Генная инженерия

Кроме того, тысячи тонн инсектицидов, расходуемых ежегодно, наносят ущерб окружающей среде. Известно, что лишь 5 % внесенных инсектицидов срабатывают по назначению, остальные 95 % попадают в окружающую среду, уничтожая многие виды насекомых, среди которых немало полезных. Решение этой проблемы легло на плечи молекулярных биологов.

Учеными было обнаружено, что почвенная бактерия Bacillus thuringiensis продуцируют целую группу так называемых Cry-белков (другое название - Bt-токсины), являющихся природными инсектицидами, селективно (избирательно) действующими в отношении разных групп насекомых.

Попадая в кишечный тракт насекомого, Bt-токсин соединяется со специфичными участками клеток, образующих кишечный эпителий и создают ионоселективные каналы в клеточных мембранах. В результате клетки разбухают от поступающих в них чрезмерных количеств воды и гибнут.

Важными свойствами Bt-токсинов являются их нетоксичность для теплокровных животных и термонестабильность (разрушаются при тепловой обработке). Таким образом, исключена возможность отравления данными токсинами человека и домашних животных.

Для создания растений с инсектицидными свойствами в их геном был пересажена кодирующая область гена Cry-белка, поставленная под контроль промотора гена, эффективно экспрессирующегося в клетках растений. Таким образом, инсектицид накапливается в достаточных количествах непосредственно в тканях растений и влияет только на тех насекомых, которые эти растения поедают.

Линии растений, получившие устойчивость к вредителям подобным образом называются Bt-культурами, или Bt-растениями. Первые Bt-культуры были созданы в 90-х годах прошлого века, и с тех пор их число увеличилось до нескольких десятков. В их числе линии картофеля, устойчивые к поеданию колорадским жуком, линии кукурузы, устойчивые к поеданию кукурузным мотыльком, линии хлопка, устойчивые к различным вредителям. В Китае получено более 50 Bt-культур, в том числе рис, пшеница, сорго, кочанная капуста, перец, яблоня, киви, цитрусовые и другие.

Вместе с тем, появляется все больше свидетельств того, что использование Bt-растений может иметь долгосрочный негативный эффект, экономический ущерб которого пока трудно оценить. При культивировании Bt-растений наблюдается накопление Bt-токсинов в почве в результате действия многих факторов: выделений корней, отложения пыльцы, разложения растительных остатков. Это приводит, в частности, к снижению биологической активности почв, занятых генетически модифицированными растениями.



Практическое занятие №8

Тема: Получение трансгенных растений с улучшенными пищевыми свойствами

Улучшение качества запасных белков

Для человека и млекопитающих необходимым условием нормальной жизнедеятельности является наличие в рационе восьми незаменимых аминокислот. Однако ни один из широко используемых в пищу белков семян не содержит сбалансированного набора всех этих аминокислот. Так, белки семян злаков содержат крайне мало лизина и триптофана, а запасные белки бобовых дефицитны по серосодержащим аминокислотам - метионину и цистеину. Введение в эти белки дополнительных количеств дефицитных аминокислот могло бы ликвидировать аминокислотный дисбаланс.

Методами традиционной селекции удалось существенно повысить содержание лизина в запасных белках злаковых. Во всех этих случаях часть проламинов (спирторастворимые запасные белки злаковых) заменялась другими белками, содержащими много лизина. Однако у таких растении уменьшались размеры зерна и снижалась урожайность. По-видимому, проламины необходимы для формирования нормального зерна, и их замена другими белками отрицательно влияет на урожайность. Учитывая это обстоятельство, для улучшения качества запасного белка зерновых нужен такой белок, который не только отличался бы высоким содержанием лизина и треонина, но и мог полноценно заменить определенную часть проламинов при формировании зерна.

Растения могут производить и белки животного происхождения. Так, встраивание в геном растений Arabidopsis thaliana и Brassica napus химерного гена, состоящего из части гена запасного 25-белка арабидопсиса и кодирующей части для нейропептида -- энкефалина, приводило к синтезу химерного белка до 200 нг на 1 г семени. Два структурных белковых домена были связаны последовательностью, узнаваемой трипсином, что давало возможность в дальнейшем легко изолировать чистый энкефалин.

В другом эксперименте удалось после скрещивания трансгенных растений, в одном из которых был встроен ген гамма-субъединицы, а во втором - ген каппа-субъединицы иммуноглобулина, получить у потомства экспрессию обеих цепей. В результате растение формировало антитела, составляющие до 1,3% суммарного белка листьев. Также было показано, что в растениях табака могут собираться полностью функциональные секреторные моноклональные иммуноглобулины. Секреторные иммуноглобулины обычно выделяются в ротовую полость и желудок человека и животных и служат первым барьером на пути кишечных инфекций. В упомянутой выше работе получили продукцию в растениях моноклональных антител, которые были специфичны для Streptococcus mutans - бактерий, вызывающих зубной кариес. Предполагается, что на основе таких моноклональных антител, продуцируемых трансгенными растениями, удастся создать действительно антикариесную зубную пасту. Из других белков животного происхождения, которые представляют интерес для медицины, показана продукция в растениях человеческого в-интерферона.

Разработаны также подходы, позволяющие получать бактериальные антигены в растениях и использовать их в качестве вакцин. Получен картофель, экспрессирующий олигомеры нетоксичной субъединицы в-токсина холеры. Эти трансгенные растения могут быть использованы для получения дешевой вакцины от холеры.

Жиры

Важнейшим сырьем для получения разного рода химических веществ являются жирные кислоты -- основной компонент растительного масла. По своей структуре это углеродные цепи, которые обладают различными физико-химическими свойствами в зависимости от своей длины и степени насыщения углеродных связей. В 1995 году была закончена экспериментальная проверка и получено разрешение от федеральных властей США на выращивание и коммерческое использование трансгенных растений рапса с измененным составом растительного масла, включающего вместе с обычными 16- и 18-членными жирными кислотами также и до 45% 12-членной жирной кислоты - лаурата. Это вещество широко используется для производства стиральных порошков, шампуней, косметики.

Экспериментальная работа заключалась в том, что был клонирован ген специфической тиоэстеразы из растения Umbellularia californica, где содержание лаурата в жире семян достигало 70%. Структурная часть гена этого фермента под контролем промотора-терминатора гена белка, специфического для ранней стадии семяобразования, была встроена в геном рапса и арабидопсиса, что и привело к увеличению содержания лаурата в масле этих растений.

