Кинетика ферментативных реакций

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

КУРСОВАЯ РАБОТА

Кинетика ферментативных реакций

Введение

Основу жизнедеятельности любого организма составляют химические процессы. Практически все реакции в живом организме протекают с участием природных биокатализаторов - ферментов.

Берцелиус в 1835 г. впервые предположил, что реакции живого организма осуществляются благодаря новой силе, которую он назвал «каталитической». Эту идею он обосновал главным образом экспериментальным наблюдением: диастаза из картофеля гидролизует крахмал быстрее, чем серная кислота. Уже в 1878 г. Куне назвал вещество, обладающее каталитической силой в живом организме, ферментом.

Кинетика действия ферментов - это раздел ферментологии, изучающий зависимость скорости реакции, катализируемой ферментами, от химической природы и условий взаимодействия субстрата с ферментом, а также от факторов среды. Иначе говоря, кинетика ферментов позволяет понять природу молекулярных механизмов действия факторов, влияющих на скорость ферментативного катализа. Этот раздел образовался на стыке таких наук, как биохимия, физика и математика. Самая ранняя попытка математически описать ферментативные реакции была предпринята Дюкло в 1898 г.

На самом деле этот раздел по изучению ферментов очень важен в наше время, а именно для практической медицины. Он даёт фармакологам инструмент направленного изменения метаболизма клетки, огромное количество фармацевтических препаратов и различные яды - это ингибиторы ферментов.

Целью данной работы является рассмотрение вопроса о зависимости скорости реакции от различных факторов, каким образом можно контролировать скорость реакций и как её можно определить.

1. Кинетика Михаэлиса - Ментен

Предварительные эксперименты по изучению кинетики ферментативных реакций показали, что скорость реакции , вопреки теоретическим ожиданиям, не зависит от концентрации фермента (Е) и субстрата (S) таким образом, как в случае обычной реакции второго порядка.

Браун и независимо от него Анри впервые выдвинули гипотезу об образовании в ходе реакции фермент-субстратного комплекса. Затем это предположение подтвердили три экспериментальных факта:

а) папаин образовывал нерастворимое соединение с фибрином (Вюртц, 1880);

б) субстрат инвертазы сахароза могла защищать фермент от тепловой денатурации (О'Салливан и Томпсон, 1890);

в) было показано, что ферменты являются стереохимически специфическими катализаторами (Фишер, 1898-1899).

В 1913 г. Михаэлис и Ментен опубликовали свою теорию общего механизма ферментативных реакций:

Они ввели понятие максимальной скорости и показали, что кривая насыщения (т.е. зависимость скорости реакции от концентрации субстрата) является равнобочной гиперболой. Они доказали, что максимально наблюдаемая скорость есть одна из асимптот к кривой, а отрезок, отсекаемый на оси абсцисс (в области ее отрицательных значений) второй асимптотой, т.е. константа в уравнении скорости, равен по абсолютному значению концентрации субстрата, необходимой для достижения половины максимальной скорости. [2]

Михаэлис и Ментен предположили, что скорость реакции определяется распадом комплекса ES, т.е. константой k₂. Это возможно только при условии, что k₂ - наименьшая из констант скорости. В этом случае равновесие между фермент-субстратным комплексом, свободным ферментом и субстратом устанавливается быстро по сравнению со скоростью реакции (быстро устанавливающееся равновесие).

Начальную скорость реакции можно выразить следующей формулой:

v = k₂ [ES]

Поскольку константа диссоциации фермент-субстратного комплекса равна

K_S = [E] [S] / [ES] = k _-1/k₁

то концентрацию свободного фермента можно выразить как

[E] =K_S [ES] / [S]

Общая концентрация фермента в реакционной смеси определяется формулой

[Е]_т = [Е] + [ЕS] = K_S [ЕS] / [S] + [ЕS]

Реакция достигает максимальной скорости, когда концентрация субстрата достаточно высока, чтобы все молекулы фермента находились в виде комплекса ЕS (бесконечно большой избыток субстрата). Отношение начальной скорости к теоретически возможной максимальной скорости равно отношению [ЕS] к [Е]_т:

v / V_max= [ES] / [E]_т= [ES] / (K_S [ES] / [S] + [ES]) = 1 / (K_S+[S] +1)

Это классическое уравнение Михаэлиса и Ментен, которое со времени его публикации в 1913 г. стало фундаментальным принципом всех кинетических исследований ферментов в течение десятилетий и с некоторыми ограничениями осталось таким до сих пор. [5]

Позднее было показано, что оригинальное уравнение Михаэлиса - Ментен предполагало наличие нескольких ограничений. Оно справедливо, т.е. правильно описывает кинетику реакции, катализируемой данным ферментом, только при условии выполнения всех следующих ограничительных условий:

1) образуется кинетически устойчивый фермент-субстратный комплекс;

2) константа K_S является константой диссоциации фермент-субстратного комплекса: это справедливо, только если ;

3) концентрация субстрата не меняется в ходе реакции, т.е. концентрация свободного субстрата равна его начальной концентрации;

4) продукт реакции быстро отщепляется от фермента, т.е. не образуется кинетически значимого количества ЕS комплекса;

5) вторая стадия реакции необратима; точнее говоря, мы принимаем во внимание только начальную скорость, когда обратной реакцией (из-за фактического отсутствия продукта) еще можно пренебречь;

6) с каждым активным центром фермента связывается только одна молекула субстрата;

7) для всех реагирующих веществ вместо активностей можно использовать их концентрации. [2]

Уравнение Михаэлиса - Ментен служит отправной точкой при любом количественном описании действия ферментов. Следует подчеркнуть, что кинетическое поведение большинства ферментов значительно сложнее, чем это вытекает из идеализированной схемы, лежащей в основе уравнения Михаэлиса - Ментен. При выводе этого уравнения предполагается, что существует только один фермент-субстратный комплекс. Между тем в действительности в большинстве ферментативных реакций образуется, по меньшей мере, два или три таких комплекса, возникающих в определенной последовательности.

