часа, и постепенное снижение до 72 часов после однократной инъекции диазепама. Хроническое введение препарата вызывало повышение активности фермента в гипоталамусе только через 3 суток. В четверохолмии активность ФМСФ-КП повышалась через 0,5 часа, через 4 часа понижалась и сохранялась на этом уровне до 72 часов после однократной инъекции диазепама. Хроническое введение препарата приводило к повышению активности фермента в четверохолмии, при этом наиболее выраженные изменения обнаружены через 3 суток. В мозжечке активность ФМСФ-КП повышалась через 0,5 часа, немного понижалась к 4 часам и оставалась таковой до 72 часов после однократной инъекции диазепама. Хроническое введение диазепама вызывало повышение активности фермента в течение трех суток. В гиппокампе наблюдалось небольшое повышение активности ФМСФ-ингибируемой КП через все промежутки времени после однократного введения диазепама и через сутки после хронического. Через 3 суток активность фермента в гиппокампе была выше, чем через сутки после хронического введения препарата. В семенниках активность ФМСФ-КП повышалась через 1 и 3 суток после хронического воздействия.

Таким образом, как однократное, так и хроническое введение диазепама вызывало повышение активности ФМСФ-ингибируемой КП относительно нормы.

3.2.4. Активность ФМСФ-ингибируемой КП в тканях крыс при введении галоперидола

3.2.4.1. Влияние однократного введения галоперидола на активность ФМСФ-ингибируемой КП в тканях крыс. Введение галоперидола не влияло на активность ФМСФ-ингибируемой КП только в семенниках (рис. 4). В гипофизе, гипоталамусе и мозжечке активность понижалась через 4 часа после инъекции на 26, 24 и 14% соответственно относительно контроля. Повышение активности ФМСФ-ингибируемой КП через 0,5 часа на 29% и понижение через 4 и 72 часа на 20 и 29% соответственно наблюдалось в четверохолмии. В гиппокампе активность фермента повышалась через 0,5 часа и понижалась через 4 часа на 37% по сравнению с контрольной группой. Известно, что при введении галоперидола в гиппокампе и больших полушариях повышается уровень холецистокинина и вещества Р [324]. Не исключено, что ФМСФ-КП участвует в обмене этих пептидов при введении галоперидола. В стриатуме активность ФМСФ-ингибируемой КП через 0,5 часа была в 1,5 раза выше, чем у контроля, а через 4 и 24 часа ниже на 26 и 18 % соответственно. Известно, что однократная инъекция галоперидола приводит к увеличению уровня мет-энкефалина и нейротензина в стриатуме [211, 232, 261]. Кроме того, уровень нейротензина у больных шизофренией уменьшен, но восстанавливается после лечения галоперидолом [59, 92, 292]. Поскольку изменение активности КПН в этом отделе мозга не обнаружены, то можно предположить, что в процессинг регуляторных пептидов, синтезируемых в стриатуме при введении галоперидола, вовлечена ФМСФ-КП.

Активность ФМСФ-ингибируемой КП через 0,5 часа повышалась в больших полушариях на 43%, в надпочечниках на 63%, а через 24 часа понизилась на 21% относительно контрольных животных в обоих случаях. В надпочечниках синтезируется большое количество мет-энкефалина, предшественники которого являются более предпочтительными субстратами для ФМСФ-КП [26], поэтому можно предположить, что этот фермент вовлечен в обмен энкефалинов в надпочечниках при введении галоперидола.

Рис. 4. Активность ФМСФ-ингибируемой КП в тканях крыс при введении галоперидола (по оси Y - активность фермента в нмоль субстрата образовавшегося за 1 мин инкубации в пересчете на 1 мг белка) (M ± m; n = 5?6; * - р < 0,05, ** - р < 0,01, *** - р < 0,001 относительно нормы; + - р < 0,05, ++ - р < 0,01, +++ - р < 0,001 относительно контроля).

Рис. 4 (продолжение). Активность ФМСФ-ингибируемой КП в тканях крыс при введении галоперидола.

3.2.4.2. Влияние хронического введения галоперидола на активность ФМСФ-ингибируемой КП в тканях крыс. Хроническое введение галоперидола вызывало снижение активности ФМСФ-ингибируемой КП через сутки после воздействия в гипофизе на 44%, в четверохолмии на 38%, в мозжечке на 39%, в гиппокампе в 5 раз, в больших полушариях в 3,7 раза, в надпочечниках в 2,5 раза относительно контроля (рис. 4).

Через трое суток после введения галоперидола активность фермента снижалась в гипофизе на 42 % и стриатуме на 22% по сравнению с контрольной группой (рис. 4). Повышение активности ФМСФ-КП наблюдалось в гипоталамусе в 2,3 раза, в четверохолмии в 2 раза, в гиппокампе на 47%, в надпочечниках в 2 раза относительно контроля через трое суток после воздействия.

