Кинетика действия ферментов

Кинетические исследования ферментативных реакций для определения ферментов и сравнения их скоростей. Образование из фермента и субстрата фермент-субстратного комплекса за счет сил физической природы. Факультативные организмы, автотрофы и гетеротрофы.

Рубрика Биология и естествознание
Вид контрольная работа
Язык русский
Дата добавления 26.07.2009
Размер файла 858,4 K

Отправить свою хорошую работу в базу знаний просто. Используйте форму, расположенную ниже

Студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в своей учебе и работе, будут вам очень благодарны.

Кинетика действия ферментов

Кинетические исследования ферментативных реакций необходимы не только для количественного определения ферментов и сравнения скоростей их функционирования, но, в еще большей степени, для расшифровки механизмов ферментативных реакций. В этих целях, прежде всего, необходимо уметь корректно вычислять кинетические параметры ферментативных реакций, оценивать конкурентный или неконкурентный характер действия ингибиторов. Рассмотрим основные уравнения, описывающие ферментативную кинетику и способы вычислений. Основное внимание будет уделено не строгости математического вывода уравнений, а правильному их использованию для получения достоверных результатов.

При выводе кинетических уравнений количественно характеризующих ферментативную активность, обычно делают следующие допущения.

1. Фермент и субстрат образуют фермент-субстратный комплекс за счет сил физической природы. Из этого комплекса в дальнейшем освобождаются фермент и продукт. Таким образом, химической реакцией является только второй этап - распад фермент-субстратного комплекса:

2. Концентрация субстрата обычно значительно выше концентрации фермента. Поэтому при рассмотрении начальных скоростей реакции, когда

3. Константа диссоциации определяется соотношением:

концентрация продукта очень низка, обратимостью второй стадии можно пренебречь. Следовательно, - const., а скорость образования продукта равна:

Поскольку общая концентрация фермента равна сумме концентраций свободного фермента и фермента, связанного в комплекс, то + или = -.

Подставляя значение [Е] = [Е0] -- [ES] из (4), получаем:

С другой стороны, из уравнения следует:

В уравнении выражение к+2 можно рассматривать как максимальную скорость, достигаемую, когда концентрация фермент-субстратного комплекса численно равна общей концентрации фермента. Следовательно:

Выражение есть не что иное, как уравнение Михаэлиса-Ментен для ферментативной кинетики, а величина Кга = Ks представляет собой меру сродства фермента к субстрату. Численно она равна такой концентрации субстрата, при которой начальная скорость ферментативной реакции составляет половину максимальной скорости. Уравнение графически выражается гиперболой.

Для практического определения кинетических параметров этот график неудобен, к тому же требует использования концентраций субстрата, «насыщающих» фермент, что не всегда достижимо при ограниченной растворимости субстрата. Поэтому обычно стремятся преобразовать уравнение Михаэлиса-Ментен в такую форму, чтобы графически оно изображалось прямой линией. Чаще всего для этого используют метод Лайнуивера-Берка, представляя уравнение Михаэлиса-Ментен в виде уравнения прямой линии:

Последнее выражение называют уравнением Лайнуивера-Берка и для расчета кинетических параметров используют график, построенный в координатах: 1/V против 1/S. В результате получается прямая, отсекающая на оси ординат отрезок, равный 1/V, а на продолжении оси абсцисс отрезок, равный - 1/Кга. Однако следует отметить, что при использовании графика Лайнуивера-Берка точки в области высоких концентраций субстрата располагаются слишком густо, а положение прямой линии во многом зависит от точек в области низких концентраций субстрата, где определение скорости менее надежно. Кроме того, реальные экспериментальные данные не всегда адекватно аппроксимируются в виде прямой линии.

Поэтому предложено еще несколько приемов для определения кинетических параметров. Метод Эди-Хофсти также основан на преобразовании уравнения Михаэлиса-Ментен. Умножив обе части уравнения на и преобразовав, получим:

График этого уравнения в координатах V против V/S представляет собой прямую линию, отсекающую на осях ординат и абсцисс отрезки, равные VmaxH Vm>x/ Кго соответственно.

В некоторых случаях для вычисления кинетических параметров удобнее использовать метод Эйзенталя и Корниш-Боуден, основанный на преобразованном уравнении Михаэлиса-Ментен:

В этом случае для каждого значения V и S строится прямая в координатах V и S. Точка пересечения всех этих прямых имеет координаты: Vmax и Кт.