Здесь через EZ обозначен комплекс, соответствующий истинному переходному состоянию, а через ЕР - комплекс между ферментом и продуктом реакции. Можно указать также, что в большинстве ферментативных реакций участвует более одного субстрата и образуется соответственно два или большее число продуктов. В реакции с двумя субстратами, S₁ и S₂, может образоваться три фермент-субстратных комплекса, а именно ES₁, ES₂ и ES₁S₂. Если в результате реакции получается два продукта, P₁ и P₂, то может существовать, по меньшей мере, еще три дополнительных комплекса EP₁, EP₂ и EP₁P₂. В таких реакциях имеется много промежуточных стадий, каждая из которых характеризуется своей константой скорости. Кинетический анализ ферментативных реакций, в которых принимают участие два реагирующих вещества или более, часто оказывается исключительно сложным и требует использования электронных вычислительных машин. Тем не менее, при анализе кинетики всех ферментативных реакций отправной точкой всегда является рассмотренное выше уравнение Михаэлиса - Ментен. [5]

1.1 Природа константы K в уравнении

уравнение ферментативный реакция кинетика

Второй постулат формулирует, что константа K_S в уравнении является константой диссоциации фермент-субстратного комплекса.

Бриггс и Холдейн в 1925 г. доказали, что исходное уравнение Михаэлиса - Ментен справедливо только при , т.е. когда равновесие элементарной стадии E+S ES устанавливается очень быстро по сравнению со скоростью следующей стадии. Поэтому такие кинетические механизмы (подчиняющиеся начальному условию Михаэлиса - Ментен и имеющие одну медленную элементарную стадию, относительно которой равновесия во всех других элементарных стадиях устанавливаются быстро) называются удовлетворяющими предположению о «быстром равновесии». Если, однако, k₂ по порядку величины сравнима с k_-1, изменение концентрации фермент-субстратного комплекса во времени можно выразить следующим дифференциальным уравнением:

d [ES] / dt = k₁ [E] [S] - k_-1 [ES] - k₂ [ES]

Так как мы рассматриваем начальную скорость реакции, т.е. момент, когда обратная реакция еще не происходит, а предстационарная стадия уже прошла, то вследствие избытка субстрата количество образовавшегося фермент-субстратного комплекса равно количеству распавшегося (принцип стационарности, или кинетика Бриггса и Холдейна, или принцип Боденштейна в химической кинетике) и справедливо, что

d [ES] / dt = 0

Подставив это в дифференциальное уравнение, получим выражение для концентрации свободного фермента:

[E] = (k_-1 + k₂) [ES] / k₁ [S]

[E]_T = [E] + [ES] = [(k_-1 + k₂) / k_-1 [S] + 1] [ES] =

= (k_-1 + k₂ + k_-1[S]) / k₁ [S] [ES]

Уравнение стационарного состояния:

[ES] = k₁ [S] [E]_T / (k_-1 + k₂ + k₁[S])

Т.к. v = k₂ [ES], то получим, что

v = k₁ k₂ [S] [E]_T / (k_-1 + k₂ + k₁[S]) = k₂ [S] [E]_T / [(k_-1 + k₂) / k₁ + [S]]

В этом случае

V_max = k₂ [E]_T

и равняется максимальной скорости, полученной по уравнению Михаэлиса - Ментен. Тем не менее, константа в знаменателе уравнения Михаэлиса - Ментен - не K_S, т.е. не константа диссоциации фермент-субстратного комплекса, а так называемая константа Михаэлиса:

K_m = (k_-1 + k₂) / k₁

K_m равно K_S только, если .

В случае константа в знаменателе уравнения скорости выражается формулой

K_k = k₂ / k₁

и называется, согласно Ван Слайку, кинетической константой. [6]

Уравнение стационарного состояния можно также получить из дифференциального уравнения без предположения, что d [ES] / dt = 0. Если подставим значение [E] = [E]_T - [ES] в дифференциальное уравнение, после преобразований получим

[ES] = (k₁ [S] [E]_T - d [ES] / dt) / (k₁ [S] + k_-1 + k₂)

Для того чтобы из этого уравнения получить уравнение стационарного состояния, не обязательно должно быть d [ES] / dt = 0. Достаточно, чтобы выполнялось неравенство d [ES] / dt << k₁ [S] [E]_T. Этим объясняется, почему можно достичь хорошего приближения в течение длительного времени при использовании принципа стационарности.

Дифференцированное уравнение стационарного состояния выглядит следующим образом:

d [ES] / dt = [k₁ (k_-1 + k₂) [E]_T / (k₁ [S] + k_-1 + k₂)²] (d [S] / dt)

Это выражение, очевидно, не равно 0.

Природа компонентов реакции не определяет целиком смысла константы K в уравнении. Величина K_m не имеет строго фиксированного значения. Она может меняться в зависимости от структуры субстрата, от рН и от температуры. При изменении условий реакции значение K также может измениться. Так, например, в случае пероксидазы при высокой концентрации донора протонов эта константа является кинетической константой K_k. При уменьшении концентрации донора протонов константа превращается в константу Михаэлиса K_m, а при очень низких уровнях донора протонов получаем константу диссоциации K_S. [2]

1.2 Преобразование уравнения Михаэлиса - Ментен

Исходное уравнение Михаэлиса - Ментен является уравнением гиперболы, где одна из констант (V_max) - асимптота к кривой. Другая константа (K_m), отрицательное значение которой определяется второй асимптотой, равна концентрации субстрата, необходимой для достижения V_max / 2. В этом легко убедиться, так как если

v=V_max / 2, то

V_max / 2 = V_max [S] / (K_m + [S])

V_max / V_max = 1 = 2 [S] / (K_m + [S])

K_m + [S] = 2 [S], т.е. [S] = K_m при v = V_max/2.

