Создание линий Drosophila melanogaster для исследования функций гена семейства d4 в нервной системе

GAL4 кодирует белок, который содержит 881 аминокислоту, идентифицирован у дрожжей Saccharomyces Cerevisiae в качестве регулятора генов (например, GAL10 и GAL1), индуцируемых галактозой (Laughon et al., 1984; Laughon and Gesteland, 1984; Oshima, 1982). В ряде известных исследований по регуляции транскрипции было определено, что GAL4 кодирует особый белок, имеющий два домена, один из которых обладает сродством к ДНК, а другой служит для активирования транскрипции (Рис. 1.22). У дрожжей GAL4 регулирует транскрипцию в разнонаправленно транскрибируемых генах GAL10 и GAL1, за счет прямого связывания с четырьмя одинаковыми участками длиной 17 пар оснований, расположенных между этими локусами (Giniger et al., 1985).

Рисунок 1.22. а) Состав преинициаторного белкового комплекса и его регуляторных компонентов, AR - энхансерные белки - активаторы транскрипции; CTD (C-Terminal Domen) - С-концевой домен РНК-полимеразы II; A, B, E, F, H - TFIIA, TFIIB, TFIIE, TFIIF, TFIIH соответственно - базовые (общие) факторы транскрипции (TF); GAL11, SIN4, RGR1 - субъединицы РНК-полимеразы II; SRB - регуляторный белок; SWI/SNF - факторы, ремодулирующие нуклеосомы; TBP - TATA-box binding protein - базовый фактор транскрипции, связывающийся с ТАТА-боксом в районе промотора и привлекающий РНК- полимеразу на промотор; TAF (TBP-associated factor) - фактор, ассоциированный с TBP; TAF и TBP формируют комплекс TFIID. б) Модель действия активирующего белка GAL4, белок GAL4 - активатор транскрипции у дрожжей, связывающийся с регуляторной последовательностью UAS. При контакте с промотором облегчает добавление к комплексу TFIID (ТВР+TAFs) фактора транскрипции TFIIB, TATA - TATA-box - участок ДНК в районе промотора, обогащ?нный аденином (А) и тимином (Т). По Жимул?ву, 2000.

Эти сайты образуют активатор последовательности, расположенной выше точки начала транскрипции (UAS), элемент аналогичный энхансеру многоклеточных эукариот, который необходим для активации транскрипции генов, регулируемых белком GAL4. ДНК-связывающая активность GAL4 определяется первыми 74 аминокислотными остатками (а.о.), а его участки, выполняющие функции активации транскрипции, расположены в двух регионах: 148-196 а.о. и 768-881 а.о., т.е. именно эти районы (области) отвечают за активирующую способность белка GAL4 (Ma and Ptashne, 1987b). После на основе этой работы, в 1988 году Фишер и коллеги показали, что экспрессия GAL4 у дрозофилы способна стимулировать транскрипцию гена-репортера под контролем UAS. Эта активность не ограничивается мушкой Drosophila, так как GAL4 может функционировать в широком диапазоне систем, активизируя транскрипцию с помощью элемента UAS (Kakidani and Ptashne, 1988; Ма et al, 1988; Webster et al, 1988). Важно отметить, что экспрессия GAL4 в клетках дрозофилы не имеет явных вредных фенотипических эффектов. Эти два результата позволили развивать систему GAL4/UAS применительно к регуляции направленной экспрессии генов.

Направленная экспрессия гена в определенное время или конкретном месте (временная или тканеспецифическая) является одним из наиболее мощных методов для установления функции гена in vivo. В 1993 Брэнд и Перримон опубликовали статью о двустороннем подходе для направленной экспрессии генов in vivo (Рис. 1.23).

Рисунок 1.23. Двухкомпонентная система GAL4/UAS в дрозофиле. По: J.B. Duffy, 2002, с изменениями. Самка, несущая в геноме респондер под контролем UAS (UAS-GFP), скрещивается с самцом, несущим драйвер Elav-GAL4. Е? потомство (UAS-GFP/Elav-GAL4) содержит оба элемента системы. Присутствие GAL4 в нервной системе изображенных эмбрионов запускает экспрессию гена-респондера GFP под промотором UAS. В данном случае продукт гена-респондера (белок GFP) выступает в роли маркера нервной системы.

