Размещено на http://www.allbest.ru/

Министерство образования и науки Российской Федерации

Новосибирский Государственный Университет

Факультет естественных наук

Кафедра: Молекулярной Биологии

Дипломная работа

Экспрессия D-глюкуронил С5-эпимеразы и декорина в нормальной и опухолевой ткани молочной железы человека

Ещенко Татьяна Юрьевна

Научный руководитель

К.б.н. Григорьева Эльвира Витальевна

Новосибирск 2010

Список сокращений

ПГ- протеогликаны

ГАГ- гликозаминогликаны

GlcN- глюкозамин

GalN- галактозамин

GlcUA- глюкуроновая кислота

IdoUA- идуроновая кислота

ХС- хондроитинсульфат

ДС-дерматансульфат

ГС- гепарансульфат

ДСПГ- дерматансульфат протеогликан

ПЦР - полимеразная цепная реакция

Введение

На сегодняшний день одной из основных проблем клеточной биологии является изучение регуляции клеточной пролиферации. На данный момент открыто множество биологических молекул, которые участвуют в процессах злокачественной трансформации. Одной из таких молекул является декорин - лейцин-богатая молекула дерматансульфат протеогликана, состоящая из белкового кора и несущая на себе одну цепь дерматансульфата. В последние годы активно ведутся исследования декорина. Показано, что декорин подавляет клеточную пролиферацию, показаны механизмы его антимитотического действия - через усиление экспрессии р21 белка, супрессии циклина и подавлении активности циклин зависимых киназ.

Добавление декорина в культуру опухолевых клеток приводило к возвращению опухолевых клеток к нормальному фенотипу, введение генно-инженерных конструкций содержащих ген декорина в экспериментально растущую опухоль приводило к значительному замедлению роста опухоли, что позволило отнести декорин к перспективным антиопухолевым агентам.

Известно, что в опухолевых клетках происходит снижение экспрессии и содержания декорина. Однако причина этого до сих пор остается неизвестной.

Нами было высказано предположение, что происходит изменение в процессе биосинтеза декорина. Известно, что ключевым ферментом биосинтеза дерматансульфат протеогликанов (в том числе и декорина) является D-глюкуронил С5-эпимераза - фермент, который осуществляет модификацию углеродной цепи хондроитинсульфата в дерматансульфат. Возможно, что происходит нарушение экспрессии либо активности этого фермента, что приводит к нарушению структуры и состава протеогликанов в опухолевых клетках.

Основной проблемой в изучении данного вопроса является то, что ген D-глюкуронил С5-эпимеразы до сих пор не клонирован и ранее работы с этим геном не проводились. Однако после окончания секвенирования генома человека методом компьютерного анализа была обнаружена последовательность ДНК, гомологичная гену D-глюкуронил С5-эпимеразы мыши. Это позволило начать нам начать работу по изучению экспрессии человеческого гомолога мышиной D-глюкуронил С5-эпимеразы и ее корреляции с экспрессией гена декорина в опухолевой ткани молочной железы человека.

Таким образом, целью данной работы являлось: установление взаимосвязи между экспрессией гена D-глюкуронил С5-эпимеразы и гена декорина в нормальной и опухолевой ткани молочной железы человека.

В соответствии с целью, были поставлены следующие задачи:

1. Провести компьютерный анализ последовательности ДНК, гомологичной гену D-глюкуронил С5-эпимеразы животных и подобрать праймеры для человеческого гомолога мышиного гена D-глюкуронил С5-эпимеразы.

2. Оценить уровень экспрессии гена D-глюкуронил С5-эпимеразы в клинических образцах нормальной ткани молочной железы человека.

3. Провести сравнительный анализ экспрессии гена D-глюкуронил С5-эпимеразы в контрольной и опухолевой ткани молочной железы человека.

4. Определить уровень экспрессии гена декорина в тех же самых клинических образцах контрольной и опухолевой ткани молочной железы человека.

5. Проверить наличие взаимосвязи исследованных параметров (экспрессию гена D-глюкуронил С5-эпимеразы и экспрессию гена декорина в опухоли) между собой и сопоставить с клиническими диагнозами пациентов.

Глава 1. Литературный обзор

1.1 Протеогликаны

Протеогликаны - это сложные белково-углеводные молекулы, состоящие из корового белка и присоединенных к нему одной или несколько цепей гликозаминогликанов

1.1.1 Строение и классификация гликозаминогликанов

Молекулы гликозаминогликанов (ГАГ) представляют собой неразветвленные углеводные цепи с характерными повторяющимися дисахаридными единицами, которые включают в себя гексозамин (D- глюкозамин или D-галактозамин) и уроновую кислоту (D-глюкуроновую или L-идуроновую), присутствующую во всех ГАГ, за исключением кератансульфата, где она замещена остатками галактозы (рис.2).

В зависимости от гексозамина, входящего в состав углеводной цепи гликозаминогликана, выделяют следующие основные классы гликозаминогликанов: гиалуроновая кислота (ГК), гепарансульфаты/гепарин (ГС/Ге), хондроитинсульфаты (ХС), дерматансульфаты (ДС), кератансульфаты (КС) (рис. 2)

Если в состав ГАГ входит глюкозамин, то углеводную цепь относят к классу ГС/ Ге, если в состав входит галактозамин, то углеводную цепь ГАГ относят к классу ГС/ ДС [1].

Размещено на http://www.allbest.ru/

Глюкуроновая кислота в гепарансульфатах и дерматансульфатах может быть эпимеризована в идуроновую кислоту под действием фермента D-глюкуронил С5-эпимеразы (рис. 3). Степень эпимеризации варьирует в различных тканях и зависит от структуры корового белка [2].



Хондроитинсульфат Дерматансульфат

Рис. 3. Эпимеризация глюкуроновой кислоты в идуроновую кислоту

Посттрансляционная модификация ГАГ заключается не только в эпимеризации остатков уроновых кислот, но и в последующем специфическом присоединении отрицательно-заряженных групп SO42- и СOO -. За исключением гиалуроновой кислоты все ГАГ в различной степени могут быть О-сульфатированы (рис. 4), а гепарин и гепарансульфат кроме того могут содержать N-сульфатированные группы в остатках глюкозамина [1].

Размещено на http://www.allbest.ru/

Степень сульфатирования ГАГ намного выше, чем других макромолекул и достигает 3-4 сульфатных групп на дисахарид.

Благодаря сульфатным и карбоксильным группам ГАГ имеют очень высокую плотность отрицательного заряда, что во многом определяет их биологические свойства и регулирует их взаимодействие с другими молекулами.

1.1.2 Биосинтез протеогликанов

Биосинтез и распад гликозаминогликанов (ГАГ) осуществляются при участии высокоспецифичных ферментов - гликозилтрансфераз и гликозидаз (сульфатаз) в эндоплазматическом ретикулуме (ЭПР) и аппарате Гольджи.

Биосинтез ПГ начинается с синтеза тетрасахаридного связывающего участка и последующей полимеризации ГАГ цепи (рис. 5).