Уравнение Михаэлиса - Ментен можно алгебраически преобразовать в другие формы, более удобные для графического представления экспериментальных данных. Одно из наиболее распространенных преобразований сводится просто к тому, что приравнивают друг другу величины, обратные левой и правой части уравнения

т.е.

В результате преобразования получаем выражение

которое носит название уравнения Лайнуивера-Бэрка. Согласно этому уравнению, график, построенный в координатах 1/[S] и 1/v, представляет собой прямую, тангенс угла наклона которой равен K_m/V_max, а отрезок, отсекаемый на оси ординат, равен 1/V_max. Такой график, построенный по методу двойных обратных величин, имеет то преимущество, что он даёт возможность более точно определить V_max; на кривой, построенной в координатах [S] и v, V_max является асимптотической величиной и определяется значительно менее точно. Отрезок, отсекаемый на оси абсцисс, на графике Лайнуивера-Бэрка равен -1/K_m. Из этого графика можно также извлечь ценную информацию, касающуюся ингибирование фермента. [3]

Другое преобразование уравнения Михаэлиса-Ментен состоит в том, что обе части уравнения Лайнуивера-Бэрка умножают на V_max*v и после некоторых дополнительных преобразований получают

Соответствующий график в координатах v и v/[S] представляет се 4, рис. 1]. Такой график (график Эди-Хофсти) не только даёт возможность очень просто определить величины V_max и K_m, но и позволяет выявить возможные отклонения от линейности, не обнаруживаемые на графике Лайнуивера-Бэрка.

Уравнение также можно линеаризовать в другой форме

[S] / v = K_m / V_max + [S] / V_max

В этом случае следует строить зависимость [S] / v от [S]. Наклон полученной прямой равен 1 / V_max; отрезки, отсекаемые на осях ординат и абсцисс, равны (K_m / V_max) и (- K_m) соответственно. По имени автора этот график называют графиком Хейнса. [1]

Статистический анализ показал, что методы Эди - Хофсти и Хейнса дают более точные результаты, чем метод Лайнуивера - Берка. Причиной этого является то, что в графиках Эди - Хофсти и Хейнса и зависимые, и независимые переменные входят в величины, откладываемые на обеих осях координат.

1.3 Влияние концентрации субстрата на кинетику реакции

Во многих случаях условие постоянства концентрации субстрата не выполняется. С одной стороны, избыток субстрата не используется в реакции in vitro с некоторыми ферментами из-за часто происходящего ингибирования ферментативной активности субстрата. В этом случае можно применять только оптимальную его концентрацию, и это не всегда обеспечивает избыток субстрата, необходимый для выполнения кинетических уравнений обсуждаемых выше механизмов. Более того, в клетке in vivo избыток субстрата, необходимый для осуществления этого условия, обычно не достигается.

В ферментативных реакциях, где субстрат не находится в избытке и, следовательно, его концентрация меняется в ходе реакции, константа диссоциации фермент-субстратного комплекса равна

K_S = ([S] ₀ - [ES] - [P]) [E]_T - [ES])/[ES]

([S]₀ - концентрация субстрата при t = 0). В этом случае начальная скорость реакции (в стационарном состоянии) определяется формулой

v= V_max [S_t] / (K_m + [S_t])

где [S_t] - концентрация субстрата в момент времени.

Тем не менее, можно написать приблизительное решение для двух случаев, когда [S]_о = [S_t]:

1) если это неравенство выполняется из-за больших значений t, т.е. когда более 5% от начальной концентрации субстрата израсходовалось за время реакции;

2) если концентрацией фермента нельзя пренебречь по сравнению с концентрацией субстрата и, таким образом, нужно принимать во внимание концентрацию фермент-субстратного комплекса.

Если t велико, а концентрация [ES] пренебрежимо мала по сравнению с [S]₀, то уравнение константы диссоциации фермент-субстратного комплекса переходит в следующее:

K_S = ([S]₀ - [P]) ([E]_T - [ES]) / [ES]

Для значения концентрации [S_t], которая меняется в ходе реакции, удовлетворительным приближением служит значение ([S]₀ + [S_t])/2. Так как [S_t] = [S]₀ - [Р], среднюю скорость; можно выразить как

Подставив это выражение и приблизительное значение [S_t] в

v= V_max [S_t] / (K_m + [S_t]),

получим:

При сравнении значений, рассчитанных на основе этого приближения, со значениями, полученными из точного, проинтегрированного уравнения Михаэлиса - Ментен, оказывается, что ошибка в определении K_m составляет 1 и 4% при расходовании 30 и 50% субстрата соответственно. Следовательно, ошибка при данном приближении незначительна по сравнению с ошибкой измерения.

Когда расход субстрата не превышает 5% начальной концентрации, но концентрация фермента так велика, что [ES] по сравнению с [S]₀ нельзя не учитывать, константа диссоциации фермент-субстратного комплекса равна:

K_s = ([S]₀ - [ES]) ([E]_T - [ES]) / [ES]

Его решение относительно [ES] дает



Из двух возможных решений может быть выбрано только отрицательное, так как только оно удовлетворяет начальным условиям: [ES] = 0 при [S]₀ = 0 или [Е]_T = 0. По аналогии с уравнением отношения v/V_max мы получили уравнение начальной скорости. Квадратное уравнение, полученное из уравнения константы диссоциации фермент-субстратного комплекса, найденную чуть выше, с помощью формул v = k₂ [ES] и V_max = k₂ [E]_T, можно привести к следующему виду:

[S]₀ V_max / v = K_s V_max / (V_max - v) + [E]_T

Если известно V_max можно рассчитать K_s.

