Экспериментальное исследование активации системы свертывания ферментами фибринолиза
Система фибринолиза как сложный набор биохимических реакций, разделенных в пространстве. Особенности разработки метода исследования фибринолиза, учитывающего пространственную неоднородность процессов коагуляции и лизиса. Сущность понятия "макроглобулин".
| Рубрика | Биология и естествознание |
| Вид | курсовая работа |
| Язык | русский |
| Дата добавления | 03.04.2013 |
| Размер файла | 899,6 K |
Отправить свою хорошую работу в базу знаний просто. Используйте форму, расположенную ниже
Студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в своей учебе и работе, будут вам очень благодарны.
Размещено на http://www.allbest.ru/
Экспериментальное исследование активации системы свертывания ферментами фибринолиза
фибринолиз макроглобулин биохимический
Введение
Фибриновые сгустки образуются в организме в результате работы системы свертывания в ответ на повреждение стенки кровеносного сосуда, закрывая собой место повреждения и предотвращая кровопотерю. После восстановления сосуда, когда необходимость в сгустке исчезает, важно его растворить, что бы восстановить кровоток. Это задачу решает система фибринолиза. Система фибринолиза представляет собой сложный набор биохимических реакций, разделенных в пространстве, результатом работы которых является разрушение фибринового тромба.
Таким образом, в нашей крови постоянно присутствуют две ферментативные системы, решающие противоположные задачи - система коагуляции создает сгустки, а система фибринолиза их разрушает. Здоровье человека напрямую зависит от баланса между данными системами. С одной стороны, при смещении баланса в сторону коагуляции, человек страдает от тромбозов (инфаркт, ТЭЛА, ТГВНК). При лечении тромбозов используются тромболитические средства, которые активируют систему фибринолиза, тем самым смещая баланс в сторону кровоточивости. Применение данных средств связано с риском тяжелейших геморрагий (в т.ч. мозговых кровоизлияний). Поэтому крайне важно знать особенности регуляции этих систем для более эффективного и разумного использования таких препаратов.
Целью данной работы было исследование пространственной динамики лизиса фибринового сгустка и взаимодействия системы фибринолиза и коагуляции в реакционно-диффузной системе in vitro. Результаты работы позволят в дальнейшем создать экспериментальный базис для теоретической модели фибринолиза, что поможет разобраться в механизмах регуляции данной системы.
В работе были поставлены следующие задачи:
- Разработка метода исследования фибринолиза, учитывающего пространственную неоднородность процессов коагуляции и лизиса.
- Оценка влияния различных концентраций тромболитических препаратов на пространственную динамику фибринолиза.
- Поиск реакций сопрягающих свертывание и фибринолиз с помощью экспериментального исследования в реакционно-диффузной системе.
Обзор литературы
Система фибринолиза - одна из жизненно важных систем нашего организма. Суть фибринолиза состоит в растворении тромбов, образующихся в результате свертывания крови. Процесс свертывания запускается организмом как ответ на повреждение стенки кровеносного сосуда и препятствует потере крови организмом[1].
Фибринолиз же восстанавливает циркуляцию крови по сосуду, разрушая сгустки. Основными участниками фибринолиза являются следующие белки: фибрин (защищает плазмин от ингибирования, запускает систему фибринолиза[2]), плазмин (разрушает фибрин), активаторы плазминогена (тканевый и урокиназный), ингибиторы плазмина (АП, МГ, ТАФИ), ингибиторы активаторов плазмина (ПАИ).
Фибрин
Появление фибрина в плазме служит причиной старта активации системы фибринолиза. Фибрин защищает плазмин от ингибирования, который запускает петли положительной обратной обратной связи (переход активаторов плазминогена в двухцепочечную форму, переход плазмина и плазминогена в Лиз-форму). Предшественником фибрина является белок фибриноген.
Он циркулирует в крови человека в концентрации около 8,8 мкМ. Молекулярная масса фибриногена 340 кДа, размеры - 45х9х9 нм [3]. На рис.1 показан схематичный вид его молекулы [2]. Фибриноген состоит из трех пар полипептидных цепочек (Аб-66,5 кДа, Bв-52 кДа и г-46,5 кДа), связанных между собой дисульфидными мостиками.
В его структуре выделяют несколько доменов: два D-домена, центральный E-домен и два бС домена. В Е-домене находятся N-концы всех трех пар полипептидных цепей. В D-домене - С-концы Вв и г цепей. гС-домен представляет собой С-конец Аб полипептидной цепи. бС-домены в фибриногене замкнуты друг на друга [2].
Рис.1 Схема молекулы фибрина [2].
Плазминоген и плазмин
Плазмин - ключевой белок системы фибринолиза. Он способен садиться на фибрин и осуществлять гидролиз фибриновых нитей. Плазмин циркулирует в крови в виде своего неактивного предшественника - плазминогена (Пг) в концентрации 2 мкМ, который синтезируется в печени и имеет молекулярную массу 92 кДа. Плазминоген синтезируется в виде своей Глу-формы (ГлуПг). Глу-плазминоген имеет на своем N-конце аминокислоту глутамин. В его структуре выделяют семь доменов: преактивационный пептид, пять крингл-доменов (К1-К5) и протеbyазный домен (перечислены, начиная с N-конца) [4]. Крингл-домены обеспечивают узнавание плазминогеном лизиновых аминокислотных остатков, входящих в сайты связывания на фибрине, ингибиторах и клеточных рецепторах. Удаление плазмином преактивационного пептида приводит к переходу Глу-формы плазминогена в его Лиз-форму (ЛизПг) (рис. 2).
Лиз-плазминоген имеет более открытую конформацию, лучше связывается с фибрином и лучше активируется активаторами по сравнению с Глу-плазминогеном [5] [6] [7] [8]. Константа диссоциации ГлуПг к цельному фибрину имеет значение 5 мкМ, что на порядок ниже, чем у ЛизПг. Но для частично разрушенного фибрина константа диссоциации для глу- и лиз- форм совпадает и составляет 0.5 мкМ [9]. Крингл-домены обеспечивают узнавание плазминогеном лизиновых аминокислотных остатков, входящих в сайты связывания на фибрине, ингибиторах и клеточных рецепторах [10], [11], [12], [13], [14].
Плазмин состоит из двух полипептидных цепей, связанных дисульфидными связями. Имеет более открытую форму, нежели плазминоген и лучше связывается с фибрином.
Рис. 2. Схема активации плазминогена. Сперва, Глу-плазминоген под действием ТПА и УПА превращается в Глу-плазмин, который, затем превращает Глу-плазин(оген) в Лиз-плазмин(оген).
Активаторы плазминогена
Плазминоген активируется до плазмина одним из двух белков-активаторов, синтезируемых в нашем организме: тканевым активатором плазминогена (ТПА) или урокиназным активатором плазминогена (УПА). При добавлении ряда белков, таких как стрептокиназа и стафилокиназа, плазминоген образует с ними автокаталитический комплекс, который также активирует плазминоген. Активация плазминогена осуществляется разрезанием пептидной связи Арг561-Вал562, в результате чего начинает функционировать его протеиназный домен, и плазминоген превращается в активную протеиназу плазмин [16].