Таким образом, хроническое введение галоперидола приводило к снижению активности ФМСФ-ингибируемой КП через сутки после воздействия и разнонаправленным изменениям через трое суток. Можно предположить, что снижение активности фермента через сутки после воздействия связано с уменьшением числа активных молекул.

Через трое суток, то есть в период отмены препарата, происходит восстановление ферментативной системы и наблюдается повышение активности ФМСФ-КП.

Согласно дисперсионному анализу (табл. 8) достоверные изменения динамики активности ФМСФ-ингибируемой КП после введения галоперидола наблюдались во всех изученных отделах мозга и тканях.

В гипофизе активность ФМСФ-ингибируемой КП повышалась через 0,5ч, затем возвращалась к значениям интактных животных, незначительно увеличивалась к 24ч и оставалась на этом уровне до 72 часов. Галоперидол, вводимый в течение 10 дней, вызывал небольшое повышение активности фермента в гипофизе только через трое суток после воздействия.

Табл. 8. Дисперсионный анализ влияния времени после инъекции галоперидола на активность ФМСФ-ингибируемой КП в тканях самцов крыс (значения критерия Фишера F_Ф, баллы экспериментальных (временных) подгрупп).

В гипоталамусе через 0,5 часа после инъекции галоперидола активность ФМСФ-КП немного повышалась и сохранялась до 24 часов, к 72 часам наблюдалось дальнейшее повышение активности. При хроническом введении препарата активность фермента повышалась, при этом повышение активности через трое суток было более выраженным. Однократное введение галоперидола приводило к повышению активности ФМСФ-ингибируемой КП в четверохолмии через 0,5 часа, понижению через 4 часа и постепенному повышению до 72 часов. При остром введении галоперидола активность ФМСФ-КП в стриатуме значительно увеличивалась через 0,5 часа, через 4 часа снижалась до значений нормы и до 72 часов постепенно повышалась. В гиппокампе и надпочечниках через 0,5 часа после однократной инъекции галоперидола активность ФМСФ-КП повышалась, затем понижалась до значений нормы и оставалась таковой до 24 часов; к 72 часам наблюдалось повышение активности фермента. Хроническое воздействие приводило к небольшому снижению активности фермента в гиппокампе, стриатуме, четверохолмии и надпочечниках через сутки и повышению через трое суток относительно нормы. В мозжечке активность ФМСФ-ингибируемой КП увеличивалась через 0,5 часа после инъекции галоперидола, несколько снижалась к 4 часам, а к 24 часам возвращалась к уровню, зафиксированному через 0,5 часа, и оставалась таковой до 72 часов, а также через сутки после хронического введения. Через трое суток после хронического воздействия препарата повышение активности было больше, чем через сутки. В больших полушариях активность ФМСФ-ингибируемой КП повышалась через 0,5 часа после инъекции галоперидола, снижалась к 4 часам и повышалась через 72 часа. Хроническое воздействие приводило к повышению активности фермента только через трое суток после воздействия. Активность ФМСФ-ингибируемой КП в семенниках повышалась только после хронического введения галоперидола, при этом через трое суток изменения были более выражены. Таким образом, однократное введение галоперидола приводило к повышению активности ФМСФ-ингибируемой КП во всех отделах мозга, гипофизе и надпочечниках по сравнению с интактными животными. Хроническое воздействие приводило к повышению активности фермента в гипофизе, гипоталамусе, мозжечке, больших полушариях и семенниках и разнонаправленным изменениям в четверохолмии, стриатуме, гиппокампе и надпочечниках относительно нормы.

3.3. Активность карбоксипептидазы М в тканях крыс в норме и при введении психолептиков

3.3.1. Распределение активности карбоксипептидазы М в тканях интактных животных

Данные о распределении активности КП М в тканях самцов крыс представлены в таблице 9.

Таблица 9. Активность КП М у интактных животных (нмоль продукта, образовавшегося за 1 мин инкубации на 1 мг белка, М m, n = 7-8)

КП М проявляла максимальную активность в четверохолмии и больших полушариях. Активность в гипоталамусе и мозжечке составляла 73% от активности в четверохолмии. В этих отделах мозга синтезируется большое количество регуляторных пептидов, в обмене которых возможно принимает участие КП М. В стриатуме и гиппокампе активность в 1,2 и 2 раза соответственно ниже, чем в гипоталамусе.