Основные ферменты, участвующие в синтезе тетрасахарида, указаны в Табл.1

Табл. 1. Основные ферменты синтеза тетрасахаридного сязывающего региона

Фермент		Субстрат
Ксилозилтрансфераза	XylT	..D/E..SG.. D/E
Галактозилтрансфераза-I	GalT-I	Xyl-Ser
Галактозилтрансфераза-II	GalT-II	Gal-Xyl-Ser
Глюкуронилтрансфераза-I	GlcAT-I	Gal-Gal-Xyl-Ser

Синтез протеогликанов начинается в ЭПР переносом ксилозы от UDP-ксилозы на остаток серина корового белка, осуществляемое ферментом О-ксилозилтрансферазой (XylT) [3]. Последующее добавление двух галактозных остатков, производимое двумя различными галактозилтрансферазами (GalT-I, GalT-II ) происходит в начальных/средних отделах аппарата Гольджи. В качестве донора галактозных остатков используется UDP-галактоза. Одна галактозилтрансфераза образует в-1,3-, а другая-- в -1,4-гликозидную связь[4]. Затем присоединяется глюкуроновая кислота при помощи фермента глюкуронилтрансферазы-1 (GlcAT-I), которая завершает синтез тетрасахаридного связывающего участка (Xyl-Gal-Gal-GluAU)[4].

Дальнейший синтез заключается в последовательном присоединении уроновой кислоты и гликозамина/галактозамина [5].

Табл. 2. Основные ферменты биосинтеза протеогликанов

Фермент		Субстрат
в- галактозилтрансфераза-I	вGalNAcT-I	GlcA-Gal-Gal-Xyl-Ser
в - глюкуронозилтрансфераза-II	вGlcAT-II	GalNAcв1-4GlcA-...
в- галактозилтрансфераза-II	вGalNAcT-II	GlcAв1-3GalNAc-...
D-глюкуронил С5-эпимераза	С5-EPI	-3GalNAcв1-GlcAb1-
Хондроитинсульфат-4-сульфотрансфераза	CS4-ST	-3GalNAcв1-GlcAb1-
Хондроитинсульфат-6-сульфотрансфераза	CS6-ST	-3GalNAcв1-GlcAb1-
Дераматансульфат- 6- сульфотрансфераза	DS6-ST	-3GalNAcв1-IdoAa1-
Дерматансульфат- 2- сульфотрансферза	DS2-ST	-3GalNAcв1-IdoAa1-

Элонгация тетрасахарида начинается с добавления GalNAc ферментом галактозилтрансферазой (вGalNAcT-I), затем в биосинтез включается фермент глюкуронозил-трансфераза, которая присоединяет остаток глюкуроновой кислоты.

После завершения синтеза углеводной цепи происходит ее модификация - эпимеризация глюкуроновой кислоты, проводимая ферментом D- глюкуронил С5-эпимеразой (С5-EPI) и сульфатирование/деацетилирование, проводимое ферментом N-деацетилаза/сульфатаза. Затем сульфотрансферазы проводят сульфатирование по различным положениям (см. Табл. 2) [6].

Таким образом, образуются полностью модифицированные зрелые молекулы протеогликанов, которые транспортируются к месту назначения.

1.1.3 Локализация и функции протеогликанов

Практически все клетки продуцируют протеогликаны (ПГ), которые затем могут транспортироваться в ВКМ, встраиваться в плазматические мембраны или оставаться в секреторных гранулах.

Протеогликаны внеклеточного матрикса (ВКМ) в основном содержат ДС/ХС цепи ГАГ[7], тогда как ПГ на поверхности клеток в основном представлены ГС [8].

Протеогликаны в ВКМ формируют его структуру за счет взаимодействия с различными внеклеточными макромолекулами. Известно, что во внеклеточном матриксе протеогликаны взаимодействуют с ламинином, фибронектином [9], коллагеном I [10]. Известно, что декорин связывается с коллагеном I, II [11], IX [12] причем как в эмбриональных тканях, так и в тканях взрослого человека [12]. Фибромодулин, так же как и декорин, связывается с коллагеном I и II и влияет на их фибриллогенез [13], тогда как бигликан коллаген не связывает, но его большое количество было обнаружено во внеклеточном матриксе мезенхимальных эмбриональных клеток [12].

Показано, что аггрекан в суставных хондроцитах быка образует комплекс с гиалуроновой кислотой и связывающим белком [14], кроме того, подобный комплекс может образовывать и другой ПГ- версикан [15] . Показано, что молекула версикана из культуры клеток ACHN взаимодействует с хемокинами [16], L- селектином [17], Р-селектином, рецептором CD 44 (рецептор CD 44 играет важную роль в процессах воспаления, аутоиммунном ответе, прогрессии опухолей). Связь образуется посредством взаимодействия ХС цепи версикана с углеводсвязывающим доменом L-, P-селектина, CD44 [18].

Протеогликаны поверхности клеток представляют собой рецепторы для различных компонентов ВКМ, регуляторных макромолекул, факторов роста и играют ключевую роль в информационной связи между клеткой и ВКМ.

На поверхности кератиноцитов обнаружен и идентифицирован эпикан - гепарансульфат протеогликан [19], после секвенирования его корового белка, было обнаружено, что он является протеогликановой формой рецептора CD44 [20]. Показано, что это альтернативно сплайсированная форма корового белка CD44, содержащая дополнительный экзон [21].

Показано, что ПГ могут связывать факторы роста и регулировать их активность.

Декорин, относящийся к классу дерматансульфат протеогликанов (ДСПГ), взаимодействует с рецептором эпидермального фактора роста и запускает сигнальный каскад реакций, который приводит к торможению деления клеток [22]. Бетагликан - ПГ, содержащий ХС и ГС, цепи взаимодействует (как и декорин) с трансформирующим фактором роста (TGFв) [23].

Гепарансульфат протеогликаны (например, синдекан) связывают различные факторы роста, включая фактор роста фибробластов- bFGF, aFGF, гранулоцитомакрофаг колониестимулирующий фактор (GM-CSF), взаимодействуют с интерлейкином 3 и интерфероном г [7], усиливают рост и дифференцировку клетки, взаимодействуя с bFGF [24] , показан предположительный механизм связывания рецептора bFGF с ГС [25].

Таким образом, протеогликаны являются очень активными молекулами, они выполняют жизненно важные функции в клетке.

1.2 Состав протеогликанов в трансформированных клетках

Известно, что в опухолевых клетках состав протеогликанов изменяется. Показано, что в клетках практически всех исследованных опухолевых тканей происходит увеличение содержания протеогликанов по сравнению с нормальной тканью: в опухолевых клетках карциномы желудка происходит увеличение содержания ПГ по сравнению с нормальной тканью в два раза [26], в карциноме поджелудочной железы в 4 раза [27], в карциноме прямой кишки - в 2 раза [28].

В опухолевых клетках происходит снижение сульфатирования ГАГ - в клетках карциномы желудка в 10 раз увеличивается содержание несульфатированных дисахаридных единиц, однако происходит увеличение сульфатирования ХС и ДС цепей по 6-сульфо-положению в 4 раза [26]. В клетках аденокарциномы кишечника увеличивается число несульфатированных единиц в 3 раза, в 3 раза уменьшается количество 4-сульфатированных единиц, увеличивается в 5 раз количество дисахаридных единиц, сульфатированных по 6-положению [29].

Показано, что изменяется структура ПГ в опухолевых клетках - в лейомиоме количество остатков L-идуроновой кислоты в уменьшается по сравнению с нормой с 55% до 45% [32].

