Культивирование, выделение, очистка и идентификация продуцентов биомассы

в) требуется обеспечить непрерывный процесс сепарации, когда фильтры рассчитаны на периодическое действие.

Методы разрушения клеток. Разрушение клеток проводится физическими, химическими и ферментативными методами. Наибольшее промышленное значение имеют физические способы дезинтеграции:

1) ультразвуком;

2) лопаточными или вибрационными дезинтеграторами - метод, обычно используемый в пилотных и промышленных установках;

3) встряхиванием со стеклянными бусами;

4) продавливанием через узкие отверстия под высоким давлением;

5) раздавливанием замороженной массы;

6) растиранием в специальных ступках;

7) с помощью осмотического шока;

8) многократным замораживанием и оттаиванием;

9) сжатием клеточной взвеси с последующим резким снижением давления (декомпрессией).

Физические способы дезинтеграции отличаются большей экономичностью в сравнении с другими методами, однако они характеризуются отсутствием выраженной специфичности, вследствие чего обработка может отрицательно влиять на качество получаемого целевого продукта.

Мягкое и избирательное разрушение клеточной стенки обеспечивается применением химических и ферментативных методов. Так, бактериальные клетки разрушаются лизоцимом в присутствии ЭДТА (этилен-диаминтетрауксусной кислоты), а клеточные стенки дрожжей зимолиазой улитки или ферментами грибного либо актиномицетного происхождения. Клеточные стенки микроорганизмов могут быть разрушены путем обработки толуолом или бутанолом. Элективный лизис клеток вызывается воздействием ряда антибиотиков: полимиксин, новобиоцин, нистатин и др.

После дезинтеграции клеток необходимо избавляться от их "обломков", для чего используют те же методы, что и при сепарации, т.е. центрифугирование или фильтрацию.

Выделение целевого продукта из культуральной жидкости или получаемого в результате процессов дезинтеграции гомогената разрушенных клеток осуществляется путем осаждения, экстракции или различных методов адсорбции.

Осаждение растворенных веществ осуществляется физическими (нагревание, разведение или концентрирование, охлаждение раствора) или химическими воздействиями, переводящими растворенное вещество в малорастворимое состояние.

Экстракция подразделяется на твердо-жидкофазную (при которой продукт из твердой фазы переходит в жидкую) и жидкожидкофазную (когда обеспечивается перевод продукта из одной жидкой фазы в другую, также жидкую фазу).

Твердо-жидкофазная экстракция сводится порой к простой обработке твердого образца водой или органическим растворителем с целью извлечения из него растворимых соединений. Достаточно широко применяются различные органические растворители, в частности экстрагирование ацетоном, который эффективно переводит в раствор ряд липидных и белковых компонентов клеток.

При жидко-жидкофазной экстракции используются различные органические растворители - алкилфенолы, эфиры, галогениды, гексан, хлороформ и др. Почти полностью избежать инактивации позволяют методы экстрагирования на холоде, т. е. путем использовании методов криоэкстракции. При этом уравниваются различия между твердым субстратом и культуральной жидкостью, поскольку и то и другое находится в замороженном состоянии (в одной фазе). Криоэкстракция проводится с применением растворителей, температура кипения которых низка и при обычной комнатной температуре находится в газообразном состоянии.

Адсорбция является достаточно распространенным методом отделения продукта и рассматривается в качестве частного случая экстракции, при котором экстрагирующим агентом служит твердое тело. Механизм ее сводится к связыванию выделяемого из жидкой или газообразной фазы вещества поверхностью твердого тела. Традиционными адсорбентами являются древесный уголь, пористые глины и т. п.

Более современные методы разделения веществ включают хроматографию, электрофорез, электрофокусировку, которые основаны на принципах экстракции и адсорбции. [4, 16, 27]

2.2 Оборудование в процессах выделения

Культуральная жидкость, образующаяся в процессе ферментации, представляет собой сложную многофазную систему: в водной фазе содержатся клетки продуцента, продукты их жизнедеятельности, непотреблен-ные компоненты питательной среды, мельчайшие капельки жира, пузырьки воздуха, как правило, мел. В свою очередь водная фаза культуральной жидкости (нативный раствор) включает большое число органических и неорганических веществ, коллоидных фракций белков, сухой остаток культуральной жидкости - до 17% и более; содержание биомассы в культуральной жидкости достигает 8-10%. Концентрация целевого продукта чаще всего не превышает 1,5%, что составляет менее 10% сухого остатка. В зависимости от целевого назначения конечного продукта (для здравоохранения, технических целей, сельского хозяйства и т. д.) реализуют различной степени сложности схемы производства, при этом учитывают и место накопления целевого продукта - внутриклеточно или внеклеточно.