Из других проектов, связанных с изменением состава жирных кислот, можно упомянуть работы, ставящие целью повышение или снижение содержания ненасыщенных жирных кислот в растительном масле. Интересными представляются эксперименты с петрозелиновой кислотой -- изомером олеиновой кислоты, где двойная связь находится за шестым углеродным членом. Эта жирная кислота входит в состав масла кориандра и определяет его более высокую температуру плавления (33°С), в то время как при наличии олеиновой кислоты температура плавления составляет только 12°С. Предполагается, что после переноса генов, определяющих синтез петрозелиновой кислоты, в растения - продуценты растительного масла удастся производить диетический маргарин, содержащий ненасыщенную жирную кислоту. Кроме того, из петрозелиновой кислоты очень легко получать лаурат путем окисления озоном. Дальнейшее изучение специфики биохимического синтеза жирных кислот, по-видимому, приведет к возможности управлять этим синтезом с целью получения жирных кислот различной длины и различной степени насыщения, что позволит значительно изменить производство детергентов, косметики, кондитерских изделий, затвердителей, смазочных материалов, лекарств, полимеров, дизельного топлива и многого другого, что связано с использованием углеводородного сырья.

Полисахариды

Проводится работа по созданию трансгенных растений картофеля и других крахмалнакапливающих культур, в которых это вещество будет находиться в основном в виде амилопектина, то есть разветвленной форме крахмала, или же в основном только в виде амилозы, то есть линейных форм крахмала. Раствор амилопектина в воде более жидкий и прозрачный, чем у амилозы, которая при взаимодействии с водой образует ригидный гель. Так, например, крахмал, состоящий в основном из амилопектина, по-видимому, будет иметь спрос на рынке производителей различных питательных смесей, где сейчас в качестве наполнителя используется модифицированный крахмал. Генетической модификации могут подвергаться также геномы пластид и митохондрий. Такие системы позволяют значительно увеличить содержание продукта в трансгенном материале.

Трансгенные растения в фармакологии

В настоящее время не вызывает сомнений, что многие продукты, потребляемые с фруктами, овощами и злаками, могут проявлять фармакологические эффекты и блокировать развитие сердечно-сосудистых, раковых и других заболеваний. К таким природным соединениям растений относятся сульфорафан из брокколи, резвератрол из винограда, генистеин из сои, эпигаллокатехин-3-галлат из зеленого чая.

Ранее было практически невозможно с помощью селекции создать растения с повышенным содержанием витаминов. Однако с развитием биохимии растений стало более ясным, какие метаболические пути являются критическими для биосинтеза витаминов. Например, для синтеза в-каротина (провитамина А) в растениях необходима фитоен-синтетаза. Этот фермент участвует в конденсации двух молекул геранил-геранил дифосфата. Ген фитоен-синтетазы из нарцисса введен в рис и экспрессирован в эндосперме риса. Таким образом, получен «золотой рис», который может помочь 2 млрд. человек, страдающих от дефицита витамина А, для которых рис - основная пища. Получены трансгенные растения рапса (канолы), экспрессирующие ген фитоен-синтетазы, в семенах которых значительно повысилось содержание каротиноидов. Выявлена экспрессия этого же фермента в клубнях картофеля, что приводило к повышенному синтезу каротиноидов и лютеина.

Недавно получены трансгенные растения земляники с повышенным синтезом L-аскорбиновой кислоты. Эти растения отличались суперэкспрессией гена НАДФ-зависимой Д-галактуронат-редуктазы (GalUR). Созданы растения сои с повышенным в пять раз содержанием витамина Е в семенах. Получены растения арабидопсиса с повышенным содержанием фолатов за счет экспрессии в них бактериального гена ГТФ-циклогидролазы-1 (EcGCH).

Практическое занятие №9

Тема: Конструирование трансгенных растений - продуцентов целевых белков

Конструирование трансгенных растений - продуцентов целевых белков

Растения являются удобной, безопасной и экономически выгодной альтернативой для продукции различных белков, вакцин и антител по сравнению с системами экспрессии на основе микроорганизмов, культур животных клеток или трансгенных животных. За последние 20 лет множество ценных белков эффективно экпрессировано в растениях. Это белки человеческой сыворотки, регуляторы роста, антитела, вакцины, промышленные ферменты, биополимеры и реагенты для молекулярной биологии. Растительные системы имеют перспективы успешного использования для производства рекомбинантных белков в промышленном масштабе.

Рекомбинантные белки, экспрессируемые в растениях

Первым фармацевтически значимым белком, экспрессированным в растениях табака и подсолнечника в 1986 г., явился человеческий гормон роста. С тех пор множество других ценных белков были синтезированы в самых различных растениях (табл. 1).

Среди разнообразия рекомбинантных белков, продуцируемых растениями есть белки, используемые в молекулярно-биологических исследованиях (авидин), молочные белки, используемые в качестве пищевых добавок (казеин) и белки-полимеры для медицинских и промышленных целей (коллаген и эластин). Ценные биологически активные пептиды можно получать, встраивая их в состав запасных белков семян. Так, последовательность ДНК, кодирующая пентапептидный нейрогормон животных лейэнкефалин была встроена в ген 2S альбумина запасного белка семян Arabidopsis thaliana. Экспрессия этого гена в трансформированных растениях рапса и арабидопсиса позволила получить их семена с высоким содержанием рекомбинантного белка. Целевой пептид легко выделялся из рекомбинантного белка с помощью специфического протеолитического расщепления.

Примеры фармацевтически ценных белков, синтезируемых трансгенными растениями, приведены в табл. 1. Многие из этих белков представляют собой продукты крови человека, такие как человеческий сывороточный альбумин (годовое производство более 500 тонн), цитокины и другие сигнальные молекулы.