3.3.2. Активность карбоксипептидазы М в тканях крыс при введении физиологического раствора

3.3.2.1. Влияние однократного введения физраствора на активность карбоксипептидазы М в тканях крыс. В гиппокампе активность карбоксипептидазы М повышалась через 0,5 и 72 часа после однократной инъекции физиологического раствора на 45 и 63% по сравнению с интактными животными (рис. 5). Активность фермента в гипоталамусе и мозжечке через 72 часа была выше на 48 и 23% соответственно относительно нормы. Поскольку в ответ на стрессовое воздействие в организме животных вырабатывается большое количество регуляторных пептидов [51], то не исключено, что повышение активности карбоксипептидазы М связано с ее участием в инактивации нейропептидов, синтезированных в ответ на данное воздействие. Инъекция физиологического раствора вызывала снижение активности КП М в стриатуме через 24 часа на 54%. Известно, что б-неоэндорфин, динорфин 1-13, широко представленные в стриатуме, в качестве С-концевой аминокислоты содержат лизин [28], следовательно, они могут выступать в качестве субстратов для КПМ [268]. Выявленное уменьшение активности КПМ, возможно приводит к замедлению деградации этих пептидов, обладающих способностью проявлять седативное действие [28].

Рис. 5. Активность карбоксипептидазы М в тканях крыс при введении диазепама (по оси Y - активность фермента в нмоль субстрата образовавшегося за 1 мин инкубации в пересчете на 1 мг белка) (M ± m; n = 5?6; * - р < 0,05, ** - р < 0,01, *** - р < 0,001 относительно нормы; + - р < 0,05, ++ - р < 0,01, +++ - р < 0,001 относительно контроля).

Рис. 5 (продолжение). Активность карбоксипептидазы М в тканях крыс при введении диазепама.

3.3.2.2. Влияние хронического введения физиологического раствора на активность карбоксипептидазы М в тканях крыс. Хроническое введение физиологического раствора вызывало повышение активности карбоксипептидазы М во всех исследуемых отделах мозга через 1 и 3 суток после воздействия (рис. 5).

Через сутки после введения наибольшие изменения обнаружены в гиппокампе - в 5,9 раза, в четверохолмии - в 4,7 раза, в стриатуме и больших полушариях - в 3 раза по сравнению с интактными животными. В гипоталамусе и мозжечке наблюдалось повышение активности фермента на 79% и 56% соответственно относительно нормы.

Через трое суток после хронического введения физраствора обнаружено повышение активности КП М в гипоталамусе - на 51%, в четверохолмии - на 12%, в мозжечке - в 2,8 раза, в стриатуме - в 3,4 раза, в гиппокампе - в 3,2 раза, в больших полушариях - на 71% по сравнению с интактной группой.

Таким образом, хроническое введение физиологического раствора вызывало повышение активности карбоксипептидазы М в отделах мозга, что может быть связано с необходимостью деградации биологически активных пептидов, секретируемых в ответ на длительный стресс.

Согласно дисперсионному анализу (табл. 10) достоверные изменения динамики активности КП М после введения физраствора обнаружены во всех исследованных тканях.

Таблица 10. Дисперсионный анализ влияния времени после инъекции физиологического раствора на активность КП М в тканях самцов крыс (значения критерия Фишера F_Ф и баллы экспериментальных (временных) подгрупп).

В гипоталамусе к 4 часам после инъекции физиологического раствора наблюдалось небольшое понижение активности карбоксипептидазы М; через 24 часа активность фермента повышалась до уровня нормы. После хронического введения физраствора активность КП М повышалась через сутки после воздействия в четверохолмии и гипоталамусе, через трое суток в мозжечке и через 1 и 3 суток в стриатуме. В гиппокампе повышение активности фермента наблюдалось через 72 часа после инъекции физиологического раствора. Активность КП М в больших полушариях понижалась через 0,5 часа, через 4 часа повышалась до уровня нормы, снижалась через 24 часа и к 72 часам опять повышалась. Хроническое введение физраствора приводило к повышению активности фермента в гиппокампе и больших полушариях, при этом через сутки изменения были более выражены.

Таким образом, однократная инъекция физиологического раствора вызывала изменения активности карбоксипептидазы М в гипоталамусе, гиппокампе и больших полушариях. При хроническом воздействии активность фермента повышалась во всех изученных отделах мозга.