Если способы выделения целевых продуктов можно разделить на несколько типовых групп (рисунок 6), то очистка каждого из них практически индивидуальна, поскольку зависит от физико-химических свойств конкретного вещества.



Рисунок 6 - Возможные способы выделения целевого продукта

Примером наиболее простой схемы может служить производство биовита, базирующегося на использовании продуцента антибиотика хлортетрациклина. Кальциевый комплекс хлортетрациклина осажадают из культуральной жидкости при pH выше 7,0. Формирующийся при этом осадок увлекает с собой и клетки продуцента. Так в осадке вместе с биомассой оказываются внеклеточный антибиотик и внутриклеточный витамин В12. Осадок фильтруют, высушивают, размельчают, добавляют отруби в качестве наполнителя и фасуют. Этот комплекс используют в качестве добавки к корму для скота.

Если целевым продуктом является биомасса клеток, например, кормовые или пекарские дрожжи, необходимо их концентрирование (сгущение). При этом широко применяют флотацию, с помощью которой увеличивают концентрацию дрожжей в 4-6 раз. Основной движущей силой флотации являются всплывающие пузырьки газа, которые захватывают клетки и выносят их на поверхность. В результате над слоем отработанной культуральной жидкости образуется пенный слой, в котором сконцентрированы дрожжи. Процесс проводят в специально предназначенных для этой цели емкостных аппаратах - флотаторах, в которые нагнетают воздух и, в зависимости от их конструкции, диспергируют его через барботер или эжектор, пену гасят в специальной части аппарата с помощью пеногасителя и выводят сконцентрированную суспензию дрожжей.

Для последующего концентрирования дрожжей широко применяют сепарирование, например, с помощью сепаратора-сгустителя непрерывного действия тарельчатого типа СОС-501 К-3. Для сгущения суспензии дрожжей от 20-30 г/л до 550-600 г/л необходимо последовательное сепарирование в 2-3 ступени.

Методы извлечения целевых продуктов из клеток зависят от свойств изолируемых веществ. Полиеновые антибиотики, например, экстрагируют органическими растворителями из нативных клеток, тогда как эндоферменты получают из разрушенных (дезинтегрированных) клеток. На рисунке 7 представлена схема процесса выделения L-аспарагиназы. Клетки отделяют на дисковой центрифуге (позиция 4), позволяющей концентрировать от 6 г/л до 120 г/л по массе сухих веществ. Разрушение клеток проводят в гомогенизаторе (позиция 5) при двукратном пропускании высвобождается до 97% фермента. От остатков клеток освобождаются после добавления этанола (позиция 9) до 30% концентрации с последующей фильтрацией на ротационном фильтре (позиция 10). Затем фермент осаждают метанолом при его концентрации в маточнике 50% (позиция И), фильтруют (позиция 12), растворяют в воде и переосаждают (позиция 13) при концентрации метанола 60%. Осадок центрифугируют (позиция 12), снова растворяют в воде (позиция 14) и концентрируют ультрафильтрацией (позиция 16), затем выделяют с помощью сефадекса ДЕАЕ-А50 (позиция 19), осажадют этанолом (0,6 объема) при pH 5,0 (позиция 27) и собирают в корзинчатой центрифуге (позиция 28). Осадок еще раз растворяют в воде (позиция 29), стерилизуют фильтрацией через мембрану (позиция 30), разливают (позиция 32) и подвергают сублимационной сушке (позиция 34).



Рисунок 7 - Схема процесса выделения L-аспарагиназы: 1,5,17 - промежуточные емкости, 2, 6, 15, 18, 26 - насосы, 3 - теплообменник, 4 - дисковая центрифуга, 7 - аппарат для получения суспензии микробных клеток, 8 - гомогенизатор, 9 - аппарат для спиртового осаждения остатков клеток и белка, 10- ротационный фильтр, 11 - аппарат для осаждения фермента метанолом, 12 - центрифуга, 13 - аппарат для переосаждения фермента, 14 - аппарат для растворения фермента, 16 - аппарат для ультрафильтрации, 19 - колонка с сефадексом, 20, 21 - емкости для буферных растворов, 22, 23 - насосы для подачи буферных растворов, 24, 25 - емкости для сбора фракций, 31 - аппарат для осаждения фермента, 28 - центрифуга, 29 - аппарат для переосаждения, 30 - стерилизующая мембрана, 31 - осадитель, 32 - кювета, 33 - фасовочное устройство, 34 - сублимационная сушилка

биомасса продуцент культивирование высаливание

Выделение большей части продуктов микробного синтеза из культуральной жидкости начинают при их содержании около 1,5%. Чтобы иметь возможность выделить вещество, используя осаждение, кристаллизацию или высушивание, необходимо оперировать с растворами, содержащими 15-20% целевого продукта. Вот почему приходится применять разномасштабное оборудование по ходу процесса: вначале необходимы емкости в несколько десятков м3, высокопроизводительное оборудование непрерывного или полунепрерывного действия, а завершают процесс небольшими аппаратами вместимостью порядка нескольких сотен и даже десятков литров с периодической загрузкой и выгрузкой, или лабораторное оборудование.

