Культивирование, выделение, очистка и идентификация продуцентов биомассы

Размещено на http://www.allbest.ru/

Введение

1. Культивирование продуцентов биомассы

1.1 Теоретические основы культивирования

1.2 Общие принципы культивирования

1.3 Оборудование в процессах культивирования

2. Выделение продуцентов биомассы

2.1 Общие принципы выделения продуцентов биомассы

2.2 Оборудование в процессах выделения

3. Очистка продуцентов биомассы

3.1 Общие принципы очистки продуцентов биомассы

4. Идентификация продуцентов биомассы

4.1 Общие принципы идентификации продуцентов биомассы

Заключение

Список использованных источников

Введение

Биотехнология - стремительно развивающаяся и интегрирующая наука, пронизывающая все биологические науки и направления исследований. Современная биотехнология - это междисциплинарная наука и отрасль производства, которая базируется на использовании биологических объектов и систем при получении пищевых продуктов, энергии, медицинских препаратов; при очистке сточных вод, переработке отходов и др. Междисциплинарная природа биотехнологии выражается в ее связи с такими науками, как генетика, микробиология, биохимическая и химическая технология и механика систем и аппаратов катализа. На развитие биотехнологии существенное влияние оказывают открытия в области генетической инженерии, иммунологии, технологии ферментации, биоэлектрохимии. Первое место в современной биотехнологии принадлежит генетической инженерии. Она предоставила исследователям новую, исключительно ценную возможность - изменять генетическую программу бактериальных, растительных и животных клеток, и тем самым как бы завершила формирование биотехнологии. Особенность развития многих перспективных направлений биотехнологии в значительной степени определяется необходимостью тесного международного сотрудничества.

Использование биотехнологических принципов и биологических процессов в производстве может существенно изменить многие направления развития промышленности и сельского хозяйства. Интерес к этой науке и отрасли человеческой деятельности в последние годы растет очень быстро.

Необходимость и важность, рассмотрения и совершенствования принципов основных технологических операций, подтверждается растущим интересом и потребностью со стороны общества. Исследования по совершенствованию должно быть сосредоточены в следующих областях, представленных основными технологическими процессами - культивированием биомассы и ее продуцентов, выделением и очисткой, а также идентификацией продуцентов биомассы.

1. Культивирование продуцентов биомассы

1.1 Теоретические основы культивирования

Стадии и кинетика роста микроорганизмов. Как известно, микроорганизмы, попав в свежую полноценную питательную среду, начинают размножаться не сразу. Этот период называют лаг-фазой - I фаза (рисунок 1). В этот период культура как бы привыкает к новым условиям обитания. Активируются ферментные системы, если необходимо, синтезируются новые ферментные системы, клетка готовится к синтезу нуклеиновых кислот и других соединений. Продолжительность этой фазы зависит от физиологических особенностей микроорганизмов, состава питательной среды и условий культивирования. Чем эти различия меньше и чем больше посевного материала, тем короче эта фаза.

Рисунок 1 - Кривая роста микроорганизмов (зависимость количества клеток от времени культивирования); I , II , III , IV , V , VI , VII - фазы роста

II фаза называется фазой ускоренного роста, она характеризуется началом деления клеток, увеличением общей массы популяции и постоянным увеличением скорости роста культуры; обычно она непродолжительна.

Затем следует логарифмическая, или экспоненциальная фаза роста - III фаза. В этот период отмечается максимальная скорость роста культуры, интервалы между появлением предыдущего и последующего поколения постоянны. Логарифм числа клеток линейно зависит от времени.

Вследствие интенсивного роста и размножения культуры запас необходимых питательных веществ в среде уменьшается. Это является основной причиной снижения скорости роста культуры. Кроме того, в среде накапливаются продукты метаболизма, которые в определенной концентрации могут мешать нормальному протеканию биохимических процессов обмена веществ. Иногда в питательной среде образуется так много клеток, что для новых поколений клеток не хватает пространства, а точнее, поверхности. Скорость роста снижается, уменьшается число делений клеток, наступает IV фаза - фаза замедления или уменьшения скорости роста.

V фаза называется стационарной (фазой линейного роста). Масса и количество всех живых клеток достигает максимума. Количество вновь образовавшихся клеток на этом этапе равно количеству клеток, отмерших и автолизованных (разрушенных клеточными ферментами).

В какой-то момент это равновесие нарушается и количество отмерших клеток превышает прирост. Наступает VI фаза - фаза ускорения отмирания.

Завершается цикл роста и развития популяции в замкнутом объеме VII фазой, характеризующейся отмиранием и автолизом микроорганизмов, которая называется фазой отмирания. На этой стадии биомасса клеток значительно уменьшается, так как запасные вещества клетки исчерпываются.

Кинетика роста микроорганизмов. Для выращивания любой культуры необходимы:

1) жизнеспособный посевной материал;

2) источники энергии и углерода;

3) питательные вещества для синтеза биомассы;

4) отсутствие ингибиторов роста;

5) соответствующие физико-химические условия (температура, рН среды, наличие или отсутствие кислорода и др.).

Если все эти требования выполнены, то скорость роста (увеличения биомассы) одноклеточных микроорганизмов с бинарным делением, размножающихся в условиях хорошо перемешиваемой периодической культуры, будет пропорциональна концентрации микробной массы, то есть:

, (1)

где d x / d t - скорость роста; м - коэффициент пропорциональности, обычно называемый удельной скоростью роста; х - концентрация биомассы (на сухой вес). Если м является постоянной величиной, то такой рост культуры микроорганизмов называют экспоненциальным или логарифмическим. Он имеет место тогда, когда состав микробной биомассы и условия окружающей среды остаются постоянными. Это относится и к смешанным культурам, в которых одноклеточные организмы равномерно распределены в культуральной среде.

Продукты микробного брожения и метаболизма. К продуктам микробного брожения и метаболизма относятся первичные метаболиты, вторичные метаболиты, ферменты и сама клеточная биомасса (так называемые белки одноклеточных микроорганизмов).