Ингибирование ферментов

Изучение подавления активности ферментов служит одним из способов расшифровки механизма их действия. Подходом к решению последней задачи является изучение специфичности действия ферментов. В свою очередь, это требует корректного измерения кинетических параметров в присутствии изучаемого аналога субстрата. Рассмотрим способы определения характера взаимоотношений субстратов, их аналогов и ингибиторов ферментативной активности путем вычисления ряда кинетических параметров.

При этом, если константа диссоциации комплекса Ks = Km равна:

Ингибиторы ферментов можно разделить на две основные группы: обратимые и необратимые. После удаления ингибитора первого типа активность фермента восстанавливается; во втором случае ингибитор удалить не удается или активность фермента не восстанавливается даже после удаления ингибитора. Необратимое ингибирование достигает максимума, когда весь фермент связан с ингибитором. Обратимое ингибирование достигает состояния равновесия, положение которого определяется константой ингибирования, характеризующей сродство фермента к ингибитору. Схема обратимого ингибирования приведена ниже:

При конкурентном ингибировании субстрат и ингибитор связываются с одним и тем же активным центром фермента. В присутствии ингибитора снижается сродство фермента к субстрату. Величина не изменяется, так как при «насыщающей» концентрации субстрат вытесняет ингибитор из комплекса с ферментом.

При неконкурентном ингибировании субстрат и ингибитор связываются с разными центрами фермента. При этом величина Кга не изменяется, а величина Vmax снижается.

Возможны также промежуточные или альтернативные случаи, например, когда ингибитор связывается не с ферментом, а с фермент-субстратным комплексом, как в случае бесконкурентного ингибирования, при котором изменяются оба кинетических параметра.

Для определения типа ингибирования обычно используют график Лайнуивера-Берка, полученный для данного субстрата в отсутствие и в присутствии ингибитора.

При конкурентном ингибировании, если определена величина Кт в присутствии ингибитора, можно рассчитать константу ингибирования по следующей формуле:

При неконкурентном ингибировании с помощью определения измененной величины V можно рассчитать К. по следующей формуле:

Все биохимические процессы в клетке взаимосвязаны и взаимозависимы, тем не менее часть из них преимущественно выполняет функцию построения клеточного материала, а часть - снабжения источниками энергии этих «строительных работ». Поэтому принято разделять биохимические процессы на два основных типа: ассимиляционные, называемые анаболизмом, включающим синтез низкомолекулярных предшественников и построения из них молекул биополимеров, и диссимиляционные, называемые катаболизмом, состоящим в обеспечение источника энергии, «энергетического привода», приводящего в движение анаболизм.

Рассмотрим основные механизмы процессов трансформации энергии в клетке, т.е. механизмы катаболических процессов.

Пути и механизмы преобразования энергии в живых системах

Главная задача энергетического метаболизма - аккумуляция энергии, полученной в результате окислительно-восстановительных превращений субстратов в такую форму, которая может быть использована для роста клеток и осуществления всех их функций.

Основными формами аккумуляции энергии в клетках являются трансмембранная разность электрохимических потенциалов ионов, а также «макроэргические» химические соединения.

В клетках, как и в неживых системах, самопроизвольно протекают только те химические процессы, которые приводят к уменьшению свободной энергии системы, т.е. той доли общей энергии, которая может быть превращена в работу. Такие реакции называют экзэргоническими. Напротив, если ДОО, то реакция не может протекать самопроизвольно, так как требует притока энергии.

Уравнение Гиббса описывает взаимосвязь между свободной энергией, энтальпией и энтропией.

Кратко рассмотрим основные уравнения химической термодинамики.

где ДН - изменение энтальпии; AS - изменение энтропии.

При реакциях в растворах изменение свободной энергии определяется уравнением:

где R - газовая постоянная; Т - абсолютная температура;

- константа равновесия химической реакции.

При стандартных условиях каждая химическая реакция характеризуется свободной энергией, вычисляемой по формуле:

AG° = -2,303 RT lgK или AG = -1,363 lgKeq ккал/моль-1 при 25C.