Таблица 1

Некоторые белки, синтезируемые трансгенными растениями

Белок	Область применения	Растение
Соматотропин	Гормон роста	Табак, подсолнечник
Энкефалины	Передозировка наркотических веществ	Табак
Человеческий сывороточный альбумин	Цирроз печени, ожоги, хирургия	Табак, картофель
Эпидермальный фактор роста	Стимуляция роста клеток кожи и роговицы	Табак
б-Трихосантин	Терапия СПИДа	Nicotiana bethamiana
б-Интерферон	Гепатиты В и С, опоясывающий лишай, вирусные бородавки	Рис, турнепс, картофель
в-Интерферон	То же	Табак
г-Интерферон	Хронический грануломатоз, лейшманиоз, лепра	Табак
Эритропоэтин	Анемия	Табак
Гирудин	Ингибитор тромбина	Рапс
Глюкоцереброзидаза	Болезнь Гоше	Табак
б,в-Гемоглобин	Заменитель крови	Табак
в-Казеин	Пищевая добавка	Картофель
Гранулоцит-макрофаг-колониестимулирующий фактор	Антираковая терапия	Табак
Коллаген	Заживление ран	Табак
Лактоферрин	Бактериальные инфекции	Картофель
TNF-б	Фактор некроза опухолей	Картофель
Трипсин	Расщепление белков	Кукуруза
Лизоцим	Инфекционные заболевания	Рис
Эластин	Восстановление повреждённых сухожилий, стенок сосудов	Табак, картофель

До недавнего времени большинство белков экспрессировали в трансгенном табаке и экстрагировали из листьев. В основном, эти белки синтезировались на низком уровне, обычно менее 0.1% от растворимого белка клеток. В последние годы стали использовать другие системы трансформации и экспрессии, позволяющие нарабатывать белки в больших количествах. Более высокие уровни экспрессии получены в различных растениях с помощью обычной агробактериальной трансформации. Так гирудин, слитый с олеозином (белком из масляных телец), в семенах трансгенной канолы экспрессировался на уровне 0,3%. Трансформация хлоропластов геном человеческого гормона роста давала уровень экспрессии до 7%, а геном человеческого сывороточного альбумина - более 11% от растворимого белка клеток.

Некоторые белки, синтезируемые трансгенными растениями, уже производятся некоторыми западными компаниями или будут выпущены на рынок в ближайшие 5 лет. Например, авидин, трипсин и в-глюкуронидаза, выделяемые из трансгенной кукурузы, производятся фирмой Sigma-Aldrich (США). В скором времени должны быть подготовлены к промышленному производству коллаген, липаза, лактоферрин, лизоцим, синтезируемые трансгенными растениями. Следует отметить перспективность получения модифицированных растений, экспрессирующих новые формы антимикробных пептидов.

Экспрессия рекомбинантных антител в трансгенных растениях

В 1989 г. Хиаттом с соавторами впервые достигнута экспрессия антител в растениях табака. Таким образом, было показано, что растения могут собирать сложные функциональные гликопротеины, состоящие из нескольких субъединиц. Типичные антитела представляют собой тетрамеры из двух идентичных тяжелых и двух легких цепей, однако есть более сложные формы, например секреторные антитела, представляющие собой димеры обычных антител и включающие две дополнительные полипептидные цепи. Если у животных для сборки таких антител нужны два типа клеток, то у растений эта сборка антител проходит в одной клетке. Для этого получено четыре различных типа трансгенных растений, синтезирующих отдельные цепи иммуноглобулинов. Скрещивание между этими трансформантами дало потомство, способное к сборке антител в одной клетке. Такие антитела обладали иммуногенностью, они накапливались в клетках в количестве до 1,3% от суммарного растворимого белка.

Кроме полноразмерных иммуноглобулинов в растениях успешно синтезированы разные их производные: Fab-фрагменты (fragment antigen binding), одноцепочечные вариабельные фрагменты (single-chain variable fragment, scFv), биспецифичные вариабельные фрагменты. Данные о синтезе некоторых антител трансгенными растениями приведены в табл. 2.



Таблица 2

Антитела, синтезируемые трансгенными растениями

Применение	Антиген	Тип антител	Растение	Уровень экспрессии
Онкология (рак кишечника, легких, опухоли эпителиального происхождения	Раково-эмбриональный антиген человека	Мышино-человеческие химерные антитела IgG1 (cT84.66), scFv T84.66, T84.66/G68	табак	1-12 мг/кг СВ*
		scFvT84.66	пшеница	50-900 нг/г СВ
			рис	1.5-29 мкг/г СВ
Нейтрализация вируса бешенства	Белок вируса бешенства	Моноклональные антитела mAb SO57	табак	3 мкг/г СВ 0.07% РБ
ИФА-диагностика	Антитела против человеческого IgG	C5-1 IgG	люцерна	0.13-1.0% РБ
Предотвращение зубного кариеса	Поверхностный антиген стрептококка SAI/II	Guy's 13 IgG IgA/G sIgA/G	табак	200-500 мкг/г СВ 5-8% РБ
Терапия рака толстой кишки	Поверхностный антиген	CO-17 A IgG	Nicotiana benthamiana	Нет данных
Лечение герпеса типа 2	Белок вируса герпеса HSV-2	IgG, IgA, DigA или sIgA IgG1 Fab и F(ab?)2	рис, соя	Нет данных
Иммуноаффинная очистка рекомбинантного HBsAg	Поверхностный антиген вируса гепатита В (HBsAg)	scFv	табак	0.031%-0.22% РБ

*(РБ - растворимый белок; СВ - сырой вес)

Антитела, полученные в растениях, могут быть одними из первых фармакологических белков, нарабатываемых в промышленных масштабах. Во многих исследованиях антитела получают в семенах злаковых и бобовых растений, что дает преимущество при их долговременном хранении при обычной температуре без потери активности. В семенах ячменя содержание диагностических антител достигало 150 мг/г веса семян. Из многих бобовых только горох и соя используются в настоящее время в качестве продуцентов рекомбинантных белков. Хотя соя дает сравнительно небольшой урожай по сравнению с кукурузой и рисом, содержание белка в семенах сои очень высокое - свыше 40%. Описан синтез человеческих антител к вирусу генитального герпеса в листьях и семенах сои. Горох дает такой же урожай, как и соя и содержание белка в его семенах такое же, однако цена его выращивания на 50% выше. В горохе были экспрессированы одноцепочечные антитела. Одни из таких антител против ракового антигена синтезировались на низком уровне под контролем семяспецифичного легуминового А-промотора. Другие антитела экспрессировались под семенным промотором USP и их синтез достигал 2% от общего белка семян. Семяспецифичный промотор фасоли был использован для экспрессии одноцепочечных антител в Arabidopsis thaliana. По сравнению с промотором 35S РНК вируса мозаики цветной капусты (CaMV 35S), экспрессия под контролем которого составила до 1% от растворимого белка, промотор фасоли arc5-I дал выход антител до 36% от растворимого белка в семенах арабидопсиса, причем антитела сохраняли антиген-связывающую активность и аффинность.