Для многих опухолей показано изменение соотношения ДС и ХС. В карциноме желудка увеличивается содержание ХС по сравнению с нормой в 4 раза [26], в карциноме поджелудочной железы содержание ХС увеличивается в 22 раза [27], в клетках карциномы гортани - в 5 раз [30], в аденокарциноме кишечника - в 11 раз [29]. Для опухоли прямой кишки показано, что содержание хондроитинсульфатов увеличивается с 27% до 70% [28], в карциноме молочной железы содержание ХС увеличивается на 32,2 % [31].

Наряду с увеличением хондроитинсульфатов происходит снижение содержания дерматансульфатов, характерных для непролиферирующих тканей.

Для опухоли прямой кишки показано, что содержание дерматансульфатов падает с 73% до 30% [28], в карциноме молочной железы содержание ДС падает на 18,5 % [31]. Лучше всего изменения показаны для ДСПГ декорина.

1.2.1 Декорин

Декорин - сложная молекула, относящаяся классу протеогликанов, которая состоит из белкового кора и несет на себе одну цепь дерматансульфата.

Было показано, что он участвует в целом ряде механизмов, регулирующих пролиферацию клеток, декорин:

· взаимодействует с рецептором эпидермального фактора роста [33] (EGFR) и запускает сигнальный каскад, приводящий к увеличению экспрессии р21 белка, что приводит к супрессии циклина, подавлению активности циклин зависимых киназ [34] и торможению клеточного деления [35],

· ингибирует биологическую активность фактора роста TGFb [36]. TGFb может влиять на рост опухоли, опосредовать устойчивость к лекарствам, усиливать ангиогенез в опухоли [37]. Декорин присоединяется к связывающему домену TGFb, предотвращая его связывание с рецептором, что приводит к торможению клеточного деления [38],

· подавляет экспрессию и биосинтез эндотелиального фактора роста сосудов (VEGF), что приводит к супрессии ангиогенеза в опухолевой ткани [39],

· вызывает функциональную инактивацию онкогенного белка ErbB2, ингибируя тем самым рост клеток и стимулируя их цитодифференцировку [38],

· влияет на жизнеспособность клеток через Akt/протеинкиназа В-зависимый и - независимый механизмы, снижая апоптоз эндотелиальных клеток [40].

Для декорина доказана антимитотическая активность- добавление рекомбинантного декорина в культуру опухолевых клеток ингибировало их рост in vitro [41], экспрессия декорина de novo в культуре опухолевых клеток приводила к их возвращению к нормальному фенотипу [42]. Аденовирусная доставка декорина в растущую экспериментальную опухоль приводила к значительному ингибированию роста опухоли [43].

При проведении описанных экспериментов их целью являлось введение в опухолевую ткань недостающего декорина в той или иной форме (рекомбинантного белка либо генно-инженерных конструкций).

Однако вопрос о причине снижения содержания декорина в трансформированных клетках до сих пор не поднимался.

1.3 D-глюкуронил С5-эпимераза

Известно, что ключевым ферментом биосинтеза дерматансульфат протеогликанов (и в том числе декорина) является фермент D-глюкуронил С5-эпимераза [44]. Этот фермент проводит эпимеризацию глюкуроновой кислоты в идуроновую с образованием функционально активного декорина, причем в экспериментах in vitro было показано, что этот процесс может быть обратимым [45], однако, после полной модификации ГАГ цепи обратная реакция невозможна [46].

Показана субстратная специфичность для D-глюкуронил С5-эпимеразы, выделенной из культуры клеток фибробластов - дерматан и хондроитин являются хорошими субстратами для этого фермента, тогда как их О-сульфатированные формы практически не подвергаются модификации [47]. По всей видимости, эпимеризация уроновой кислоты в идуроновую происходит до О-сульфатирования ГАГ и О-сульфатированные ГАГ не являются субстратом для D-глюкуронил С5-эпимеразы [48].

Известно, что для работы D-глюкуронил С5-эпимеразы мыши необходимы N-ацетильные группы на глюкозамине и определенное расположение N-сульфатных групп. Кроме того, существует прямая зависимость работы фермента от размера субстрата [49].

Хотя биосинтез протеогликанов изучен достаточно хорошо, и все ферменты биосинтеза клонированы, D-глюкуронил С5-эпимераза является единственным ферментом биосинтеза протеогликанов человека, которых до сих пор не клонирован.

В настоящее время клонированы и охарактеризованы гены D-глюкуронил С5-эпимеразы быка [50] и мыши [51] - единственный ген D-глюкуронил С5-эпимеразы мыши находится в 9 хромосоме. Показано, что мышиная D-глюкуронил С5-эпимераза приблизительно одинаково экспрессируется в различных тканях- сердце, мозг, легкие, печень, мышцы, почки- за исключением селезенки, в которой экспрессия D-глюкуронил С5-эпимеразы понижена [51].

Показано, что разрушение гена, кодирующего D-глюкуронил С5-эпимеразу у мыши, приводило к гибели эмбриона (гетерозиготы погибали в течение года, гомозиготы по мутантному генотипу погибали сразу после рождения), у эмбрионов были обнаружены дефекты развития почек, легких, и неправильное формирование скелета, другие жизненно важные органы выглядели нормальными, включая мозг, печень, желудочно-кишечный тракт, кожу. Оказалось, что присутствие идуроновой кислоты необходимо для нормального развития почек, легких, скелета [52]. Также показано, что наличие ГС, содержащих остатки идуроновой кислоты необходимо для нормального развития различных типов нейронов [53].

Отсутствие других публикаций по данному вопросу не позволяет сказать, есть ли какая-либо ткане- или видоспецифичность в экспрессии D-глюкуронил С5-эпимеразы у человека и одинаковы ли экспрессия/активность этого фермента в нормальных и опухолевых тканях, существует ли связь между изменением состава ПГ и изменением экспрессии/активности D-глюкуронил С5-эпимеразы.

Данная работа посвящена исследованию взаимосвязи экспрессии декорина и D-глюкуронил С5-эпимеразы в клинических образцах нормальной и опухолевой ткани молочной железы человека.

Глава 2. Материалы и методы

2.1 Материалы

В работе были использованы следующие материалы и реактивы:

этиловый спирт, фенол, хлорид калия, хлорид натрия, хлороформ, изопропиловый спирт, уксусная, соляная, кислоты - отечественного производства категории ОСЧ.

Трис, SDS (додецилсульфат натрия), агароза, борная кислота - "ICN" (США).

Хлорид магния, ацетат натрия, этидий бромистый- "Merсk" (Германия)

EDTA, агароза, красители бромфеноловый синий, ксиленцианол - "Serva" (Германия)

Taq-ДНК-полимераза -“Лаборатория Медиген” (Россия, Новосибирск)

Обратная трансриптаза (M-MLV RT), ДНКаза (RQ1 RNAse free) -“Promega” (США)

Реагент "Trizol"- "Invitrogen" (США)

tРНК дрожжей - "Sigma", (США)

нуклеозидтрифосфаты - "Sibenzyme" (Россия, Новосибирск).