Следует учесть два предельных случая. В первом случае [S]<<K_m.

v = (V_max / K_m) [S] = k[S]

Таким образом, мы получили кажущуюся реакцию первого порядка и k=V_max/K_m - кажущуюся кинетическую константу первого порядка. Ее фактическая размерность - время ^-1, но она является комбинацией констант скорости первого и второго порядков нескольких элементарных стадий, т.е. k₁k₂[E]_T/(k_-1 + k₂). При условиях кажущегося первого порядка k является мерой прохождения реакции.

Другой предельный случай: [S] >> K_m. Здесь константа K_m ничтожно мала по сравнению с [S], и, таким образом, получаем v = V_max. [2]

1.4 Образование кинетически устойчивого комплекса фермент - продукт

Если в ходе реакции происходит образование кинетически устойчивого комплекса фермент - продукт, механизм реакции выглядит следующим образом:

Применив предположение о стационарном состоянии, можно написать дифференциальные уравнения:

d [ES] /dt = k₁ [E] [S] + k_-2 [EP] - (k_-1 + k₂) [ES] = 0

d [EP] /dt = k₂ [ES] - (k_-2 + k₃) [EP] = 0

Из этих уравнений следует, что

[ES] = [(k_-2 + k₃) / k₂] [EP]

[E] = [(k_-1 k_-2 + k_-1 k_-3 + k₂k₃) / k₁k₂ [S]] [EP]

Так как v = k₃ [EP]

и [E]_T = [E] + [ES] + [EP] =

= [(k_-1 k_-2 + k_-1 k_-3 + k₂k₃) / k₁k₂ [S] + (k_-2 + k₃) / k₂ + 1] [EP] =

= {[k_-1 k_-2 + k_-1 k_-3 + k₂k₃ + k₁ [S] (k_-2 + k₃) + k₁k₂ [S]] / k₁k₂ [S]} [EP]

получаем

[EP] = k₁k₂[S] [E]_T / [k_-1 k_-2 + k_-1 k_-3 + k₂k₃ + k₁ [S] (k_-2 + k₃ + k₂)]

v = k₁k₂k₃[S] [E]_T / [k_-1 k_-2 + k_-1 k_-3 + k₂k₃ + k₁ [S] (k_-2 + k₃ + k₂)] =

= [k₂k₃ / (k_-2 + k₃ + k₂)] [E]_T[S] / [(k_-1 k_-2 + k_-1 k_-3 + k₂k₃) / k₁ (k_-2 + k₃ + k₂) + [S]]

То есть

V_max = [k₂k₃ / (k_-2 + k₃ + k₂)] [E]_T

K_m = (k_-1 k_-2 + k_-1 k_-3 + k₂k₃) / k₁ (k_-2 + k₃ + k₂)

В этом случае уже очень сложно вычислить конкретные значения индивидуальных констант скорости, так как прямо измерить можно только их отношение. Ситуация еще более затрудняется при усложнении механизма ферментативной реакции, когда в реакции участвуют больше двух комплексов, потому что количество констант скорости в уравнении, естественно, гораздо больше, и их соотношения также сложнее. [2]

Однако ситуация упрощается, если после обратимой реакции образования первого комплекса последующие элементарные стадии необратимы. Важными представителями ферментов, подчиняющихся этому механизму, являются протеолитические ферменты и эстеразы. Механизм их реакции можно записать следующим образом:

где ES` - ацилферментное промежуточное соединение, которое разлагается под действием воды. Мы можем написать

d [P₂] /dt = d [P₁] / dt = v = k₁k₂k₃ [S] [E]₀ / [k₃(k_-1 + k₂) + [S] (k₂ + k₃)]

V_max = k₂k₃ [E]₀ / (k₂ + k₃) = k_кат [E]₀

K_m = k₃ (k_-1 + k₂) / (k₂ + k₃) k₁

k_кат / K_m = k₂k₁ / (k_-1 + k₂) = k₂ / K_m'

Константа Михаэлиса стадии ацилирования - K_m' K_s. Чем больше отношение k_кат/K_m, тем выше специфичность субстрата. [5]

Определение констант значительно упрощается, если эксперимент проводят в присутствии нуклеофильного агента (N), способного конкурировать с водой. Тогда

k₃ = k₃' [H₂O] и P_i (i = 1, 2, 3) - продукты.

v_i = k_{кат, i} [E₀] [S] / (K_m + [S])

k_{кат, 1} = k₂ (k₃ + k₄ [N]) / (k₂ + k₃ + k₄ [N])

k_{кат, 2} = k₂k₃ / (k₂ + k₃ + k₄ [N])

k_{кат, 3} = k₂k₄ [N] / (k₂ + k₃ + k₄ [N])

K_m = K_s (k₃ + k₄ [N]) / (k₂ + k₃ + k₄ [N])

1/v_N = K_s (k₃ + k₄ [N]) / k₂k₃ [S] [E₀] + (k₂ + k₃ + k₄ [N]) / k₂k₃ [E₀]

Так как известно, что K_s/k₂ = K_m/ k_кат, и если нуклеофил отсутствует, то

1/v = K_s / k₂ [S] [E₀] + (k₂ + k₃) / k₂k₃ [E₀]

и для определения констант можно использовать точку пересечения прямых в координатах 1/v_N (и 1/v) - 1/[S]. Две прямые линии в двойных обратных координатах пересекаются во втором квадранте. В отсутствии нуклеофила точка пересечения прямой с вертикальной осью определяется как 1/V_max и 1/k_кат[E₀], а с горизонтальной осью - как -1/K_m. Координаты точки пересечения двух прямых: -1/K_s и 1/k₃[E₀]. Расстояние между 1/V_max и 1/k₃[E₀] равно 1/k₂[E₀].