Кроме того, антитела в растениях были получены методом агроинфильтрации, а также с использованием векторов на основе вирусов. Преимущества этих двух систем в том, что можно получить миллиграммы белка за несколько дней вместо нескольких месяцев, которые требуются для получения трансгенных либо транспластомных линий растений.

Практическое занятие №10

Тема: Создание и применение трансгенных животных

На протяжении тысячелетий человек создавал новые породы животных, совершенствуя методы традиционной селекции. Для получения улучшенных генетических линий подобным образом требуется проведение множества раундов скрещиваний и отбора, каждый раз используя в качестве производителей животных наилучшими характеристиками. В результате подобных манипуляций со временем можно получить более или менее чистые линии высокопродуктивных пород животных. Данная стратегия считается весьма успешной, однако она требует больших временным?х и материальных затрат. Кроме того, после того, как улучшенная генетическая линия получена, вводить новые признаки методом скрещиваний и отбора становится затруднительно, поскольку могут быть утеряны ранее приобретенные полезные признаки, а также приобретены «вредные» гены, ухудшающие породу. Для преодоления этих затруднений необходима абсолютно новая стратегия, каковая и была разработана в рамках генной инженерии.

Идея генетического изменения животных путём введения в их геном нужной человеку генетической информации была впервые реализована в 80-х годах ХХ столетия. С тех пор животные, чей геном был трансформирован, называются трансгенными, а сам процесс их получения называется трансгенной технологией или трансгенозом.

В общих чертах новые генетически трансформированные линии (породы) животных получают по следующей схеме, разработанной на мышах:

1) клонированный ген вводят в ядро оплодотворённой яйцеклетки;

2) трансформированные оплодотворённые яйцеклетки имплантируют в реципиентную женскую особь (успешное развитие эмбриона млекопитающих в иных условиях невозможно);

3) отбирают потомков, родившихся из имплантированных яйцеклеток, которые содержат клонированный ген во всех клетках;

4) скрещивают между собой трансгенных животных и получают новую генетическую линию.

Трансгенные технологии разрабатывались и совершенствовались на лабораторных мышах. Трансгенные мыши сыграли свою роль в исследовании возможности синтеза лекарственных веществ, а также в моделировании различных генетических болезней человека, что необходимо при выработке стратегий борьбы с этими заболеваниями.

Так, трансгенные мыши использовались при изучении секреции белка CFTR, нарушения в котором приводят к возникновению муковисцидоза. Муковисцидоз -- это распространённая генетическая болезнь, поражающая в странах Европы одного из 2500 новорожденных. Болезнь возникает вследствие мутации в гене CF, кодирующем белок CFTR, который в норме служит каналом для ионов хлора, проходящих через клеточную мембрану. В результате блокирования этого потока в некоторых органах, особенно в лёгких и поджелудочной железе, начинает скапливаться слизь, которая становится источником тяжёлой бактериальной инфекции. Загустевшая слизь забивает протоки, нарушается нормальная работа органов и симптомы муковисцидоза усиливаются. Продолжительность жизни больных муковисцидозом в настоящее время составляет 25-30 лет. Для изучения действия белка CFTR необходимо получить его в достаточном количестве. Для этого были получены трансгенные линии мышей, несущих ген CF под контролем регуляторных последовательностей гена в-казеина -- одного из белков молока. В результате, в молоке трансгенных мышей содержался белок CFTR в форме, позволяющей его экстракцию.

Кроме того, были разработаны «мышиные» модели таких генетических заболеваний человека, как болезнь Альцгеймера, артрит, мышечная дистрофия, образование опухолей, гипертония, дисфункция эндокринной системы и многие другие.

Трансгенный крупный рогатый скот. Молочные железы крупного рогатого скота являются удобным «биореактором» для производства многих необходимых человеку веществ, прежде всего, белковой природы. Коровы-рекордсменки дают в год до 10 000 л молока с содержанием белка до 35 г/л. Таким образом, теоретически, стадо из 20 трансгенных коров в год может выдать столько белка С, используемого для предотвращения тромбообразования, что покроет всю потребность человечества в этом препарате. Одной трансгенной коровы достаточно для получения требуемого ежегодно количества фактора IX (фактора Кристмаса), который вводят больным гемофилией для повышения свертываемости крови.

Для создания трансгенных коров используется модифицированная схема трансгеноза мышей методом микроинъекций ДНК. Процедура включает следующие этапы:

1) Сбор ооцитов (яйцеклеток) коров, забитых на скотобойне.

2) Созревание ооцитов in vitro.

3) Оплодотворение бычьей спермой in vitro.

4) Центрифугирование оплодотворённых ооцитов для концентрирования желтка, который в нормальных яйцеклетках мешает визуализации мужского пронуклеуса Мужской пронуклеус - это ядро сперматозоида. После оплодотворения яйцеклетки мужской пронуклеус ещё некоторое время существует отдельно от женского. Он крупнее ядра яйцеклетки и более удобен для введения в него трансгенного материала методом микроинъекции. с помощью светового микроскопа.

5) Микроинъекция ДНК в мужской пронуклеус.

6) Развитие эмбрионов in vitro.

7) Имплантация одного эмбриона реципиентной самке во время течки.

8) Скрининг ДНК потомков на наличие трансгена.

Описанный выше метод, как показала практика, результативен, однако эффективность его весьма низка. Так, из 2470 оплодотворенных трансгенных яйцеклеток удалось получить двух трансгенных телят. Работа по усовершенствованию техники трансгеноза ведётся.

Одна из целей трансгеноза крупного рогатого скота -- изменение содержания в молоке различных компонентов. Так, количество сыра, получаемого из молока, прямо пропорционально содержанию в нём к-казеина. Увеличение количества этого белка в молоке возможно при помощи гиперэкспрессии трансгена этого белка. Ещё один пример: если обеспечить экспрессию гена лактазы в клетках молочной железы, то можно получить молоко, не содержащее лактозы. Такое молоко незаменимо для людей, не переносящих лактозу -- после употребления молока или молочных продуктов у них возникает серьёзное желудочное расстройство.