2.1.1 Операционный материал

В работе использовали ткань опухоли и нормальной молочной железы человека, удаленные в ходе хирургического вмешательства. Операционный материал получали в 1 Городской клинической больнице, забор образцов проводили под контролем главного онколога г. Новосибирска д. м. н., проф. Сидорова С. В.

2.1.2 Праймеры

Для полимеразной цепной реакции (ПЦР) использовались праймеры, синтезированные в компании "Лаборатория Медиген", Новосибирск.

Праймеры для человеческого гомолога гена мышиной D-глюкуронил С5-эпимеразы (GI:29740243), для гена декорина человека (NM001920,GI:19743844), гена в-актина человека, гена GAPDH (NM_002046.2, GI:7669491).

ген	Последовательности нуклеотидных праймеров	Температура плавления (?C)	Размер продуктов ПЦР (п.о).
GAPDH	Прямой	5?-GGGCGCCTGGTCACCAG -3?;	59	350
	Обратный	5?- AACATGGGGGCATCAGCAGAG-3?;	59
в-актин	Прямой	5'-CCTCGCCTTTGCCGATCC- 3'	59	628
	Обратный	5'-GGATCTTCATGAGGTAGTCAGTC- 3'	59
Декорин	Прямой	5?-GGCCACTATCATCCTCCTTCTGC -3?;	59	1031
	Обратный	5?-ATGGCAGAGCGCACGTAGACAC-3	59
Эпимераза 329/1240	Прямой	5?-AAGGGAGACGAGAGGGGAACGAA-3?;	59	911
	Обратный	5?-GCCACCTTTCTCATCCTGGTTCC-3?;	59
Эпимераза 809/1240	Прямой	5 - CCAGTGAAGGTGTATCCTTGCAACT- 3	59	430
	Обратный	5?-GCCACCTTTCTCATCCTGGTTCC-3?;	59
Эпимераза 809/1830	Прямой	5' - CCAGTGAAGGTGTATCCTTGCAACT - 3'	59	1021
	Обратный	5' - CTACCGGTGTGCTTTGCCCTGCTGC - 3'	59
Эпимераза 575/1240	Прямой	5' - ctacacaatggggacctcaaggc - 3'	59	665
	Обратный	5?-GCCACCTTTCTCATCCTGGTTCC-3?;	59
Эпимераза 329/745	Прямой	5?-AAGGGAGACGAGAGGGGAACGAA-3?;	59	416
	Обратный	5' - AGCAGCCCTTTGGCACAGTCCA - 3'	59
Эпимераза 170/745	Прямой	5' - TGGGATCCATATGCGTTGCTTGGCAGCT - 3'	59	575
	Обратный	5' - AGCAGCCCTTTGGCACAGTCCA - 3'	59

2.2 Методы

2.2.1 Выделение РНК

Выделение РНК фенольным методом

Кусочек ткани растирали в ступке, постоянно добавляя азот. В стеклянный гомогенизатор добавляли 0,8 мл водонасыщенного фенола и 0,4 мл следующего раствора: 1,5% SDS, 50мМ NaAc (рН 4,0). Помещали туда порошок замороженной ткани и тщательно гомогенизировали. Гомогенат переносили в чистую пробирку Eppendorf на 1,5 мл и добавляли в неё же 100мкл хлороформа. Интенсивно перемешивали и инкубировали на льду 10 мин. Центрифугировали 15 мин на Eppendorf 5415D, при 12006g. Аккуратно переносили водную (верхнюю) фазу в чистую пробирку Eppendorf на 1,5 мл. К отобранной фазе добавляли равный объём смеси водонасыщенного фенола с хлороформом (1:1) (на 250мкл водной фазы 125мкл фенола и 125мкл хлороформа). Интенсивно перемешивали. Центрифугировали 15 мин на Eppendorf 5415D, при 12006g. Переносили водную (верхнюю) фазу в чистую пробирку Eppendorf на 1,5 мл, опять стараясь не захватыватить интерфазу. К отобранной фазе добавляли 1% tРНК дрожжей (10мг/мкл) (соосадитель) и перемешивали. Добавляли 2,5 объёма 96% этилового спирта. Перемешивали и инкубировали на -200С в течение 30 мин. Центрифугировали 15 мин, на Eppendorf 5415D, при 12006g. Образовавшийся осадок промывали 400мкл 70% этилового спирта. Сушили осадок 15мин на 370С. Растворяли осадок в 40мкл воды в течение 20мин при комнатной температуре.

Выделение РНК с помощью реактива TRIZOL

Кусочек ткани 50-100 мг растирали в ступке с 1мл реактива TRIZOL. Переносили в стеклянный гомогенизатор и тщательно гомогенизировали. Переносили гомогенат в чистую пробирку Eppendorf и инкубировали в течение 5 мин при комнатной температуре. Добавляли 0,2 мкл хлороформа (на 1 мл исходного реактива TRIZOL). Инкубировали в течение 3 мин при комнатной температуре. Центрифугировали образцы при 12,000 g в течение 15 мин. После центрифугирования смесь разделилась на нижнюю (красную) фенол-хлороформную фазу, интерфазу, и неокрашенную верхнюю водную фазу. РНК оставалась в верхней водной фазе. Переносили водную фазу в чистую пробирку Eppendorf и добавляли 0,5 мл изопропанола (на 1 мл исходного реактива TRIZOL). Инкубировали в течение 10 мин при комнатной температуре и центрифугировали 12,000 g в течение 10 мин. Образовавшийся осадок промывали 75% этиловым спиртом. Тщательно перемешивали и центрифугировали 7,5 g в течение 5 мин. Высушивали осадок, растворяли в 40 мкл воды и инкубировали при 55оС в течение 10 мин.

глюкуронил эпимераза опухолевый клетка

2.2.2 Очистка РНК от ДНК

Переосаждение с помощью LiCl

К 40мкл раствора выделенной РНК добавляли 20мкл раствора 8М LiCl, перемешивали и инкубировали на льду 30 мин. Центрифугировали 15 мин, на Eppendorf 5415D, при 12006g и аккуратно удаляли супернатант.

Сразу же добавляли к осадку 200мкл предварительно охлаждённого 80% этилового спирта. Аккуратно удаляли спирт. Осадок сушили 15мин на 370С. Растворяли осадок в 40мкл воды.

Очистка с помощью ДНКазы

Добавляли к 40 мкл выделенного раствора РНК 1 ед. акт. ДНКазы и соответствующий буфер, доводили до объема 100мкл. Инкубировали при 37оС в течение 30 мин. Добавляли 100 мкл фенола, перемешивали. Добавляли 40 мкл хлороформа центрифугировали 5 мин 7,5 тыс g. Переносили водную фазу в чистую пробирку, добавляли 100 мкл изопропанола. Инкубировали в течение 10 мин при комнатной температуре, центрифугировали при 12,000 g в течение 10 мин. Образовавшийся осадок промывали 200 мкл 75% этилового спирта и центрифугировали 7,5 g в течение 5 мин. Высушивали осадок, растворяли в 40мкл воды и инкубировали при 55оС в течение 10 мин.

2.2.3 Проверка чистоты выделенной РНК на содержание примеси ДНК

Проводили ПЦР реакцию с выделенной РНК и праймером для в-актина. Поскольку фермент Taq-ДНК-полимераза не работает с матрицы РНК, реакция не должна проходить.