1.5 Анализ полной кинетической кривой реакции

Уравнение Михаэлиса - Ментен в исходном виде относится только к необратимым реакциям, т.е. к реакциям, где рассматривается только начальная скорость, а обратная реакция не проявляется из-за недостаточного количества продукта и не влияет на скорость реакции. В случае необратимой реакции полную кинетическую кривую можно легко анализировать (для произвольного интервала времени t), интегрируя исходное уравнение Михаэлиса - Ментен. В этом случае, следовательно, сохраняется предположение, что в ходе реакции образуется только один промежуточный фермент-субстратный комплекс. Так как для интервала времени t не ставится никаких ограничений, концентрация субстрата в момент анализа не может быть равной первоначально введенной его концентрации. Таким образом, также необходимо принимать во внимание изменение [S] в ходе реакции. Пусть S₀ - начальная концентрация субстрата, (S₀ - y) - концентрация в момент времени t. Тогда, на основе исходного уравнения Михаэлиса - Ментен (если y - количество превращенного субстрата), мы можем написать

dy / dt = V_max (S₀ - y) / (K_m +S₀ - y)

Взяв обратные величины и разделив переменные, интегрируем по y в пределах от 0 до y (V_max обозначена как V):

(2,303 / t) lg [S₀ / (S₀ - y)] = V / K_m - (1 / K_m) (y / t)

Таким образом, построив график зависимости левой части уравнения от y/t (координаты Фостера-Ниманна), получим прямую линию с наклоном (-1/K_m), отсекающую на оси ординат отрезок (V/K_m), а на оси абсцисс - отрезок V. Интегральное уравнение можно также линеаризовать по-другому:

t / 2,3031 lg [S₀ / (S₀ - y)] = y / 2,303 V lg [S₀ / (S₀ - y)] + K_m / V

или t/y = 2,3031 K_m lg [S₀ / (S₀ - y)] / V_y +1/V [5]

Если мы изучаем обратимую реакцию, необходимо обращать внимание на то, с каким временным интервалом мы имеем дело. В момент смешения фермента с субстратом начинается так называемая предстационарная фаза продолжительностью несколько микро- или миллисекунд, в течение которой образуются фермент-субстратные комплексы, соответствующие стационарному состоянию. При изучении обратимых реакций на достаточно протяженных отрезках времени эта фаза не играет значительной роли, так как в этой фазе реакция не протекает с полной скоростью ни в одном из направлений.

Для реакции, идущей слева направо, фермент-субстратные комплексы, принимающие участие в реакции, достигают скоростьлимитирующей концентрации только в конце предстационарной фазы. Квазистационарное состояние, в котором концентрации скоростьопределяющих фермент-субстратных комплексов приближаются к максимальным значениям концентраций в стационарном состоянии, длится несколько десятых долей секунды или секунды. Во время этой фазы скорость образования продукта (или расходования субстрата) практически линейная во времени. Теоретически здесь образования продукта еще не произошло, а практически его концентрация настолько мала, что скорость обратной реакции не влияет на скорость прямой. Эта линейная фаза называется начальной скоростью реакции, до сих пор мы только ее и принимали во внимание. [3]

Реакция справа налево в следующей фазе также ускоряется из-за постепенного увеличения концентрации продукта (переходное состояние; наблюдаемая до сих пор линейность во времени исчезает). Эта фаза продолжается до тех пор, пока скорость реакции слева направо не становится равной скорости реакции справа налево. Это - состояние динамического равновесия, так как реакция непрерывно продолжается в обоих направлениях с одинаковой скоростью.

2. Факторы, от которых зависит скорость ферментативной реакции

2.1 Зависимость скорости ферментативной реакции от температуры

С повышением температуры среды скорость ферментативной реакции увеличивается, достигая максимума при какой-то оптимальной температуре, а затем падает до нуля. Для химических реакций существует правило, что при повышении температуры на 10°С скорость реакции увеличивается в два-три раза. Для ферментативных реакций этот температурный коэффициент ниже: на каждые 10°С скорость реакции увеличивается в 2 раза и даже меньше. Наступающее вслед за этим снижение скорости реакции до нуля свидетельствует о денатурации ферментного блока. Оптимальные значения температуры для большинства ферментов находятся в пределах 20 - 40⁰С. Термолабильность ферментов связана с их белковым строением. Некоторые ферменты денатурируют уже при температуре около 40⁰С, но основная часть их инактивируется при температурах выше 40 - 50⁰С. Отдельные ферменты инактивирует холод, т.е. при температурах, близких к 0°С, наступает денатурация.

Повышение температуры тела (лихорадочное состояние) ускоряет биохимические реакции, катализируемые ферментами. Нетрудно подсчитать, что увеличение температуры тела на каждый градус повышает скорость реакции примерно на 20%. При высоких температурах около 39-40°С расточительное использование эндогенных субстратов в клетках больного организма обязательно требуется восполнять их поступление с пищей. Кроме того, при температуре порядка 40°С часть весьма термолабильных ферментов может денатурироваться, что нарушает естественный ход биохимических процессов. [1]

Низкая температура вызывает обратимую инактивацию ферментов вследствие незначительного изменения его пространственной структуры, но достаточного для нарушения соответствующей конфигурации активного центра и молекул субстрата.