Технологические показатели фильтрации культуральных жидкостей определяются свойствами их как дисперсных систем. Клетки микробов-продуцентов, например, грибов чаще всего образуют микроколонии различной плотности размером 16-600 мкм. Фильтрационные свойства жидкости обусловлены размерами отдельных гиф, типом микроколоний, характером роста мицелия. Эти факторы зависят от вида и штамма биообъекта, условий его культивирования.

Пенициллы и аспергиллы образуют легко фильтруемую биомассу, поэтому для получения нативного раствора в этом случае применяют барабанные вакуум-фильтры - аппарат непрерывного действия с фильтрующим основанием, расположенным на наружной цилиндрической поверхности горизонтального вращающегося барабана, частично погруженного в суспензию.

Культуральные жидкости после ферментации проактиномице-тов представляют собой густые суспензии с относительной вязкостью 50-1000 и с высоким содержанием твердой фазы. Они практически не расслаиваются при стоянии. Характерной особенностью и других бактериальных суспензий является изменчивость их фильтрационных свойств как во времени, так и от одной операции до другой.

Необходимо также отметить, что образуемые осадки заметно сжимаемы (показатель сжимаемости 0,9), значит процесс фильтрации не может быть интенсифицирован повышением разности давления из-за соответственно возрастающего удельного сопротивления осадка. Такие суспензии без предварительной обработки культуральной жидкости отфильтровать практически невозможно. Предварительную обработку культуральной жидкости проводят с целью максимального перевода конечного продукта в ту фазу, из которой предполагают его выделить, а также для коагуляции коллойдных примесей и, следовательно, улучшения процесса фильтрации, для удаления или связывания в растворимые комплексы тех побочных веществ, которые затрудняют последующий процесс химической очистки. К тому же при коагуляции изменяется структура твердой фазы культуральной жидкости.

Применяют несколько видов коагуляции: неорганическими солевыми электролитами, органическими и неорганическими кислотами, термической обработкой, добавлением веществ, образующих наполнители. Эффективным методом коагуляции дисперсных систем является обработка их высокомолекулярными полиэлектролитами - флоккулянтами. При этом в отличие от обычной коагуляции, образуются флоккулы или осадки рыхлой структуры, что значительно улучшает процесс фильтрации.

Для получения нативного раствора из труднофильтруемых культуральных жидкостей после коагуляции применяют вакуум-барабанный фильтр с намывным слоем - аппарат полунепрерывного действия. Перед работой на фильтрующую поверхность барабана намывают дренажный слой наполнителя. В качестве наполнителя используют суспензию порошков целлюлозы, перлита, древесной муки. Особенность работы такого фильтра (в отличие от вакуум-барабанного) состоит в том, что нож, предназначенный для съема осадка с барабана, имеет специальную микрометрическую подачу. С каждым оборотом барабана нож подается к центру, срезая нафильтрованный осадок вместе с тонким слоем дренажа, обновляя таким образом фильтрующую поверхность; поэтому скорость фильтрации не снижается. На рисунке 8 представлена схема аппаратурного оформления процесса фильтрации культуральной жидкости на вакуум-барабанном фильтре с намывным слоем.



Рисунок 8 - Схема аппаратурного оформления процесса фильтрации на вакуум-барабанном фильтре с намывным слоем 1 - аппарат для суспензии вспомогательного материала, 2, 4, 7 - насосы, 3 - коагулятор, 5 - вакуум-барабанный фильтр с намывным слоем, б - ресивер [9, 15, 18]

3. Очистка продуцентов биомассы

3.1 Общие принципы очистки продуцентов биомассы

Проведение этих стадий процесса обусловлено рядом технических сложностей, связанных, в основном, с нестабильностью (лабильностью) ферментов, потерей им активности под влиянием незначительных изменений внешних условий. Поэтому при выборе технологии выделения, концентрирования и очистки ферментных препаратов ищут решения, позволяющие проводить эти процессы в непрерывном режиме, с высокой скоростью, в "мягких" условиях и добиваться максимального обезвоживания образующихся осадков. Для уменьшения потерь продуктов применяют различные стабилизаторы ферментов, проводят процесс при оптимальном значении рН растворов, стараются обеспечить максимально возможную механизацию и автоматизацию всех процессов.