ПЦР проводили в буфере, содержащем 10 мМ Tris-HCl, 1,5 мМ MgCl2, 50 мМ KCl, pH 8,3 на амплификаторе «Терцик» (Компания "ДНК Технологии", Россия). Обьем реакционной смеси составлял 20 мкл, с содержанием ~100 нг геномной ДНК, 2 мкл 10x ПЦР-буфера, 20 пмоль праймера, 0,2 ммоль каждого дезоксинуклеотидтрифосфата и 1 ед. акт. Taq-ДНК-полимеразы. Реакционную смесь покрывали равным объёмом минерального масла. ПЦР проводили при следующих условиях: начальная денатурация 3 мин при 95 оС, далее 27 циклов при следующих условиях: денатурация 7 мин при 95,0оС, отжиг праймеров 15 сек при 55,0оС, элонгация 3 сек при 72,0оС.

2.2.4 ОТ-ПЦР

Обратная транскрипция

К 2 мкг выделенной РНК добавляли 10 пмоль праймеров (OligodT или случайные гексануклеотидные праймеры), инкубировали 5 минут при 70оС, охлаждали на льду в течение 1 мин, встряхивали. Далее добавляли в строгой последовательности: 5 мкл буфера для обратной транскрипции, 0,5 ммоль каждого дезоксинуклеозидтрифосфата, 200 ед. акт. обратной транскриптазы M-MTLV, доводили водой до 25 мкл. Инкубировали 1ч при 37оС.

Амплификация фрагмента гена методом ПЦР

Амплификацию фрагментов генов, D-глюкуронил С5-эпимеразы, декорина, синдекана, люмикана, глипикана, аггрекана, GAPDH и в-актина проводили методом ПЦР на амплификаторе Терцик (Компания "ДНК Технологии", Россия). Объем реакционной смеси составлял 20мкл, с добавлением ~200нг кДНК, 2 мкл 10x ПЦР-буфера (10 мМ Tris-HCl, 1,5 мМ MgCl2, 50 мМ KCl, pH 8,3), 20 пмоль каждого праймера, 0,2 ммоль каждого дезоксинуклеозидтрифосфата и 1 ед.акт. Taq-ДНК-полимеразы. Реакционную смесь покрывали равным объёмом минерального масла. ПЦР проводили при следующих условиях: начальная денатурация 5 мин при 95 оС, далее 32 цикла при следующих условиях: денатурация 30 сек при 95,0оС, отжиг праймеров 30 сек при 55,0оС, элонгация 60 сек при 72,0оС, 10 мин при 72,0оС. ПЦР-продукты анализировали методом горизонтального гель-электрофореза в агарозном геле.

2.2.5 Мультиплексная ПЦР

Мультиплексная ПЦР отличается от обычной ПЦР тем, что в реакционную смесь добавляется сразу две пары праймеров - праймеры для исследуемого гена и праймеры для гена домашнего хозяйства. Преимущество этого метода состоит в том, что амплификация проводится в одной пробирке и, следовательно, в одинаковых условиях.

Методом мультиплексной ПЦР проводили амплификацию фрагментов гена D-глюкуронил С5-эпимеразы и декорина. В качестве контрольного гена использовался ген GAPDH.

Для гена декорина течение двух циклов проводили амплификацию с праймерами для гена декорина, после чего в реакционную смесь добавлялись праймеры для гена GAPDH и далее проводили еще 18 циклов амплификации. Для гена эпимеразы, проводилось амплификация в течение 17 циклов, после чего в реакционную смесь добавлялись праймеры для GAPDH и проводилось еще 16 циклов амплификации. Амплификация проводилась при следующих условиях: денатурация 30 сек при 95,0оС, отжиг праймеров 30 сек при 55,0оС, элонгация 60 сек при 72,0оС

Анализ продуктов ПЦР проводили методом горизонтального гель-электрофореза в агарозном геле.

2.2.6 Горизонтальный электрофорез нуклеиновых кислот в агарозном геле

Анализ продуктов ПЦР проводили методом горизонтального гель-электрофореза в 0,9% агарозном геле в буфере ТАЕ (0.04 М Tris-HCl, 0,05 М EDTA, pH 8,0) с содержанием 1 мкг/мл бромистого этидия. Проводили электрофорез в течение 20 минут. Напряженность электрического поля 6-8 В/см. Для нанесения на гель раствор ДНК смешивали с 50% глицерином, содержащим 0,1% бромфеноловый синий, 0,1% ксиленцианол в соотношении 1:10. Сканирование геля проводили в УФ свете с помощью видеосистемы “DNA Analyzer” (Москва). В качестве стандарта молекулярной массы использовали ДНК плазмиды pBlueScript/SK, обработанную эндонуклеазой рестрикции MspI, маркерную ДНК 100 bp и 1kb.

Глава 3. Результаты и обсуждение

Целью нашей работы являлось изучение корреляции между изменением экспрессии гена D-глюкуронил С5-эпимеразы и гена декорина в опухоли. Поэтому нашей первой задачей было изучение экспрессии гена D-глюкуронил С5-эпимеразы в ткани молочной железы человека, для решения которой нами был выбран метод ОТ-ПЦР.

В работе использовали три типа ткани молочной железы человека - нормальная ткань молочной железы пациентов, не страдающих опухолевыми новообразованиями, опухолевая ткань и окружающая опухоль ткань молочной железы того же пациента, обозначенная нами как контрольная ткань.

Операционный материал получали в 1 Городской клинической больнице, забор образцов проводили под контролем главного онколога г. Новосибирска, д. м. н., проф. Сидорова С. В.

3.1 Компьютерный анализ гена D-глюкуронил С5-эпимеразы

Ген D-глюкуронил С5-эпимеразы человека до сих пор не клонирован. Поэтому на первом этапе необходимо было провести компьютерный анализ вероятного гена D-глюкуронил С5-эпимеразы человека и подобрать праймеры для ОТ-ПЦР. В первую очередь мы провели сравнительный анализ нуклеотидной и аминокислотной последовательностей D-глюкуронил С5-эпимеразы мыши, быка и человеческого гомолога мышиной D-глюкуронил С5-эпимеразы.

Табл. 3. Эволюционная консервативность белковой последовательности D-глюкуронил С5-эпимеразы

	Гомология нуклеотидной последовательности	Гомология аминокислотной последовательности
Homo sapiens	100	100
Bos Taurus	84	97
Mus musculus	81	96

Компьютерный анализ показал высокую гомологию нуклеотидной последовательности у мыши и быка с человеком- 81% и 84% соответственно (см. Табл. 3), еще больше оказалась гомология аминокислотной последовательности- 96% у мыши и 97% у быка.

Анализ нуклеотидных замен показал, что в основном, происходили замены в 3, 6, 9…3n положении, что, как правило, не приводит к смене аминокислоты.

По всей видимости, D-глюкуронил С5-эпимераза играет важную роль в жизни клетки, и мутации, приводящие к смене аминокислот, элиминировались в процессе эволюции отбором.