Урокиназный активатор плазминогена
Урокиназный активатор плазминогена (о-УПА) является одноцепочечным гликопротеином с молекулярной массой 55 кДа. Синтезируется он многими клетками (соединительнотканными, эпителиальными, макрофагами, эндотелиальными клетками) и в норме циркулирует в крови в концентрации 70 пМ [16]. О-УПА состоит из домена эпидермального фактора роста (необходимого для связывания с клеточными рецепторами), крингл-домена (не имеющего афинности к лизину) и каталитического домена (гомологичного трипсиновым протеиназам). Разрезание плазмином связи Лиз158-Иле159 приводит к превращению одноцепочечного урокиназного активатора (о-УПА) в двухцепочечный (д-УПА), являющийся гораздо более эффективным[17], [18] (активность о-УПА по отношению к плазминогену составляет 0.1%-0.4% от активности д-УПА [19]). Урокиназный активатор имеет очень низкое сродство к фибрину, однако присутствие фибрина все же повышает активацию плазминогена с помощью о-УПА (но не д-УПА) [20]. Интересно, что основной ингибитор активаторов плазминогена ПАИ способен ингибировать только д-УПА, но не о-УПА [21].
Тканевый активатор плазминогена
Тканевый активатор плазминогена (о-ТПА) является одноцепочечным гликопротеином с молекулярной массой 68 кДа. Синтезируется он эндотельальными клетками и в норме циркулирует в крови в концентрации 70 пМ [21], хотя только 20% от этого количества находится в свободной форме, другая же часть циркулирует в комплексе со своим ингибитором ПАИ. N-концевая часть о-ТПА состоит из finger-домена, домена эпидермального фактора роста и двух крингл-доменов. С-концевая часть молекулы содержит каталитический домен, характерный для трипсиновых протеаз. Finger и второй крингл-домен способны взаимодействовать с фибрином [22]. Во взаимодействии о-ТПА с ингибитором ПАИ участвуют его второй крингл-домен, каталитический домен (активный сайт) и аминокислотные остатки 296-304 [23]. Хотя о-ТПА и является ферментом, его активность по отношению к своему субстрату-плазминогену довольно мала в отсутствии фибрина, тогда как в присутствии последнего активность повышается примерно в 1000 раз, благодаря формированию тройного комплекса активатор-плазминоген-фибрин [24]. Плазмин может превращать одноцепочечный активатор (о-ТПА) в двухцепочечный (д-ТПА) путем разрезания связи Арг275-Иле276 [25].
Ингибиторы. Антиплазмин
Антиплазмин (АП) является основным ингибитором плазмина [26]. Этот белок принадлежит к семейству серпинов и является гликопротеином с молекулярной массой 70 кДа. Синтезируется антиплазмин в печени и циркулирует в крови в концентрации 1 мкМ. Антиплазмин взаимодействует с лизин-связывающими кринглами и активным сайтом плазмина. Плазмин, находящийся в связанном с фибрином состоянии, гораздо меньше подвержен ингибированию антиплазмином: эффективность его инактивации уменьшается в 430 раз и его время жизни составляет около 7 минут (тогда как время жизни свободного плазмина примерно 1 с) [27].
Макроглобулин
Макроглобулин (МГ) - ингибитор большого числа протеиназ, его молекулярная масса 725 кДа. В системе фибринолиза наиболее заметное действие оказывает на плазмин, хотя эффективность ингибирования плазмина макроглобулином составляет примерно 10% от эффективности ингибирования антиплазмином. Концентрация Mg в крови составляет 3.5 мкМ [28]. Вероятно, физиологическая роль макроглобулина состоит в ингибировании плазмина, когда запасы антиплазмина исчерпаны.
Ингибитор активаторов плазминогена
Ингибитор активаторов плазминогена (ПАИ) является основным ингибитором и тканевого и урокиназного активаторов. Этот белок принадлежит к семейству серпинов и является гликопротеином с молекулярной массой 52 кДа. Синтезируется ПАИ эндотелиальными клетками, моноцитами, макрофагами, гепатоцитами и тромбоцитами, в крови человека присутствует в различных концентрациях вплоть до 2 нМ. Основным источником ПАИ считаются тромбоциты [29], что является значительным для предотвращения преждевременного фибринолиза в момент формирования сгустка [30].
Тромбин-активируемый ингибитор фибринолиза
Тромбин-активируемый ингибитор фибринолиза (ТАФИ) является одноцепочечным гликопротеином с молекулярной массой 60 кДа. Он синтезируется в печени и циркулирует в крови в концентрации 220 нМ [31]. ТАФИ является проферментом и нуждается в активации для превращения в активный фермент ТАФИа. Такая активация осуществляется в основном комплексом тромбин-тромбомодулин [32], [33], но также может осуществляться и плазмином [34], [35], трипсином [34] или одним тромбином [32], [34], хотя и гораздо медленнее. ТАФИа является нестабильным при 37°С, время его полужизни при этой температуре 8-9 мин [33]. Ингибирующее действие ТАФИ заключается в удалении С-концевых лизиновых аминокислотных остатков, появляющихся на фибрине в процессе его деградации [36].
Работа системы фибринолиза
Расщепление фибрина плазмином ? ключевая реакция фибринолиза, физиологической ролью которого является растворение фибриновых сгустков крови, образующихся в результате работы системы свертывания. Сгустки представляют собой скопление клеток крови, переплетенное сетью полимеризованного белка фибрина. Фибриновая часть сгустка формируется следующим образом. Сериновая протеаза тромбин активирует белок фибриноген, отщепляя от него отрицательно заряженные фибринопептиды A и B и образуя при этом активный мономер фибрина размерами 45нм x 2нм.
Такие мономеры быстро полимеризуются между собой в длинные двухцепочечные нити (протофибриллы) ,радиусом 3-5 нм [2], [37]. Образовавшиеся протофибриллы впоследствии собираются в более крупные структуры ? фибриллы, которые и составляют сеть сгустка [2]. Параметры сгустка зависят от условий полимеризации: концентраций тромбина и фибриногена, ионной силы раствора [37]. Образовавшиеся фибриллы имеют относительно постоянный диаметр по всему объему сгустка и могут ветвиться [38]. При физиологических условиях диаметр фибрилл может составлять 50-100 нм [38]. Суть фибринолиза заключается в расщеплении фибриновых волокон. Такое расщепление способен делать плазмин, являющийся сериновой протеазой и циркулирующий в крови в виде своего неактивного предшественника плазминогена. Превращение плазминогена в плазмин происходит под действием специфических активаторов [39].