Процесс ультрафильтрации в режиме диализа позволяет получать высокоочищенные препараты. Для его осуществления в получаемый концентрат постоянно добавляют чистую воду. Такая пятикратная промывка позволяет в 250-300 раз повысить активность ферментного раствора, т.е. при концентрации 30% раствор содержит практически один белковый ферментный препарат.

На практике процесс ультрафильтрации проводят в циркуляционных аппаратах периодического действия. Перед подачей раствора на стадию ультрафильтрации из него предварительно удаляют клетки продуцента и для предотвращения развития посторонней микрофлоры на поверхности мембран подвергают стерилизующей фильтрации через специальные бактериальные фильтры. В ходе проведения процесса ультрафильтрации в зависимости от свойств получаемого фермента раствор постоянно охлаждается до температуры 4-15* С.

Недостатком метода ультрафильтрации следует считать забивание пор мембраны осадками или адсорбированными молекулами, что приводит к снижению производительности мембранного аппарата во времени. Последнее требует периодического проведения промывки материала мембраны. Для предотвращения забивания пор мембраны осадками или сорбирующимися молекулами циркуляционный насос, используемый в этих установках, должен обеспечить линейную скорость потока жидкости через мембрану около 2-5 м/с. При таких скоростях наблюдается значительное гидравлическое сопротивление. Для его снижения на практике применяют две конструкции мембранных аппаратов: трубчатые мембранные аппараты и проточные с плоскими мембранными элементами, устанавливаемыми параллельно основному потоку раствора.

Для концентрирования и выделения ферментных препаратов часто применяют процесс высаливания. Он основан на уменьшении растворимости большинства белков в солевых растворах. Для этой цели в технологии чаще всего используют сульфат аммония как наиболее дешевый и хорошо растворимый реагент. Однако недостатком использования сульфата аммония является выделение аммиака при повышенных значениях рН раствора, что приводит к коррозии металлических частей оборудования.

Тот же эффект высаливания достигается при использовании сульфата натрия вместо сульфата аммония. Однако из-за меньшей по сравнению с сульфатом аммония растворимостью его можно использовать при температурах раствора не ниже 35-40*С. При охлаждении раствора наблюдается выпадение осадка сульфата натрия, что создает возможность его регенерации и повторного использования. Однако использование сульфата натрия предполагает повышение энергозатрат на нагревание растворов, а пребывание ферментов в условиях повышенных температур способствует их инактивации.

При проведении процесса высаливания большое значение имеет режим осуществления контакта соли с раствором фермента. Для высаливания можно брать соль в виде тонкоизмельченного порошка или в виде насыщенного раствора. В последнем случае процесс можно проводить в периодическом или непрерывном режиме. Установлено, что наибольший эффект - минимально необходимое количество соли на 1 кг осаждаемого белка - достигается при использовании соли в виде тонко измельченного порошка. Наименьший эффект достигается при непрерывном смешении насыщенного раствора соли с раствором фермента. Для достижения того же процента высаливания в последнем случае соли требуется в 1,3-1,5 раза больше.

Время образования осадков белков при высаливании для различных ферментов колеблется в пределах 0,5-12 часов. Время высаливания и необходимое для проведения процесса количество соли зависят от количества (процентного содержания) растворенных веществ. Чем их больше, тем меньшее количество воды подлежит связыванию. Так, например, для получения 1 кг препарата из культуральной жидкости требуется 45-50 кг соли, а из упаренного до 30%-ной концентрации раствора - только 1,4-1,6 кг.

В получаемых таким образом осадках белка содержится 60-85% балластных веществ, в том числе 30-45% соли. Повторное использование операций растворение - высаждение дает возможность получать высоко-очищенные ферментные препараты для медицинских целей.

Варьируя такие параметры, как температура и рН среды, в ряде случаев, возможно, осуществить фракционное высаждение белков. Для этого в присутствии соли изменяют рН исходного раствора или температуру, добиваясь денатурации балластной фракции белка. Последние необратимо выпадают в осадок, который отделяют от маточного раствора. На последующей стадии уже выделяют целевой ферментный препарат.

Довольно часто вместо соли используют полиэтиленгликоль с молекулярной массой 6000. Он оказывает стабилизирующее воздействие на активные белки, легко отделяется от белка методом ионообменной хроматографии или ультрафильтрации.