2.2 Зависимость скорости реакции от рН среды

Для большинства ферментов имеется определенное значение рН, при котором их активность максимальна; выше и ниже этого значения рН активность этих ферментов уменьшается. Однако не во всех случаях кривые, описывающие зависимость активности фермента от рН, имеют колоколообразную форму; иногда эта зависимость может выражаться также прямой. Зависимость скорости ферментативной реакции от рН главным образом свидетельствует о состоянии функциональных групп активного центра фермента. Изменение рН среды влияет на ионизацию кислых и основных групп аминокислотных остатков активного центра, которые участвуют или в связывании субстрата (в контактном участке), или в его превращении (в каталитическом участке). Поэтому специфическое влияние рН может быть вызвано или изменением сродства субстрата к ферменту, или изменением каталитической активности фермента, или обеими причинами вместе.

Большинство субстратов имеют кислотные или основные группы, поэтому рН влияет на степень ионизации субстрата. Фермент предпочтительно связывается или с ионизированной, или с неионизированной формой субстрата. Очевидно, при оптимальном рН и функциональные группы активного центра находятся в наиболее реакционноспособном состоянии, и субстрат находится в форме, предпочтительной для связывания этими группами фермента. [6]

При построении кривых, описывающих зависимость активности фермента от рН, измерения при всех значениях рН обычно проводят в условиях насыщения фермента субстратом, поскольку величина K_m для многих ферментов изменяется с изменением рН.

Кривая, характеризующая зависимость активности фермента от рН, может иметь особенно простую форму в тех случаях, когда фермент действует на электростатически нейтральные субстраты или субстраты, у которых заряженные группы не играют существенной роли в каталитическом акте. Примером таких ферментов служит папаин, а также инвертаза, катализирующая гидролиз нейтральных молекул сахарозы и сохраняющая постоянную активность в интервале рН 3,0-7,5.

Значение рН, соответствующее максимальной активности фермента, не обязательно совпадает со значением рН, характерным для нормального внутриклеточного окружения этого фермента; последнее может быть как выше, так и ниже оптимума рН. Это позволяет предположить, что влияние рН на активность фермента может быть одним из факторов, ответственных за регулирование ферментативной активности внутри клетки. Поскольку в клетке содержатся сотни ферментов, и каждый из них по-разному реагирует на изменение рН, значение рН внутри клетки является, возможно, одним из важных элементов в сложной системе регуляции клеточного метаболизма. [5]

2.3 Определение количества фермента по его активности

Содержание фермента в данном растворе или в тканевом экстракте можно определить, измеряя его каталитический эффект. Для этого необходимо знать:

1) общую стехиометрию катализируемой реакции;

2) возможную потребность в кофакторах - в ионах металлов или коферментах;

3) зависимость активности фермента от концентраций субстрата и кофактора, т.е. величины K_m как для субстрата, так и для кофактора;

4) значение рН, соответствующее максимальной активности фермента;

5) область температур, при которых фермент устойчив и сохраняет высокую активность.

Кроме того, необходимо иметь в своем распоряжении какую-нибудь достаточно простую аналитическую методику, позволяющую определять скорость исчезновения субстрата или скорость появления продуктов реакции.

Всегда, когда это возможно, анализ на содержание фермента проводится в стандартных условиях, при которых поддерживается оптимальное значение рН и концентрация субстрата, превышающая концентрацию насыщения; в этом случае начальная скорость соответствует нулевому порядку реакции в отношении субстрата и пропорциональна только концентрации фермента. Для ферментов, нуждающихся в кофакторах - ионах металлов или коферментах, концентрация этих кофакторов также должна превышать концентрацию насыщения, с тем, чтобы фактором, лимитирующим скорость реакции, была концентрация фермента. Обычно измерение скорости образования продукта реакции может быть проведено с большей точностью, чем измерение скорости исчезновения субстрата, так как для поддержания кинетики нулевого порядка субстрат, как правило, должен присутствовать в сравнительно высоких концентрациях. Скорость образования продукта (или продуктов) реакции можно измерять химическими или спектр о фотометрическими методами. Второй способ более удобен, поскольку он позволяет непрерывно регистрировать ход реакции на лепте самописца. [5]

По международному соглашению за единицу ферментативной активности принимается количество фермента, способное вызвать превращение одного микромоля субстрата в минуту при 25°С в оптимальных условиях. Удельной активностью фермента называют число единиц ферментативной активности в расчете на 1 мг белка. Эту величину используют в качестве критерия чистоты ферментного препарата; она возрастает по мере очистки фермента и для идеально чистого препарата достигает максимального значения. Под числом оборотов понимают число молекул субстрата, подвергающихся превращению в единицу времени в расчете на одну молекулу фермента (или на один активный центр) в условиях, когда скорость реакции лимитируется концентрацией фермента.

2.4 Активация ферментов

Регуляция ферментов может осуществляться путем взаимодействия с ними различных биологических компонентов или чужеродных соединений (например, лекарств и ядов), которые принято называть модификаторами или регуляторами ферментов. Под действием модификаторов на фермент реакция может ускоряться (активаторы) или замедляться (ингибиторы).

Активация ферментов определяется по ускорению биохимических реакций, наступающему после действия модификатора. Одну группу активаторов составляют вещества, влияющие на область активного центра фермента. К ним относятся кофакторы ферментов и субстраты. Кофакторы (ионы металлов и коферменты) являются не только обязательными структурными элементами сложных ферментов, но и по существу их активаторами.

Ионы металлов бывают довольно специфичными активаторами. Часто для некоторых ферментов требуются ионы не одного, а нескольких металлов. Например, для Na⁺, K⁺-АТФазы, осуществляющей транспорт одновалентных катионов через клеточную мембрану, необходимы в качестве активаторов ионы магния, натрия и калия.