При окислительно-восстановительных реакциях изменение свободной энергии определяется уравнением:

где п - количество перенесенных электронов:

F - число Фарадея: заряд одного моля электронов; Е «' - стандартный окислительно-восстановительный потенциал для окислителя и восстановителя, В.

Эти уравнения удобно применять при расчетах. Например, можно подсчитать, сколько энергии выделяется в результате дыхания;

Таким образом, AG = 2 * 23062 кал * моль-1 - В-[0,815 - (-0,32)] В = 52351 кал/моль.

Классификация энергетических процессов

Энергетические процессы в нефототрофных организмах подразделяются на аэробные и анаэробные в зависимости от участия или не участия в них молекулярного кислорода.

Аэробное дыхание - энергетический процесс, при котором конечным акцептором электронов окисляемого субстрата, передающихся по электрон-транспортной цепи, является молекулярный кислород.

В анаэробном дыхании конечными акцепторами электронов становятся другие окислители: нитрат-, сульфат-анионы, катионы металлов, органические вещества.

Брожение - энергетический процесс, при котором электроны передаются непосредственно от донора к акцептору без участия электрон-транспортной цепи: гликолиз, молочнокислое брожение и др.

Перечисленные процессы можно классифицировать на основе механизма образования АТР, являющегося основным макроэр-гическим соединением, запасающим энергию в своих химических связях. Различают образование АТР в результате переноса электронов по дыхательной цепи - окислительное фосфорилирование, а также образование АТР в процессах, не связанных с переносом электронов по цепи - субстратное фосфорилирование. В настоящее время первый тип процессов правильнее называть образованием АТР за счет трансформации энергии трансмембранного электрохимического потенциала или сокращенно - мембранным фос-форилированием.

У фототрофных организмов основным способом запасания энергии является фо-тофосфорилирование, т.е. образование АТР за счет трансформации энергии ТЭП, формируемого путем утилизации световой энергии.

Роль АТР и ТЭП в запасании энергии

АТР был открыт в 1929 г. К. Фиске и И. Суббароу, а в 1930 г. В. Энгельгард показал возможность его образования в процессе переноса электронов по дыхательной цепи. В 1941 г. Ф. Липман выдвинул концепцию, рассматривающую АТР как «конвертируемую энергетическую валюту».

Почему в процессе эволюции именно АТР выпала такая роль? Для этого есть несколько причин, обусловленных свойствами данного соединения.

Если необходима энергия ненамного большая, чем 10 ккал/моль -- по реакции Б. При необходимости энергии, зна-чительно превышающей 10 ккал/моль, используется несколько молекул АТР в одном процессе. Иногда дополнительная энергия выделяется при сорбции АТР на ферменте.

1. Изменение свободной энергии при гидролизе фосфоангидридных связей довольно велико - около 10 ккал / моль. Когда необходима энергия меньшая или равная 10 ккал / моль, гидролиз идет по

Скорость неферментативного гидролиза АТР мала, т.е. молекула химически стабильна, и запасенная в ней энергия не рассеивается в виде тепла при спонтанном гидролизе. Однако замена Р на As резко повышает лабильность. Этим обстоятельством объясняется ингибиторное действие арсената на энергетический метаболизм: конкурируя с ортофосфатом, он включается вместо него в АТР, а образовавшееся соединение подвергается спонтанному гидролизу.

Малые размеры молекулы АТР позволяют ей свободно проникать в различные участки клетки, в то же время цитоплазматическая мембрана для нее непроницаема, следовательно, «утечка» АТР не происходит.

«Выбор» АТР как нуклеотида был вызван, по-видимому, необходимостью взаимодействия с белками, так как взаимодействие белков с моно- и полинуклеотидами лежит в основе жизнедеятельности.

«Выбор» в качестве пуриновой части молекулы аденозина, вероятно, обусловлен его промежуточными электроннодонорными и акцепторными свойствами, что обеспечивает взаимодействие с широким кругом партнеров. Кроме того, среди азотистых оснований аденин наиболее устойчив к действию ультрафиолета, что могло иметь значение на ранних этапах формирования живых систем.

При описании механизма образования АТР путем мембранного фосфорилирования в настоящее время общепринятой является хемиосмотическая теория сопряжения окисления и фосфорилирования, предложенная П. Митчеллом в 1961 г. Согласно этой теории в «сопрягающих» мембранах локализованы два типа систем, способных к транслокации протонов: электрон-транспортная цепь и Н+-АТРаза, координированная работа которых приводит к формированию трансмембранной разности электрохимического потенциала протонов, - а затем АТР. Таким образом, первичной формой запасания энергии при дыхании является ТЭП.