Первичные метаболиты - это низкомолекулярные соединения (молекулярная масса менее 1500 дальтон), необходимые для роста микробов; одни из них являются строительными блоками макромолекул, другие участвуют в синтезе коферментов. Среди наиболее важных для промышленности метаболитов можно выделить аминокислоты, органические кислоты, пуриновые и примидиновые нуклеотиды, витамины и др. Исходными штаммами для промышленных процессов служат природные организмы и культуры с нарушениями регуляции синтеза этих метаболитов, так как обычные микробные клетки не производят избытка первичных метаболитов.

Вторичные метаболиты - это низкомолекулярные соединения, образующиеся на более поздних стадиях развития культуры, не требующиеся для роста микроорганизмов. По химическому строению вторичные метаболиты относятся к различным группам соединений. К ним относят антибиотики, алкалоиды, гормоны роста растений, токсины и пигменты.

Сырье и состав питательных сред для биотехнологического производства. Питательная среда обеспечивает жизнедеятельность, рост, развитие биообъекта, эффективный синтез целевого продукта. Неотъемлемой частью питательной среды является вода, питательные вещества, которые образуют истинные растворы (минеральные соли, аминокислоты, карбоновые кислоты, спирты, альдегиды и т.д.) и коллоидные растворы (белки, липиды, неорганические соединения - гидроксид железа). Отдельные компоненты могут находиться в твердом агрегатном состоянии, могут всплывать, равномерно распределяться по всему объему в виде взвеси или образовывать придонный слой.

Сырье для питательных сред в биотехнологическом производстве. Сырье, используемое для получения целевого продукта, должно быть недефицитным, недорогим, по возможности легко доступным: меласса - побочный продукт производства сахара, компоненты нефти и природного газа, отходы сельского хозяйства, деревообрабатывающей и бумажной промышленностей и т.д. Наиболее часто в качестве компонентов питательных сред используются отходы пищевых производств.

Свекловичная меласса - отход производства сахара из свеклы, богата органическими и минеральными веществами, необходимыми для развития микроорганизмов. Она содержит 45-60 % сахарозы, 0,25-2,0 % инвертного сахара, 0,2-3,0 % рафинозы. Кроме того, в мелассе содержатся аминокислоты, органические кислоты и их соли, бетаин, минеральные вещества, а также некоторые витамины. Используется для промышленного производства лимонной кислоты, этанола и других продуктов.

Мелассная барда - отход мелассно-спиртового производства. Химический состав барды зависит от состава исходной мелассы и колеблется в широких пределах. По своему химическому составу мелассная барда является полноценным сырьем для производства кормовых дрожжей, не требующим добавок ростовых веществ, так как содержит достаточное количество витаминов. Содержание сухих веществ в натуральной барде - 8-12 %, в упаренной барде - 53 %.

Зерно-картофельная барда - отход спиртового производства. Содержание растворимых сухих веществ обычно составляет 2,5-3,0 %, в том числе 0,2-0,5 % редуцирующих веществ, имеются источники азота и микроэлементы. Применяется для получения микробного белка.

Отходы пивоварения (пивная дробина и солодовые ростки), а также отходы подработки несоложеного ячменя являются подходящим, однако небольшим источником усвояемых углеводов для получения микробного белка. Для производства кормовых дрожжей это сырье соответствующим образом гидролизуют и вводят в питательную среду в соотношении 8: 0,2 : 0,05 (дробина : ростки : отходы ячменя).

Пшеничные отруби - отход мукомольного производства, используется для приготовления питательных сред при твердофазном способе культивирования. Имеют богатый химический состав и могут использоваться в качестве единственного компонента питательной среды. Так как пшеничные отруби являются дорогим продуктом, их смешивают с более дешевыми компонентами: древесными опилками, солодовыми ростками, фруктовыми выжимками и т.д.

Молочная сыворотка - отход производства сыров, творога и казеина. В связи с этим различают подсырную, творожную и казеиновую сыворотку. По химическому составу и энергетической ценности данный продукт считают «полумолоком». Молочная сыворотка очень богата различными биологически активными соединениями, ее сухой остаток содержит в среднем 70-80 % лактозы, 7-15 % белковых веществ, 2-8 % жира, 8-10 % минеральных солей. Кроме того, молочная сыворотка имеет в своем составе значительное количество гормонов, органических кислот, витаминов и микроэлементов.

Наличие в молочной сыворотке легко усвояемых многими видами микроорганизмов источников углерода, а также различных ростовых факторов, выдвигает ее в ряд наиболее ценных питательных сред для получения продуктов микробного синтеза, например, для производства белковых препаратов в промышленных масштабах. Большое значение имеет и то обстоятельство, что применение молочной сыворотки не требует специальной сложной подготовки, а культуральная жидкость после выращивания микроорганизмов может быть использована в пищевых и кормовых целях без обработки.

Состав питательных сред. Питательные среды могут иметь неопределенный состав, то есть включать биогенные (растительные, животные, микробные) добавки - мясной экстракт, кукурузную муку, морские водоросли и т.д. Применяют также среды, приготовленные из чистых химических соединений в заранее определенных соотношениях - синтетические среды.

В состав практически любой питательной среды входят такие компоненты, как вода, соединения углерода, азота, фосфора и других минеральных веществ, витамины.

Вода. Вода должна отвечать требованиям ГОСТ (чистая, бесцветная, без привкуса, запаха и осадка).

Источники углерода. Легкодоступными считаются сахара: глюкоза, сахароза, лактоза, за ними следуют многоатомные спирты: глицерин, маннит и др. Далее следуют полисахариды: целлюлоза, гемицеллюлоза, крахмал, которые могут быть источниками углерода либо после превращения их в усвояемые микроорганизмами моно- и низкомолекулярные олигосахариды, либо микроорганизмы должны иметь набор ферментов, гидролизующих эти вещества. Такими микроорганизмами являются плесневые грибы родов Aspergillus, Penicillium, бактерии рода Bacillus и другие.