Появление фибрина в плазме вызывает изменение скорости активации плазминогена с помощью ТПА на 3 порядка [24], тем самым инициируя запуск фибринолиза. Активный центр плазмина содержит аминокислотные остатки, типичные для сериновых протеаз (His 602, Asp 645, Ser 740), в то время как лизин-связывающие участки, входящие в состав пяти крингл-доменов плазмина обеспечивают взаимодействие фермента с фибрином, фибриногеном и б2-антиплазмином [39], поэтому связанный с фибрином плазмин гораздо хуже ингибируется антиплазмином [2], что является очень важным физиологическим эффектом, т.к. в данном случае активация системы фибринолиза происходит только в области наличия сгустка. На каждом мономере фибрина находятся два сайта связывания плазмина [40] (рис. 3), хотя в процессе деградации появляются дополнительные центры связывания на С-концевых остатках лизина расщепленных цепей фибрина [41]. В результате лизиса от фибрина отщепляются продукты деградации разных размеров и массы [42].
Таким образом процесс фибринолиза можно разделить на две основные фазы: образование фибрина в котором открываются сайты связывания для ТПА и плазминогена, тем самым запуская фибринолиз, и разрушение фибриновых нитей, при котором открываются новые сайты связывания плазмина (C-концевые лизиновые остатки) [43].
Рис.3. Сайты связывания плазминогена, ТПА и фибрина [2]. Аб, Bв и г цепи представлены оранжевым, синим и зеленым цветом соответственно. Аб392-610 - область связывания как плазминогена, так и ТПА. г312-324 - сайт связывания ТПА, Аб148-160 - сайт связывания плазминогена.
В первой фазе так же происходит изменение конформации активаторов плазминогена т.к. появившийся плазмин превращает одноцепочечнуые конформации ТПА и УПА в двухцепочечные путем разрезания связи Арг275-Иле276 и Лиз158-Иле159 соответственно (рис.4). Двухцепочечная урокиназа имеет в 250 раз большую активность по отношению к плазмину, нежели одноцепочечная [19]. В то же время, двухцепочечная форма урокиназы становится подвержены ингибированию с помощью ПАИ [44]. Для ТПА же ингибирование ПАИ характерно как для двухцепочечной, так и для одноцепочечной формы [45], константы ингибирования представлены в таблице 1 .
Рис.4. Схема ингибирования системы фибринолиза.
Таблица 1. Константы ингибирования второго порядка [10^7/М/с] ТПА и УПА с помощью ПАИ-1 [45]
|
о-ТПА |
д-ТПА |
УПА |
||
|
ПАИ-1 |
1 |
3 |
5 |
Эмболические осложнения тромболитической терапии
Тромболитическая терапия является довольно опасной для пациента из-за возможных осложнений. К наиболее серьезным осложнениям относятся как геморрагические осложнения в виде мозговых кровоизлияний, так и тромботические, в виде рестенозов коронарных артерий, инфарктов мозга и ДВС [46], так же частым осложнением является острая желудочковая аритмия [47]. В клиническом исследовании эффективности ТПА J-ACT [46] проводившемся в 2005-2012г на 103 пациентах были отмечены тромботические осложнения в виде 7 случаев инфаркта мозга, 1 случая инфаркта миокарда, 1 случая ДВС синдрома.
Случаи активации системы свертывания во время тромболитической терапии отмечены в работе [48]. В данной работе отмечается повышение уровня фибринопептида А, который является маркером тромбина, у пациентов, которые проходили тромболитическую терапию стрептокиназой, и получили осложнения в виде реокклюзий сосудов.
Постановка задачи
Анализ литературы показал, что пространственная динамика фибринолиза является мало изученной областью, с другой стороны, известно, что пространственное распределение компонент играет немаловажную роль в процессах тромбообразования и лизиса. Так, например, более высокая концентрация тромбина вблизи места активации свертывания приводит к более плотной структуре фибринового сгустка в данной области.
В результате первых же экспериментов по исследованию фибринолиза в пространственно-диффузной среде было обнаружено явление сильной активации системы свертывания во всем объеме плазмы, в которую добавлен тромболитический препарат [49].
Эффект активации свертывания в крови, при добавлении в неё стрептокиназы был отмечен только в работах [48], [50], но в данных работах не были определены реакции активации белков коагуляции ферментами фибринолиза, не было обнаружено значительной активации системы коагуляции при добавлении других активаторов плазминогена (в наших же экспериментах урокиназа и тканевый активатор плазминогена также вызывают активацию свертывания).
Какие ферменты системы фибринолиза активируют систему свертывания? Какие белки системы свертывания активируются ферментами фибринолиза? Как зависит скорость распространения волны фибринолиза в сгустке от концентраций тромболитических препаратов? Зачем в организме имеются два типа активаторов плазминогена?
На все эти вопросы точных ответов, однозначно подтвержденных экспериментами, пока нет.
Поэтому целью данной работы было исследование влияния ферментов фибринолиза на пространственную динамику процессов свертывания и лизиса, а так же на активацию системы свертывания, которое позволило бы дать ответы на некоторые из поставленных вопросов.
В задачи исследования входили:
- Разработка метода исследования фибринолиза, учитывающего пространственную неоднородность процесса.
- Оценить влияние различных концентраций и типов тромболитических препаратов на пространственную динамику фибринолиза.
- Проверить возможность активации белков коагуляции (Fg,II,IX,X,XI) ферментами фибринолиза (УПА, ТПА, СК, Пм).
Материалы и методы. Материалы
Урокиназа. В экспериментах использовалась высокомолекулярная урокиназа (HMW-uPA, American Diagnostica, Stamford, CT), M=52 кДа. Белок находился в буфере 50 mM TRIS-HCl, 100 mM NaCl, 0.1% PEG, 200 mM Mannitol, pH 7.4.
Тканевый активатор плазминогена. Использовался медицинский препарат «Actilyse» (Boehringer Ingelheim, Германия). 1 флакон содержит алтеплаза 50 мг (1 мл готового р-ра - алтеплаза 1 мг); вспомогательные вещества: L-аргинин (1.742 г/фл.), фосфорная кислота (536 мг/фл.), полисорбат 80 (менее 5 мг/фл., менее 100 мкг/1 мл готового раствора).
Стрептокиназа. В экспериментах использовался очищенный белок Streptokinase from hemolytic Streptococcus (PN S3134), активность >4200МЕ/мг (Sigma, Saint Louis, MO).
Подготовка плазмы. Человеческая кровь здоровых доноров была предоставлена Гематологическим научным центром РАМН. Использовался пул плазмы 4 здоровых доноров. В кровь был добавлен 3.8% цитрат натрия (pH 5.5) в объемном отношении кровь/антикоагулянт 9:1, а также добавлен трипсиновый ингибитор контактной активации в конечной концентрации 0.4 г/литр для ингибирования контактного пути активации свертывания. После предварительного отделения эритроцитов центрифугированием в течение 15 минут при 1600g, плазму центрифугируют 5 минут при 10 000g для удаления тромбоцитов. Полученная таким образом свободная от тромбоцитов плазма содержит 15-70 мкМ ионов свободного кальция, а концентрация тромбоцитов в ней не превышает 109 клеток/литр.
Плазма дефицитная по XI фактору: Замороженная плазма (Affinity biologicals, Ancaster, Ontario).
Плазма дефицитная по IX фактору: Замороженная плазма (Precision biologics, Westlake Village, CA).