Количество энергии, запасенной в форме ТЭП, прямо пропорционально количеству транслоцированных протонов: AG - пДцн+ и складывается из двух составляющих: химической и электрической:

где 2,3RT/ F = Z = 59 мВ при 25°С;

Др - протондвижущая сила.

Для образования АТР необходима AG около 250 мВ. Примерно такая величина ТЭП и создается на мембранах митохондрий и прокариотических клеток, хотя вклад каждой из составляющих различен. Например, у ацидофильных бактерий ТЭП практически полностью состоит из ЛрН, а у алкалофилов - из Л<р.

Важно отметить, что АТРазный комплекс может не только утилизировать ТЭП с образованием АТР, но и формировать его за счет гидролиза АТР, осуществляя таким образом взаимное превращение этих двух форм энергии.

Первичные и вторичные генераторы ТЭП

Первичные генераторы используют энергию света или химических связей субстратов для формирования ТЭП. АТР в этих процессах не участвует. К первичным генераторам ТЭП относятся:

дыхательная цепь, содержащая от 1 до 3 протонных насосов;

фотосинтетическая цепь, содержащая 1-2 протонных насоса;

бактериродопсин галофильных архебактерий;

системы экскреции кислых продуктов брожения у бактерий в неионизированной форме.

Вторичные генераторы используют энергию АТР для формирования ТЭП. Они представляют собой Н+-АТФазы, основной функцией которых является не синтез, а гидролиз АТР. Такие АТРазы характерны для цитоплазматической мембраны анаэробных бактерий, плаз-малеммы клеток эукариот, мембраны вакуолей растений и грибов.

Таким образом, основные пути трансформации энергии в клетке можно суммировать в виде схемы.

Энергетический заряд и энергетическая эффективность роста

Количество АТР, образующегося в разных метаболических путях, различается во много раз. Так, при катаболизме глюкозы по гликолитическому пути с последующим включением цикла трикарбоновых кислот и дыхания образуется 38 моль АТР на моль глюкозы.

У некоторых бактерий в дыхательной цепи существует лишь два пункта сопряжения и количество образованного АТР составит 26 моль на моль глюкозы. Сам по себе гликолиз в анаэробных условиях приводит к образованию лишь 2 молей АТР на моль глюкозы.

Не только общее количество синтезированного АТР, но и расход АТР на образование единицы биомассы сильно зависит от типа метаболизма. Так, например, при выращивании бактерий на среде с глюкозой 1 моль АТР обеспечивает образование 27 г. биомассы, тогда как на среде с С02 1 моль АТР - только 5 г биомассы. При различных типах анаэробных брожений выход биомассы на моль синтезированного АТР все же достаточно постоянен и составляет около 10. Этот показатель получил обозначение YATp и используется для характеристики роста наряду с экономическим коэффициентом.

Определенная часть клеточной энергии затрачивается на процессы, не связанные непосредственно с ростом. Их называют процессами поддержания жизнедеятельности. Затраты на поддержание жизнедеятельности составляют 10-20% всех энергетических расходов.

Важное значение имеет не только абсолютное количество АТР в клетке, но и соотношение компонентов аденилатной системы, так как АТР, ADP и AMP являются мощными регуляторами метаболических процессов.

Д. Аткинсон ввел понятие энергетического заряда, как меры «заполнения» аденилатной системы макроэргами.

Теоретически ЭЗ может варьировать от 0 до 1, однако реально в экспоненциально растущих клетках он составляет 0,8-0,9, а при снижении его величины до 0,5 клетка погибает.

Основные типы сопряжения энергетических и конструктивных процессов

Первоначально биологи подразделяли все живые организмы по типу питания на две группы: автотрофов и гетеротрофов.

В настоящее время применяется более детальная классификация, основанная на указании природы источника энергии и природы источника углерода.

Таким образом, растения следует отнести к фото-лито-автотрофам, а животных - к хемооргана - гетеротрофам. Всего же при сочетании этих характеристик возможны восемь основных типов соотношений между энергетическими и конструктивными процессами.