На практике встречается большое количество микроорганизмов, которые успешно утилизируют органические кислоты, особенно в анаэробных условиях.

Низкомолекулярные спирты: метанол и этанол - относятся к числу перспективных видов сырья. Многие дрожжи родов Candida, Hansenula и др. способны ассимилировать этанол. Дрожжи родов Pichia, Candida и другие, бактерии рода Flavobacterium используют в качестве единственного источника углерода метанол.

Некоторые виды микроорганизмов (незначительная часть) используют в качестве источника углерода и энергии углеводороды: н-алканы и некоторые фракции нефти.

Источники азота. Азот может содержаться в форме неорганических солей или кислот. Большинство дрожжей хорошо усваивает аммиачные соли, а также аммиак из водного раствора, потребность в нитратах испытывают только некоторые виды дрожжей. Источником азота могут служить и органические соединения: аминокислоты, мочевина и т.д., которые легко усваиваются микроорганизмами.

Известно, что бактерии более требовательны к источникам азота, чем другие микроорганизмы (грибы, актиномицеты и дрожжи).

Источники фосфора. Фосфор является важнейшим компонентом клетки. Он входит в состав АТФ (аденозинтрифосфата), АДФ, АМФ и тем самым обеспечивает нормальное течение энергетического обмена в клетке, а также синтез белков, нуклеиновых кислот и другие процессы биосинтеза. Фосфор вносят в среду в виде солей фосфорной кислоты.

Источники витаминов и микроэлементов. Потребность микроорганизмов в этих соединениях различна, тем не менее, практически все микроорганизмы лучше растут в присутствии витаминов. Эффективной добавкой к питательным средам оказался кукурузный экстракт благодаря наличию в нем витаминов, аминокислот и минеральных элементов в легко ассимилируемых формах. В рецептуры сред включают также дрожжевой автолизат, дрожжевой экстракт, сок картофеля, молочную сыворотку, экстракт солодовых ростков и другие продукты. Микроэлементы в состав питательных сред вводят в микродозах, в противном случае они оказывают ингибирующее действие на микробные клетки.

При составлении питательной среды для конкретного вида микроорганизма подбираются наиболее подходящие источники углерода, азота, фосфора и других веществ. [10, 30, 16]

1.2 Общие принципы культивирования

Главным направлением биотехнологии является интенсификация производственных процессов, что достигается внедрением новых высокопродуктивных биологических объектов, подбором подходящего сырья для выращивания продуцента, разработкой наилучшей конструкции биореактора, а также усовершенствованием способов выделения и очистки целевого продукта.

Питательные среды для выращивания объектов биотехнологии, т.е. продуцентов тех или иных соединений, могут быть неопределенного состава и включать различные биогенные добавки (растительные, животные или микробные) - мясной экстракт, кукурузную муку, морские водоросли и т. п. Применяются также среды из чистых химических соединений определенного состава, так называемые синтетические.

Компонентный состав сред определяется питательными потребностями продуцента. Во многих процессах используют в качестве объектов гетеротрофные организмы, которые в настоящее время подразделяются на:

органоавтотрофы (употребляющие органические вещества как источники энергии);

литогетеротрофы (использующие органические вещества как источники углерода);

органогетеротрофы (для которых органические вещества служат и источниками энергии, и источниками углерода).

Для приготовления питательных сред в биотехнологии используются разнообразные субстраты, которые должны удовлетворять определенным критериям. Субстрат представляет собой сырье для получения целевого продукта и должен быть недефицитным, дешевым, по возможности легкодоступным.

Достаточно хорошо утилизируемым источником углерода для биотехнологических целей является растительная биомасса и, в меньшей степени, биомасса животных организмов. На основе этих источников основано давно существующее производство алкоголя из зерна исыра из молока.Растительныеисточники могут рассматриваться как практически неистощимые. Наибольшая доля биомассыобразуетсяв виде древесины. Продукция сельского хозяйствасоставляетлишь 6 % первичнойпродукции за счет фотосинтеза, хотя именно из этого количества получается основная часть пищи для людей и животных, а также многие необходимые материалы (например, для текстильной и бумажной промышленности).

Биомасса сельского и лесного хозяйства в настоящее время является значительным экономическим потенциалом во многих странах, в первую очередь в тропических и субтропических регионах.

Источником природного сырья являются сельское хозяйство и отрасли лесоводства. Получаемые в этих отраслях материалы представляют собой соединения различной химической сложности и включают сахара, крахмал, целлюлозу, гемицеллюлозу и лигнин.

Наиболее подходящим и доступным питательным субстратом для биотехнологических процессов является сырье, используемое в производстве сахара - сахарная свекла и сахарный тростник. Однако в настоящее время в мире традиционное использование сахара постепенно снижается, и он заменяется более эффективными подсластителями. Уже сейчас сахарный тростник используется в качестве субстрата для бразильской "топливной" программы (производство этанола как горючего для двигателей внутреннего сгорания). Бразильский пример быстро убеждает многие другие страны в перспективности такой новой технологии.

Существенную значимость представляют крахмалосодержащие сельскохозяйственные продукты, включающие различные злаки, такие как кукуруза, рис, пшеница, картофель, различные корнеплоды, сладкий картофель и маниока.

Половину высушенной растительной массы как сельскохозяйственного, так и "лесного" происхождения составляет один из самых распространенных биополимеров - полисахарид целлюлоза, являющийся ценным источником энергии и углерода. Чистая целлюлоза может быть довольно легко разрушена путем химического или ферментативного гидролиза до растворимых сахаров, которые затем легко подвергаются ферментации (сбраживанию) микроорганизмами с образованием этанола, бутанола, ацетона, одноклеточного белка, метана и многих других продуктов. В этом плане значительные успехи достигнуты в США, Швеции, Британии.

Наибольшие трудности встречаются при попытках утилизации древесины, в которой целлюлоза находится в комплексе с гемицеллюлозой и лигнином. Лигноцеллюлозные комплексы характеризуются очень высокой степенью устойчивости к биодеградации.