Фибриноген: Очищенный белок Fibrinogen from human plasma (Sigma, Sant Louis, Missouri). M=340кД.
Протромбин: Очищенный белок factor II from human plasma (Sigma, Sant Louis, Missouri).
Методы
Видеомикроскопия. Эксперименты проводились на системе по видеомикроскопии [51], [52], схема которой представлена на рис.5. Для предотвращения контактной активации и стабилизации рН плазмы в течение эксперимента (при контакте с воздухом из плазмы выходит СО2, вследствие чего меняется ионный состав плазмы и ее рН) за 10 минут до проведения эксперимента в плазму добавляли КТИ в конечной концентрации 0.2 мг/мл в буфере с HEPES (pH 7.4). Подготовленная плазма инкубируется 10 мин при 37°C для предотвращения холодовой активации свертывания. Затем производится рекальцифицикация плазмы и добавляется тромболитический препарат. Конечная концентрация ТПА достигала 1.5, 2.5, 5, 10, 20, 30, 40 мкг/мл [53], [54], концентрация урокиназы составляла 180МЕ/мл [53], стрептокиназы - 200МЕ/мл [53], также проводились контрольные эксперименты, без добавления тромболитических препаратов. Полученный раствор заливается в кювету, в которую вставляется активатор свертывания, покрытый тканевым фактором свертывания. Кювета с растущим сгустком освещается красным светом и в течение 90 мин регистрируется изменение интенсивности светорассеяния сгустка. При образовании сгустка плазма крови переходит из жидкого в гелеобразное состояние, и вследствие этого процесса происходит изменение интенсивности светорассеяния плазмы.
Рис.5. Схема установки: Установка состоит из исследовательской кюветы (1), которая помещается в воду, находящуюся в прозрачном термостатируемом отсеке при 37°С (2), и освещается сбоку светодиодами красного цвета свечения (3). Изображение области контакта плазмы (4) с активатором (5) фокусируется на ПЗС матрице фотокамеры (6) с помощью фотообъектива (7). Оцифрованное ПЗС камерой изображение передается в компьютер.
Наблюдение за фибриновым сгустком производится по методу темного поля. Экспериментальная кювета в водяном термостате освещается сбоку под углом 45є светодиодами красного цвета (длина волны свечения 660 нм). Рассеянный сгустком свет фокусируется на цифровую видеокамеру фотообъективом.
Для проведения эксперимента, сбора и предварительной обработки данных используется специальная программа Tromboimager (ООО «Гемакор»). После помещения активатора в кювету программе дается команда начать съемку, далее каждые 15 секунд пространственная картина интенсивности светорассеяния (выдержка составляет 50 мсек) записывается на жесткий диск.
При обработке все полученные изображения полагаются симметричными относительно перпендикуляра к активатору. Это позволяет перейти от двумерных распределений интенсивности светорассеяния к одномерным на отрезках, проведенных вдоль распространения роста тромба. На первом этапе обработки данных по светорассеянию выбирается узкая полоса, перпендикулярная активирующей поверхности (репер). Вдоль этой полосы для всех моментов времени вычисляются профили интенсивности регистрируемого сигнала. При этом, для снижения шумов, производилось усреднение значений светорассеяния внутри полосы в направлении, перпендикулярно росту сгустка (т.е. параллельно активатору). Первый, фоновый, профиль светорассеяния вычитается из всех последующий экспериментальных профилей.
Планшетный фотометр: Для проверки активации протромбина и фибриногена использовался 96-луночный планшетный фотометр. В лунки с буфером (0.5% БСА, 20mM HEPES, 140mM NaCl) pH7.4 добавлялся: 1: фибриноген [2мг/мл] c протромбином [4мкМ]. 2: фибриноген [2мг/мл] c протромбином [4мкМ] и активным фактором XIa[240нМ]. 3: фибриноген [2мг/мл] c протромбином [2мкМ] и активным фактором XIa [240нМ]. 4: фибриноген [2мг/мл] c протромбином [4мкМ] и урокиназой [1000МЕ/мл]. 5: фибриноген [2мг/мл] c активным фактором XIa[240нМ]. Измерялось светорассеяние образующегося фибрина (длина волны 450 нм). Предварительно оценивалась чувствительность фотометра по тромбину: концентрация тромбина более 1.5nM успешно регистрировалась.
Результаты и обсуждение. Разработка методики исследования фибринолиза
Для исследования процесса фибринолиза было решено использовать систему видеомикроскопии Tromboimager (ООО «Гемакор»), которая успешно используется для диагностики состояния системы свертывания и позволяет регистрировать пространственную динамику роста фибринового сгустка. Необходимо было проверить возможность регистрации лизиса сгустка при имеющихся параметрах оборудования и продумать постановку эксперимента, которая отражала бы процесс фибринолиза наиболее приближенно к in vivo ситуации. Было решено остановиться на двух основных типах методики (рис 6). В первой постановке (гетерогенное распределение тромболитического препарата в пространстве, гомогенный сгусток) в кювету сначала заливается плазма донора и активатор свертывания (тромбин). Через некоторое время плазма переходит из жидкого состояния в гелеобразное (образуется сгусток). Затем, сверху на сгусток наливается тромболитический препарат. Начинает происходить диффузия тромболитического препарата в сгусток, вследствие чего фибриновые волокна разрушаются, процесс фиксируется системой видеомикроскопии. Данная постановка отражает in vivo ситуацию, при которой у пациента образовался тромб и ему в организм ввели тромболитический препарат. Во второй постановке (гомогенное распределение тромболитического препарата в плазме, гетерогенный сгусток) в кювету сперва заливается плазма донора в которую добавлен тромболитический препарат. Затем в кювету вставляется пластина с иммобилизованным тканевым фактором свертывания, от которой начинает расти сгусток. В таком случае мы можем параллельно наблюдать динамику роста и разрушения сгустка. Такая постановка моделирует ситуацию, когда в организм человека уже введен тромболитический препарат и в определенном месте начинает расти новый тромб. Так же плюсом данной постановки является то, что она позволяет фиксировать спонтанное образование сгустков в плазме.
Для исследования пространственной динамики фибринолиза и поиска реакции сопряжения фибринолиза и свертывания в рамках данной дипломной работы использовалась вторая постановка (гомогенное распределение тромболитического препарата в плазме, гетерогенный сгусток).
Рис. 6. Два типа постановки эксперимента. Слева - гетерогенное распределение тромболитического препарата (сгусток снизу, препарат сверху). Справа - постановка с вставленным активатором свертывания, препарат растворен в плазме.
Пространственная динамика фибринолиза
Для исследования пространственной динамики процессов свертывания и фибринолиза рассчитывались зависимости значений таких параметров, как скорость распространения волн свертывания/фибринолиза, время задержки начала коагуляции и фибринолиза от различных концентраций и различных типов тромболитических препаратов.