Весьма перспективно создание домашних животных с наследственной устойчивостью к бактериальным и вирусным инфекциям и паразитарным инвазиям. Наиболее обнадёживающими в настоящее время являются предварительные результаты, полученные при введении мышам, кроликам и свиньям генов, кодирующих моноклональные антитела Моноклональные антитела - антитела, обладающие высокой специфичностью к какому-либо одному антигену.. Идея этого подхода заключантся в том, чтобы снабдить трансгенное животное наследуемым механизмом защиты, позволяющим обойтись без иммунизации при помощи прививок.

Практическое занятие №11

Тема: Генотерапия

Лечение заболеваний с помощью генов получило название генотерапии. Сейчас в мире насчитывается порядка 400 проектов, посвященных лечению с помощью генотеропии. Разработке программы генной терапии предшествуют тщательный анализ тканеспецифической экспрессии соответствующего гена, идентификация первичного биохимического дефекта, исследование структуры, функции и внутриклеточного распределения его белкового продукта, а также биохимический анализ патологического процесса. Все эти данные учитываются при составлении соответствующего медицинского протокола.

Апробацию процедуры генокоррекции наследственного заболевания проводят на первичных культурах клеток больного, в которых в норме функционально активен данный ген. На этих клеточных моделях оценивают эффективность выбранной системы переноса экзогенной ДНК, определяют экспрессию вводимой генетической конструкции, анализируют ее взаимодействие с геномом клетки, отрабатывают способы коррекции на биохимическом уровне. Используя культуры клеток, можно разработать систему адресной доставки рекомбинантных ДНК, однако проверка надежности работы этой системы может быть осуществлена только на уровне целого организма. Поэтому такое внимание в программах по генной терапии уделяется экспериментам in vivo на естественных или искусственно полученных моделях соответствующих наследственных болезней у животных.

Успешная коррекция генетических дефектов у таких животных и отсутствие нежелательных побочных эффектов генной терапии являются важнейшей предпосылкой для разрешения клинических испытаний. Таким образом, стандартная схема генокоррекции наследственного дефекта включает серию последовательных этапов. Она начинается созданием полноценно работающей (экспрессирующейся) генетической конструкции, содержащей смысловую (кодирующую белок) и регуляторную части гена. На следующем этапе решается проблема вектора, обеспечивающего эффективную, а по возможности и адресную доставку гена в клетки-мишени. Затем проводится трансфекция (перенос полученной конструкции) в клетки-мишени, оценивается эффективность трансфекции, степень коррегируемости первичного биохимического дефекта в условиях клеточных культур (in vitro) и, что особенно важно, in vivo на животных - биологических моделях. Только после этого можно приступать к программе клинических испытаний.

Существует два типа генотерапии: заместительная и корректирующая.

Заместительная генотерапия заключается во вводе в клетку неповрежденного гена. Внесенная копия заменит по функциям сохранившийся в геноме больного дефектный ген. Все проводимые сегодня клинические испытания используют внесение в клетку дополнительных количеств ДНК.

При корректирующей терапии предполагается замена дефектного гена нормальным в результате рекомбинации. Пока этот метод на стадии лабораторных испытаний, так как эффективность его еще очень низка.

В зависимости от способа введения экзогенных ДНК в геном пациента генная терапия может проводиться либо в культуре клеток (ex vivo), либо непосредственно в организме (in vivo). Клеточная генная терапия или терапия ex vivo предполагает выделение и культивирование специфических типов клеток пациента, введение в них чужеродных генов, отбор трансфецированных клеток и реинфузию их тому же пациенту.

Примером может служить лечение комбинированного иммунодефииицита. Комбинированный иммунодефицит может быть результатом дефекта гена аденозиндезаминазы. Впервые попытка лечения такого больного методами генотерапии была предпринята в США в 1990 г. У больного ребенка извлекли Т-лимфоциты, трансформировали ретровирусным вектором, введя нормальный ген аденозиндезаминазы и вернули клетки в организм. Введение приходится повторять. Более эффективна аналогичная трансформация стволовых клеток костного мозга.

Генная терапия in vivo основана на прямом введении клонированных и определенным образом упакованных последовательностей ДНК в специфические ткани больного. В настоящее время не существует общедоступного метода культивирования клеток легких, поэтому при легочных заболеваниях единственный способ доставить чужеродный ген - это ввести его прямо в организм. Муковисцидоз - весьма распространенное среди людей белой расы тяжелое наследственное заболевание легких, которое поражает, например, в семьях из Центральной Европы одного новорожденного из 2500 и для которого установлен дефектный ген, кодирующий белок-регулятор трансмембранной проводимости. Основное проявление дефектного гена - пневмония. Поражаются все эпителиальные клетки. Основная проблема - как доставить ген в клетки, покрытые слизью, которая препятствует трансформации. Неповрежденную копию "гена заболевания", включенную в аденовирусный вектор или липосому, вводят в форме аэрозоля в дыхательные пути больного.

Для коррекции нарушения при прогрессирующей мышечной дистрофии Дюшенна (заболевании мальчиков, связанном с дефектами Х-хромосомы) нормальный ген, кодирующий белок дистрофии, пытались прямо вкалывать в мышечные волокна, используя либо "голую" ДНК, либо аденовирусный вектор. Другие исследователи трансплантировали больному миобласты после генетической коррекции. Ранее неподвижный ребенок приобретал способность двигаться! К сожалению, во всех этих опытах удается получить только временный терапевтический эффект, и процедура введения гена должна неоднократно повторяться.

Список наследственных заболеваний, которые пытаются или планируют лечить генами, велик. Это и ревматоидный артрит, и фенилкетонурия, и заболевания, связанные с недостатком гормонов (инсулина, эритропоэтина, гормона роста). В случае хронической анемии, связанной с дефицитом эритропоэтина, на основании опытов на животных предлагается принципиально новый подход к лечению. Так как каждая из наших клеток содержит один и тот же геном, можно заставить фибробласты кожи, которые в норме не производят эритропоэтина, синтезировать этот гормон. Для этого нужно ввести в геном новую контролирующую область и тем самым снять запрет со считывания (экспрессии) гена эритропоэтина, присутствующего, но "молчащего" в фибробластах.