Использование побочных продуктов в качестве сырья для биотехнологии. Одной из главных задач биотехнологии является максимальное использование огромных объемов органических отходов, повсеместно образующихся в мировом производстве. Биотехнологическая утилизация этих отходов, во-первых, обеспечит удаление источников загрязнения (например, сточных вод), а во-вторых, обусловит превращение этих отходов в полезные целевые продукты. Так, многие побочные материалы пищевой промышленности оказываются экономически малозначащими и часто выбрасываются в магистральные водные системы, обусловливая мощное загрязнение внешней среды. В связи с этим, весьма перспективной может быть разработка технологии их утилизации в качестве биотехнологического сырья, с извлечением двойной выгоды.

Широко распространенными видами отходов, которые нашли уже сейчас применение в биотехнологических процессах в качестве сырья для ферментации, являются меласса (черная патока) и молочная сыворотка. Меласса представляет собой побочный продукт, появляющийся при производстве сахара, и содержит до 50 % сахаров. Меласса широко используется как питательный субстрат для ферментационных процессов в производстве антибиотиков, органических кислот и коммерческих дрожжей для хлебопечения; помимо этого, она используется в чистом виде в качестве добавки в корма животным. Сыворотка, получаемая при производстве сыра, также может быть использована в качестве питательного субстрата для ферментации.

Более сложные продукты отходов, такие, как солома и жом (отход сахарного производства), также имеющиеся в больших количествах и во многих местах, по мере улучшения процессов расщепления лигноцеллюлозных соединений все больше находят применение в биотехнологических производствах.

Химические и нефтехимические субстраты. С развитием биотехнологических процессов в коммерческих масштабах для производства одноклеточного белка, а также ряда других органических продуктов многие питательные вещества химического и нефтехимического происхождения приобретают важную роль в качестве питательных субстратов для ферментации. Преимущество таких субстратов состоит в том, что их можно получать в различных странах мира. Например, метанол и этанол. Наилучшим субстратом из компонентов нефти являются n-алканы с числом углеродных атомов от 10 до 20. Их могут утилизировать большинство бактерий и дрожжи. Однако и нефть, и газ также истощаются. Поэтому биотехнологии ориентируются на возобновляемые источники сырья. Большое внимание уделяется различным видам растительной массы: плоды, соки, клубни, травяная масса и упоминавшаяся выше древесина. Используются также отходы сельского хозяйства, деревообрабатывающей и бумажной промышленности, а также многих отраслей пищевой промышленности. Возможность использования перечисленных сырьевых материалов является основой создания безотходных производств.

Наиболее важным критерием, определяющим выбор сырья для биотехнологических процессов, являются: стоимость, наличие в достаточных количествах, химический состав, форма и степень окисленности источника углерода и т. п. В настоящее время наиболее широко используемыми и коммерчески выгодными материалами являются крахмал (преимущественно кукурузный), метанол, меласса и сырой сахар. Практически нет сомнения в том, что зерновые (в частности, кукуруза, рис и пшеница) будут основными краткосрочными сырьевыми материалами для биотехнологических процессов именно в тех странах, где развиты интенсивные биотехнологические процессы.

Следует отметить, что биотехнология на современном этапе своего развития преимущественно ориентируется на различные виды недорогого, легкодоступного и возобновляемого сырья, наиболее значимым из которого является растительная масса. При конверсии субстратов в биотехнологических процессах основное внимание обращается на создание безотходных производств, когда побочные продукты одного процесса служат питательными субстратами для последующего.

В большинстве случаев биотехнологические процессы рассчитаны на использование живых клеток и тканей различного происхождения, и даже в инженерной энзимологии применение молекул ферментов сопряжено с рядом ограничений, присущих живым клеткам или тканям. К их числу относят поддержание оптимальных температуры (достаточно низкой), pH, стерильности, концентрации растворенного кислорода (в случаях эксплуатации биообъектов - аэрофилов). Микробные клетки, за редким исключением (например, микоплазмы), и клетки растений имеют клеточную стенку, которой не обладают клетки животных организмов; вирусы как организованные частицы реплицируются и паразитируют на живых культурах клеток или в тканях, поэтому отмеченные выше ограничения относятся больше к этим последним, а не к вирусным частицам. Наличие клеточной, стенки у биообъекта заведомо обеспечивает ему более высокую устойчивость в различных условиях существования, чем биообъектам, лишенным клеточной стенки. Даже при большой густоте, например, бактерий, они активно размножаются, если им обеспечиваются достаточные пищевые потребности.

Вирусам - как облигатным паразитам - присуща еще и весьма высокая специфичность применительно к организмам-хозяевам (вирусы бактерий, грибов, растений, животных) и, даже тканям (вирусы бешенства и полиомиелита - в отношении нервной ткани, вирус оспы - в отношении кожи, аденовирусы - в отношении железистой ткани).

Таким образом, особенности биообъектов обусловливают следующие принципы технического оснащения биопроизводств:

конструкционное совершенство и относительная универсальность биореакторов;

инертность, или коррозионная стойкость материалов биореакторов и другого технологического оборудования, вмещающих биообъект или контактирующих с ним или продуктами его метаболизма;

эксплуатационная надежность технологического оборудования;

доступность, эстетичность и легкость обслуживания, замены, смазки, чистки, обработки антисептиками или дезинфектантами узлов и соответствующих частей оборудования.