3.3.3. Активность карбоксипептидазы М в тканях крыс при введении диазепама

3.3.3.1. Влияние однократного введения диазепама на активность карбоксипептидазы М в тканях крыс. На активность КП М в четверохолмии и больших полушариях введение диазепама не повлияло (рис. 5). Активность карбоксипептидазы М в мозжечке через 72 часа составляла 80% от контроля. В гипоталамусе через 4 часа после воздействия активность исследуемого фермента увеличивалась на 49%, а через 72 часа уменьшалась на 25% по сравнению с контрольными животными. Обнаруженное снижение активности фермента через 72 часа в мозжечке и гипоталамусе может быть обусловлено уменьшением числа активных молекул фермента. Снижение активности КП М в стриатуме наблюдалось через 4 часа на 53% и увеличение через 24 часа в 2,3 раза по отношению к контролю. В гиппокампе активность была достоверно выше, чем у контрольной группы, на 42 % через 4 часа после однократной инъекции диазепама. Таким образом, изменение активности КПМ обнаружено в тех отделах мозга, где эндогенный лиганд бензодиазепиновых рецепторов - ингибитор связывания диазепама (DBI) и бензодиазепиновые рецепторы присутствуют в высоких концентрациях [2, 113]. Известно, что на С-конце DBI и его производных присутствует лизин [112]. Учитывая специфичность действия КПМ, можно предположить, что фермент, локализованный на внешней стороне плазматической мембраны [118], участвует в инактивации эндозепинов путем отщепления лизина. DBI является анксиогенным пептидом, который повышает агрессивность животных [8, 118]. Обнаруженное увеличение активности КПМ может привести к снижению уровня этого пептида путем его инактивации. Следовательно, седативное действие диазепама может проявляться через увеличение уровня седативных пептидов и понижение уровня проконфликтных за счет действия КПМ.

3.3.3.2. Влияние хронического введения диазепама на активность карбоксипептидазы M в тканях крыс. Хроническое введение диазепама вызывало снижение активности КП М во всех исследуемых отделах мозга через сутки после воздействия (рис. 5). Наибольшие изменения активности фермента зафиксированы в четверохолмии (в 5,9 раза) и стриатуме (в 3,6 раза). В гипоталамусе активность карбоксипептидазы М через сутки после хронического введения диазепама снижалась на 57%, в мозжечке - на 36%, в гиппокампе - на 62%, в больших полушариях - на 48% относительно контроля.

Через трое суток после введения диазепама активность фермента снижалась только в мозжечке и стриатуме в 2,2 и 2,4 раза соответственно по сравнению с контрольными животными.

В ответ на хроническое введение диазепама из клетки секретируются как пептиды так и ферменты их обмена. Возможно, что снижение активности карбоксипептидазы М через сутки после хронического воздействия может быть связано с уменьшением количества активных молекул фермента в связи с преобладанием процессов их деградации над синтезом. Через трое суток снижение активности КП М наблюдалось только в отделах с высоким содержанием регуляторных пептидов. Можно предположить, что для восстановления пептидергической системы мозжечка и стриатума необходим более длительный промежуток времени.

Достоверные отличия влияния времени на активность КП М при введении диазепама обнаружены в гипоталамусе и гиппокампе (табл. 11). В этих отделах наблюдалось небольшое повышение активности карбоксипептидазы М в течение 72 часов после однократной инъекции диазепама. При хроническом введении препарата активность фермента повышалась в гипоталамусе через трое суток, в гиппокампе через 1 и 3 сутки после воздействия по сравнению с интактной группой.

Таблица 11. Дисперсионный анализ влияния времени после инъекции диазепама на активность КП М в тканях самцов крыс (значения критерия Фишера F_Ф и баллы экспериментальных (временных) подгрупп).

3.3.4. Активность карбоксипептидазы М в тканях крыс при введении галоперидола

3.3.4.1. Влияние однократного введения галоперидола на активность карбоксипептидазы М в тканях крыс. Введение галоперидола увеличивало активность КП М в гипоталамусе через 4 часа после воздействия на 97%, через 24 часа на 51% относительно контрольной группы (рис. 6). В четверохолмии и гиппокампе активность через 4 часа была выше, чем у контроля, на 97 и 86% соответственно. Увеличение активности фермента в 2,3 раза по сравнению с контрольными животными наблюдалось в стриатуме через 24 часа после инъекции. В больших полушариях активность КП М была выше, чем у контроля, через 0,5 часа на 58% и через 24 часа на 44%. Повышение активности фермента в мозжечке наблюдалось через 4 и 72 часа после введения галоперидола на 30 и 20% соответственно. Эти данные согласуются со сведениями о том, что под влиянием галоперидола увеличивается уровень многих нейропептидов [69, 117, 129, 314]. Вероятно, увеличение активности КП М связано с инактивацией большого количества пептидов, секретируемых из клетки в ответ на данное воздействие.

Рис. 6. Активность карбоксипептидазы М в тканях крыс при введении галоперидола (по оси Y - активность фермента в нмоль субстрата образовавшегося за 1 мин инкубации в пересчете на 1 мг белка) (M ± m; n = 5?6; * - р < 0,05, ** - р < 0,01, *** - р < 0,001 относительно нормы; + - р < 0,05, ++ - р < 0,01, +++ - р < 0,001 относительно контроля).