Зависимость кинетических параметров распространения волн коагулаяции и фибринолиза от концентрации тромболитического препарата
В качестве тромболитического препарата использовался тканевый активатор плазминогена в концентрации 1.5, 2.5, 5, 10, 20, 30, 40 мкг/мл. Замерялись следующие параметры:
LagTimeCoagulation - промежуток времени между моментом активации свертывания и моментом начала роста фибринового сгустка.
CoagulationSpeed - средняя скорость движения переднего фронта волны свертывания за первые 10 минут.
LagTimeFibrinolysis - промежуток времени между моментом активации свертывания и моментом начала регистрации фибринолиза (момент, при котором интенсивность светорассеяния сгустка на расстоянии 100мкм от активатора начала падать).
FibrinolysisTime - промежуток времени между моментом образования сгустка и моментом его лизиса. Параметр вычислялся для средней интенсивности на расстоянии 100-400 мкм от активатора.
Для расчета параметров LagTimeCoagulation, LagTimeFibrinolysis, FibrinolysisTime происходит усреднение интенсивности по горизонтальной оси на расстоянии 100 мкм от активатора. С помощью этого мы переходим двумерным координатам - интенсивность и время (расстояние зафиксировано). Качественно, результат показан на рис.7.
Определяется максимальная интенсивность (I max), затем определяются моменты времени, когда интенсивность имела значения I max/2. T1 будет соответствовать параметру LagTimeCoagulation (момент начала роста сгустка), Т2 - LagTimeFibrinolysis (момент разрушения сгустка). Параметр FibrinolysisTime рассчитывается как Т2-Т1, но для интенсивности усредненной не на узкой линии 100мкм от активатора, а на прямоугольнике 100-400мкм от активатора (рис.8). Ширина прямоугольника 2.5 мм.
FibrinolysisSpeed - средняя скорость движения фронта фибринолиза. Вычислялась по формуле:
Где X- расстояние от активатора до фронта волны фибринолиза [мкм]. Схема определения фронта волны свертывания и фибринолиза показана в приложении 1.
Так же строились зависимости положения фронта коагуляции/свертывания и от времени и концентрации ТПА.
Рис.7. Схема определения параметров LagTimeCoagulation, LagTimeFibrinolysis и FibrinolysisTime.
Рис. 8: Распространение волны фибринолиза от активатора (сверху). Зеленым цветом отмечена область на расстоянии от 100 до 400мкм от активатора. Красная линия - 100мкм от активатора. Фотография сделана через 30 минут после вставки активатора.
Таблица 2. Зависимость скоростей коагуляции и фибринолиза [мкм/мин] от концентрации ТПА (n=3).
|
ТПА |
0 мкг/мл |
2,5 мкг/мл |
5 мкг/мл |
10 мкг/мл |
20 мкг/мл |
|
|
CoagulationSpeed |
48+-3 |
54+-3 |
58+-5 |
59+-5 |
61+-6 |
|
|
FibrinolysisSpeed |
"--" |
44+-4 |
48+-5 |
48+-3 |
45+-5 |
Обнаружено, что скорость распространения фронта коагуляции возрастает при добавлении в плазму тромболитического препарата. Вероятно, это вызвано активацией факторов свертывания компонентами фибринолиза.
Зависимости скорости фибринолиза от концентрации тромболитического препарата не прослеживается в диапазоне клинических концентраций ТПА (2.5-20мкг/мл). Значения скоростей представлены в таблице 2.
На рис.9 видно, что при увеличении концентрации ТПА время задержки фибринолиза падает до полутора минут и остается на данном уровне при концентрациях больших 10 мкг/мл. При уменьшении концентрации ТПА время задержки фибринолиза экспоненциально растет.
Рис.9. Зависимость параметров LagTimeFibrinolysis, LagTimeCoagulation и FibrinolysisTime от концентрации ТПА (n=3).
Время лизиса сгустка минимально при концентрациях ТПА 2.5-30 мкг/мл. При изменении концентрации в меньшую сторону время лизиса растет по причине роста лаг тайма. При изменении концентрации в большую сторону время лизиса также растет.
При добавлении тромболитического препарата время задержки свертывания уменьшается с 120 сек до 70-80 сек и остается на данном уровне во всем диапазоне концентраций ТПА (0.75-40 мкг/мл).
Если анализировать динамику изменения фронта волны фибринолиза в зависимости от времени, то можно увидеть, что фронт фибринолиза останавливается тем раньше, чем выше концентрация ТПА. Фронт останавливается в момент спонтанной активации свертывания по объему. При концентрациях ТПА менее 5мкг/мл спонтанное свертывание в экспериментах за 90 минут не наблюдается, фронт фибринолиза не останавливается (рис.10).
Рис.10. Положение фронта фибринолиза при различных концентрациях ТПА: 5, 10, 20, 30, 40 мкг/мл (типичные кривые).
В контрольных экспериментах (без добавления тромболитических препаратов) максимальная интенсивность монотонно возрастает (Рис.11). При добавлении ТПА максимальная интенсивность сначала растет, через 2-3 минуты достигая максимума. Затем интенсивность начинает спадать (включается система фибринолиза). Интенсивность падает на протяжении времени, пока в плазме не начинается спонтанное свертывание. Чем выше концентрация ТПА, тем быстрее начинается спонтанное свертывание (рис.12, рис.13). Далее, интенсивность возрастает до определенного уровня и сохраняется неизменной на протяжении всего эксперимента.
Рис.11. Динамика значений максимальной интенсивности при различных концентрациях ТПА: 0, 5, 10, 20, 30, 40 мкг/мл (типичные кривые).
Рис.12. Положение фронта коагуляции при различных концентрациях ТПА: 5, 10, 20, 30, 40 мкг/мл (типичные кривые).
Рис.13 Зависимость момента минимальной интенсивности от концентрации ТПА.
Пространственная динамика фибринолиза при клинических концентрациях различных тромболитических препаратов
В данной постановке эксперимента использовалась урокиназа в конечной концентрации 180 МЕ/мл, стрептокиназа - 200 МЕ/мл, ТПА - 20 мкг/мл [53], [54].
Измерялись параметры LagTimeCoagulation, LagTimeFibrilonysis, FibrilonysisTime и FibrilonysisSpeed.
Наибольшее время задержки активации системы фибринолиза (параметр LagTimeFibrilonysis) наблюдается в экспериментах с урокиназой (7 мин), в экспериментах с ТПА и стрептокиназой значение данного параметра в несколько раз ниже - 1,5 и 2 минуты соответственно. Время разрушения сгустка (FibrilonysisTime) для всех тромболитиков колеблется на уровне 5.5-8 минут (Рис.14). Так же для всех тромболитических препаратов наблюдается снижение времени задержки коагуляции по отношению к контрольным значениям (без тромболитических препаратов).
Рис.14. Зависимость временных параметров фибринолиза от вида тромболитического препарата (n=4).
На рис.15 изображена зависимость интенсивности светорассеяния сгустка от времени и расстояния от активатора для различных тромболитических препаратов (реальная картина с видеомикроскопии представлена на рис. 16). Видно, что в экспериментах с ТПА и стрептокиназой фронт фибринолиза замедляется и останавливается, в эксперименте с урокиназой фронт не останавливается на протяжении всего эксперимента. Во всех экспериментах с использованием тромболитических препаратов в клинических концентрациях наблюдалась спонтанная активация свертывания по всему объему плазмы (приложение 2). Скорость распространения волны фибринолиза в первые 10 минут для всех тромболитических препаратов составляет 45-55 мкм/мин (Таблица 3).