Согласно первому принципу желательно конструировать такие биореакторы, которые можно использовать для реализации биотехнологических процессов, основанных на использовании разных биообъектов (бактерий, грибов, клеток растений и млекопитающих). Под совершенством и относительной универсальностью следует понимать возможность создания оптимальных условий культивирования разных биообъектов в одном и том же биореакторе с автоматическим регулированием заданных параметров. Многоцелевые реакторы высоких стандартов изготавливает нидерладская фирма ADI (Applikon Dependable Instruments). Они пригодны для флокулирующих организмов, иммобилизованных клеток (микробных, растительных, животных) в целях повышения выхода биомассы и достижения их выраженной продуктивности. (см. рисунок 2)

Рисунок 2 - Многоцелевой биопрцессор ADI 1020

Чтобы обеспечить биореакторы компьютерным контролем, фирма ADI выпускает биопроцессор, с помощью которого обеспечивается полное регулирование заданных параметров в течение роста биообъекта Заманчивой представляется конструкция ферментатора в виде циклонной колонны, создающей возможность проведения периодических, непрерывных и фазовых ферментаций, и обеспечивающей новые подходы к оценке клеточных циклов и поведению самих клеток.

Поддержание заданных параметров - дело не простое, когда непрерывно изменяются условия культивирования биообъекта вследствие многокомпонентности исходной питательной среды и культуральной жидкости на заключительной стадии ферментации, изменения pH в процессе роста, размножения и развития биообъекта, сложности регуляторных механизмов при биосинтезе целевых продуктов, к тому же возможно - нестабильных, различный уровень структурно-функциональной дифференцировки акариот, прокариот и эукариот, и пр. Лишь при эксплуатации в колоннах иммобилизованных ферментов аппаратурное оформление технологических процессов существенно отличается от оформления процессов, когда используют, прежде всего, специальные биореакторы.

Второй принцип технического оснащения касается инертности материалов, используемых для изготовления биореакторов и другого технологического оборудования. Это означает, что в процессе культивирования биообъекта как будто не будет происходить его взаимодействия (равно как и продуктов метаболизма) с металлическими и неметаллическими конструкциями, постоянно или временно находящимися в контакте с ним.

Реально при выборе конструкционных материалов ферментаторов необходимо учитывать тот факт, что эти аппараты в процессе работы подвергаются механическим, химическим и физическим (тепловым) воздействиям. Стерилизацию ферментаторов осуществляют острым паром при 127-130°С с последующим охлаждением до 24-28°С. В результате непрерывной аэрации культуральной жидкости внутренние поверхности аппаратов испытывают постоянное окисляющее действие кислорода; кроме того, развитие продуцента сопровождается выделением в среду агрессивных метаболитов (например, органических кислот).

Весьма существенно также влияние на стенки аппарата интенсивных газожидкостных потоков, кавитации, вибрации; содержание в среде абразивных примесей - частиц масла и муки - создает дополнительный истирающий эффект.

Для обеспечения стерильности необходима систематическая обработка аппарата моющими средствами и антисептиками (растворами триполифосфата, хлорамина, формалина).

Материалы, идущие на изготовление ферментационного оборудования, должны быть химически стойкими и не подвергаться коррозии в течение длительного времени эксплуатации. Коррозия (от лат. corrosion - разъедание) - это процесс молекулярного разрушения материала (ограниченного - локального или распространенного) под воздействием внешних факторов. Коррозионные процессы можно подразделить на 3 большие группы: химическая, физическая (электрохимическая) и биологическая коррозии. Химическая коррозия индуцируется сухими газами и жидкостями, неспособными проводить электрический ток. Физическая- (электрохимическая) коррозия имеет место в случаях возникновения местных электрических токов - гальванокоррозия, например, в конструкциях, где контактируют несколько металлов с разными электродными потенциалами (электролиты здесь особенно благоприятны для протекания электрохимической коррозии). Возникновение такой коррозии возможно даже при неоднородности одного и того же металла в случае его неравноценной обработки на отдельных участках.

Биологическая коррозия обусловливается биологическими объектами (бактериями, микромицетами и другими организмами). По механизму развития биокоррозию можно отнести к химической. Однако наличие биообъекта в среде и на объекте коррозии привносит дополнительный фактор - клеточную биомассу (фактор обрастания или/и зарастания). Поэтому биокоррозия нередко сопрягается с биоповреждением. Биоповреждение - понятие более широкое, чем биокоррозия. В биотехнологии, где среды чаще не агрессивны, применяют обычные углеродистые стали с повышенной прочностью и выраженной упругостью. Нержавеющая сталь сохраняет большую стойкость в условиях атмосферной коррозии.

Крупнейшие отечественные заводы антибиотиков были оснащены ферментаторами из углеродистой стали марки Ст-3. Однако по отношению к углеродистой стали культуральные жидкости оказались агрессивными. По данным ВНИИА скорость коррозии стали марки Ст-3 достигает 0,2-0,4 мм/год; по стандартной классификации такой показатель соответствует 6 баллам, т.е. характеризует материал пониженной стойкости. При этом происходит не только уменьшение толщины стенок аппаратов, но возможно также появление раковин и каверн. Железо, попадая в среду, подавляет активность ферментов продуцента, угнетает биосинтез, инактивирует некоторые антибиотики.

Несмотря на коррозию, возможность использовать стальные ферментаторы обусловлена образованием на внутренних поверхностях аппаратов пассивирующей пленки, которая состоит из окислов железа и веществ, выделившихся из среды. Эта пленка замедляет коррозию.

Хорошо удовлетворяет всем требованиям, предъявляемым к материалам для ферментационной аппаратуры, хромоникелевая нержавеющая сталь марки Х18Н10Т, которая содержит 0,01% углерода, 18% хрома, 10% никеля и менее 1% титана. Аппараты из этой стали долговечны, удобны в эксплуатации, "универсальны11, то есть пригодны для производства любых антибиотиков, витаминов, ферментов и других БАВ. Однако высоколегированная сталь очень дорога, поэтому ферментаторы вместимостью 32 м3 и более изготовляют из двухслойной стали: корпус - из Ст-3, внутренний тонкий слой - из хромоникелевой стали.

Обычно кислотоустойчивые и нержавеющие стали - это сплавы железа с хромом и легированные в целях улучшения их сопротивляемости молибденом, никелем, титаном, марганцем и другими элементами. Содержание углерода в них порядка 0,15%. Жаропрочные стали включают железо, хром, никель; их используют для изготовления арматуры печей, муфелей, воздухоподогревателей. Вольфрам и молибден используют в качестве легирующих веществ.