DNA: GGCTGGAGCTGCGGCACCGCAGGCCTGAGCCACCCCTTCTCTGCTGTCTCC+1: G W S C G T A G L S H P F S A V S

DNA: TTCTCTTCCTCAGGGCTCCCGTGTCTGCTCGCCCTCCGACGCTGCTCAGGA+1: F S S S G L P C L L A L R R C S G

DNA: ATTTGACAAGAAACTGAAGTTTTGATTCAGATATATTTTGAATTGAAACCA+1: I * Q E T E V L I Q I Y F E L K P

DNA: GAGATGTTCTAGAGTTTAGATTCTTTCATTTGATTAAGGTATGGTCTGAAT+1: E M F * S L D S F I * L R Y G L N

DNA: ATGCGTTGCTTGGCAGCTCGGGTCAACTATAAGACTTTGATTATTATCTGC+1: M R C L A A R V N Y K T L I I I C

DNA: GCACTCTTCACTTTGGTCACAGTACTTTTGTGGAATAAGTGTTCCAGTGAC+1: A L F T L V T V L L W N K C S S D

DNA: AAAGCAATCCAGTTTCCACGGCGTTCGAGTAGTGGCTTCAGAGTGGATGGG+1: K A I Q F P R R S S S G F R V D G

DNA: TTTGAAAAAAGAGCAGCAGCATCTGAGAGTAACAACTATATGAACCACGTG+1: F E K R A A A S E S N N Y M N H V

DNA: GCCAAACAACAGTCTGAGGAAGCATTCCCTCAGGAACAGCAGAAAGCACCC+1: A K Q Q S E E A F P Q E Q Q K A P

DNA: CCTGTTGTTGGGGGCTTCAATAGCAATGTGGGAAGTAAGGTGTTAGGGCTC+1: P V V G G F N S N V G S K V L G L

DNA: AAATATGAAGAAATTGACTGTCTCATAAATGATGAACACACAATTAAAGGG+1: K Y E E I D C L I N D E H T I K G

DNA: AGACGAGAGGGGAACGAAGTCTTTCTTCCATTCACTTGGGTTGAGAAATAT+1: R R E G N E V F L P F T W V E K Y

DNA: TTTGATGTTTATGGAAAGGTGGTTCAGTATGATGGCTATGATCGGTTTGAA+1: F D V Y G K V V Q Y D G Y D R F E

DNA: TTCTCTCATAGCTATTCCAAAGTCTATGCACAGAGAGCCCCCTATCACCCC+1: F S H S Y S K V Y A Q R A P Y H P

DNA: GATGGTGTGTTTATGTCTTTTGAAGGCTACAATGTGGAAGTCCGAGACAGA+1: D G V F M S F E G Y N V E V R D R

DNA: GTCAAGTGCATAAGTGGGGTTGAAGGTGTGCCATTATCTACACAATGGGGA+1: V K C I S G V E G V P L S T Q W G

DNA: CCTCAAGGCTATTTCTATCCAATCCAGATTGCACAGTATGGATTAAGTCAT+1: P Q G Y F Y P I Q I A Q Y G L S H

DNA: TACAGCAAGAATCTAACTGAGAAACCTCCTCACATAGAGGTATATGAAACA+1: Y S K N L T E K P P H I E V Y E T

DNA: GCAGAAGACAGAGACAAAAACAAGCCTAATGACTGGACTGTGCCAAAGGGC+1: A E D R D K N K P N D W T V P K G

DNA: TGCTTTATGGCGAATGTGGCTGATAAGTCTAGATTCACCAATGTCAAACAG+1: C F M A N V A D K S R F T N V K Q

DNA: TTTATTGCACCAGAAACCAGTGAAGGTGTATCCTTGCAACTGGGAAACACA+1: F I A P E T S E G V S L Q L G N T

DNA: AAAGATTTTATTATTTCATTTGACCTCAAGTTCTTGACAAATGGAAGTGTG+1: K D F I I S F D L K F L T N G S V

DNA: TCCGTGGTTCTAGAGACCACAGAAAAGAATCAGCTCTTCACTATACATTAT+1: S V V L E T T E K N Q L F T I H Y

DNA: GTCTCAAATGCTCAGCTAATTGCTTTTAAAGAAAGAGATATATACTATGGC+1: V S N A Q L I A F K E R D I Y Y G

Предполагаемый белковый продукт человеческого гомолога мышиной D-глюкуронил С5-эпимеразы анализировали с помощью различных компьютерных программ. Было показано, что продукт данного гена представляет собой:

· мембранный белок, который имеет трансмембранный домен (рис.10) 10-32 аминокислот (программы HMMTOP,SOSUIignal)

· сигнальный пептид расположен на N-конце белковой молекулы (программа Signal P V1.1)

· не заякорен через гликозилфосфатидилинозитол (GPI) (программа DGPI)

· наиболее вероятная локализация предполагаемого белка - в мембранах аппарата Гольджи (программа PSORT II)

Таким образом, предполагаемый продукт исследуемого гена по основным характеристикам аналогичен D-глюкуронил С5-эпимеразе быка и мыши, нуклеотидные последовательности всех трех генов также проявляют высокую степень гомологии.

Сравнив нуклеотидную последовательность (рис. 11) D-глюкуронил С5-эпимеразы мыши, быка и человеческого гомолога, были выявлены наиболее консервативные участки у всех трех генов и подобраны праймеры к этим участкам.

Homo sapiens CACACAATTAAAGGGAGACGAGAGGGGAAсGAAGTCTTTCTTCCATTCA 400

Bos taurus CACACAATTAAAGGGAGACGAGAGGGGAATGAAGTCTTTCTTCCATTCA 347

Mus musculus CACACсATTAAAGGGAGACGAGAGGGGAATGAAGTTTTсCTTCCATTCA 600

*********************************************

Homo sapiens AGTGAtTGGCTAGTaAGGAACCAGGATGAGAAAGGTGGCTGGCCAATTA 1321

Bos Taurus AGTGACTGGCTgGTGAGGAACCAGGATGAGAAAGGTGGCTGGCCgATTA 1247

Mus musculus AGTGACTGGCTAGTGAGGAACCAGGATGAGAAAGGTGGCTGGCCAATTA 1560

***** ***** ** ***************************** ****

Рис. 11. Гомология нуклеотидной последовательности гена D-глюкуронил С5-эпимеразы

Прописные буквы - нуклеотидные замены

Подчеркивание - подобранные праймеры (эпимераза 329/1240)

Праймеры были подобраны таким образом, чтобы последовательности находились в экзонах известных генов D-глюкуронил С5-эпимеразы мыши и быка.

Таким образом, мы провели компьютерный анализ гена D-глюкуронил С5-эпимеразы человека и подобрали праймеры (эпимераза 329/1240) к наиболее консервативным участкам гена. Далее необходимо было посмотреть экспрессию D-глюкуронил С5-эпимеразы в ткани молочной железы человека.

3.2 Анализ экспрессии D-глюкуронил С5-эпимеразы в ткани молочной железы человека

Для изучения экспрессии гена D-глюкуронил С5-эпимеразы был выбран метод ОТ-ПЦР. Для работы этим методом, в первую очередь необходимо выделить РНК, провести обратную транскрипцию, и с полученной кДНК провести полимеразную цепную реацию с праймерами (эпимераза 329/1240) для D-глюкуронил С5-эпимеразы.