Практически в любой области медицины либо начаты клинические испытания лечения наследственных заболеваний с помощью генотерапии, либо в опытах на животных разрабатываются подходы к такому лечению. По мере усовершенствования методов доставки генов и контроля их экспрессии список заболеваний, к которым можно применять генотерапию, будет безусловно расширяться.

Генотерапия применима не только к наследственным заболеваниям. Предстоит решить проблему лечения генами "чумы XX века" -- синдрома приобретенного иммунодефицита (СПИД), возникающего при заражении вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ). ВИЧ представляет собой ретровирус, поражающий Т-лимфоциты и макрофаги. Болезнь удалось бы победить, если бы были найдены новые гены, введение которых в зараженные ВИЧ лимфоциты останавливало бы дальнейшее размножение вируса. Предложено множество хитроумных способов борьбы со СПИДом с помощью привнесенных генов. Все они основаны на новейших данных о строении и функционировании генома ретровируса. Например, вводя прямо в мышцы больного ретровирусные векторы, несущие отдельные гены ВИЧ, ученые рассчитывали на то, что гены ВИЧ после внедрения в ДНК хромосом хозяина смогут дать информацию для синтеза вирусных белков и произойдет "противоСПИДная" иммунизация больного этими белками. Однако еще не получено ощутимых результатов, которые сулили бы успех в борьбе с вирусом дикого типа, коварство которого заключается в его изменчивости.

Огромные перспективы открывает использование генотерапии для лечения онкологических заболеваний. Многолетние усилия ученых привели к пониманию того, что рак -- это генетическое заболевание и его развитие происходит многостадийно, в результате серии генетических нарушений, накапливающихся в клетке. Следовательно, каждый из таких отдельных генетических эффектов может стать точкой приложения генотерапевтического подхода.



КРАТКИЙ СЛОВАРЬ ТЕРМИНОВ

Амплификация ДНК (лат. amplificatio -- усиление, увеличение) -- увеличение числа копий молекул ДНК, либо увеличение числа копий гена в геноме организма. В генной инженерии часто применяется амплификация молекул ДНК методом ПЦР (см.).

Антиген -- вещество (обычно белки, реже полисахариды), вызывающее у животных иммунный ответ (образование антител).

Антитело -- белок (иммуноглобулин), образуемый иммунной системой организма животных в ответ на введение антигена и способный вступать с ним в специфическое взаимодействие.

Бактериофаг (часто произносится и пишется сокращенно -- фаг) -- вирус, паразитирующий на бактериях. Состоит из ДНК или РНК, упакованной в белковую оболочку -- капсид.

Блоттинг -- перенос молекул ДНК, РНК или белка из геля, в котором шёл электрофорез, на фильтр (мембрану).

Вакцина -- препарат ослабленного или убитого инфекционного агента (вируса, бактерии и т. п.) или его отдельных компонентов, несущих антигенные детерминанты, способный вызывать образование иммунитета к данной инфекции у животных (человека). Кроме того, в последнее время появились вакцины, произведенные методами генной инженерии (примером такой вакцины может служить вакцина против гепатита B).

Вектор (в генетике) -- молекула нуклеиновой кислоты, чаще всего ДНК, используемая в генетической инженерии для передачи генетического материала другой клетке. Вектор представляет собой либо искусственно модифицированную плазмиду (см.), выделенную из клеток бактерии, либо искусственно модифицированный геном бактериофага (см.) или другого вируса, либо конструкцию, объединяющую в себе фрагмент плазмиды и фагового генома. В связи с этим принято различать плазмидные, фаговые и плазмидно-фаговые векторы. Зачастую вертор содержит также один или более генетических маркёров (см.), необходимых для успешного скрининга (см.).

Ген -- структурная и функциональная единица наследственности, контролирующая развитие определенного признака или свойства. Материально ген представляет собой участок молекулы ДНК, несущий целостную информацию о строении одной молекулы белка или одной молекулы РНК. В составе гена, помимо кодирующей области, имеются регуляторные участки, отвечающие за частоту экспрессии данного гена (см. также: промотор, экспрессия гена).

Генетическая карта -- схема расположения структурных генов и регуляторных элементов в хромосоме.

Генетически модифицированные источники (ГМИ) -- таковыми считаются все, присутствующие в продуктах, генетически модифицированные организмы (бактерии, грибы, животные и растения). ГМИ могут присутствовать в продуктах питания, либо являться биореакторами при производстве лекарственных средств (гормонов человека, антибиотиков, вакцин и пр.) и витаминов.

Генетически модифицированные продукты (ГМП) -- продукты питания, в состав которых входят ГМИ.

Генетически модифицированный организм (ГМО) -- живой организм, генотип которого был искусственно изменён при помощи методов генной инженерии. Синоним: трансгенный организм.

Геномм -- совокупность всех генов организма; его полный хромосомный набор.

Гетеродуплекс (см.: дуплекс).

Гибридная ДНК (см.: рекомбинантная ДНК).

ГМО (см. генетически модифицированный организм).

ГМИ (см. генетически модифицированные источники).

ГМП (см. генетически модифицированные продукты).

Денатурация -- нарушение пространственной структуры молекулы в результате разрыва внутри- или межмолекулярных нековалентных связей. Под денатурацией ДНК или РНК понимается разрушение водородных связей в дуплексах и расхождение составляющих их нитей.

ДНК-полимеразы -- класс ферментов, играющих ключевую роль в репликации ДНК. Катализируют реакцию присоединения следующего нуклеотида к 3' концу синтезируемой нуклеотидной цепочки. Подбор нужного нуклеотида осуществляется путём использования комплементарной нити в качестве матрицы. Различают ДНК-зависимые ДНК-полимеразы (синонимы: обратные транскриптазы, ревертазы), использующие в качестве матрицы комплементарную цепь ДНК, и РНК-зависимые ДНК-полимеразы, катализирующие синтез нити ДНК на РНК-матрице (см. обратная транскрипция).

Дуплекс -- двунитевая молекула нуклеиновой кислоты, закрученная в форме спирали. Нити в дуплексах соединяются водородными связями по принципу комплементарности азотистых оснований. Как правило, ДНК в клетках присутствует в виде дуплекса -- двойной спирали (однонитевыми ДНК представлены геномы некоторых вирусов), частично переходя в однонитевую форму во время актов транскрипции и репликации. РНК также способна образовывать дуплексы. Кроме того, существуют гетеродуплексы, одна из нитей которых представлена молекулой ДНК, а другая -- молекулой РНК.