В биотехнологии также широко применяют чугун, из которого делают компрессоры, поршневые кольца, рамы фильтрпрессов и др.; некоторые чугунные аппараты покрывают эмалью. Хром, никель, молибден - как легирующие элементы повышают жаростойкость и химическую стойкость чугуна. Такой чугун полезен, например, для изготовления отдельных частей барабанных сушилок, работающих при повышенных температурах.

Различные конструкции, используемые во многих аппаратах, состоят из алюминия (или включают его). Этот металл быстро подвергается электрохимической коррозии, но вследствие легко образующейся окисной защитной пленки, дальнейшее разрушение алюминия прекращается. Продукты его коррозии не ядовиты.

Стекло, полиэтилен, "пищевая" резина и другие полимерные материалы также широко используют в биотехнологических процессах.

Защиту материалов от коррозионных процессов осуществляют различными способами: применяют специальные ингибиторы химической и биологической коррозии, катодную и протекторную защиту- от электрохимической коррозии.

Третий принцип технического оснащения биопроизводств касается эксплуатационной надежности технологического оборудования. Эта надежность обеспечивается соответствием аппаратов, приборов и другого оборудования целевому назначению, в частности, по конструкционному совершенству, полностью обеспечивающему оптимальные условия для протекания технологического процесса и контроля за ним (в том числе, с учетом требований по технике безопасности). Лишь в подобных случаях достигают максимально возможной интенсивности работы оборудования.

Критерием оптимальности работы аппарата выступает себестоимость продукции.

Интенсивность работы оборудования может быть повышена за счет автоматизации и замены периодических процессов непрерывными, снижения энергоемкости аппаратов благодаря уменьшению расхода энергии на единицу сырья или конечного продукта.

Эксплуатационная надежность технологического оборудования обеспечивается также стабильностью его работы в заданном режиме и временном интервале, при максимальном соответствии условий труда физическим и психическим возможностям людей, занятых в конкретном производстве (эргономика).

Рассмотренный третий принцип напрямую связан с экономикой биотехнологического процесса. Оборудование с высокими конструктивными и эксплуатационными показателями обеспечивает, как правило, и высокие экономические показатели.

Четвертый принцип технического оснащения биопроизводств касается эстетичности, легкости и удобства обслуживания, замены, смазки, чистки, обработки антисептиками или дезинфектантами узлов и соответствующих частей оборудования.

Любой прибор или аппарат, легко доступный для сборки и разборки, загрузки материалами, питательными средами и выгрузки, для чистки, мойки, смазки, ремонта и пр., оценивается выше, чем оборудование с усложненным доступом к его частям.

Масса аппаратов, используемых, например, в микробной биотехнологии, различна, и требования здесь определяются большей частью экономическими соображениями. Применительно к ферментаторам различают следующие типы их: лабораторные емкостью 0,5-100 л, пилотные емкостью 100л-10 м3, промышленные емкостью 10-100 м3 и более. При масштабировании добиваются соответствия важнейших характеристик процесса, а не сохранения принципа конструкции.

Применяемое в биотехнологии оборудование должно вносить определенную долю эстетичности в интерьер цеха или отделения ("ласкать глаз"). В ходе его эксплуатации и вне ее оборудование должно быть легко доступным, содержащимся и функционирующим в определенных рамках требований гигиены и санитарии.

В случае замены каких-либо частей или деталей в аппарате, смазки и чистки узлов при текущем ремонте, и т. д., загрязнения не должны попадать внутрь биореакторов, в материальные поточные коммуникационные линии, в конечные продукты.

Техническую вооруженность биотехнологических процессов целесообразно условно ограничить аппаратурным оформлением производств, базирующихся на культивировании:

1) бактерий и грибов,

2) клеток и тканей растений,

3) клеток и тканей животных организмов и человека.

Такое подразделение обусловлено тем, что бактерии и грибы в большинстве своем выращивают в однотипных биореакторах, имеющих почти однотипную обвязку, в которую входят: ферментатор, многокорпусный вентиль стерильный (для подачи питательной среды, посевного материала, подпитки и пр.), системы регулирования pH, подачи пеногасителя, система контроля расхода воздуха, пробоотборник, электродвигатель.

Растительные клетки, имеющие клеточную стенку (также как бактерии и грибы) растут, размножаются и развиваются значительно дольше, чем большинство бактерий и грибов, а это вносит определенные коррективы в аппаратурное оформление соответствующих биотехнологических процессов.

Культуры клеток животных и человека, не имеющие клеточных стенок, являются более ранимыми и требовательными к условиям своего существования, чем клетки других эукариот и прокариот. Поэтому оборудование для них можно отнести к разряду "тихоходного", обеспечивающего нежное обращение с биообъектами.

Несомненно, в отдельных случаях допустимы исключения, например, когда возможно культивирование в глубинных условиях некоторых растительных клеток (суспензионная культура женьшеня), используя ферментационное оборудование, рассчитанное на выращивание, например, бактерий или грибов.

К. Шюгерль в 1982 г. предложил подразделить биореакторы на 3 основные группы согласно способу потребления энергии для перемешивания и диспергирования стерильного воздуха (газа):

в биореакторах I типа энергия расходуется на механическое движение внутренних устройств;

в биореакторах II типа энергия расходуется на работу внешнего насоса, обеспечивающего рециркуляцию жидкости и/или газа;

в биореакторах III типа энергия расходуется на сжатие и подачу газа в культуральную жидкость. [3, 6, 19]

1.3 Оборудование в процессах культивирования

Человек с древнейших времен эмпирически применял дрожжевые организмы в примитивных по аппаратурному оформлению биотехнологических процессах (хлебопечение, виноделие и пр.). Развитие промышленности антибиотиков продвинуло далеко вперед проблему создания специальной аппаратуры для культивирования микробов - продуцентов БАВ (аминокислот, антибиотиков, полисахаридов, витаминов, ферментов и других соединений). Были предложены различного типа биореакторы для выращивания микроорганизмов, однако все конструкции ферментаторов (ферментеров) оставались в основном сходными по большинству параметров и, усредненно, их можно подразделить на 2 типа: без подводки стерильного воздуха (для анаэробов) и с подводкой его (для аэробов). Аэрируемые биореакторы могут быть с мешалками и без них (рисунок 3).