Активация с помощью ионов металлов осуществляется по разным механизмам. В некоторых ферментах они входят в состав каталитического участка. В ряде случаев ионы металлов облегчают связывание субстрата с активным центром фермента, образуя как бы своеобразный мостик. Нередко металл соединяется не с ферментом, а с субстратом, образуя металлосубстратный комплекс, который предпочтителен для действия фермента. [1]

Специфичностью участия коферментов в связывании и катализе субстрата объясняется активация ими ферментативных реакций. Особенно заметно активирующее влияние кофакторов при действии на фермент, который не насыщен кофакторами.

Субстрат тоже в известных пределах концентраций является активатором. После достижения насыщающих концентраций субстрата активность фермента не возрастает. Субстрат повышает стабильность фермента и облегчает формирование нужной конформации активного центра фермента.

Ионы металлов, коферменты и их предшественники и активные аналоги,

субстраты можно использовать на практике как препараты, активирующие ферменты.

Активация некоторых ферментов может осуществляться путем модификации, не затрагивающей активный центр их молекул. Возможно несколько вариантов такой модификации:

1) активация неактивного предшественника - профермента, или зимогена. Например, превращение пепсиногена в пепсин;

2) активация путем присоединения какой-либо специфической модифицирующей группы к молекуле фермента;

3) активация путем диссоциации неактивного комплекса белок - активный фермент. [6]

2.5 Ингибирование ферментов

Существуют реагенты, способные взаимодействовать более или менее специфично с той или иной боковой цепью белков, что приводит к ингибированию активности фермента. Это явление позволяет изучать природу аминокислотных боковых остатков, принимающих участие в данной ферментативной реакции. Однако на практике следует учитывать многочисленные тонкости, делающие однозначную интерпретацию результатов, полученных со специфическими ингибиторами, довольно трудной и зачастую сомнительной. Прежде всего, чтобы реакция с ингибитором подходила для изучения природы участвующих в реакции боковых цепей, она должна удовлетворять следующим критериям:

1) быть специфичной, т.е. ингибитор должен блокировать только нужные группы;

2) ингибировать активность фермента, и это ингибирование должно становиться полным при увеличении числа модифицированных групп;

3) реагент не должен вызывать неспецифическую денатурацию белка.

Выделяют 2 группы ингибиторов: обратимого и необратимого действия. В основе подразделения лежит критерий восстановления активности фермента после диализа или сильного разведения раствора фермента с ингибитором.

По механизму действия выделяют конкурентное, неконкурентное, бесконкурентное, субстратное и аллостерическое ингибирование. [3]

Конкурентное ингибирование

Конкурентное ингибирование было открыто при изучении ингибирования, вызываемого аналогами субстрата. Это торможение ферментативной реакции, вызванное связыванием с активным центром фермента ингибитора сходного по структуре с субстратом и препятствующего образованию фермент-субстратного комплекса. При конкурентном торможении ингибитор и субстрат, будучи сходными по строению, конкурируют за активный центр фермента. С активным центром связывается то соединение молекул, которого больше.

Такие представления о механизме ингибирования были подтверждены экспериментами по кинетике реакций конкурентного ингибирования. Так, было показано, что в случае конкурентного ингибирования аналог субстрата не влияет на скорость разложения уже образовавшегося комплекса фермент-субстрат, т.е. при использовании «бесконечно большого» избытка субстрата получается одна и та же максимальная скорость как в присутствии, так и в отсутствие ингибитора. Напротив, ингибитор влияет на величину константы диссоциации и константы Михаэлиса. Из этого можно сделать вывод, что ингибитор реагирует с группами белка, участвующими тем или иным образом в связывании субстрата, следовательно, из-за взаимодействия его с этими группами прочность связывания субстрата уменьшается (т.е. уменьшается число молекул фермента, способных связывать субстрат).

Позже было показано, что кинетически конкурентное ингибирование может быть вызвано не только аналогами субстратов, но и другими реагентами, химическая структура которых абсолютно отличается от структуры субстрата. В этих случаях также предполагалось, что данный реагент взаимодействует с группой, ответственной за связывание субстрата.

Для конкурентного ингибирования теоретически могут существовать две возможности:

связывающие и каталитические центры фермента перекрываются; ингибитор связывается с ними, но влияет только на группы центра связывания;

центр связывания и каталитический центр в молекуле фермента пространственно обособлены; ингибитор взаимодействует с центром связывания.

Существуют следующие элементарные стадии реакции:

где I - ингибитор, а K_I - константа диссоциации комплекса фермент - ингибитор.

Относительная скорость (отношение скорости ферментативной реакции, измеренной в присутствии ингибитора (v_i), к максимальной скорости) равна

v_i / V = [ES] / [E]_T

поскольку для общей концентрации фермента справедливо

[E]_T = [E] + [ES] + [EI]

то 1 / v_i = (K_s / V[S]) (1 + [I] / K_I) + 1 / V

Очевидно, если [I] = K_I, то наклон прямой линии становится вдвое больше, чем для зависимости 1/v₀ от [S] (v₀ - скорость ферментативной реакции в отсутствие ингибитора).

Тип ингибирования обычно определяют графически. Конкурентное ингибирование легче всего распознается путем построения графиков Лайнуивера - Берка (т.е. графиков в координатах 1/v_i и 1/[S]) при разных концентрациях ингибитора. При истинном конкурентном ингибировании получается набор прямых, отличающихся тангенсом угла наклона и пересекающих ось ординат (ось 1/v_i) в одной точке. При любой концентрации ингибитора можно попользовать настолько высокую концентрацию субстрата, что активность фермента будет максимальной.

В качестве примера конкурентного ингибирования можно привести влияние различных веществ на активность сукцинатдегидрогеназы. Этот фермент входит в состав ферментной циклической системы - цикла Кребса. Его природным субстратом является сукцинат, а сходным с ним конкурентным ингибитором - оксалоацетат, промежуточный продукт того же цикла Кребса:



Аналогичным конкурентным ингибитором сукцинатдегидрогеназы является малоновая кислота, часто использующаяся в биохимических исследованиях.