Таблица 3. Скорость распространения волны фибринолиза [мкм/мин] для различных тромболитических препаратов - ТПА 20[мкг/мл], УПА 180[МЕ/мл], СК 200[МЕ/мл] (n=4).
|
ТПА |
УПА |
СК |
||
|
FibrinolysisSpeed, мкм/мин |
45+-5 |
53+-6 |
47+-6 |
Рис.15. Типичная зависимость интенсивности от времени и расстояния от активатора для различных тромболитических препаратов.
Рис.16. Видеомикроскопия. Распространение волн фибринолиза и коагуляции в первые 20 минут эксперимента. Волна коагуляции стартует от активатора (сверху). Первый ряд - контрольный эксперимент (без добавления тромболитического препарата), второй ряд - добавление стрептокиназы (200МЕ/мл), третий ряд - добавление ТПА (20мкг/мл), четвертый ряд - добавление урокиназы (180МЕ/мл). Полоса масштаба - 1мм.
Поиск реакции активации свертывания ферментами фибринолиза
Для поиска фактора коагуляции, который активируется фибринолизом было решено пойти снизу каскада свертывания наверх - факторы проверялись в следующем порядке I, II, X, IX, XI.
Фибриноген и протромбин
Перед экспериментом фактор II предварительно смешивался с ppack (D-Фенилаланин-L-пролил-L-аргинин хлорметил кетон) для инактивации активных форм протромбина. Далее раствор очищался от ppack методом диализа в течение суток при температуре +4°C в фосфатном буфере НФБ.
Для проверки того, что фактор II «живой» использовался фактор Xa, который активировал протромбин (фактор II), что вызывало образование фибрина (увеличение интенсивности в сериях 2 и 3, рис 17).
Проверка активации фибриногена (фактор I) и протромбина урокиназой осуществлялась экспериментом на планшетном фотометре (рис.17). В лунку заливался фибриноген, протромбин и урокиназа. В качестве буфера использовался 0.5% раствор БСА в HEPES (20mM) и NaCl (140mM). Если бы урокиназа активировала хотя бы один из данных белков, то начался бы процесс образования сгустка и это отразилось бы на интенсивности светорассеяния. Увеличения интенсивности светорассеяния не зафиксировано (серия 4), что позволяет говорить о том, что ни фибриноген, ни протромбин не активируются урокиназой.
Рис. 17. Проверка активации фибриногена и протромбина урокиназой. (Fg+IId) - фибриноген [2мг/мл] c протромбином [4мкМ]. (Fg+IId+Xa) - фибриноген [2мг/мл] c протромбином [4мкМ] и активным фактором XIa[240нМ]. (Fg+IId/2+Xa) - фибриноген [2мг/мл] c протромбином [2мкМ] и активным фактором XIa [240нМ]. (Fg+IId+UPA) - фибриноген [2мг/мл] c протромбином [4мкМ] и урокиназой [1000МЕ/мл]. (Fg+Xa) - фибриноген [2мг/мл] c активным фактором XIa[240нМ]. N=2.
Фактор IX
Проверка возможности активации фактора IX ферментами фибринолиза проверялась на плазме, дефицитной по фактору IX. В плазму добавлялся фибринолитический препарат (один из активаторов плазминогена) и с помощью видеомикроскопии проверялось наличие (или отсутствие) явления спонтанной активации свертывания во всем объеме плазмы. Результаты представлены на рис. 19, таблица 4. Видно, что в плазме, дефицитной по фактору IX, так же, как и в обычной плазме запускается система фибринолиза (сгусток у активатора лизируется), но спонтанной активации свертывания по всему объему не происходит, в то время как в обычной плазме свертывание к 30 минуте активировано во всем объеме. Это позволяет говорить о том, что фактор свертывания, который активируется ферментами фибринолиза находится «не ниже» фактора IX в каскаде свертывания (т.е. факторы I, II, X ферментами фибринолиза не активируются). Были также проведены контрольные эксперименты с плазмой дефицитной по фактору IX, в которой фактор IX был восстановлен (рис.18). Добавление фактора IX вызывает спонтанное свертывание.
Для оценки скорости спонтанного зарастания использовался параметр FullCoaSpeed. Рассчитывался параметр по формуле FullCoaSpeed=1/CoagulationTime, где CougulationTime [мин]- время от момента вставки активатора, до момента полузароста плазмы на расстоянии от 4000мкм до 5000мкм.
Таблица 4. Скорость спонтанного зарастания для экспериментов рис.19. «0» означает отсутствие спонтанного зарастания.
|
нормальная плазма, без активаторов плазминогена |
нормальная плазма, урокиназа 600 МЕ/мл |
FIX дефицитная плазма, урокиназа 600 МЕ/мл |
FIX дефицитная плазма, стрептокиназа 500 МЕ/мл |
FXI дефицитная плазма, стрептокиназа 500 МЕ/мл |
||
|
FullCoaSpeed, 1/мин |
0 |
0,048 |
0 |
0 |
0,040 |
Рис. 18. Видеомикроскопия, эксперименты с плазмой, дефицитной по фактору IX. Верхний ряд - добавление стрептокиназы (500 МЕ/мл) и фактора IX (100нМ); средний ряд - добавление фактора IX (100нМ); Нижний ряд - добавление стрептокиназы (500 МЕ/мл).
Рис. 19. Видеомикроскопия. Коагуляция и фибринолиз в нормальной плазме и плазмах, дефицитных по факторам IX и XI. Полоса масштаба 1 мм.
Фактор XI
Следующий фактор, находящийся выше фактора IX по каскаду свертывания - фактор XI. Проверка активации фактора XI ферментами фибринолиза проводилась аналогично экспериментам по проверке фактора IX, с единственной разницей в том, что использовалась плазма дефицитная по фактору XI, а не по фактору IX. Эксперимент показал (рис. 19), что в плазме дефицитной по фактору XI спонтанная активация свертывания присутствует, хоть сгусток имеет менее плотную структуру, нежели в обычной плазме. Это позволяет говорить о том, что, скорее всего именно фактор IX активируется системой фибринолиза.
Обсуждение
Был разработан метод исследования пространственной динамики фибринолиза, который позволяет оценить кинетические параметры распространения волн коагуляции и лизиса. Данная методика может быть в последствии применена в диагностике отклонений фибринолитической системы.
Обнаружено явление распространения волны лизиса в направлении от активатора свертывания. Проведено сравнение влияния терапевтических концентраций стрептокиназы, урокиназы и ТПА на пространственную динамику фибринолиза:
1. Добавление тромболитических препаратов увеличивает скорость свертывания.
2. Наибольшее время задержки фибринолиза наблюдается для урокиназы.
3. Скорость фибринолиза не зависит от концентрации ТПА и от типа тромболитического препарата.