В технологии выделения ферментов методом осаждения значительное место занимает процесс получения активных белков осаждением их с помощью органического растворителя. Действие органических растворителей основано на снижении диэлектрической постоянной среды, которая определяет величину силы электростатического взаимодействия между молекулами растворенного белка и растворителя. Устойчивость белковых растворов обусловлена толщиной гидратного слоя, окружающего молекулу белка. При разрушении этого гидратного слоя молекулы белка начнут образовывать конгломераты и выпадать в осадок. Для осуществления такого процесса необходимо использовать вещества более гидрофильные, чем осаждаемый белок. В качестве растворителей используют, в основном, этанол, метанол, изопропанол и ацетон. Варьируя тип органического растворителя, его количество, величину рН раствора можно проводить избирательное осаждение той или иной фракции белков.

В технологии процесс осаждения органическим растворителем проводят в реакторе непрерывного и периодического действия. Для снижения процента потерь активности выделяемого фермента при смешении растворителя с водным раствором активных белков обе жидкости первоначально охлаждают до температур соответственно -8оС и 5-6о С. Полученную смесь, содержащую не менее 8-10% белков, тщательно перемешивают, и через 20-30 мин происходит выпадение мелких частиц белка. Процесс осаждения проводят в вертикальном цилиндрическом аппарате с коническим днищем, снабженным мешалкой и рядом штуцеров для удаления жидкой фазы. Потеря активности фермента на этой стадии составляет около 15%, в основном, по причине длительного контакта фермента с органическим растворителем. Организация процесса по способу непрерывного осаждения при времени контакта 10-15 мин позволяет снизить потери активности фермента на 20-25%.

Полученный на этой стадии осадок отделяют на центрифуге, промывают чистым этанолом и вновь сепарируют до остаточной влажности 30-35%.

Для получения высокоочищенных ферментных препаратов, полученные на стадии выделения активные белки подвергают, как правило, сорбционной чистке. Поскольку в молекуле фермента присутствуют функциональные группы, сообщающие ей кислотный или основной характер, то обычно для этой цели используют метод ионного обмена на ионитах, полученных на основе целлюлозы: катионит КМЦ (карбоксиметилцеллюлоза) и анионит ДЭАЭ (диэтиламиноэтилцеллюлоза).

В последние годы число различных ионитов сильно возросло, и для конкретного производства ферментного препарата существует возможность выбрать наилучший. Среди ионитов, получивших достаточно широкое распространение, необходимо отметить такие, как обработанный крахмал, сефадексы на основе декстрана, катиониты на основе полиметакриловой кислоты, аниониты на основе поливинилового спирта и др.

Процесс проводят в насадочных колоннах, через которые пропускается раствор фермента, или в аппаратах с мешалкой. В последнем случае предполагается последующее отделение твердой фазы.

Десорбцию осуществляют элюирующими растворами, специально подобранными для каждого фермента и сорбента.

Потери фермента на стадии сорбционной чистки не превышают 15%. Для получения более высокоочищенных ферментов используют различные препаративные методы. Среди них наибольшее распространение получили такие, как диализ, гельфильтрация, вымораживание, электрофорез, аффинная хроматография и др.

Диализ - процесс диффузии ионов через полимерную мембрану под действием градиента концентраций. При этом за счет диффузии через мембрану удаляются соли и другие низкомолекулярные продукты, а их место в исходном растворе ферментного препарата занимают молекулы растворителя, в данном случае воды. И хотя исходный раствор фермента при этом увеличивается в объеме, но активность его возрастает в 3-4 раза.

В последние годы с развитием промышленности по производству синтетических пленок сильно возрос интерес к использованию процесса диализа в промышленном масштабе и был создан для его осуществления ряд промышленных установок.

Разновидностью процесса диализа является электродиализ. Перенос ионов через мембраны осуществляется в этом случае не за счет градиента концентраций, а под действием электрического поля.

Гельфильтрация - хроматографический метод разделения, основанный на использовании высокопористых носителей со строго определенным размером пор. При этом молекулы, способные проникнуть в поры носителя, дольше задерживаются в его материале, так как проходят при этом больший путь. В качестве материалов для проведения процессов гельфильтрации используют декстраны с поперечными связями, полиакриламид, стекло и др.

Вымораживание - метод основан на частичном замораживании раствора ферментного препарата. Образующиеся при этом кристаллы льда отделяют на центрифуге. Фермент концентрируется в водной фазе. Подбирая условия замораживания исходного раствора можно фракционировать белки по составу и еще более сконцентрировать целевой фермент.

Электрофорез - метод, основанный на различной подвижности ионов в электрическом поле. Процесс достаточно длительный. За счет диффузии может происходить размытие концентрационных зон. Частичная интенсификация процесса возможна за счет создания температурного градиента. Применяется, в основном, для получения высокоочищенных препаратов в лабораторных условиях.