Рисунок 3 - Ферментатор периодического действия (1 - турбинная трехярусная мешалка, 2 - охлаждающий змеевик, 3 - секционная рубашка, 4 - отражательная перегородка, 5 - барботер, П-пар); I-XI - материальные и вспомогательные трубопроводы с запорно-регулирующими устройствами (I - посевная линия, II -подача стерильного сжатого воздуха, III - подача пара, IV - удаление отработанного воздуха, V - загрузочная линия, VI - линия введения добавок, VII - подача пеногасителя, VIII - подача моющего раствора, IX - пробоотборник, X - выдача продукта, XI - выдача в канализацию через нижний спуск)

В последние годы апробированы мембранные биореакторы, биореакторы с полыми волокнами и некоторые другие. При расчете и конструировании биореакторов необходимо учитывать время протекания различных биологических процессов у представителей различных групп организмов (рисунок 4.).

Рисунок 4 - Ориентировочное усредненное время протекания биологических процессов у различных групп организмов: 1 - репликация хромосомы, 2 - продолжительность клеточного цикла, 3 - бактерии, 4 - дрожжи, 5 - плесени, б - растительные и животные клетки, 7 - элементарные химические реакции, 8 - регуляция транскрипции, 9 - аллостерическая регуляция белков, 10 - изменение концентрации ферментов, 11 - возникновение мутантов

Размеры ферментаторов определяются соотношением внешнего диаметра к высоте, который варьирует обычно в пределах от 1:2 до 1:6. Почти универсальными и чаще используемыми являются ферментаторы для анаэробных и аэробных процессов. Эти ферментаторы в свою очередь классифицируют по способу ввода в аппарат энергии для перемешивания (таблица 1): газовой фазой (ФГ), жидкой фазой (ФЖ), газовой и жидкой фазами (ФЖГ). С использованием указанных выше классификаций удается разработать единые методы инженерных расчетов основных конструктивных элементов и режимов работы ферментаторов.

Таблица 1 - Классификация ферментаторов по способу ввода энергии для перемешивания

Ферментаторы	Характеристика конструкции аппарата	Тип аппарата
ФГ с подводом энергии газовой фазой	Простота конструктивного оформления и высокая надежность в связи с отсутствием движущихся узлов и деталей	Барботажный, барботажно-эрлифтный, колоночный (колонный), форсуночный
ФЖ с подводом энергии жидкой фазой	Обычно энергия передается жидкой фазе самовсасывающей мешалкой или насосом	Эжекционный, с циркуляционным контуром, с всасывающей мешалкой
ФЖГ (комбинированные)	Основным конструктивным элементом является перемешивающее устройство, обеспечивающее высокую интенсивность растворения кислорода и высокую степень диспергирования газа. В то же время энергия газовой фазой выводится обычным способом	Барботажный с механическим перемешиванием

Ферментаторы указанных трех групп имеют большое количество общих элементов. Различие же состоит в конструкциях аэрирующих и перемешивающих устройств. Примером конструктивного оформления ферментатора группы ФГ может быть аппарат с эрлифтом вместимостью 63 м3 В аппарате отсутствует механическое перемешивание, поэтому проще поддерживать асептические условия. Воздух для аэрации среды подается по трубе, расположенной вертикально в ферментаторе.

Аэратор, конструкция которого обеспечивает вихревое движение выходящего воздуха, расположен в нижней части диффузора и насыщает питательную среду воздухом. Газожидкостная смесь поднимается по диффузору и перемешивается через его верхние края. В этой же зоне часть воздуха уходит из аппарата, и более плотная среда опускается вниз в кольцевом пространстве между корпусом ферментатора и диффузором. Так происходит многократная циркуляция среды в ферментаторе. Для отвода биологического тепла внут-ри ферментатора установлеи змеевик, а также - диффузор, рубашка, труба.

Недостатком этих аппаратов является низкая интенсивность массообмена по кислороду. Известны ферментаторы этого типа объёмом 25, 49, 63 и 200м3.

Широкое распространение в производстве кормового белка получили ферментаторы с самовсасывающими мешалками (рисунок 5). Это ферментаторы из группы ФЖ. Для выращивания чистой культуры дрожжей созданы ферментаторы вместимостью 0.32, 3.2 и 50 м3. Ферментатор представляет собой вертикальный цилиндрический аппарат, снабженный циркуляционными, теплообменными и аэрирующими устройствами. В качестве циркуляционных устройств использованы системы направляющих диффузоров, разграничивающих восходящие и нисходящие потоки.

Рисунок 5 - ферментатор с самовсасывающей мешалкой непрерывного действия: 1 - корпус, 2 - диффузор, 3 - самовсасывающая мешалка, 4 - теплообменник, 5 - фильтр

Теплообменные устройства выполнены в виде трубок, установленных в трубных решетках диффузоров.

На предприятиях микробиологической промышленности при выращивании дрожжей в средах с жидкими парафинами также применяют ферментаторы с самовсасывающими мешалками непрерывного действия. Аппарат такого типа представлен на рисунке 5. Емкость его 800 м3 (рабочий объем 320 м3) разделена на 12 секций. Ферментационная среда последовательно проходит все секции, и из последней выходит культуральная жидкость с минимальным содержанием н-парафинов и максимальной концентрацией биомассы. В каждой секции установлено перемешивающее и аэрирующее устройство и змеевики для отвода тепла.