Выявлена монотонная обратно пропорциональная зависимость времени задержки запуска системы фибринолиза от концентрации ТПА. Данная зависимость может быть использована в тромболитической терапии для оценки концентрации и эффективности действия тромболитического препарата в крови пациента.
Обнаружено явление спонтанной активации свертывания в плазме, в которую добавлен тромболитический препарат. Определен механизм данного явления - активация фактора свертывания IX. Так как активация свертывания происходит при добавлении любого активатора плазминогена (ТПА, УПА, стрептокиназа), то вероятнее всего, именно плазмин активирует фактор IX. Для проверки гипотезы активации фактора IX были проведены контрольные эксперименты по фибринолизу с плазмой дефицитной по фактору IX и с той же плазмой, в которой фактор IX был восстановлен. Данные эксперименты подтвердили гипотезу активации фактора IX. Данные эффекты необходимо учитывать в тромболитической терапии, применении антикоагулянтов совместно с тромболитическими препаратами, а так же при дозировке данных препаратов.
Выводы
1. Разработан метод исследования фибринолиза, учитывающий пространственную неоднородность процессов коагуляции и лизиса.
2. Лизис фибринового сгустка распространяется волнообразно от активатора с постоянной скоростью, не зависящей от вида тромболитического препарата.
3. Фактор IX активируется системой фибринолиза.
Используемая литература
1.Бутенас С, Манн КГ. Свертывание крови. Обзор. Биохимия. 2002;67:5-15.
2.Medved L, Nieuwenhuizen W. Molecular mechanisms of initiation of fibrinolysis by fibrin. Thromb Haemost. 2003;89:409-19.
3.Bachmann L, Schmitt-Furmian WW, Hammel R, Lederer K. Size and shape of fibrinogen. Electron microscopy of the hydrated molecule. Macromol Chemie. 1975;176:2603-2618
4.Novokhatny VV, Kudinov SA, Privalov PL. Domains in human plasminogen. J Mol Biol. 1984;179:215-232.
5.Weisel JW, Nagaswami C, Korholm B, Petersen LC, Suenson E. Interaction of plasminogen with polymerizing fibrin and its derivatives, monitored with a photoaffinity cross-linker and electron microscopy. J Mol Biol. 1994;235:1117-1135.
6.Marcus G, Priore RL, Wissler FC. The binding of tranexamic acid to native (glu) and modified (lys) human plasminogen and itseffect on conformation. J Biol Chem. 1979;254:1211-1216.
7.Lucas MA, Fretto LJ, McKee PA. The binding of human plasminogen to fibrin and fibrinogen. J Biol Chem. 1983;258:4249-4256Mangel WF, Lin B, Ramakrishnan V. Characterization of an extremely large, ligand-indused conformational change of plasminogen. Science. 1990;248:69-73.
8.Hoylaerts M, Rijken DC, Lijnen HR, Collen D. Kinetics of the activation of plasminogen by human tissue plasminogen activator: role of fibrin. J Biol Chem. 1982;257:2912-2929.
9.Fleury V, Anglйs-Cano E. Characterization of the binding of plasminogen to fibrin surfaces: the role of carboxy-terminal lysines. Biochemistry 1991;30:7630-7638
10.Lucas MA, Fretto LJ, McKee PA. The binding of human plasminogen to fibrin and fibrinogen. J Biol Chem. 1983;258:4249-4256Mangel WF, Lin B, Ramakrishnan V. Characterization of an extremely large, ligand-indused conformational change of plasminogen. Science. 1990;248:69-73.
11.Hoylaerts M, Rijken DC, Lijnen HR, Collen D. Kinetics of the activation of plasminogen by human tissue plasminogen activator: role of fibrin. J Biol Chem. 1982;257:2912-2929.
12.Suenson E, Lutzen O, Thorsen S. Initial plasmin-degradation of fibrin as the basis of a positive feed-back mechanism in fibrinolysis. Eur J Biochem. 1984;140:513-522.
13.Wiman B, Boman L, Collen D. On the Kinetics of the Reaction between Human Antiplasmin and a Low-Molecular-Weight Form of Plasmin. Eur J Biochem. 1978;87:143-146.
14.Miles LA, Dahlberg CM, Plow EF. The cell-binding domains of plasminogen and their function in plasma. J Biol Chem. 1988;263:11928-11934.
15.Henschen A. On the structure of functional sites in fibrinogen. Thromb Res. 1983; Suppl V: 27-39.
16.Darras V, Thienpont M, Stump DC, Collen D. Measurement of urokinase-type plasminogen activator (u-PA) with an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) based on three murine monoclonal antibodies. Thromb Haemost. 1986;56:411-414.
17.Ellis V, Scully MF, Kakkar VV. Plasminogen activation by single-chain urokinase in functional isolation. A kinetic study. J Biol Chem. 1987;262:14998-15003.
18.Lijnen HR, Van Hoef B, De Cock F, Collen D. The mechanism of plasminogen activation and fibrin dissolution by single chain urokinase-type plasminogen activator in a plasma milieu in vitro. Blood. 1989;73:1864-1872.
19.Andreasen PA, Nielsen LS, Kristensen P, Grondahl-Hansen J, Skriver L, Dano K. Plasminogen activator inhibitor from human fibrosarcoma cell binds urokinase-type plasminogen activator, but not its proenzyme. J Biol Chem. 1986;261:7644-7651.
20.Gurewich V, Pannell R, Louie S, Kelley P, Suddith RL, Greenlee R. Effective and fibrin-specific clot lysis by a zymogen precursor form of urokinase (pro-urokinase). A study in vitro and in two animal species. J Clin Invest. 1984;73:1731-1739.
21.Robbie LA, Bennett B, Croll AM, Brown PA, Booth NA. Proteins of the fibrinolytic system in human thrombi. Thromb Haemost. 1996;75:127-133.
22.van Zonneveld AJ, Veerman H, Pannekoek H. On the interaction of the finger and the kringle-2 domain of tissue-type plasminogen activator with fibrin. Inhibition of kringle-2 binding to fibrin by epsilon-amino caproic acid. J Biol Chem. 1986;261:14214-14218.
23.Madison EL, Goldsmith EJ, Gerard RD, Gething MJ, Sambrook JF, Bassel-Duby RS. Amino acid residues that affect interaction of tissue-type plasminogen activator with plasminogen activator inhibitor 1. Proc Natl Acad Sci. 1990;87:3530-3533.
24.Ranby M. Studies on the kinetics of plasminogen activation by tissue plasminogen activator. Biochim Biophys Acta. 1982;704:461-469.
25.Tate KM, Higgins DL, Holmes WE, Winkler ME, Heyneker HL, Vehar GA. Functional role of proteolytic cleavage at arginine-275 of human tissue plasminogen activator as assessed by site-directed mutagenesis. Biochemistry. 1987;26:338-343
26.Wiman B, Collen D. On the kinetics of the reaction between human antiplasmin and a low-molecular-weight form of plasmin. Eur J Biochem. 1978;87:143-146.