Аффинная хроматография - метод, основанный на способности ферментов избирательно связывать те или иные лиганды - субстраты, коферменты, конкурентные ингибиторы, аллостерические эффекторы и т.п. Такое связывание весьма специфично, что позволяет выделить тот или иной фермент из множества других белков.

Для синтеза аффинного сорбента, соответствующего специфичности данного фермента, лиганд (субстрат или его аналог) присоединяют к инертной матрице (макропористые гидрофильные гели, синтетические полимеры, неорганические носители) [5, 15, 18]

4. Идентификация продуцентов биомассы

4.1 Общие принципы идентификации продуцентов биомассы

После того как микроорганизм, обладающий ценными антибиотическими свойствами, тем или иным способом выделен из субстрата, необходимо определить его принадлежность к определенному виду, установить таксономическое положение этого штамма. Для указанных целей используют большой спектр признаков: культуральные свойства, морфологию и организацию клеток, физиологические и биохимические особенности организма, химический состав клеток, содержание гуанина и цитозина (ГЦ) в ДНК, ДНК-ДНК-гибридизацию и т.д.

Определенную помощь при идентификации видов стрептомицетов - продуцентов антибиотических веществ, принадлежащих к одной группе, оказывает метод, основанный на специфическом действии микробов-антагонистов. Эта специфика состоит в том, что, например, продуценты стрептомицина, выделенные в различных районах земного шара, не подавляют развитие друг друга. Такая закономерность характерна и для других видов стрептомицетов. Исходя из этого для идентификации внешне сходных культур стрептомицетов предложено применять метод так называемого перекрестного антагонизма.

Метод перекрестного антагонизма. Сущность метода состоит в следующем. Агаровые блочки с одним видом выращенного стреп-томицета помещают на поверхность агаровой пластинки, засеянной другим видом стрептомицета. В качестве тест-культуры наряду с другими используют тот же штамм организма. При этом обнаруживается, что один вид стрептомицета-антагониста может подавлять рост других видов стрептомицетов и не подавляет развитие своего вида. Метод специфики межвидового антагонизма может быть использован лишь при идентификации внешне очень близких видов стрептомицетов и не может оказать существенной помощи при систематике далеко стоящих видов. Оценивая все случаи, которые могут иметь место при использовании метода перекрестного антагонизма, следует заметить, что данный метод не помогает решению вопроса идентификации видов, но может оказать помощь при подразделении на виды культур внутри отдельных групп стрептомицетов.

Для идентификации микроорганизмов - продуцентов применяют и другие методы.

Использование организмов, устойчивых к определенному антибиотическому веществу. В основу этого метода положены два главных признака, связанных с образованием и действием антибиотиков.

Микроорганизмы, устойчивые к одному антибиотику, устойчивы и к антибиотическим веществам, близким к нему по химическому строению и биологическим свойствам. Вместе с тем они могут быть чувствительны к антибиотикам другой химической природы и, следовательно, обладать другим биологическим действием.

Антибиотик, образуемый неизвестным организмом, может быть определен путем испытания его биологического действия на ряд микроорганизмов, чувствительных и устойчивых к известным антибиотикам. Таким путем можно выяснить сходство или различие биологического действия изучаемого вещества и известных антибиотиков и тем самым решить вопрос о химическом сходстве или различии этих веществ.

Для исследования этого явления изучаемый организм высевают на поверхность питательного агара в виде штриха или в виде отдельной макроколонии в центре чашки Петри. Вырабатываемое организмом антибиотическое вещество диффундирует в окружающий агар и создает определенную зону. Пересекая эту зону чувствительными и устойчивыми к определенному антибиотику микроорганизмами, выясняют сходство биологического действия изучаемого препарата с известным антибиотиком.

Установив такое сходство, можно предположить, что изучаемое соединение относится к определенной группе антибиотических веществ и образуется соответствующими организмами. Однако оценка принадлежности изучаемого организма к тому или иному виду продуцентов может быть лишь ориентировочной. Так, было известно, что р-лактамные антибиотики вырабатываются только плесневыми грибами, но последующие исследования показали, что антибиотические вещества этой природы образуют некоторые виды стрептомицетов и собственно бактерий.

Метод хроматографии. Для идентификации антибиотиков и их продуцентов применяют метод хроматографии, открытый выдающимся русским ученым М.С. Цветом еще в 1903 г. и теперь очень широко используемый в лабораторной практике. Метод особенно важен при идентификации антибиотиков на ранних стадиях исследования.

Иногда метод хроматографии необходимо дополнить данными методов электрофореза, которые помогают выяснить прежде всего ионный характер антибиотика.