В системе GAL4/UAS экспрессия исследуемого гена, называемого респондером, находится под контролем элемента UAS, состоящего из пяти последовательных GAL4-связывающих сайтов. Так как транскрипция респондера требует присутствия GAL4, то при отсутствии GAL4 в линии, данный ген поддерживается в транскрипционно молчащем состоянии. Для активации их транскрипции, дрозофилы, несущие этот ген, скрещиваются с дрозофилами, экспрессирующими GAL4, которые называются драйверами. В результате у потомства паттерн экспрессии гена-респондера будет соответствовать паттерну экспрессии GAL4-драйвера. Этот двусторонний подход, в котором два компонента системы, респондер и драйвер, поддерживается в виде отдельных родительских линий, имеет множество преимуществ. Во-первых, молчание респондерной материнской линии означает, что трансгенные линии могут синтезироваться для генов, продукты которых являются токсичными, летальными, или понижают жизнеспособность при экспрессии. Например, в настоящее время подобные линии существуют для таких генов, как ricin А (кодирует ядовитый продукт), reaper (при определенных условиях может запускать программируемую смерть клетки - апоптоз), для онкогенов, таких, например, как brafact, чья экспрессия приводит к снижению жизнеспособности (Brand, Perrimon, 1994; Aplin, Kaufman, 1997). Когда в эти клетки вводится драйвер для GAL4, индукция таких респондеров прекращается, тем самым вызывая гибель клеток, летальность или пониженную жизнеспособность от продуктов. Это дает мощный инструмент в изучении эффекта гибели специфических клеток в интересующих процессах, и функции генов ядов, смертельных или опухолеродных генов. Дополнительное преимущество системы возникает из возможности с ее помощью целенаправленно вызывать тканеспецифическую и временную экспрессию любого гена, комбинируя ее с различными драйверами GAL4. Так как экспрессия респондера зависит от характера драйвера GAL4, Брэнд и Перримон ловко воспользовались огромным разнообразием геномных регуляторных последовательностей и энергичностью сообщества генетиков-дрозофилистов, чтобы синтезировать конструкции, называемые «ловушка энхансеров» на основе GAL4 (pGAWB). Такие конструкции способны вызывать и усиливать экспрессию гена GAL4, а, следовательно, и гена-респондера в различных тканях, в том числе и тех, в которых в норме данный ген не экспрессируется. Это привело к образованию поразительного множества специфических драйверов GAL4 для направленной экспрессии генов почти во всех основных типах тканей.

Сегодня подавляющее большинство драйверов GAL4 находятся в открытом доступе через музеи коллекций линий дрозофилы, например, через американский центр в Блумингтоне on-line на http://flystocks.bio.indiana.edu/Browse/gal4/gal4_main.htm.

В настоящее время общее понятие о системе GAL4/UAS как об инструменте для изучения нарушенной экспрессии специфических генов быстро изменяется и список альтернативных использований этой системы разнообразен и длинен. Некоторые из наиболее стандартных направлений использования системы включают: 1) идентификацию генов, вовлеченных в интересующий процесс при помощи энхансерных или генетических ловушек;

2) анализ автономности работы гена с помощью направленной мозаичной экспрессии; 3) маркировка клеток для облегчения скрининга мутаций, воздействующих на интересующий процесс; 4) анализ фенотипа потери функции через направленную экспрессию РНК-интерференции негативных доминантных конструкций; 5) идентификации генов, нарушенная экспрессия которых воздействует на интересующий процесс (Duffy, 2002).

Таким образом, система GAL4/UAS является мощным инструментом для изучения функций генов через их направленную экспрессию в различных тканях и клетках. Данная система позволяет экспрессировать любой ген, находящийся под контролем UAS, в любой клетке или ткани организма через подбор определенных драйверов. Исследователь может моделировать различные процессы, видоизменяя систему активации транскрипции.

Мы использовали данную систему для исследования нервной системы у мух с нулевым аллелем гена семейства d4 - toothrin (tth). Для этого была использована драйверная линия, экспрессирующая GAL4 тканеспецифически в нервной системе дрозофилы, и линия-репортер, экспрессирующая белок GFP под контролем UAS. Сочетание конструкций в одном геноме позволяет визуализировать (маркировать) нервную систему по свечению флуоресцентного белка GFP (см. рис. 1.23). Основной задачей стало совместить их в геноме мутантных мух, несущих нулевой аллель гена tth, и сравнить паттерн экспрессии GFP у мутантов и у мух дикого типа.

1.10 Балансирование хромосом

· Df(1)260-1, y1/FM4 - линия, содержащая балансер по первой хромосоме, где FM4 - это инверсия In(1)FM4, y31d sc8 dm1 B1 ;

· w1; Bl1/ SM5 - линия, содержащая балансер по второй хромосоме, где SM5 - это инверсия In(2LR)SM5, al2ds55Cy1ltvcn2sp2;

· w1;TM2/TM6B - линия, содержащая балансеры по третьей хромосоме, где TM2 - это инверсия In(3LR)TM2, Me1Sbsbd-l kniri-1и TM6B - это инверсия In(3LR)TM6B, AntpHu e1 Tb1 ;

· tth{w+} - линия, в которой последовательность гена tth заменена на последовательность гена white;

· Elav-GAL4 / CyO - линия-драйвер, где Elav - тканеспецифичный промотор, GAL4 - дрожжевой ген, экспрессирующий активатор транскрипции;

· Cy/Bl; UAS-CD8-GFP - линия-репортер, где UAS - дрожжевой промоторный элемент, сайт связывания с активатором транскрипции GAL4, GFP - ген, кодирующий флуоресцентный белок; конструкция UAS-CD8-GFP локализована в III хромосоме;

· w; Cy/L; D/Sb - балансерная линия с доминантными маркерами во II и III аутосомах (сокращ?нно 18V).