27.Kolev K, Lerant I, Tenekejiev K, Machovich R. Regulation of fibrinolytic activity of neutrophil leukocyte elastase, plasmin and miniplasmin by plasma protease inhibitors. J Biol Chem. 1994;269:17030-17034.
28.Aoki N, Moroi M, Tachiya K. Effect of alpha-2-plasmin inhibitor on fibrin clot lysis. Its comparison with alpha-2-macroglobulin. Thromb Haemost. 1978;39:22-31.
29.Booth NA, Simpson AJ, Croll A, Bennett B, MacGregor IR. Plasminogen activator inhibitor (PAI-1) in plasma and platelets. Br J Haematol. 1988;70:327-333.
30.Fay WP, Eitzman DT, Shapiro AD, Madison EL, Ginsburg D. Platelets inhibit fibrinolysis in vitro by both plasminogen activator inhibitor-1-dependent and -independent mechanisms. Blood. 1994;83:351-356.
31.Stromqvist M, Schatteman K, Leurs J, Verkerk R, Andersson JO, Johansson T, Scarpe S, Hendriks D. Immunological assay for the determination of procarboxypeptidase U antigen levels in human plasma. Thromb Haemost. 2001;85:12-17.
32.Bajzar L, Morser J, Nesheim M. TAFI, or plasma procarboxypeptidase B, couples the coagulation and fibrinolytic cascades through the thrombin-thrombomodulin complex. J Biol Chem. 1996;271:16603-16608.
33.Boffa MB, Wang W, Bajzar L. Nesheim M.E. Plasma and recombinant thrombin-activable fibrinolysis inhibitor (TAFI) and activated TAFI compared with respect to glycosylation, thrombin/thrombomodulin-dependent activation, thermal stability and enzymatic properties. J Biol Chem. 1998;273:2127-2135.
34.Eaton DL, Malloy BE, Tsai SP, Henzel W, Drayna D. Isolation, molecular cloning, and partial characterization of a novel carboxipeptidase B from human plasma. J Biol Chem. 1991;269:21833-21838.
35.Mao SS, Cooper CM, Wood T, Shafer JA, Gardell SJ. Characterization of plasmin-mediated activation of plasma procarboxypeptidase B. J Biol Chem. 1999;274:35046-35052.
36.Wang W, Boffa MB, Bajzar L, Walker JB, Nesheim ME. A study of the mechanism of inhibition of fibrinolysis by activated thrombin-activable fibrinolysis inhibitor. J Biol Chem. 1998;273:27176-27181.
37.Diamond S.L., Anand S. Inner clot diffusion and permeation during fibrinolysis.// Biophys. J. - 1993. - Vol.65. - P.2622-43.
38.Baradet T.C., Haselgrove J.C., Weisel J.W. Three-dimensional reconstruction of fibrin clot networks from stereoscopic intermediate voltage electron microscope images and analysis of branching.// Biophys. J. - 1995. - Vol.68. - P.1551-60
39.Cesarman-Maus G., Hajjar K.A. Molecular mechanisms of fibrinolysis.// Br. J. Haematol. - 2005. - Vol.129. - P.307-21.
40.Suenson E., Thorsen S. Secondary-site binding of Glu-Plasmin, Lys-Plasmin and miniplasmin to fibrin.// Biochem. J. - 1981. - Vol.197. - P. 619-628.
41.Tran-Thang C., Kruithof E.K., Atkinson J., Bachmann F. High-affinity binding sites for human Glu-plasminogen unveiled by limited plasmic degradation of human fibrin.// Eur. J. Biochem. - 1986. - Vol.160. - P.599-604.
42.Walker J.B., Nesheim M.E. The molecular weights, mass distribution, chain composition, and structure of soluble fibrin degradation products released from a fibrin clot perfused with plasmin.// J. Biol. Chem. - 1999. - Vol.274. - P.5201-12.
43.Fleury, Characterisation of the binding of plasminogen to fibrin surfaces. //Biochemistry. 1991- 30(30)-P.7630-8.
44.Kruithof EK.The inhibitors of the fibrinolytic system. In:Bachmann F, ed. Fibrinolytics and antifibrinolytics. Handbook of experimental pharmacology. Vol 146. Berlin, Springer, 2001:113-139
Подобные документы
Описания первичного сосудисто-тромбоцитарного и вторичного коагуляционного гемостаза. Плазменные факторы свертывания крови. Анализ типов кровоточивости. Основы диагностики нарушений гемостаза. Основные маркеры активации свертывающей системы и фибринолиза.
презентация [367,0 K], добавлен 14.04.2015Программное обеспечение для осуществления моделирования биохимических и генетических процессов в клетке. Математическая модель динамики изменения объема и потенциала эритроцита. Симуляция гибели эритроцита методом фиксации трансмембранного потенциала.
дипломная работа [1,3 M], добавлен 26.05.2012Исследование механизмов функционирования клеточных систем, кодирование и регуляция биохимических процессов. Принцип обратной связи высокоспецифических механизмов, регулирующих активность макромолекул. Колебательный режим работы регуляторных систем.
реферат [16,4 K], добавлен 06.09.2009Организация открытых систем в пространстве и во времени. Энтропия как мера необратимости природных процессов. Синтез белка в клетке, понятие матричных реакций. Признаки и свойства одноклеточных простейших организмов. Характеристика структуры популяций.
контрольная работа [43,4 K], добавлен 16.04.2014Понятие и основные причины нарушения свертывающей системы крови. Понижение свертывания крови, повышенная кровоточивость (геморрагический синдром). Нарушение тромбоцитарно-сосудистого и коагуляционного гемостаза как следствие повышения свертывания крови.
реферат [20,4 K], добавлен 01.11.2015Понятие системного метода и этапы его исторического формирования. Строение и структура систем, порядок взаимодействия ее элементов, классификация и разновидности. Метод и перспективы системного исследования, назначение математического моделирования.
контрольная работа [25,4 K], добавлен 28.10.2009Сущность понятия "рефлекс". Особенности объективного метода условных рефлексов. Филогенетическое изучение условных рефлексов. Классификация безусловных рефлексов российского физиолога Слонима, английского этолога Темброка. Сущность понятия "доминанта".
реферат [20,1 K], добавлен 22.09.2009Основные свойства молока и причины возникновения патогенной микрофлоры. Сущность биохимических процессов брожения и гниения. Фазы изменения микрофлоры парного молока. Характеристика кисломолочных продуктов, особенности их использования человеком.
курсовая работа [19,0 K], добавлен 12.04.2012Градация активации мозга. Восходящая активирующая ретикулярная система. Сенсорные и корковые импульсы. Серотонинэргическая система ядер. Адренергическая система голубоватого места. Предельное психическое напряжение и полудремотное состояние человека.
презентация [1,1 M], добавлен 31.03.2016Особенности проведения биохимических исследований в спорте, объекты, основные показатели и задачи контроля. Направленность биохимических сдвигов в организме после выполнения стандартных и максимальных нагрузок в зависимости от уровня тренированности.
реферат [127,4 K], добавлен 06.09.2009