Некоторые организмы способны осуществлять только одни из перечисленных типов питания, тогда как другие могут переключаться с одного типа питания на другой. Последние организмы называют факультативными.

Таблица 1. Основные типы питания

Источник энергии

Донор электронов

Источник углерода

Тип питания

Организмы-представители

Неорганические вещества

С02

Хемолитоавтотрофия

Прокариоты

Химические

Органич. вещества

Хемолитогетеротрофия

Прокариоты

реакции

Органические вещества

С02

Хеморганоавто-трофия

Прокариоты

Органич. вещества

Хемоорганоге-теротрофия

Животные и многие прокариоты

Источник энергии

Донор электронов

Источник углерода

Тип питания

Организмы-представители

Неорганические вещества

со2

Фотолитоавтотрофия

Растения, цианобакте-рии, пурпурные и зеленые бактерии

Свет

Органич. вещества

Фотолитогетеротрофия

Прокариоты

Органические вещества

со2

Фотоорганоавтотрофия

Прокариоты

Органич. вещества

Фотоорганогетеротрофия

Прокариоты


Подобные документы

  • Классификация ферментов, их функции. Соглашения о наименовании ферментов, структура и механизм их действия. Описание кинетики односубстратных ферментативных реакций. Модели "ключ-замок", индуцированного соответствия. Модификации, кофакторы ферментов.

    презентация [294,1 K], добавлен 17.10.2012

  • Общая характеристика и основные типы ферментов. Химические свойства ферментов и катализируемых ими реакций. Селективность и эффективность ферментов. Зависимость от температуры и от среды раствора. Активный центр фермента. Скорость ферментативных реакций.

    презентация [1,8 M], добавлен 06.10.2014

  • Изучение ферментов, их свойств и механизма биологического действия. Проведение исследования современных представлений о механизме ферментативного трансаминирования. Разработка общей теории пиридоксалевого катализа. Строение фермент-субстратного комплекса.

    реферат [189,0 K], добавлен 14.03.2015

  • Природа константы К в уравнении. Преобразование уравнения Михаэлиса-Ментен. Влияние концентрации субстрата на кинетику реакции, образование устойчивого комплекса. Факторы, от которых зависит скорость ферментативной реакции, устройства для их определения.

    курсовая работа [278,9 K], добавлен 23.02.2012

  • Характеристика ферментов, органических катализаторов белковой природы, которые ускоряют реакции, необходимые для функционирования живых организмов. Условия действия, получение и применение ферментов. Болезни, связанные с нарушением выработки ферментов.

    презентация [2,6 M], добавлен 19.10.2013

  • Уникальные свойства ферментов как биокатализаторов, их высокая каталитическая активность и избирательность действия. Определение наличия и активности фермента в препарате. Факторы, влияющие на биосинтез ферментов, интенсификация процесса роста и синтеза.

    реферат [19,5 K], добавлен 19.04.2010

  • Ускорение химических реакций с помощью катализаторов. Особенности ферментов (энзимов) как высокоспецифичных белков, выполняющих функции биологических катализаторов. Строение ферментов, их специфичность и классификация. Этапы ферментативного катализа.

    презентация [3,4 M], добавлен 20.11.2014

  • Химический состав, природа и структура белков. Механизм действия ферментов, виды их активирования и ингибирования. Современная классификация и номенклатура ферментов и витаминов. Механизм биологического окисления, главная цепь дыхательных ферментов.

    шпаргалка [893,3 K], добавлен 20.06.2013

  • Понятие ферментов как глобулярных белков, которые состоят из одной или нескольких полипептидных цепей. Особенности строения простых и сложных ферментов. Субстратный, аллостерический и каталитический центры в строении простых и сложных ферментов.

    презентация [76,4 K], добавлен 07.02.2017

  • Определение ферментов как специфических белков, присутствующих во всех живых клетках биологических катализаторов. Пространственность структурной молекулы ферментов, процесс биосинтеза оксидоредуктазы, трансферазы, гидролазы, лиазы, изомеразы и лигазы.

    контрольная работа [13,5 K], добавлен 27.01.2011

Работы в архивах красиво оформлены согласно требованиям ВУЗов и содержат рисунки, диаграммы, формулы и т.д.
PPT, PPTX и PDF-файлы представлены только в архивах.
Рекомендуем скачать работу.