Рис. 6 (продолжение). Активность карбоксипептидазы М в тканях крыс при введении галоперидола.

3.3.4.2. Влияние хронического введения галоперидола на активность карбоксипептидазы М в тканях крыс. Через сутки после хронического введения галоперидола активность карбоксипептидазы М снижалась в гиппокампе - в 2,8 раза, в больших полушариях - в 2 раза, в стриатуме - в 1,8 раза относительно контроля (рис. 6).

Хроническое введение галоперидола вызывало повышение активности фермента через трое суток после воздействия в четверохолмии - в 3,8 раза, в гипоталамусе - в 2,3 раза, в стриатуме - в 1,9 раза по сравнению с контролем (рис. 6). В гиппокампе активность КП М снижалась в 2,2 раза относительно контрольной группы.

Длительное воздействие могло привести к уменьшению числа активных молекул фермента, чем и объясняется снижение активности КП М в отделах с высокой концентрацией дофаминовых рецепторов. Восстановление и даже повышение активности фермента через трое суток после воздействия может быть связано с восстановлением ферментативной системы после отмены препарата.

Дисперсионный анализ влияния времени после инъекции галоперидола на активность КП М показал, что статистически значимая динамика изменения активности фермента наблюдается во всех исследованных отделах мозга (табл. 12).

Таблица 12. Дисперсионный анализ влияния времени после инъекции галоперидола на активность КП М в тканях самцов крыс (значения критерия Фишера F_Ф, баллы экспериментальных (временных) подгрупп).

В гипоталамусе и четверохолмии через 0,5 часа после однократной инъекции галоперидола активность КП М немного повышалась, через 4 часа она была достоверно выше, чем у интактных животных, а через 24 часа возвращалась к уровню, зафиксированному через 0,5 часа, и сохранялась на этом уровне до 72 часов. Галоперидол, вводимый в течение 10 дней, вызывал повышение активности фермента в гипоталамусе и четверохолмии, через сутки изменения были более выраженными. В мозжечке и стриатуме изменение активности наблюдалось только через 3 суток после хронического введения препарата. Однократная инъекция галоперидола немного повышала активность КП М в гиппокампе в течение 24 часов. Такое же повышение активности наблюдалось в гиппокампе и при хроническом воздействии. Через 72 часа активность КП М в этом отделе мозга была достоверно выше, чем у интактной группы. В больших полушариях небольшое повышение активности фермента наблюдалось в течение 72 часов после однократной инъекции галоперидола и через сутки после хронического воздействия. Через трое суток активность карбоксипептидазы М в больших полушариях была достоверно выше относительно нормы.

Таким образом, введение галоперидола, особенно в течение 10 дней, вызывало повышение активности карбоксипептидазы М во всех изученных отелах мозга.

3.4. Активность основных карбоксипептидаз in vitro при действии психолептиков

В настоящее время одной из наиболее актуальных проблем в современной медицине является профилактика и лечения психических заболеваний. Успешное решение данной проблемы возможно лишь в сочетании с изучением молекулярно-биохимических механизмов, лежащих в основе развития патологии нервной системы.

Известно, что развитие патологических процессов происходит в связи с нарушением процессов передачи информации между клетками [2, 4, 8, 40, 50], поэтому в психофармакологии используют препараты, действующие на медиаторные системы, в частности, галоперидол - антагонист дофаминергической и диазепам - агонист ГАМК-ергической систем [39, 163, 310]. Установлено при этом, что введение психолептиков существенно изменяет уровень ряда биологически активных пептидов [67, 95, 164, 193, 243, 228, 263, 324]. Однако механизмы взаимодействия медиаторных и пептидергических систем до сих пор остаются неизученными.

Содержание биологически активных пептидов зависит от активности ферментов, участвующих в их обмене [21, 30]. Изучение содержания уровня того или иного нейропептида в тканях не дает достаточно точных представлений о динамических процессах, происходящих в пептидергической системе при введении психолептиков. Более информативным является изучение процессов синтеза и утилизации нейропептидов [12, 21]. Поэтому изучение активности КП Н, ФМСФ-КП и КП М при воздействии галоперидола и диазепама представляет значительный интерес, как для уточнения биологической роли самих ферментов, так и для понимания роли регуляторных пептидов в механизмах действия психолептиков.

Максимальная активность КП Н обнаружена в отделах мозга и тканях с высоким уровнем нейропептидов, а именно, в гипофизе, где синтезируются пептидные гормоны, а также в гипоталамусе, четверохолмии, стриатуме - отделах лимбической системы, в которых обнаружено высокое содержание эндорфинов и вещества Р [55, 84, 201, 278, 279]. Низкая активность фермента выявлена в надпочечниках и гонадах. Полученные нами данные об уровне и распределении активности КП H в мозге и тканях крыс соответствуют литературным данным [137, 148, 149].