Интерфероны -- белки, синтезируемые клетками позвоночных в ответ на вирусную инфекцию, подавляющие развитие вирусов.

Капсид -- оболочка вируса, состоящая из белков-капсомеров.

Компетентность (генетическая) -- способность клеток поглощать чужеродную ДНК из внешней среды (см.: трансформация).

Комплементарность (в генетике) -- свойство азотистых оснований образовывать с помощью водородных связей парные комплексы аденин--тимин (или урацил) и гуанин--цитозин при взаимодействии цепей нуклеиновых кислот.

Космида -- вектор, содержащий cos-сайт ДНК фага л.

Линкер -- короткий синтетический олигонуклеотид, применяемый для соединения фрагментов ДНК in vitro; обычно содержит участок узнавания определённой рестриктазой. Если линкер содержит несколько сайтов узнавания различными рестриктазами, он называется полилинкер.

Липкие концы -- комплементарные однонитевые участки ДНК, расположенные на концах дуплексов ДНК.

Локус -- участок ДНК (хромосомы), где расположена определённая генетическая детерминанта. Близкий по значению термин: сайт.

Маркёр (синоним: маркерный ген) -- ген в рекомбинантной ДНК, кодирующий хорошо различимый селективный признак.

Молекулярное клонирование -- технология многократного копирования фрагментов ДНК, осуществляемая путем встраивания целевого фрагмента в геном живого организма (например, бактерии), вируса или в живые клетки культуры тканей и последующего размножения трансформантов.

Нокаут гена -- целенаправленное внесение определенных мутаций (вплоть до полного удаления фрагмента ДНК из генома), приводящих к избирательной инактивации гена.

Нуклеазы -- общее название ферментов, расщепляющих молекулы нуклеиновых кислот.

Обратная транскрипция -- это процесс образования двуцепочечной ДНК на матрице одноцепочечной РНК. Осуществляется при участии ферментов обратных транскриптаз (см. ДНК-полимеразы). В генной инженерии этот процесс используется для создания новых генов на основе имеющихся матричных РНК.

Отжиг (см.: ренатурация).

Плазмиды -- дополнительные факторы наследственности, расположенные в клетках вне хромосом и представляющие собой кольцевые (замкнутые) или линейные молекулы ДНК. Обнаружены у большинства прокариот и некоторых низших грибов. Каждая плазмида имеет точку начала репликации (ori), что дает ей возможность автономно реплицироваться в клетке и наследоваться дочерними клетками. Это свойство позволяет использовать их в генной инженерии в качестве вектора.

Полилинкер (см.: линкер).

Полимерамзная цепная реакция (ПЦР) -- метод амплификации молекул ДНК, позволяющий добиться значительного увеличения малых концентраций определённых фрагментов нуклеиновой кислоты (ДНК) в биологическом материале (пробе). Метод ПЦР широко используется не только в генной инженерии, но и в судебно-медицинской экспертизе, генетической генеалогии, молекулярной филогенетике и других областях науки и технологии.

Праймер (англ. primer) -- это короткий фрагмент нуклеиновой кислоты, который служит стартовой точкой при репликации ДНК. Праймеры необходимы ДНК-полимеразам, так как ферменты этого класса могут только наращивать существующую цепь, но не начинать ее синтез «с нуля».

Пролиферация - размножение клеток.

Промотор -- участок гена, узнаваемый РНК-полимеразой как стартовая площадка для начала транскрипции. От структуры промотора в значительной степени зависит уровень экспрессии генов (см.). Различают сильные промоторы - обеспечивающие высокий уровень экспрессии генов в клетке-хозяине и слабые промоторы, обеспечивающие более низкий уровень экспрессии. «Сила» промотора зависит от того, в клетках какой ткани или какого организма он находится, а также от положения гена в хромосоме.

ПЦР -- (см. полимерамзная цепная реакция).

Рекомбинантная ДНК (синоним: гибридная ДНК) -- молекула ДНК, созданная путём искусственного соединения фрагментов ДНК различного происхождения.

Ренатурация -- восстановление исходной пространственной структуры молекул. В отношении нуклеиновых кислот ренатурация означает восстановление двунитевой структуры за счет образования водородных связей между комплементарными основаниями (у этого процесса есть и другое название -- отжиг), которые были разрушены при денатурации (см.).

Рестриктазы (синоним: эндонуклеазы рестрикции) -- ферменты из класса гидролаз, катализирующие реакцию гидролиза (разрезания) молекул нуклеиновых кислот в определенных участках. Каждая рестриктаза узнаёт специфический участок ДНК длиной 4-6 пар нуклеотидов (сайт рестрикции). В генной инженерии являются одним из основных инструментов при создании рекомбинантных ДНК (см.). Чаще всего используются т.н. рестриктазы второго класса, гидролизующие ДНК внутри сайта рестрикции или на небольшом, фиксированном расстоянии от него.

Рестрикты -- фрагменты ДНК, образовавшиеся после её гидролиза рестриктазой (см.).

Рестрикция -- разрезание на фрагменты молекулы ДНК или РНК с помощью ферментов-рестриктаз (см.).

Сайт (генетический) -- участок молекулы ДНК, РНК или белка, в котором локализована определенная генетическая детерминанта, мутация, участок узнавания определенной рестриктазой (сайт рестрикции) и т.п.

Секвенирование -- установление последовательности нуклеотидов в молекулах нуклеиновых кислот или последовательности аминокислотных остатков в белках (полипептидах).

Скрининг -- выявление и отбор организмов, несущих в геноме рекомбинантную ДНК.

Трансген -- чужеродный фрагмент ДНК, переносимый при помощи генно-инженерных манипуляций в геном определенного организма. Трансген может быть выделен из биологического объекта или синтезирован искусственно. Организм, получившийся в ходе переноса и встраивания в геном трансгена, называют трансгенным.

Трансгеноз (синоним: трансгенез) -- процесс переноса и встраивания генетического материала из организма одного вида, в организм другого вида.

Трансгемнный организм (синоним: генетически модифицированный организм) -- живой организм, в геном которого искусственно введен ген другого организма.