РНК выделяли несколькими методами, однако остановились на методе выделения РНК с помощью реактива “Trizol”. Очистку РНК от возможных примесей ДНК проводили с помощью ДНКазы

Для обратной транскрипции мы пробовали использовать два вида праймеров - oligo(dT) и случайные гексануклеотидные праймеры. Поскольку обратная транскрипция лучше проходила на праймерах oligo(dT), они были выбраны для дальнейших экспериментов

По результатам проведенных экспериментов, для дальнейших исследований мы выбрали метод выделения РНК с помощью реактива “Trizol”, очистку РНК от примесей ДНК с помощью ДНКазы, обратную транскрипцию проводили с использованием oligo(dT) праймеров.

3.2.1. Нормальная ткань молочной железы человека.

Экспрессию гена D-глюкуронил С5-эпимеразы смотрели в клинических образцах нормальной ткани молочной железы человека здоровых пациентов, не страдающих злокачественными новообразованиями.

Для этого полученную после обратной транскрипции кДНК использовали для амплификация гена D-глюкуронил С5-эпимеразы методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с праймерами эпимераза 329/1240 (см. Мат. и Мет.) (рис. 14).

Электрофорез показал, что нам удалось получить фрагмент ДНК ожидаемого размера - 911п.н.

Для того чтобы проверить нуклеотидную последовательность амплифицированного фрагмента, мы выделили ДНК из геля и провели секвенирование. Результаты секвенирования показали, что полученная последовательность идентична ожидаемой (рис. 15).



Размещено на http://www.allbest.ru/

Таким образом, нам удалось впервые показать экспрессию гена D-глюкуронил С5-эпимеразы в нормальной ткани молочной железы человека.

Тканеспецифичность экспрессии гена D-глюкуронил С5-эпимеразы

Для того чтобы посмотреть тканеспецифичность D-глюкуронил С5-эпимеразы, мы использовали коммерческую кДНК из различных нормальных тканей человека - тимус, почки, легкое, кишечник, и полученную нами кДНК щитовидной железы и молочной железы человека (рис.16).

Электрофорез продуктов ПЦР показал, что уровень экспрессии гена D-глюкуронил С5-эпимеразы в тканях человека неодинаков.

Самый высокий уровень оказался в молочной железе человека (Рис.15.), в легком D-глюкуронил С5-эпимераза экспрессируется на среднем уровне. В щитовидной железе, тимусе, почке и толстой кишке экспрессия гена эпимеразы оказалась на приблизительно одинаковом низком уровне.

Таким образом, мы показали, что экспрессия гена D-глюкуронил С5-эпимеразы в различных тканях человека поддерживается на разном уровне.

Сравнительный анализ экспрессии гена D-глюкуронил С5-эпимеразы в контрольной и опухолевой ткани молочной железы человкека

Экспрессиию гена D-глюкуронил С5-эпимеразы в опухолевой ткани смотрели методом ОТ-ПЦР, сравнивая ее с экспрессией гена D-глюкуронил С5-эпимеразы в контрольной ткани (максимально удаленная от опухоли ткань молочной железы того же пациента). Мы выделяли РНК из контрольной и опухолевой ткани, проводили обратную транскрипцию и полученную кДНК использовали в полимеразной цепной реакции.

В результате мы увидели, что в опухолевой ткани по сравнению с контрольной происходило изменение экспрессии гена D-глюкуронил С5-эпимеразы (рис.17). На электрофорезе исчезала полоса ДНК ожидаемого размера (911 п.н.) и появлялись полосы меньшего размера.

Однако является ли это случайным изменением или есть некая закономерность можно сказать только после исследования большего количества пациентов.

Качественная полимеразная цепная реакция

Нами были исследованы клинические образцы опухолевой и контрольной ткани от 30 пациенток методом качественной ПЦР. Для этого мы выделяли РНК одновременно из контрольной и опухолевой ткани одного и того же пациента, проводили обратную транскрипцию. С полученной кДНК вели полимеразную реакцию, используя праймеры для D-глюкуронил С5-эпимеразы (эпимераза 329/1240) и для гена домашнего хозяйства (GAPDH либо в-актин), причем реакция с использованием каждой пары праймеров шла в отдельной пробирке (рис. 18,19).

На основании полученных результатов, однозначного изменения экспрессии гена D-глюкуронил С5-эпимеразы в контрольной и опухолевой ткани молочной железы человека не показано.

Согласно предварительной качественной оценке, у 10 пациенток из 30 экспрессия гена D-глюкуронил С5-эпимеразы в опухоли по сравнению с контролем увеличивалась, у 8 пациентов экспрессия гена D-глюкуронил С5-эпимеразы по сравнению с контролем уменьшалась, у 11 пациенток не удалось детектировать D-глюкуронил С5-эпимеразу ни в контроле, ни в опухоли (Рис. 18, 19).



Размещено на http://www.allbest.ru/

На основании этого пациентов можно предварительно разделить на группы с уменьшением экспрессии гена D-глюкуронил С5-эпимеразы, увеличением экспрессии гена эпимеразы, и пациентов, у которых не удалось детектировать экспрессию гена эпимеразы (рис. 20).

Таким образом, мы не увидели в опухоли какой-либо однозначной тенденции изменения экспрессии гена D-глюкуронил С5-эпимеразы по сравнению с контролем - увеличение или уменьшение экспрессии данного гена. Для того чтобы более точно показать изменения в экспрессии гена эпимеразы необходимо было использовать метод мультиплексной ПЦР.

Мультиплексная полимеразная цепная реакция

Нами были исследованы клинические образцы контрольной и опухолевой ткани от 20 пациентов. Уровень экспрессии гена D-глюкуронил С5-эпимеразы оценивался методом мультиплексной ПЦР. Суть этого метода заключается в том, что в одну пробирку одновременно добавляли праймеры для гена D-глюкуронил С5-эпимеразы (эпимераза 329/1240) и гена GAPDH, чтобы оценить уровень экспрессии гена D-глюкуронил С5-эпимеразы по отношению к экспрессии гена GAPDH (рис.21)

Полуколичественный анализ мультиплексной ПЦР проводили с помощью программы TotalLab, которая обсчитывает интенсивность амплифицированных полос ДНК - D-глюкуронил С5-эпимеразы и гена домашнего хозяйства (Аэпим и АGAPDH соответственно). Далее определяем их отношение в контроле (Аэпим. контр/АGAPDH контр) и опухоли (Аэпим.опух/АGAPDH опух). Отношение этих параметров, обозначенное Аизм. позволяет нам приблизительно оценить во сколько раз экспрессия гена эпимеразы в опухоли больше/меньше экспрессии гена D-глюкуронил С5-эпимеразы в контроле.

Данные, полученные нами для каждого пациента представлены на рис.22.

Размещено на http://www.allbest.ru/

Аизм. соответствующее 1 говорит о том, что экспрессия гена в опухоли не изменяется по сравнению с контролем, >1 - экспрессия гена в опухоли больше по сравнению с контролем, <1 - экспрессия гена в опухоли меньше по сравнению с контролем.

Мы увидели, что у различных пациентов происходят неоднозначные изменения (рис. 22). Они идут как в сторону увеличения экспрессии гена D-глюкуронил С5-эпимеразы, так и в сторону уменьшения, вплоть до полного исчезновения эпимеразы в опухоли. Мы провели условное деление пациентов на группы, критерием деления было увеличение или уменьшение экспрессии гена D-глюкуронил С5-эпимеразы более чем на 50%.