Региональное и тканевое распределение фермента соответствует литературным данным о содержании регуляторных пептидов в нервной системе [201], что хорошо согласуется с данными о вовлечении КП Н в процессинг нейропептидов [149, 175, 181, 247, 259, 282, 283].

Наибольшая активность ФМСФ-ингибируемой КП обнаружена в гипофизе и надпочечниках, т.е. в органах, связанных с образованием регуляторных пептидов и гормонов пептидной природы. Нужно отметить, что в гипофизе активность фермента значительно выше, чем в отделах центральной нервной системы. Поскольку в гипофизе синтезируются пептидные гормоны, то, не исключено, что ФМСФ-ингибируемая КП может участвовать в процессинге предшественников этих гормонов. Однако, в гипоталамусе и стриатуме, отделах мозга с наиболее высоким уровнем нейропептидов [201], активность ФМСФ-ингибируемой КП не высока.

Обнаружено, что в гипофизе активность КП Н существенно выше активности ФМСФ-ингибируемой КП, тогда как в надпочечниках, в которых синтезируются преимущественно энкефалины, наблюдается обратное соотношение. Возможно, это различие связано с различной субстратной специфичностью данных ферментов [9]. Так, в гипофизе синтезируются в основном пептидные гормоны, в проформах которых перед остатком основной аминокислоты находится остаток аминокислоты с коротким алифатическим радикалом (аланин, глицин) [55]. В надпочечниках же синтезируются преимущественно энкефалины, в которых предпоследними являются остатки лейцина и метионина [55]. Сопоставляя субстратную специфичность и аминокислотную последовательность регуляторных пептидов можно придти к выводу, что предпочтительным субстратом для КП Н будут предшественники пептидных гормонов, а для ФМСФ-ингибируемой КП предшественники лей- и мет-энкефалинов, с чем, возможно, и связан более высокий уровень активности ФМСФ-ингибируемой КП в надпочечниках.

Максимальный уровень активности КП М у интактных животных наблюдался в четверохолмии, больших полушариях, мозжечке и гипоталамусе. В этих отделах мозга синтезируется большое количество регуляторных пептидов, в обмене которых возможно принимает участие этот фермент.

Однократное введение физиологического раствора вызывало уменьшение активности КП Н в гипофизе через все исследуемые промежутки времени. Активность исследуемого фермента снижалась через 0,5 часа в гипоталамусе, стриатуме и мозжечке. Вероятно, это связано с особенностями воздействия внутрибрюшинной инъекции физраствора, при которой в организм поступает дополнительное количество жидкости. Понижение активности КП Н может способствовать ускорению высвобождения жидкости из организма благодаря уменьшению образования вазопрессина [41].

Инъекция физиологического раствора вызывала достоверное повышение активности ФМСФ-ингибируемой КП во всех изученных тканях и отделах мозга: в гипофизе - через 0,5, 24 и 72 часа; в четверохолмии, мозжечке, стриатуме, больших полушариях и гипоталамусе - через все исследуемые промежутки времени; в надпочечниках и гиппокампе - через 4, 24 и 72 часа; в семенниках - через 0,5, 4 и 72 часа после воздействия. Если рассматривать инъекцию физраствора как кратковременный стресс, то повышение активности ФМСФ-ингибируемой КП может быть связано с повышением уровня синтеза энкефалинов и эндорфинов при воздействии стресса [51].

Активность карбоксипептидазы М в гиппокампе повышалась через 0,5 и 72 часа после однократной инъекции физиологического раствора по сравнению с интактными животными. Активность фермента в гипоталамусе и мозжечке через 72 часа была выше, чем в норме. Поскольку в ответ на стрессовое воздействие в организме животных вырабатывается большое количество регуляторных пептидов [51], то не исключено, что повышение активности карбоксипептидазы М связано с ее участием в инактивации нейропептидов, синтезированных в ответ на данное воздействие. Введение физраствора приводило к снижению активности КП М в стриатуме через 24 часа после воздействия. Известно, что б-неоэндорфин, динорфин 1-13, широко представленные в стриатуме, в качестве С-концевой аминокислоты содержат лизин [55], следовательно, они могут выступать в качестве субстратов для КП М [118, 271, 301]. Выявленное уменьшение активности КП М, возможно, приводит к замедлению разрушения этих пептидов, обладающих способностью проявлять седативное действие [41, 55].