Трансфемкция - процесс введения нуклеиновой кислоты в клетки человека и животных невирусным методом. Аналогичный процесс в отношении бактерий, дрожжей и растений называется трансформация.

Трансформация (см. трансфекция).

Фаг (см. бактериофаг).

Химера (в генетике) -- организм или часть организма, состоящие из генетически разнородных тканей или клеток.

Целевой фрагмент ДНК -- участок ДНК, несущий гены, которые необходимо перенести в геном вновь создаваемого трансгенного организма (см. трансген). Эти гены кодируют фенетические признаки, ради которых создается трансгенный организм (например: способность синтезировать инсулин человека трансгенными бактериями, устойчивость к колорадскому жуку у трансгенного картофеля и пр.).

Экспрессия гена -- это процесс, в ходе которого наследственная информация от гена (последовательности нуклеотидов ДНК) преобразуется в функциональный продукт -- РНК или белок. Экспрессия генов может регулироваться на всех стадиях процесса: и во время транскрипции, и во время трансляции, и на стадии посттрансляционных модификаций белков. При введении в геном организма чужеродных генов кране важно предугадать уровень (частоту) их экспрессии на новом месте. Недостаточно высокий уровень экспрессии целевых генов может служить причиной неудачи эксперимента по созданию трансгенного организма.

Эндонуклеазы рестрикции (см.: рестриктазы).



Вопросы для самостоятельного изучения

1. История развития генетической инженерии.

2. Схема типового эксперимента в генной инженерии.

3. Источники ДНК для клонирования.

4. Плазмидные, фаговые и плазмидно-фаговые векторы

5. Векторы, сконструированные на основе фага М13

6. Векторы на основе фага л

7. Челночные векторы

8. Сегмент-направленный мутагенез in vitro.

9. Олигонуклеотид-направленный мутагенез in vitro.

10. Оптимизация экспрессии генов, клонированных в прокариотических системах.

11. Экспрессия генов при участии сильных регулируемых промоторов.

12. Использование для экспрессии различных микроорганизмов.

13. Использование бактерий рода Agrobacterium для создания генетически модифицированных растений.

14. Строение и функции плазмид Ti и Ri.

15. Структура Т-области плазмид Ti.

16. Синтез в организмах чужеродных белков медицинского назначения.

17. Синтез съедобных вакцин трансгенными растениями.

18. Трансгенные растения с новыми биотехнологическими свойствами.

19. Трансгенные животные в фундаментальных исследованиях.

20. Биотехнологическое применение трансгенных животных.



Вопросы итогового контроля

1. Опишите коннекторный метод создания рекомбинантных ДНК

2. Опишите рестриктазно-лигазный метод создания рекомбинантных ДНК

3. Линкеры и полилинкеры - что это, для чего используются?

4. Что такое генетическая компетентность клеток? Опишите один из химических методов ее искусственного повышения

5. Физические методы повышения компетентности клеток

6. Рестриктазы какого класса используются в генной инженерии и почему?

7. Фенотипический скрининг

8. Что такое и для чего применяется блоттинг? Опишите саузерн-блоттинг

9. Дидезоксинуклеотидный метод секвенирования

10. Полимеразная цепная реакция и её применение

11. Плазмидные векторы

12. Плазмидно-фаговые векторы

13. Использование бактерий в создании трансгенных растений

14. Строение плазмид Ti

15. Строение Т-ДНК

16. Устойчивость трансгенных растений к насекомым-вредителям

17. Устойчивость трансгенных растений к вирусам.

18. Устойчивость трансгенных растений к неблагоприятным условиям среды

19. Повышение пищевой ценности растений методами генной инженерии

20. Растения с измененным вкусом и внешним видом плодов

21. Трансгенная соя и содержащие её продукты питания

22. Генетически модифицированные сорта риса

23. Трансгенный картофель

24. Трансгенные сорта кукурузы

25. Трансгенные томаты

26. Улучшение сохранности и качества плодов и овощей методами генной инженерии

27. Создание растений-биореакторов биологически активных белков

28. Трансгенные овцы и козы

29. Трансгенные свиньи и их использование

30. Трансгенные породы птиц

31. Трансгенный крупный рогатый скот

32. Опыты по трансгенозу мышей. Применение трансгенных мышей

33. Улучшение пород рыб с помощью трансгеноза

34. Молочные железы животных как биореактор необходимых человеку веществ

35. Биосинтез гормонов человека в трансгенных микроорганизмах

36. Съедобные вакцины

37. Генная терапия in vivo

38. Генная терапия ex vivo

39. ДНК-технологии в профилактике отторжения трансплантированных органов

40. Синтез антисмысловых РНК

41. Использование ДНК-технологий в криминалистике. Метод «генетических отпечатков пальцев»

42. Возможные последствия употребления продуктов, содержащих ГМИ в пищу

43. Государственный контроль за производством пищевых продуктов и пищевых добавок, содержащих ГМИ

44. Контроль экспериментов с рекомбинантными ДНК

45. Чем опасны ГМО для окружающей среды?

46. Контроль за высвобождением генетически модифицированных организмов в окружающую среду

47. Правила маркировки продуктов, содержащих ГМИ, принятые в России и других странах

48. Методы определения ГМИ в продуктах питания



Список рекомендуемой литературы

1. Щелкунов С.Н. Генетическая инженерия: учеб. пособие для вузов. - 2-е изд., испр. и доп. - Новосибирск: Сибир. университет. изд-во, 2004. - 496с.:ил. - ISBN 5-94087-098-8

2. Егорова Т.А., Клунова С.М., Живухина Е.А. Основы биотехнологии : учеб. пособие для студентов вузов. - М.: Academia, 2003. - 208с. : ил. - (Высшее образование). - ISBN 5-7695-1022-6

3. Красноштанова А.А., Крылов И.А., Бабусенко Е.С. Основы биотехнологии: учеб. Пособие. - М.: РХТУ, 2001. - 84с.:ил. - ISBN 5-7237-0270-X

4. Бакай А.В., Кочиш И.И., Скрипниченко Г.Г. Генетика: учебник для вузов. - М.: КолосС, 2006. - 448с.: ил. - ISBN 5-9532-0325-Х

5. Иванов В.И. [и др.] Генетика: учебник для вузов / под ред. В.И.Иванова. - М.: Академкнига, 2006. - 247с.: ил. - ISBN 5-94628-146-1