Метод бумажной хроматографии антибиотиков состоит в следующем. На полоски хроматографической бумаги длиной 20-30 см и шириной 1 см наносят испытуемый антибиотик. Подсушенные на воздухе полоски с антибиотиком помещают затем в хромато-графический бак или цилиндр с соответствующим растворителем на 10-20 ч. Время выбирают в зависимости от скорости прохождения растворителя и от высоты используемого для хроматографии сосуда.

Для обнаружения антибиотиков на хроматограммах применяют биологические, химические и физические методы.

Наиболее распространенным методом обнаружения антибиотиков на хроматограммах является биоавтографический метод. При этом высушенные в вытяжном шкафу полоски бумаги накладывают на агаровую пластинку, предварительно засеянную культурой тест-организма, чувствительной к изучаемому антибиотику. Кюветы с полосками бумаги помещают в термостат на 18-20 ч при температуре, оптимальной для роста тест-организма. По зонам отсутствия роста тест-микроба, образующимся вокруг тех мест на хроматограмме, где находится пятно антибиотика, во-первых, судят об однородности антибиотика, во-вторых, сравнивают полученные хроматограммы с хроматограммами известных антибиотических веществ.

Химические методы обнаружения антибиотиков на хроматограммах основаны на реакциях, в результате которых образуются соединения, выявляемые по соответствующей окраске или обесцвечиванию реактива в месте расположения пятна антибиотика. Физические методы обнаружения антибиотиков включают способы, связанные:

а) с выявлением люминесценции антибиотического пятна при воздействии УФ-излучения;

б) с поглощением УФ-излучения

в) с определением радиоактивной метки антибиотика.

Для целей бумажной хроматографии антибиотиков с успехом используют и круговые хроматограммы.

Важное значение при оценке результатов хроматографии имеет положение пятен исследуемых веществ, характеризуемое коэффициентом Яр Коэффициент определяется отношением расстояния, которое проходит пятно изучаемого вещества от линии старта за определенное время, к расстоянию, пройденному фронтом растворителя от линии старта. Воспроизводимость значений Rf зависит от постоянства следующих факторов: качества бумаги, температуры, степени чистоты растворителей, состава газов атмосферы, в которую помещена бумага, однотипности процедур и аппаратуры.

При использовании метода хроматографии на бумаге для идентификации антибиотиков было показано, что значение Лу зависит также от системы растворителей, степени очистки изучаемого антибиотика и состава культуральной жидкости.

Итак, если в результате идентификации выделенного микроорганизма установлено, что он является новым видом и антибиотическое вещество, образуемое им, не принадлежит к уже описанным соединениям, то и организм, и продуцент должны быть детально исследованы. С этой целью прежде всего изучают условия культивирования микроба, обеспечивающие максимальное образование продукта. При подборе сред необходимо иметь в виду, что чем сложнее среда, тем труднее выделять и очищать продукт, поэтому среда для культивирования должна быть по возможности простой по составу и обеспечивать максимальную выработку антибиотического вещества [6, 9, 16]

Заключение

Современный уровень развития биотехнологии обусловлен общим прогрессом науки и техники, особенно - в течение последних 50 лет. Достаточно отметить лишь такие события, как установление структуры и функций нуклеиновых кислот, обнаружение ферментов рестрикции ДНК и выявление их значения в жизни клеток с последующим использованием в генно-инженерных работах, создание гибридом и получение моноклональных антител, внедрение ЭВМ и компьютерной техники в биотехнологические процессы и т. д.

Изучение биотехнологии невозможно без знания основ химических дисциплин и, прежде всего, органической, биологической и коллоидной химии, ряда биологических дисциплин (общей биологии, микробиологии, ботаники, генетики, иммунологии, экологии), а также процессов и аппаратов химической и биологической технологии и ряда других общеинженерных дисциплин.

Биотехнологию относят к числу приоритетных наук, где можно прогнозировать более быстрые и важнейшие достижения для социально-экономического прогресса общества.

Основные направления совершенствования биотехнологической науки складываются из поиска новых продуцентов и совершенствования технологической схемы их производства. Сюда можно отнести такие процессы как, культивирование продуцентов, их очистка и выделение, а также способы идентификации.

В данной курсовой работе были рассмотрены основные составляющие любого биотехнологического производства, а именно:

культивирование продуцентов и аппаратура используемая для этого

выделение и очистка продуцентов, технологическое оборудование, используемое для этого

идентификация продуцентов, методы и способы.

Список использованных источников

1. Н.П. Елинов Основы биотехнологии. Для студентов институтов; аспирантов и практических работников. - СПб.: Наука, 1995 - 600 с.