При хроническом введении физиологического раствора активность КП Н увеличивалась через сутки после воздействия в гипоталамусе, четверохолмии, мозжечке, стриатуме, надпочечниках и семенниках относительно интактных животных. Через трое суток после хронического воздействия наблюдалось понижение активности исследуемого фермента в гипоталамусе и повышение активности в мозжечке, гиппокампе и семенниках по сравнению с нормой.

Хроническое введение физраствора приводило к повышению активности ФМСФ-КП через сутки после воздействия в гипофизе, четверохолмии, мозжечке, гиппокампе, больших полушариях и семенниках. В стриатуме и надпочечниках через сутки после воздействия наблюдалось понижение активности фермента относительно интактных животных. Через трое суток после хронического введения физиологического раствора наблюдалось повышение активности ФМСФ-ингибируемой КП в гипофизе, мозжечке, стриатуме, гиппокампе и семенниках относительно интактных животных. В надпочечниках активность фермента понижалась по сравнению с нормой.

Повышение активности карбоксипептидазы М во всех исследуемых отделах мозга наблюдалось через 1 и 3 суток после хронического воздействия физиологического раствора. Через сутки после введения наибольшие изменения обнаружены в гиппокампе, четверохолмии, стриатуме и больших полушариях, а также в гипоталамусе и мозжечке по сравнению с интактными животными. Через трое суток после хронического введения физраствора обнаружено повышение активности КП М в гипоталамусе, четверохолмии, мозжечке, стриатуме, гиппокампе и больших полушариях по сравнению с интактной группой.

Таким образом, введение физиологического раствора в течение 10 дней можно рассматривать в качестве стресса для животных. В связи с этим обнаруженное изменение активности основных карбоксипептидаз согласуется с данными об участии исследуемых ферментов в ответе организма на стресс [5].

Изучение активности КП Н, ФМСФ-ингибируемой КП и КП М у самцов крыс при однократном введении диазепама показало, что активность ФМСФ-ингибируемой КП достоверно изменялась во всех исследуемых органах и тканях, в то время как активность КП Н не изменялась только в стриатуме. Изменения активности КП М были обнаружены в гипоталамусе, мозжечке, стриатуме и гиппокампе.

Введение диазепама приводило к значительному уменьшению активности КП Н в гипофизе через 24 и 72 часа, гипоталамусе через 4, 24 и 72часа и надпочечниках через 72 часа, что согласуется с представлениями о стресс-протективном действии диазепама [51] путем ингибирования гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой системы и уменьшения секреции и образования АКТГ при его введении [263, 290]. При этом необходимо отметить, что изменения в гипоталамусе наступали раньше, чем в гипофизе.

Инъекция диазепама понижала активность КП Н в четверохолмии, больших полушариях, мозжечке и гиппокампе через 4, 24 и 72 часа относительно соответствующих значений контроля. При этом наибольшие изменения зафиксированы в больших полушариях и гиппокампе (в 1,3-1,4 раза), в отделах с высоким содержанием холецистокининов и вовлекающихся в развитие эмоциональных реакций и невротических состояний [24]. На основе полученных данных можно предположить, что уменьшение уровня холецистокининов под действием бензодиазепинов [24] вызвано снижением активности КПН. Кроме того, по данным ряда ученых [126, 285] вещество Р вовлекается в модуляцию стресса и его уровень повышен у пациентов с депрессивными расстройствами. Понижение уровня этого пептида в гиппокампе при введении диазепама [95] можно быть связано с понижением активности КПН. В семенниках активность КП Н снижалась через 72 часа после инъекции диазепама. В половых железах самцов синтезируются энкефалины, холецистокинины и другие биологически активные пептиды [195, 260], в обмене которых участвует карбоксипептидаза Н, поэтому снижение активности фермента может влиять на уровень пептидов в семенниках.

Активность ФМСФ-ингибируемой КП после инъекции диазепама изменялась подобно активности КП Н: уменьшалась в гипофизе через 4 и 72 часа; в гипоталамусе, мозжечке, стриатуме и больших полушариях через 24 и 72часа; в гиппокампе, четверохолмии и надпочечниках через 4, 24 и 72 часа после воздействия. Обнаруженное нами снижение активности ФМСФ-ингибируемой КП позволяет предположить ее участие в обмене регуляторных пептидов при введении диазепама.

Имеются данные о понижении уровня мет-энкефалина в стриатуме при однократном введении диазепама [237]. В наших исследованиях изменения активности КП Н в этом отделе мозга не были обнаружены, но произошло понижение активности ФМСФ-ингибируемой КП. Отсюда можно предположить, что ФМСФ-ингибируемая КП участвует в обмене энкефалинов в стриатуме, предшественники которых являются более предпочтительными субстратами для ФМСФ-ингибируемой КП [9, 26].

Понижение активности фермента в семенниках через 0,5 и 72 часа после воздействия может быть связано с увеличением уровня тестостерона под действием диазепама [48, 123].