Ферментаторы периодического действия из групп ФЖГ применяют с 1944 г. в промышленности для получения антибиотиков, витаминов и других биологически активных веществ. Его конструкция обеспечивает стерильность ферментации в течение длительного времени (нескольких суток) при оптимальных условиях для роста и жизнедеятельности продуцента. Ферментаторы такой конструкции изготавливают на 1,25; 2,0; 2,5; 3,2; 4,0; 5,0; 6,3; 10,0; 16,0; 20,0; 32,0; 50,0; 63,0; 100,0 и 160,0 м3. Как видно из рисунка, это цилиндрический вертикальный аппарат со сферическим днищем, снабженный аэрирующим, перемешивающим и теплопередающим устройствами. Воздух для аэрации поступает в ферментатор через барботер, установленный под нижним ярусом мешалки. С точки зрения эффективности диспергирования воздуха конструкция барботера принципиальной роли не играет при наличии мешалки, однако, с точки зрения эксплуатации, наиболее удобным является квадратный барботер, который получил наибольшее распространение. Отверстия в барботере направлены вниз, во избежание засорения биообъектами. Общая площадь отверстий должна быть на 25% больше площади поперечного сечения трубопровода, подводящего воздух. Барботер по своим размерам должен соответствовать диаметру мешалки, чтобы выходящий из него воздух попадал в зону ее действия.

Эффективность работы ферментатора определяется прежде всего необходимой интенсивностью перемешивания. Перемешивающие устройства служат для сохранения равномерного температурного поля по всему объему аппарата, своевременного подвода продуктов питания к клеткам и отвода от них продуктов метаболизма, а также интенсификации массопередачи кислорода.

Для культуральных жидкостей с высокой структурной вязкостью наиболее эффективными являются открытые турбинные мешалки с шестью лопастями. Выбраны более или менее оптимальные соотношения размеров мешалки (dM/Д= 0,3-0,4, где dM - диаметр мешалки, Д - диаметр аппарата). Количество ярусов мешалки определяется высотой столба жидкости. Оптимальное межярусное расстояние (hя) = (1,5-1,8) dM. Расстояния от верхнего яруса мешалки до уровня жидкости в ферментаторе (Нж1) должно быть > dM и от нижнего яруса мешалки до дна аппарата (0,8-1,1) dM.

Для создания в ферментаторе условий "полного отражения", во избежание образования вращательного контура, который резко снижает интенсивность перемешивания, в аппарате устанавливают отражательные перегородки (отбойники). Ширина их составляет (0,1-0,12) dM. Обычно рекомендуют устанавливать 4 отражательных перегородки, несколько отступая от стенок ферментатора.

Важным элементом в конструкции ферментатора являются теплообменные устройства. Применение высокопродуктивных штаммов биообъектов, концентрированных питательных сред, высокий удельный расход мощности на перемешивание - все эти факторы сказываются на существенном возрастании тепловыделений, и для отвода тепла в ферментаторе устанавливают наружные и внутренние теплообменные устройства. Промышленные ферментаторы, как правило, имеют секционные рубашки, а внутри аппарата - четыре змеевика. [7, 19, 26]

2. Выделение продуцентов биомассы

2.1 Общие принципы выделения продуцентов биомассы

Завершающие стадии биотехнологических процессов - выделение целевого продукта - существенно различаются в зависимости от того, накапливается продукт в клетке, или он выделяется в культуральную жидкость, или же продуктом является клеточная биомасса. Наиболее сложным является выделение внутриклеточного продукта. При этом клетки необходимо отделить от среды культивирования, подвергнуть их разрушению, а затем целевой продукт очистить от остатков разрушенных клеток.

Выделение продукта существенно облегчается, если он экскретируется продуцентом в культуральную жидкость. Поэтому одной из насущных задач биотехнологии является создание промышленных штаммов микроорганизмов, секретирующих возможно большее число ценных продуктов в значительных количествах.

Технология выделения и очистки в значительной степени определяется природой целевого продукта. В ряде случаев существует возможность не использовать тщательную очистку продукта, если он обладает требуемыми активностями в неочищенном состоянии и если примесь посторонних веществ не оказывает каких-либо нежелательных влияний при его использовании. Некоторые традиционные биотехнологические процессы вообще исключают этап отделения продукта.

Первым этапом в процессе очистки целевого продукта является разделение культуральной жидкости и клеточной биомассы - сепарация. В некоторых случаях сепарации предшествует специальная обработка реакционной смеси, способствующая более эффективному отделению биомассы и стабилизации выделяемого продукта. Применяются различные методы сепарации.

Флотация. Метод используется в том случае, если клетки продуцента в силу низкой смачиваемости накапливаются в поверхностных слоях содержимого биореактора. Особые устройства (флотаторы) различной конструкции удаляют образующуюся при культивировании пену вместе с прилипшими к пузырькам газа клетками. Повышение эффективности отбора биомассы достигается вспениванием жидкости с последующим отделением ее верхнего слоя механическим путем. Достоинствами метода являются его экономичность, высокая производительность и возможность использования в непрерывных процессах.

Фильтрация. Различны применяемые в настоящее время фильтрующие системы (барабанные, ленточные, тарельчатые фильтры, карусельные вакуум-фильтры, фильтры-прессы, мембранные фильтры) основаны на одинаковом принципе - задержке биомассы на пористой фильтрующей перегородке. Недостатком способа является налипание клеток на фильтре, слой которых снижает скорость протока жидкости в процессе фильтрования.

Для фильтров непрерывного действия предусматриваются системы автоматической очистки от биомассы, забивающей поры. Она может сдуваться с поверхности фильтров сжатым воздухом или удаляться специальными "ножами".

Существуют также фильтры для многократного или однократного периодического использования. Например, мембранные (в частности, тефлоновые) фильтры, позволяющие фильтровать очень разбавленные клеточные взвеси. Однако проблемой их использования является быстрая закупорка пор клетками, белками и другими коллоидными частицами.

Центрифугирование. Данный способ требует более дорогостоящего оборудования, чем фильтрование, поэтому он применяется, если:

а) суспензия фильтруется слишком медленно;

б) возникает необходимость максимального освобождения культуральной жидкости от содержащихся в ней частиц;