Согласно предварительным оценкам у 7 пациентов из 20 в опухоли происходило увеличение экспрессии гена D-глюкуронил С5-эпимеразы по сравнению с контролем, у 5 - уменьшение экспрессии гена эпимеразы, причем у 3 пациентов из 5 происходило уменьшение экспрессии гена эпимеразы вплоть до полного исчезновения, у 8 пациентов из 20 экспрессия гена эпимеразы в опухоли значительно не изменялась по сравнению с контрольной тканью (рис. 23).

Размещено на http://www.allbest.ru/

Таким образом, результат мультиплексной ПЦР согласуется с предварительными данными, полученными в ходе качественной ПЦР - уровень экспрессии гена D-глюкуронил С5-эпимеразы в опухоли изменяется по сравнению с контрольной тканью молочной железы человека и изменения эти неоднозначны.

Необходимо учитывать, что нормировку экспрессии гена D-глюкуронил С5-эпимеразы мы вели на контрольную ткань, полученную у того же пациента. Неизвестно, во всех ли случаях она действительно нормальная, нет ли там предопухолевых (мастопатийных, воспалительных) изменений. Более того, было замечено, что уровень экспрессии гена эпимеразы различался даже в контрольной ткани. Поэтому возник вопрос о сравнении уровня экспрессии гена D-глюкуронил С5-эпимеразы в контрольной ткани и нормальной ткани (от пациентов, не страдающих злокачественными новообразованиями).

Сравнение экспрессии гена D-глюкуронил С5-эпимеразы в контрольной и нормальной ткани молочной железы человека

Нами были проанализированы клинические образцы нормальной ткани 6 пациенток методом мультиплексной ПЦР и проведено сравнение уровня экспрессии гена D-глюкуронил С5-эпимеразы с аналогичными данными, полученными для контрольной ткани (рис. 24).

Размещено на http://www.allbest.ru/

Мы увидели, что ген D-глюкуронил С5-эпимеразы человека в образцах нормальной ткани экспрессируется на более высоком уровне - Аэпим/АGAPDH ? 3.5

Среди больных раком молочной железы лишь у одного пациента из 20 наблюдался высокий уровень экспрессии гена D-глюкуронил С5-эпимеразы, сравнимый с экспрессией гена D-глюкуронил С5-эпимеразы в нормальной, неизмененной ткани молочной железы человека. У 10 пациентов из 20 уровень экспрессии гена D-глюкуронил С5-эпимеразы был в 2-3 раза ниже нормального уровня экспрессии этого гена, у 5 уровень экспрессии гена эпимеразы был меньше в 10-15 раз. У 4 пациентов из 20 D-глюкуронил С5-эпимераза не детектировалась даже в контрольной ткани. Не исключено, что такие различия могут быть связаны со степенью злокачественности процессов, прогнозом заболевания или с другими клиническими параметрами. Этот вопрос требует дальнейшего изучения и обследования большего количества пациентов.

Таким образом, можно сказать, что даже в клинических образцах контрольной ткани, уровень экспрессии гена D-глюкуронил С5-эпимеразы в основном ниже уровня экспрессии данного гена в ткани молочной железы от здорового пациента. Поэтому возник вопрос, каким будет изменение экспрессии гена D-глюкуронил С5-эпимеразы в опухоли, если нормировать ее не на контрольную ткань, а на нормальную, не учитывая возможный индивидуальный разброс (рис. 25).

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Видно, что если производить нормировку на нормальную ткань, то соотношение изменения экспрессии гена эпимеразы меняется в сторону уменьшения (рис. 26).

Размещено на http://www.allbest.ru/

При сравнении уровня экспрессии гена D-глкуронил С5-эпимеразы в опухоли и нормальной ткани молочной железы человека было показано, что уровень экспрессии гена D-глкуронил С5-эпимеразы в опухоли снижается у 95% исследованных пациентов.

Такое резкое снижение уровня экспрессии гена D-глюкуронил С5-эпимеразы в опухоли по сравнению с контролем позволяет предположить, что D-глюкуронил С5-эпимераза может служить в качестве потенциального маркера для диагностики злокачественных новообразований молочной железы человека.

Однако нельзя исключать, что данные результаты получены именно для этой пары праймеры, тогда как альтернативные пары праймеров могли показать другой результат.

3.3 Определение экспрессии гена D-глюкуронил С5-эпимеразы при помощи набора различных праймеров

Чтобы подтвердить полученные данные, нами были подобраны праймеры к различным вероятным экзонам гена D-глюкуронил С5-эпимеразы человека

Дополнительно были подобраны пары праймеров

· Эпимераза 170/745 - I-II экзон

· Эпимераза 329/1240 - I-III экзон

· Эпимераза 575/1240 - II-III экзон

· Эпимераза 329/745 - I-III экзон

· Эпимераза 809/1830 - III экзон

3.3.1 Нормальная ткань молочной железы человека

Было проведено сравнение уровня экспрессии гена D-глюкуронил С5-эпимеразы в нормальной ткани молочной железы человека с использованием различных пар праймеров

Все использованные праймеры работали и давали полосу амплифицированной ДНК ожидаемого размера и сопоставимой интенсивности. Это говорит о том, что в нормальной ткани молочной железы человека с данного гена считывается полноразмерный транскрипт мРНК.

3.3.2 Опухолевая ткань молочной железы человека

Мы определяли экспрессию гена D-глюкуронил С5-эпимеразы в опухолевой ткани молочной железы с помощью этого же набора праймеров.

В отличие от экспрессии гена D-глюкуронил С5-эпимеразы в нормальной ткани, у обследованных пациентов в опухоли наблюдались видимые различия в экспрессии данного гена в зависимости от использованных праймеров. Так, при использовании праймеров лежащих в пределах одного (третьего) экзона, видно, что экспрессия гена эпимеразы поддерживается на одном уровне. Если в ходе ПЦР использовались праймеры эпимераза 329/1240 или эпимераза 329/745, то происходило полное исчезновение фрагмента амплифицированной ДНК (рис.29, дор. 6,7 и 10,11 соответственно). При использовании праймеров эпимераза 575/1240 в опухоли происходило снижение экспрессии гена D-глюкуронил С5-эпимеразы и определялся укороченный фрагмент ДНК (рис.29, дор. 8,9). Возможно, опухолевая ткань содержит мРНК D-глюкуронил С5-эпимеразы, укороченной за счет альтернативного сплайсинга или делеции.

Для проверки данного предположения мы исследовали кДНК 17 пациентов с использованием праймеров эпимераза 809/1830 (эпимераза809) и эпимераза 575/1240 (эпимераза575)

На гистограммах видно (рис. 31. Б,Г.), что разные пары праймеров (эпимераза 575/1240 и эпимераза 809/1830) показали различный уровень экспрессии гена эпимеразы в опухоли молочной железы человека.

Например, у пациентов №100, №104 экспрессия809 гена D-глюкуронил С5-эпимеразы в опухоли увеличивалась, а экспрессия575 гена эпимеразы в опухоли уменьшалась. Нами были посчитаны Аизм для эпимеразы 809/1830 и эпимеразы 575/1240 для каждого пациента (рис. 32)