Методы содержания дрозофилы и манипулирования с ней

Наркотизированных дрозофил просматривают под бинокуляром. Для их массового разбора и подсчета обычно используют подрезанные маховые перья птиц. Если во время просмотра особи просыпаются, их вновь подвергают наркотизации. Ненужных для последующей работы дрозофил выбрасывают в сосуд, содержащий жидкость, в которой они быстро тонут (трансформаторное масло, спирт и растворы детергентов в воде).

Температурные условия разведения

В лабораторных условиях дрозофил разводят при 22 - 24оС. При этой температуре развитие мушек происходит за 10 дней, а средняя продолжительность жизни D. melanogaster составляет 3-4 недели. При температуре выше 30о наступает полная или частичная стерильность. Низкие температуры оказывают замедляющее действие на развитие (20 дней), это используют для содержания фонда. Коллекцию обычно содержат при 18о - 19оС, что позволяет реже пересаживать мух на свежую питательную среду.

Отбор девственных самок

При постановке скрещиваний необходимо использовать девственных самок, поскольку жизнеспособная сперма может храниться в сперматеках самок в течение нескольких суток после спаривания. Девственных самок отбирают следующим образом: из культур удаляют всех мух, затем через 6 часов, в течение которых выводятся новые мухи, отбирают самок. Так как первые подвижные сперматозоиды у самцов появляются только через 7+1 часов после выхода из куколки, то девственность самок, отобранных в этом интервале, не вызывает сомнений.

Генетический синтез линий D. melanogaster

Схема 1. Ввод балансера (FM4) по первой хромосоме в геном мух линии tth{w+}.

Р: + FM4, B/Df(1)260-1, y1 х > tth{w+}/Y

В F1 отбираем самок с мутацией Bar , которой маркирована Х-хромосома, и возвратно скрещиваем их с родительскими самцами.

F1:+ FM4, B/tth- x > tth{w+}/Y

В F2 отбираем особей без мутации Bar и скрещиваем их между собой.

F2: +> tth-

Схема 2. Ввод балансера (FM4) по первой хромосоме в геном мух балансерной линии w1; Bl1/SM5.

Р: + FM4, B/Df(1)260-1, y1; +/+ x > w1/Y ; SM5, Cy/ Bl1

В F1 отбираем самок с мутацией Bar и мутацией Curly, которыми маркированы балансеры по Х-хромосоме и второй хромосоме соответственно. Далее скрещиваем их с самцами, отобранными в этом же скрещивании, несущими также мутацию Bar в Х-хромосоме и мутацию Bristle1 во второй.

F1: +FM4, B/ w1; SM5, Cy/+ х > FM4, B/Y ; Bl1/+

В F2 отбираем самцов, имеющих доминантные мутации Bar, Curly и Bristle1 и скрещиваем их возвратно с родительскими самками линии-балансера FM4, B/Df(1)260-1, y1.

F2: +FM4, B/Df(1)260-1, y1 ; +/+ x > FM4, B/Y ; SM5, Cy/Bl1 F3: + FM4, B/Df(1)260-1, y1; Bl1/+ x > FM4, B/Y ; SM5, Cy/+ F4: +> FM4, B/Df(1)260-1, y1 ; SM5, Cy/ Bl1

Схема 3. Замена хромосомы II у мух с нулевым аллелем гена toothrin на балансерную хромосому II мух линии, полученной по Схеме 2.

Р: + tth-/tth- ; +/+ х > FM4, B/Y ; SM5, Cy/Bl1

В F1 отбираем девственных самок, несущих мутацию или Curly, или

Bristle1, и скрещиваем их возвратно с родительскими самцами.

F1: + FM4, B/ tth- ; SM5, Cy(Bl1)/+ x > FM4, B/Y ; SM5, Cy/ Bl1

F2:+ FM4, B/tth- ; SM5, Cy/Bl1 x > tth- /Y ; SM5, Cy/Bl1

F3: +> tth- ; SM5, Cy/Bl1

Схема 4. Замена хромосомы II у мух с нулевым аллелем гена toothrin на хромосому II, несущую драйверную конструкцию Elav-GAL4.

Сначала делаем замену хромосомы II мух линии FM4, B/Df(1)260-1, y1; SM5, Cy/ Bl1, полученной нами по Схеме 2, на хромосому с конструкцией драйвера Elav-GAL4.

Р: + FM4, B/Df(1)260-1, y1; SM5, Cy/Bl1 x > +/Y; Elav-GAL4/CyO

F1:+ FM4, B/+; Elav-GAL4/Cy x > FM4, B/Y; Elav-GAL4/Cy

Самцов с мутацией Bar, полученных в потомстве F1, скрещиваем с самками FM4, B/tth-; SM5, Cy/Bl1 (см. Схему 3).

F2:+ FM4, B/tth-; SM5, Cy/Bl1 x > FM4, B/Y; Elav-GAL4/Cy

F3: + FM4,B/tth-; Elav-GAL4/Cy x > tth-/Y ; Elav-GAL4/Cy

F4: +> tth-; Elav-GAL4/Cy