Активность карбоксипептидазы М снижалась в мозжечке через 72 часа после острого воздействия диазепама. В гипоталамусе через 4 часа после воздействия активность исследуемого фермента увеличивалась, а через 72 часа уменьшалась по сравнению с контрольными животными. Обнаруженное снижение активности фермента через 72 часа в мозжечке и гипоталамусе может быть обусловлено уменьшением числа активных молекул фермента. Снижение активности КП М в стриатуме наблюдалось через 4 часа и увеличение через 24 часа по отношению к контролю. В гиппокампе активность фермента была достоверно выше, чем у контрольной группы, через 4 часа после однократной инъекции диазепама. Таким образом, изменение активности КПМ обнаружено в тех отделах мозга, где эндогенный лиганд бензодиазепиновых рецепторов - ингибитор связывания диазепама (DBI) и бензодиазепиновые рецепторы присутствуют в высоких концентрациях [2, 113]. Известно, что на С-конце DBI и его производных присутствует лизин [112]. Учитывая специфичность действия КПМ, можно предположить, что фермент, локализованный на внешней стороне плазматической мембраны [118], участвует в инактивации эндозепинов путем отщепления лизина. DBI является анксиогенным пептидом, который повышает агрессивность животных [8, 118]. Обнаруженное увеличение активности КПМ может привести к снижению уровня этого пептида путем его инактивации. Следовательно, седативное действие диазепама может проявляться через увеличение уровня седативных пептидов и понижение уровня проконфликтных за счет действия КПМ.

Хроническое введение диазепама приводило к снижению активности КП Н и КП М и разнонаправленным изменениям ФМСФ-КП в изученных отделах мозга и периферических органах крыс.

Введение диазепама в течение 10 дней вызывало снижение активности КП Н в гипофизе, гипоталамусе, четверохолмии, мозжечке, стриатуме через сутки после воздействия. Наибольшее понижение активности фермента в этот период обнаружены в периферических тканях: в надпочечниках и семенниках относительно контрольной группы. Таким образом, хроническое введение диазепама приводило к таким же изменениям активности КП Н, как и при остром воздействии препарата. Диазепам, вводимый в течение 10 дней, вызывал ингибирование гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой и гипоталамо-гипофизарно-гонадной систем, а также отделов, отвечающих за двигательную активность животных. Через трое суток после хронического введения диазепама снижение активности КП Н обнаружено в отделах с высоким содержанием опиоидных пептидов: в гиппокампе и надпочечниках. Следовательно, хроническое введение диазепама вызывало наибольшие изменения активности карбоксипептидазы Н через сутки после воздействия.

Снижение активности ФМСФ-ингибируемой КП через сутки после хроническое введение диазепама наблюдалось в гипофизе, мозжечке, гиппокампе и больших полушариях по сравнению с контрольной группой. Активность фермента через сутки после воздействия повышалась в стриатуме, надпочечниках и семенниках.

Хроническое введение диазепама приводило к снижению активности ФМСФ-КП через трое суток после воздействия в гипофизе, мозжечке, стриатуме и гиппокампе относительно контрольных животных. Повышение активности фермента зафиксировано в гипоталамусе, четверохолмии и надпочечниках по сравнению с контролем.

Таким образом, в отличие от действия однократной инъекции диазепама хроническое введение препарата приводило к разнонаправленным изменениям активности ФМСФ-ингибируемой КП во всех исследуемых отделах мозга и тканях относительно контрольных животных. Кроме того, диазепам, вводимый в течение 10 дней, вызывал снижение активности КП Н и разнонаправленные изменения активности ФМСФ-КП. Возможно, что подобное отличие в изменении активности этих ферментов связано с разной ролью исследуемых карбоксипептидаз в различных отделах мозга и периферических органах, что согласуется с данными, полученными другими исследователями [26].

Хроническое введение диазепама вызывало снижение активности КП М во всех исследуемых отделах мозга через сутки после воздействия. Наибольшие изменения активности фермента зафиксированы в четверохолмии и стриатуме. Через трое суток после введения диазепама активность фермента снижалась только в мозжечке и стриатуме по сравнению с контрольными животными.

В ответ на хроническое введение диазепама из клетки секретируются как пептиды, так и ферменты их обмена. Возможно, что снижение активности карбоксипептидазы М через сутки после хронического воздействия может быть связано с уменьшением количества активных молекул фермента в связи с преобладанием процессов их деградации над синтезом. Через трое суток снижение активности КП М наблюдалось только в отделах с высоким содержанием регуляторных пептидов. Можно предположить, что для восстановления пептидергической системы мозжечка и стриатума необходим более длительный промежуток времени.