2. Г.А. Гореликова Основы современной пищевой биотехнологии. - Кемерово, 2004. - 100 с.

3. А.А. Красноштанова, И.А. Крылова, Е.С. Бабусенко Основы биотехнологии. - М.: РХТУ им. Д.И. Менделеева, 2001 - 84 с.

4. Г.Г. Гончаренко Основы биотехнологии. Гомель: УО «ГГУ им. Ф. Скорины», 2008 - 282 с.

5. В.К. Османов, О.В. Бирюкова, А.В. Борисова Методы выделения и очистки продуктов биотехнологических производств. - Нижний Новгород, 2005 - 27 с.

6. К.Г. Федосеев Процессы и аппараты биотехнологии в химико-фармацевтической промышленности. - М.: Медицина, 1996. - 200 с.

7. М.Е. Бекер Введение в биотехнологию. - М.: Пищ. Промышленность, 1978. - 232 с.

8. А.М. Белоусов, М.А. Ленский Основы проектирования предприятий биотехнологической и бродильной промышленности. Нормы пожарной безопасности. - Бийск, БТИ АлтГТУ, 2005. - 198 с.

9. В.В. Бирюков Основы промышленной биотехнологии. - М.: КолосС, 2004. - 296 с.

10. В.А. Блинов Общая Биотехнология. Курс лекций. - Саратов: ФГОУ ВПО "Саратовский ГАУ", 2003 - 162 с.

11. А.И. Божков Биотехнология. Фундаментальные и промышленные аспекты. - Харьков, 2005 - 364 с.

12. А.В. Буров Основы биотехнологии. - СПб.: ГОУ ВПО СПБПУ РП. СПб., 2005. - 38 с.

13. Р.Г. Василов, В.Е. Лепский Биотехнология и общество. Сборник материалов форума Биотехнология и Общество. - М.: Изд-во «Когито-Центр», 2010. - 159 с.

14. У.Э. Виестур Биотехнология: Биотехнологические агенты, технология, аппаратура. - Рига: Зинатне, 1987. - 263 с.

15. А.Ю. Винаров, А.А. Кухаренко, В.И. Панфилов Лабораторные и промышленные ферментеры. - М.: РХТУ, 2004. - 97 с.

16. Н.А. Войнов, Т.Г. Волова, Н.В. Зобова Современные проблемы и методы биотехнологии. - Красноярск: ИПК СФУ, 2009.

17. Н.А. Войнов, Р.А. Степень, С.М. Воронин, Д.В. Буйко Улучшение экологичности и повышение эффективности биохимических производств. - Химия растительного сырья. - 1998. - №1. - С. 33-43.

18. Т.Г. Волова Биотехнология. - Новосибирск: Изд-во Сибирского отделения Российской Академии наук, 1999. - 252 с.

19. Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение. - М.: Мир, 2002. - 589 с.

20. Гончаренко Г.Г. Основы биотехнологии: учебно-методический комплекс для студентов биологических специальностей. - Гомель: УО «ГГУ им. Ф. Скорины», 2008. - 282 с.

21. Грачева И.М., Иванова Л.А. Биотехнология биологически активных веществ. - М., Издательство НПО «Элевар», 2006. - 453 с.

22. Гребенникова В.В. Биотехнология: сборник ситуационных задач с эталонами ответов. - Красноярск : тип. КрасГМУ, 2011. - 73 с.

23. Евтушенков А.Н., Фомичев Ю.К. Введение в биотехнологию. Курс лекций. - Мн.: БГУ, 2002. - 105 с.

24. Егорова Т.А., Клунова С.М., Живухина Е.А. Основы биотехнологии. - - М.: Издательский центр «Академия», 2003. - 208 с.

25. Ермишин А.П. Биотехнология. Биобезопасность. Биоэтика. - Мн.: Тэхналогія, 2005. -430 с.

26. Ефимова М.В. Введение в прикладную биотехнологию. - Петропавловск-Камчатский: КамчатГТУ, 2004. - 95 с.

27. Катлинский А.В. Курс лекций по биотехнологии. - М.: Московская медицинская академия им. И. М. Сеченова, 2005. - 152 с.

28. Коростелева Н.И., Громова Т.В., Жукова И.Г. Биотехнология. - Барнаул: АГАУ, 2006. - 127 с.

29. Кошелев Ю.А. и др. Краткий курс биотехнологии. - Бийск: Изд-во Алт. гос. техн. ун-та, 2009. - 77 с.

30. Крылов И.А. Комплексная переработка биомассы промышленных микроорганизмов. - М., 2001. - 84 с.

Размещено на Allbest.ru