На принципе конкурентного ингибирования основано действие многих фармакологических препаратов, ядохимикатов, используемых для уничтожения сельскохозяйственных вредителей, и боевых отравляющих веществ.

Например, группа антихолинэстеразных препаратов, к которым относятся производные четвертичных аммониевых оснований и фосфорорганические соединения, являются конкурентными ингибиторами фермента холинэстеразы по отношению к его субстрату ацетилхолину. Холинэстераза катализирует гидролиз ацетилхолина - медиатора холинэргических систем (нервно-мышечных синапсов, парасимпатической системы и т.д.). Антихолинэстеразные вещества конкурируют с ацетилхолином за активный центр фермента, связываются с ним и выключают каталитическую активность фермента. Такие препараты, как прозерин, физостигмин, севин, угнетают фермент обратимо, а фосфорорганические препараты типа армина, нибуфина, хлорофоса, зомана действуют необратимо, фосфорилируя каталитическую группу фермента. В результате их действия накапливается ацетилхолин в тех синапсах, где он является медиатором нервного возбуждения, т.е. происходит отравление организма накопившимся ацетилхолином. Действие обратимых ингибиторов постепенно проходит, так как чем больше накапливается ацетилхолина, тем быстрее он вытесняет ингибитор из активного центра холинэстеразы. Токсичность необратимых ингибиторов несравненно выше, поэтому их применяют для борьбы с вредителями сельского хозяйства, бытовыми насекомыми и грызунами (например, хлорофос) и как боевые отравляющие вещества (например, зарин, зоман и др.). [6]

Неконкурентное ингибирование

При неконкурентном ингибировании специфический ингибитор не влияет на константу диссоциации комплекса фермент-субстрат. С другой стороны, максимально достижимая скорость реакции меньше в присутствии ингибитора, чем в его отсутствие, даже при бесконечно большом избытке субстрата. Наличие ингибирования доказывает, что ингибитор связывается с белком. Неизменность константы диссоциации как в присутствии, так и в отсутствие ингибитора в свою очередь указывает на то, что в отличие от субстрата ингибитор связывается с другой группой. С теоретической точки зрения, механизм подобного ингибирования может быть интерпретирован различными способами.

а) Центр связывания и каталитический центр фермента различны. В этом случае ингибитор, связанный с каталитическим центром, уменьшает активность фермента и максимально достигаемую
скорость, не влияя на образование комплекса фермента с субстратом.

б) Центр связывания и каталитический центр перекрываются на
поверхности фермента, а ингибитор связывается с другими группами белка. Благодаря связыванию ингибитора с поверхностью фермента информация белка изменяется и становится неблагоприятной для осуществления катализа.

в) Ингибитор не связывается ни с каталитическим центром, ни с центром связывания, и при этом не влияет на конформацию белка. Тем не менее, он может локально изменять распределение заряда на участке поверхности белка. Ингибирование активности может происходить и в этом случае, если, например, делается невозможной ионизация групп, существенных для проявления активности, или, если наоборот происходит ионизация групп, активных только в неионизованной форме. Такое явление наблюдается главным образом при использовании сильнокислых или сильнощелочных реагентов. [5]

Ингибитор и субстрат не влияют на связывание друг друга с ферментом, но комплексы фермента, содержащие ингибитор, совершенно неактивны. В таком случае можно предположить следующие элементарные стадии:

v_i / V = [ES] / [E]_T

[E]_T = [E] + [ES] + [EI] + [ESI]

1 / v_i = (K_s / V [S]) (1 + [I] / K_I) + (1 / V) (1 + [I] / K_I)

Если [I] = K_I величины наклонов прямых и ординаты точки пересечения с вертикальной осью удваиваются по сравнению с 1/v₀.

Неконкурентными ингибиторами являются, например, цианиды, которые прочно соединяются с трехвалентным железом, входящим в каталитический участок геминового фермента - цитохромоксидазы. Блокада этого фермента выключает дыхательную цепь, и клетка погибает. К неконкурентным ингибиторам ферментов относятся ионы тяжелых металлов и их органические соединения. Поэтому ионы тяжелых металлов ртути, свинца, кадмия, мышьяка и других очень токсичны. Они блокируют, например, SH-группы, входящие в каталитический участок фермента.

Неконкурентными ингибиторами являются цианиды, которые прочно соединяются с трехвалентным железом, входящим в каталитический участок геминового фермента - цитохромоксидазы. Блокада этого фермента выключает дыхательную цепь, и клетка погибает. Снять действие неконкурентного ингибитора избытком субстрата (как действие конкурентного) нельзя, а можно лишь веществами, связывающими ингибитор - реактиваторы. [6]

Неконкурентные ингибиторы применяются как фармакологические средства, отравляющие вещества для борьбы с вредителями сельского хозяйства и в военных целях. В медицине применяются препараты, содержащие ртуть, мышьяк, висмут, которые неконкурентно ингибируют ферменты в клетках организма или болезнетворных бактерий, чем и определяется тот или иной их эффект. При интоксикации связывание яда или его вытеснение из комплекса фермент - ингибитор возможно с помощью реактиваторов. К ним относятся все SH-содержащие комплексоны (цистеин, димеркаптопропанол), лимонная кислота, этилендиаминтетрауксусная кислота и др.

Бесконкурентное ингибирование

Этот тип ингибирования в литературе называют также антиконкурентным или сопряженным ингибированием, однако термин «бесконкурентное ингибирование» используется наиболее широко. Характеристикой этого типа ингибирования является то, что ингибитор не способен присоединяться к ферменту, но он присоединяется к комплексу фермент-субстрат.